UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO
Avaliação de Neutrófilos Circulantes em
Pacientes com Neoplasia Pré-invasiva e
Invasiva de Colo Uterino
PAULO CESAR FERNANDES JUNIOR
UBERABA–MG
2006
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA
Avaliação de Neutrófilos Circulantes em Pacientes com
Neoplasia Pré-invasiva e Invasiva de Colo Uterino
Tese apresentada ao Curso de PósGraduação
em
Patologia,
sub-área
Patologia Ginecológica e Obstétrica, da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro
como requisito para obtenção do título de
Mestre em Patologia Ginecológica e
Obstétrica.
ALUNO: PAULO CESAR FERNANDES JUNIOR
ORIENTADORA: PROFª. DRª. BEATRIZ MARTINS TAVARES MURTA
CO-ORIENTADOR: PROF. DR. EDDIE FERNANDO CANDIDO MURTA
UBERABA – MG
2006
Capa: Lençóis Maranhenses
Foto: Cristian Knepper e Márcio Vasconcelos
Criação: VCR Comunicação e Marketing
Catalogação na fonte por Beatriz Gabellini Alves - Biblioteca da UFTM
F411a
Fernandes Junior, Paulo Cesar
Avaliação de neutrófilos circulantes em pacientes com
neoplasia pré-invasiva e invasiva de colo uterino. / Paulo
Cesar Fernandes Junior. – – 2006.
106f.: tab.; graf.; fig.
Tese de Mestrado em Patologia Ginecológica e Obstétrica –
Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba-MG,
2006.
Orientadora: Profa. Dra. Beatriz Martins Tavares Murta
1. NEOPLASIA DE COLO UTERINO. 2. NEUTRÓFILOS. 3. ESTADIAMENTO.
4. FUNÇÃO CELULAR. I. Título. II. Murta, Beatriz Martins Tavares.
NLM – WP458
Apoio Financeiro:
•
Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM)
•
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)
Local de desenvolvimento do trabalho:
•
Ambulatório de Oncologia Ginecológica e Mastologia da Disciplina de
Ginecologia e Obstetrícia do Hospital Escola da UFTM
•
Laboratório da Disciplina de Farmacologia do Departamento de Ciências
Biológicas da UFTM
ii
CERTIFICADO DE APROVAÇÃO
TÍTULO: AVALIAÇÃO DE NEUTRÓFILOS CIRCULANTES EM PACIENTES COM
NEOPLASIA PRÈ-INVASIVA E INVASIVA DE COLO UTERINO
AUTOR: PAULO CESAR FERNANDES JUNIOR
ORIENTADORA: PROFª. DRª. BEATRIZ MARTINS TAVARES MURTA
CO-ORIENTADOR: PROF. DR. EDDIE FERNANDO CANDIDO MURTA
APROVADO COMO PARTE DAS EXIGÊNCIAS PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO
DE MESTRE EM PATOLOGIA (SUB-ÁREA PATOLOGIA GINECOLÓGICA E
OBSTÉTRICIA) PELA COMISSÃO EXAMINADORA:
PROFª. DRª. BEATRIZ MARTINS TAVARES MURTA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO – UFTM/UBERABA-MG
PROFª. DRª. WIRLA MARIA DA SILVA CUNHA TAMASHIRO
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS – UNICAMP-CAMPINAS-SP
PROFª. DRª. RENATA MARGARIDA ETCHEBEHERE
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO – UFTM/UBERABA
DATA DA REALIZAÇÃO: 02 DE AGOSTO DE 2006
_________________________________________
PRESIDENTE DA COMISSÃO EXAMINADORA
PROFª. DRª. BEATRIZ MARTINS TAVARES MURTA
- ORIENTADORA -
iii
Dedico Este Trabalho Especialmente:
Aos meus pais Paulo Cesar e Maria Emília,
Pelo apoio e, apesar da distância, pelo amor, cumplicidade, carinho...
Aos meus orientadores, Dra. Beatriz e Dr. Eddie, pela confiança e exemplos de
atuação profissional...
A Andréia, pelo seu amor, paciência e cumplicidade....
iv
AGRADECIMENTOS
À Professora Beatriz Martins Tavares Murta, pessoa ímpar na orientação e apoio
recebidos durante a realização deste trabalho. Ainda, pela atenção, amizade e
confiança dispensadas e, sobretudo, pela seriedade e profissionalismo que tanto
contribuíram para minha formação.
Ao Professor Eddie Fernando Candido Murta, pela co-orientação, pelo aprendizado
no contexto clínico e cirúrgico das pacientes participantes de nosso trabalho e pelo
exemplo como médico e professor pesquisador.
Às mulheres, pacientes e voluntárias, pela participação e especialmente, por
acreditarem na ciência e assim contribuir para o desenvolvimento deste trabalho.
Aos funcionários do Laboratório da Disciplina de Farmacologia, Januário Barbosa
dos Santos Júnior e Douglas Cobo Micheli, pelo auxílio na realização das técnicas e
no dia-a-dia no laboratório e, principalmente, pela amizade e dedicação.
Às secretárias da Disciplina de Farmacologia e da Disciplina de Ginecologia e
Obstetrícia, Beatriz Cibele Resende Gerolin, Kelly Cristina de Araújo Pantaleão e
Viviane Beatriz Rodrigues Matos, pelo auxílio em várias etapas deste trabalho, pelo
companheirismo, dedicação e grande amizade.
À professora Maria Angélica, por quem tenho um carinho muito especial, exemplo
daqueles que possuem o dom da arte de ensinar.
v
Aos colegas do curso de Pós-Graduação, em especial, Cristiana Bernadelli, pela
paciência, respeito e aprendizado.
Aos Professores do Curso de Pós-Graduação, pela oportunidade de conhecimento
nas mais diversas áreas da ciência.
À Universidade Federal do Triângulo Mineiro e Disciplinas de Ginecologia e
Obstetrícia e Farmacologia da UFTM, pela acolhida e pela estrutura que permitiu o
desenvolvimento da pesquisa.
vi
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS E PRANCHAS
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................21
1.1. Neoplasia de Colo Uterino – Aspectos Gerais e Fatores de Risco ...............21
1.2. Resposta Inflamatória ....................................................................................24
1.3. O Câncer e a Resposta Inflamatória ..............................................................28
2. HIPÓTESE ...........................................................................................................32
3. OBJETIVOS .........................................................................................................34
4. PACIENTES E MÉTODOS ..................................................................................36
4.1. Pacientes .......................................................................................................36
4.2. Tratamento ....................................................................................................37
4.3. Avaliação do Número de Neutrófilos Circulantes de Pacientes ....................38
4.4. Avaliação da Função Quimiotática e Fagocítica de Neutrófilos ....................38
4.4.1. Coleta de Sangue ......................................................................................38
4.4.2. Obtenção e Preparo dos Neutrófilos Circulantes .......................................39
4.4.3. Ensaio de Quimiotaxia ................................................................................40
4.4.4. Ensaio de Fagocitose .................................................................................46
4.5. Preparo de Meios de Cultura, Soluções, Reagentes e Drogas ......................49
4.5.1. Meios de Cultura e Soluções ....................................................................49
vii
4.5.2. Corantes e Reagentes ................................................................................50
4.5.3. Drogas e Citocinas .....................................................................................50
4.5.4. Zimosan ....................................................................................................51
4.6. Análise Estatística ........................................................................................51
5. RESULTADOS ....................................................................................................53
5.1. População de Estudo ....................................................................................53
5.2. Avaliação do Leucograma..............................................................................53
5.3. Avaliação da Função Quimiotática de Neutrófilos entre Controles e
Pacientes .......................................................................................................58
5.4. Avaliação da Função Quimiotática de acordo com o Estadiamento
Inicial e avançado ..........................................................................................61
5.5. Avaliação da Função Quimiotática nas Pacientes com Estadiamento
Inicial antes e após tratamento ......................................................................63
5.6. Avaliação da Função Fagocítica ...................................................................65
6. DISCUSSÃO .........................................................................................................68
7. CONCLUSÃO ......................................................................................................79
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................81
ANEXOS
viii
LISTA DE FIGURAS E PRANCHAS
Figura 1. Tipos de Câncer mais incidentes, estimados para 2006, exceto pele não
melanoma, na população brasileira ..................................................................... 22
Figura 2. Representação espacial das taxas brutas de incidência por 100.000
mulheres, estimadas para o ano de 2006, segundo a Unidade da Federação
(Neoplasia Maligna do Colo Uterino).................................................................... 22
Figura 3. Evento Celular da Inflamação .............................................................. 25
Figura 4. Separação de leucócitos a partir do sangue total contendo anticoagulante.
............................................................................................................................. 40
Figura 5. Microcâmara de quimiotaxia................................................................. 42
Figura 6. Curva Dose-Efeito do Número de Neutrófilos Emigrados .................... 45
Figura 7. Relação neutrófilo-linfócito (RNL) em pacientes com neoplasia de colo
uterino dos grupos NIC/MICRO e INV ................................................................. 55
Figura 8. Número absoluto de neutrófilos em pacientes com neoplasia de colo
uterino dos grupos NIC/MICRO e INV (Avaliação quantitativa) ........................... 56
Figura 9. Presença ou não de neutrofilia (n° absoluto de ne utrófilos >70% leucócitos
ix
totais) em pacientes com neoplasia de colo uterino dos grupos NIC/MICRO e INV
............................................................................................................................. 57
Figura 10. Presença ou não de neutrofilia (n° absoluto de neut rófilos >6.500/mm3)
em pacientes com neoplasia de colo uterino dos grupos NIC/MICRO e INV ...... 57
Figura 11. Quimiotaxia de neutrófilos nos grupos controle e de pacientes com
neoplasia de colo uterino em resposta ao RPMI e aos estímulos quimiotáticos
(10-7M) fMLP, LTB4, e IL-8.................................................................................... 59
Figura 12. Quimiotaxia de neutrófilos nos grupos controle e de pacientes com
neoplasia
de
colo
uterino
comparando-se
a
resposta
aos
quimioatraentes (10-7M) ..................................................................................... 60
Figura 13. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes do grupo NIC/MICRO e INV em
resposta ao RPMI e aos estímulos quimiotáticos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8. .... 61
Figura 14. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes dos grupos NIC/MICRO INV,
comparando-se a resposta aos estímulos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8. ................ 62
Figura 15. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes do grupo NIC/MICRO antes e
cerca de 30 dias após tratamento cirúrgico, em resposta ao RPMI e aos estímulos
(10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8 .................................................................................... 63
Figura 16. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes do grupo NIC/MICRO antes e
x
cerca de 30 dias após tratamento cirúrgico, comparando-se a resposta ao RPMI e
aos estímulos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8. ............................................................ 64
Figura 17. Índice fagocítico (IF) de controles e pacientes com neoplasia de colo
uterino e pacientes divididas em grupos NIC/MICRO e INV, de acordo com o
estadiamento ....................................................................................................... 65
Figura 18. Índice fagocítico do grupo NIC/MICRO nos tempos antes e cerca de 30
dias após tratamento cirúrgico.. ........................................................................... 66
Prancha 1. Neutrófilos purificados coloração de Rosenfeld. (Foto 1) quimiotaxia de
neutrófilos-10x-400-vezes.jpg);
(foto
2)
quimiotaxia
de
neutrófilos-50x-2000-
vezes.jpg; (foto 3) quimiotaxia de neutrófilos -100x-4000-vezes.jpg) ................. 43
Prancha 2. Neutrófilos purificados coloração de Rosenfeld. (Foto 1) fagocitose em
neutrófilos -10x-jpg.jpg; (foto 2) fagocitose em neutrófilos-100x-jpg.jpg; (foto 3)
fagocitose em neutrófilos -100x.-jpg.jpg .............................................................. 47
xi
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
BSA – soroalbumina bovina
°C – grau Celsius
CO2 – dióxido de carbono
FIGO – Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia
fMLP – formil-metil-leucil-fenilalanina
g – grama
GM-CSF – fator estimulador de colônia de granulócitos e monócitos
HE – Hospital Escola
HPV – papilomavírus humano
IF – índice fagocítico
IFN – interferon
IL – interleucina
INCA – Instituto Nacional do Câncer
l – litro
LT – leucotrieno
µl – microlitro
µm – micrômetro
M – molar
MCP – proteína quimiotática para monócitos
M-CSF – fator estimulador de colônia de monócitos
mg – miligrama
MHC – complexo de histocompatibilidade principal
min – minuto
MIP – proteína inflamatória de macrófagos
xii
ml – mililitro
n – número da amostra
NIC – neoplasia intraepitelial cervical
NK – natural killer
P.A. – para análise
PBS – solução salina tamponada com fosfato
pH – potencial hidrogeniônico
q.s.p. – quantidade suficiente para
RNL – relação neutrófilo-linfócito
TGF – fator de crescimento e transformação
TNF – fator de necrose tumoral
UFTM – Universidade Federal do Triângulo Mineiro
UI – Unidade internacional
x g – aceleração da gravidade
xiii
____________________________ RESUMO
Resumo
_____________________________________________________________
O câncer de colo uterino é o segundo tipo de câncer mais comum em
mulheres no mundo. No Brasil, o número de novos casos esperados para 2006 é de
19.260 (MS/INCA-2005). Uma vez que os neutrófilos apresentam atividade antitumoral e que funções de leucócitos circulantes podem estar alteradas em pacientes
com câncer de diferentes origens, nosso objetivo foi verificar se pacientes com
neoplasia de colo uterino, em diferentes estadiamentos, apresentam alterações no
número e/ou função quimiotática e fagocítica de neutrófilos circulantes e o efeito do
tratamento sobre esses parâmetros. Foram estudadas 21 mulheres sadias
voluntárias (Grupo Controle) e 23 pacientes, sendo 11 diagnosticadas como NIC alto
grau ou carcinoma microinvasivo (Grupo NIC/MICRO) e 12 como carcinoma invasivo
(Grupo INV) por meio de biópsia. De acordo com o estadiamento, as pacientes
foram submetidas à cirurgia (grupo NIC/MICRO) ou quimioterapia (grupo INV). O
leucograma das pacientes no momento do diagnóstico mostrou neutrofilia e aumento
da relação neutrófilo/linfócito (RNL) na maioria das pacientes em estadiamento
avançado, em oposto ao observado no grupo em estadiamento inicial. A quimiotaxia
de neutrófilos purificados do sangue periférico foi avaliada em microcâmara em
resposta aos estímulos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8 comparados a migração aleatória
(RPMI). As pacientes (Grupo total) apresentaram migração de neutrófilos frente aos
estímulos quimiotáticos, porém menor para LTB4 e IL-8 comparado ao grupo
controle (p<0,05). Ainda, foi observado que as pacientes do grupo INV tiveram
quimiotaxia reduzida a todos os estímulos quimiotáticos comparado ao grupo
NIC/MICRO (p<0,01). Após o tratamento cirúrgico (cerca de 30 dias), houve
aumento da migração dos neutrófilos em resposta aos estímulos fMLP e LTB4 em
pacientes do grupo NIC/MICRO (p<0,05). A função fagocítica foi avaliada utilizando
zimosan sensibilizado como partícula fagocítica e os resultados apresentados por
xv
Resumo
_____________________________________________________________
meio do índice fagocítico (IF). Não foi observada diferença no IF entre controles e
pacientes, porém, considerando o estadiamento, observou-se uma redução da
capacidade fagocítica em pacientes do grupo INV comparado ao grupo NIC/MICRO
(p=0,015). Após o tratamento cirúrgico, não foi observada variação estatisticamente
significante quanto ao IF em pacientes do grupo NIC/MICRO (n=6). Conclui-se que o
estadiamento mais avançado no câncer cervical é fator determinante para o
aumento do número de neutrófilos circulantes e a redução da função dessas células.
A retirada da lesão aumentou a capacidade de migração dos neutrófilos frente aos
estímulos quimiotáticos, sugerindo a produção de mediadores inibitórios circulantes
pelas células tumorais. A neoplasia de colo uterino mesmo em estadiamento préinvasivo pode ser considerada como uma doença com repercussões sistêmicas.
Palavras-chave: neoplasia de colo uterino; estadiamento; neutrófilos; função celular.
xvi
__________________________ ABSTRACT
Abstract
_____________________________________________________________
Cervical cancer is the second most common type of cancer in women
worldwide. In Brazil, the number of new cases awaited for 2006 is 19.260 (MS/INCA2005). Considering that neutrophils may present anti-tumor activity and that sistemic
leucocyte functions can be altered in cancer patients, our aim was to verify if patients
with cervical neoplasia, at different tumor stage, present alterations in the number
and/or chemotactic and phagocytic function of circulating neutrophils and the effect of
treatment on these parameters. It was enrolled twenty one healthy women (Control
Group) and 23 patients, being 11 diagnosed as cervical intraepithelial neoplasia
grade III or microinvasive carcinoma (NIC/MICRO Group) and 12 as invasive
carcinoma (INV Group) through biopsy. According to tumor stage, patients were
submitted to surgery (NIC/MICRO Group) or chemotherapy (group INV). Leucogram
of patients upon diagnosis showed neutrofilia and increased neutrophil/lymphocyte
ratio in most patients of advanced tumor stage (INV Group), in opposite to results
found in patients at early stage group (NIC/MICRO Group). The chemotactic activity
of blood peripheral neutrophils was evaluated in microchemotaxis chamber assay
towards the chemotactic stimuli (10-7M) fMLP, LTB4 and IL-8, compared to random
migration (RPMI). Total patient group had significant neutrophil migration in response
to the chemotactic stimuli, however lesser for LTB4 and IL-8 compared to controls
(p<0,05). Moreover, it was observed that patients from INV group had reduced
neutrophil migration to all the chemotactic stimuli compared with NIC/MICRO group
(p<0,01). After surgical treatment (around 30 days) neutrophil migration was increase
towards fMLP and LTB4 in patients of NIC/MICRO group (p<0,05). Phagocytic
function was evaluated using sensitized zimosan as phagocytic particle, and the
results were presented as the phagocytic index (IF). It was not observed differences
xviii
Abstract
_____________________________________________________________
in IF between controls and patients. However considering tumor stage, a reduction of
phagocytic activity was observed in patients of INV group compared to NIC/MICRO
group (p=0,015). After surgical treatment in pacients of NIC/MICRO group (n=6) no
significant differences were observed compared to time upon diagnosis. It can be
concluded that advanced tumor stage in cervical cancer is a determinant factor for
the increase in the number of circulating neutrophils and reduction in the function of
these cells. The withdrawal of neoplasia cells increased the capacity of neutrophil
migration suggesting the production of circulating mediators by tumor cells. Cervical
cancer, even at initial stages, can be seen as an illness with systemic findings.
Keywords: cervical cancer; neutrophil; tumor stage; cellular function.
xix
_______________________ INTRODUÇÃO
Introdução _______________________________________________________________ 21
1. INTRODUÇÃO
1.1. Neoplasia de Colo Uterino – Aspectos Gerais e Fatores de Risco
O câncer de colo uterino destaca-se dos demais tumores malignos do trato
genital feminino pela maior freqüência e por levar a óbito, grande número de
mulheres em idade ainda jovem (GUSBERG; RUNOWICZ, 1991). Em 2006, estimase o aparecimento de 237.480 novos casos de câncer não especificados em
mulheres. Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), espera-se, para o ano de
2006, cerca de 20.000 novos casos de câncer do colo uterino (Figura 1). Na região
sudeste, existe uma estimativa de 7.970 novos casos de câncer de colo de útero
para este ano, sendo que, no Rio Grande do Sul, se observa a maior incidência por
100.000 mulheres, estimadas para o ano de 2006 (30,9) (Figura 2).
Dentre os fatores de risco para o desenvolvimento do câncer de colo uterino,
destaca-se a infecção pelo papilomavírus humano (HPV), pois, em 99,7% das
neoplasias invasivas do colo uterino, é detectado DNA do HPV (PEREYRA;
PARELLADA, 2003).
Introdução _______________________________________________________________ 22
Figura 1: Tipos de câncer mais incidentes, estimados para 2006, exceto pele não melanoma, na
população brasileira. Fonte: MS/INCA 2005.
Fonte: MS/INCA-2005
Figura 2: Representação espacial das taxas brutas de incidência de neoplasia maligna do
colo uterino por 100.000 mulheres, estimadas para o ano de 2006, segundo a
Unidade da Federação.
Introdução _______________________________________________________________ 23
Segundo um estudo controlado, o fator mais convincente relacionado com o risco de
câncer do colo do útero foi a presença dos tipos de HPV 16, 18, 31 e 33 (ELUFNETO et al., 1994).
Além do HPV, outros fatores de risco são identificados para o câncer de colo
de útero, tais como: baixas condições sócio-econômicas, início precoce da atividade
sexual, multiplicidade de parceiros, idade precoce do primeiro parto, tabagismo
(diretamente relacionado à quantidade de cigarros fumados), higiene íntima
inadequada e uso prolongado de contraceptivos orais. A prevenção primária do
câncer do colo de útero pode ser realizada por meio do uso de preservativos durante
a relação sexual, uma vez que a prática de sexo seguro é uma das formas de evitar
o contágio pelo HPV (MS/INCA, 2006).
A principal estratégia utilizada para detecção precoce da doença (prevenção
secundária), no Brasil, é pela realização do exame de Papanicolaou. Este teste,
combinado com o teste de HPV colhido por profissional de saúde, mostrou ser a
estratégia mais efetiva (maior número de casos detectados) para a detecção
precoce da neoplasia de colo uterino, em um estudo de custo-efetividade realizado
pelo INCA. Porém, pelo seu alto custo, torna-se incompatível com a realidade
brasileira (INCA, 2006).
A transformação maligna do epitélio do colo uterino, normalmente, é um
processo lento, que passa pelos estádios (facultativo) de displasia e carcinoma in
situ (neoplasia intraepitelial cervical, NIC I-III) até o carcinoma invasivo. A maioria
das neoplasias cervicais invasivas (90-95%) deriva do epitélio escamoso; 2-8% do
epitélio colunar. Por definição, a neoplasia intraepitelial cervical (NIC) é pré-invasiva
e limitada ao epitélio. Existem três estádios de desenvolvimento. O primeiro é a
Introdução _______________________________________________________________ 24
transição de NICII a NICIII, quando a possibilidade de reversão da displasia é menor.
O segundo é o início do crescimento invasivo (estádio IA1) com invasão estromal
microscópica inferior a 5 mm de profundidade e 7 mm de largura do estroma cervical
subjacente. A terceira é a transformação de microcarcinoma (estádio IA1) para
doença franca (estádio IB), invadindo além do útero, mas não a parede pélvica ou o
terço inferior da vagina, quando a lesão desenvolve potencial metastático
(SELLORS; SANKARANARAYANAN, 2003).
Em fases muito precoces da invasão do estroma, a neoplasia do colo uterino
pode não dar origem a sintomas manifestos ou características clínicas e, portanto, é
conhecida como doença invasiva pré-clínica. O câncer cervical (estádio IB-IV), com
freqüência,
apresenta
um
ou
mais
dos
seguintes
sintomas:
hemorragia
intermenstrual, hemorragia pós-coito, fluxos menstruais mais intensos, corrimento
seroso purulento excessivo, corrimento de odor fétido, cistite recorrente, urgência
miccional e aumento da freqüência urinária, dor nas costas e dor abdominal no
quadrante inferior. Em estádios avançados, as pacientes podem apresentar falta de
ar devido à anemia grave, uropatia obstrutiva, edema de membros inferiores,
hematúria, obstrução intestinal e caquexia (SELLORS; SANKARANARAYANAN,
2003).
1.2. Resposta Inflamatória
A inflamação é uma resposta do organismo a diversos agentes lesivos, como,
por exemplo, microorganismos, queimaduras, trauma físico ou células tumorais
(DEJANA, CORADA; LAMPUGNANI, 1995).
Introdução _______________________________________________________________ 25
Os neutrófilos, também denominados leucócitos polimorfonucleares, graças
aos seus núcleos morfologicamente diferenciados e multilobulados, são os mais
numerosos dentre os granulócitos presentes no sangue periférico. Estas células
respondem rapidamente aos estímulos quimiotáticos, realizam funções fagocitárias e
são a população celular principal na resposta inflamatória (ABBAS; LICHTMAN;
POBER, 1995). Após sua migração, os neutrófilos são ainda capazes de liberar mais
mediadores, o que promove a amplificação da resposta inflamatória (HEIT et al.,
2002). O recrutamento de neutrófilos para o local da inflamação envolve uma
seqüência de eventos (ativação, rolamento, adesão e transmigração), coordenada
por moléculas de adesão expressas na superfície dos leucócitos e das células
=
=
Corrente
sangüínea
Óxido
Nítrico
=
= =
= =
TNF-α
α
IL-8
=
=
=
=
=
=
=
=
endoteliais, envolvidas na interação leucócito-endotélio (Figura 3).
Atividade
microbicida
=
=
=Quimiotaxia
=
TGF-β
β
IL-10
Tecido
=
Endotélio
Fagocitose
Macrófagos
Modificado de Holgate ST, Church MK, Lichtenstein LM. — Allergy. 2end edition. London: Mosby
Figura 3: Evento Celular da Inflamação
O início do rolamento dos neutrófilos é mediado pela ligação reversível das
glicoproteinas selectinas encontradas tanto no neutrófilo como no endotélio
(SPERTINI et al., 1991; KADONO et al., 2002). Devido à expressão de outras
glicoproteínas na superfície dos leucócitos, denominadas de integrinas, que
Introdução _______________________________________________________________ 26
reconhecem moléculas de adesão endoteliais (família das imunoglobulinas), ocorre a
ligação de alta afinidade dos leucócitos ao endotélio. A Mac-1 é reconhecida como a
integrina mais relevante na maioria dos modelos de resposta inflamatória com
participação de neutrófilos, com sítios de ligação específicos nas células endoteliais
(WAGNER; ROTH, 1999). Entre as células endoteliais, ocorre a transmigração do
neutrófilo, que, para chegar ao local de injúria tecidual, se move em direção ao
gradiente quimiotático representado por um excesso de mediadores (DITTMAR et
al., 2000).
A migração celular é um evento chave na resposta inflamatória de qualquer
etiologia. Os leucócitos circulantes migram em resposta aos mediadores
inflamatórios liberados no sítio de lesão, como os componentes do sistema
complemento (C5a), os produtos derivados da via das lipooxigenases (LTB4) e as
quimiocinas
(COUSSENS;
WERB,
2002).
Grande
parte
destes
agentes
quimiotáticos, IL-8, fMLP, LTB4 e C5a, ligam-se aos neutrófilos por receptores
transmembrana específicos. Estes receptores ativam as proteínas G triméricas, nos
neutrófilos, iniciando, deste modo, a sinalização que permitirá a essas células
migrarem para os sítios inflamatórios. As quimiocinas, subdivididas em quatro
famílias (CXC, CC, C e CX3C), de acordo com a seqüência de resíduos de cisteína,
podem controlar a evolução natural da resposta inflamatória, recrutando células
efetoras específicas. Desta forma, a contínua produção de citocinas no sítio
inflamatório torna-se importante para o desenvolvimento de uma doença crônica,
incluindo uma neoplasia (WAHL; KLEINMAN, 1998).
Sabe-se que, para manter outras funções importantes dos leucócitos, como a
fagocitose e atividade microbicida, é essencial que sua função quimiotática esteja
preservada (MacFADDEN, SAITO; PRUZANSKI, 1985). Em pacientes com sepse
Introdução _______________________________________________________________ 27
observa-se redução da função quimiotática de neutrófilos comparado a voluntários
sadios, maior no grupo de pacientes não sobreviventes, sugerindo que essa
disfunção contribui para o prognóstico da doença (TAVARES-MURTA et al., 2002).
Em doenças infecciosas, o papel de neutrófilos como células de defesa é bem
documentado. Em pacientes com AIDS, as drogas antiretrovirais aumentam a
quimiotaxia de neutrófilos e monócitos e reduzem a incidência de infecções
(MASTROIANNI et al.,1999).
A fagocitose é um evento celular complexo no qual partículas são
reconhecidas, internalizadas e eliminadas. Consistindo na primeira linha de defesa
do organismo na remoção de microorganismos, esse processo envolve o
reconhecimento de antígenos por receptores de superfície nas células fagocíticas,
iniciando a polimerização e a internalização de partículas externas ou organismos no
fagossomo (ALLEN; ADEREM, 1996). Além de microorganismos, a remoção de
células em apoptose ocorre por fagocitose (FRANK, WHITE; EZEKOWITZ, 1999).
Na superfície do fagócito, são expressos vários receptores capazes de reconhecer e
decodificar seus ligantes cognatos, presentes na superfície de agentes infecciosos e
células apoptóticas, e desencadear o englobamento (STUART; EZEKOWITZ, 2005).
Neste processo, ocorre interação de receptores de membrana com moléculas
específicas ligantes, localizadas na superfície de partículas. O complexo ligantereceptor estimula a reorganização local do citoesqueleto de actina submembranosa,
que provê força para a internalização das partículas (KWIATKOWSKA; SOBOTA,
1999). A fagocitose é seguida pela fusão do fagossomo com lisossomos contendo
enzimas digestivas, formando o fagolisossomo, seguindo-se a degradação da
partícula. O remodelamento e a homeostase do número de células são outras
funções para as quais a fogocitose foi adaptada. Desta forma, o excesso de células
Introdução _______________________________________________________________ 28
ou células danificadas, removidas durante o desenvolvimento, está diretamente
relacionado com a apoptose ou morte programada de células (STUART;
EZEKOWITZ, 2005).
1.3. O Câncer e a Resposta Inflamatória
Os tumores malignos, ou câncer, crescem de modo descontrolado, invadem
os tecidos normais e, freqüentemente, desencadeiam metástases e crescem em
sítios distantes do tecido de origem. O câncer pode surgir, a partir de quase todos os
tecidos do organismo. Os derivados de células epiteliais, denominados carcinomas,
são os tipos mais comuns. Sarcomas são tumores malignos dos tecidos
mesenquimatosos surgindo a partir de células como fibroblastos, células musculares
e adiposas. A presença de infiltrados de células mononucleares, compostos de
linfócitos T, células NK e macrófagos circundando diversos tumores, assim como o
achado freqüente de proliferação linfocitária (hiperplasia) nos linfonodos de
drenagem dos sítios de crescimento tumoral sugere que os tumores podem ser
imunogênicos. Uma função fundamental do sistema imune é o reconhecimento e a
destruição de células malignas denominadas “clones mutantes”, antes que elas
cresçam e originem tumores. Vários tipos de antígenos tumorais estudados são
compartilhados por diferentes tumores, sendo denominados antígenos associados a
tumor, podendo ser encontrados em células tumorais e em células normais (ABBAS;
LICHTMAN; POBER, 1995).
Os macrófagos são células potencialmente importantes da imunidade antitumoral, pois são capazes de lisar, preferencialmente, as células tumorais e não as
células normais. Na resposta imune contra o HPV, tanto na região cervical como na
Introdução _______________________________________________________________ 29
circulação periférica, o ambiente pode tornar-se favorável à transformação de
neoplasias, o que permite a progressão de lesões intraepiteliais cervicais para
carcinoma cervical (AHMED et al., 2002). A imunidade local é considerada fator
importante no desenvolvimento do carcinoma cervical. Em tecidos tumorais,
encontra-se infiltrado de leucócitos no próprio estroma (NEGUS et al., 1997) e nos
líquidos neoplasicos (MONTOVANI et al., 1997).
Vários estudos têm demonstrado que as citocinas podem modular o
desenvolvimento tumoral (SRIVANI; NAGARAJAN, 2003). Síntese de RNAm para IL1α, IL-1β, IL-6, IL-8 e proteína quimiotática para macrófago (MCP-1) foi detectada
em diversas linhagens de células de carcinoma cervical (HAZELBAG et al; 2001).
Acredita-se que os neutrófilos ativados pela IL-8 tenham papel tumoricida
(SCHROEDER et al., 1990), além de produzir mediadores capazes de reduzir o
crescimento tumoral (LLOYI., OPPENHEIN, 1992). Por outro lado, a IL-8 pode
promover a migração de células tumorais (WANG et al., 1990) e, em associação
com os fatores de crescimento de endotélio vascular (VEGF) e derivado de
plaquetas (PDGF), produzido por células malignas ou pelo estroma, participar na
angiogênese do carcinoma cervical (FUJIMOTO et al., 2000). Em pacientes com
câncer de mama, foi demonstrada, já no sítio tumoral, a correlação positiva entre o
número de macrófagos infiltrantes, grau de vascularização e prognóstico da doença
(LEEK et al,. 1996).
Sabe-se que, no infiltrado de células inflamatórias tumorais, macrófagos e
neutrófilos desenvolvem papel importante na progressão e disseminação de vários
tipos de tumores (BALKWILL; MONTOVANI, 2001; COUSSENS; WERB, 2002).
Funções celulares podem estar alteradas em pacientes com câncer de diferentes
origens, já no momento do diagnóstico (LUKAC et al., 1994; GEBHARD et al., 2000).
Introdução _______________________________________________________________ 30
Além disso, durante o tratamento, as drogas quimioterápicas podem alterar funções
de leucócitos circulantes (HUMPHREYS et al., 1993, MENDONÇA et al., 2006).
Dependente do sistema citotóxico clássico, o efeito anti-tumoral dos
neutrófilos têm sido sugerido como um importante mecanismo na depuração de
células tumorais (KOGA et al., 2004). Uma vez que os neutrófilos podem exercer
atividade anti-tumoral por meio de diferentes mecanismos (KIM et al., 2000), o
conhecimento de alterações de funções de leucócitos, em determinadas doenças
,possibilita a correção farmacológica desses defeitos, o que pode ser benéfico para
o prognóstico da doença.
______________________________________________________
HIPÓTESE
Hipótese ________________________________________________________________ 32
2. HIPÓTESE
Pacientes com neoplasia de colo uterino devem apresentar alterações no
número e funções de neutrófilos, variáveis de acordo com o estadiamento do tumor.
___________________________________________________
OBJETIVOS
Objetivos ________________________________________________________________ 34
3. OBJETIVOS
3.1. Verificar se ocorrem alterações no número e/ou na função quimiotática e
fagocítica de neutrófilos circulantes em pacientes com neoplasia de colo
uterino, em estadiamento inicial ou avançado da doença, antes do início de
qualquer tratamento.
3.2. Verificar o efeito do tratamento sobre os parâmetros acima descritos.
__________________________
PACIENTES E MÉTODOS
Pacientes e Métodos _______________________________________________________ 36
4. PACIENTES E MÉTODOS
4.1. Pacientes
Foram estudadas pacientes com neoplasia de colo uterino, independente do
estadiamento, não submetidas a tratamento anterior, atendidas no Ambulatório de
Oncologia Ginecológica do Hospital Escola da Universidade Federal do Triângulo
Mineiro (HE/UFTM). O diagnóstico foi realizado por meio de história, exame clínico
e ginecológico - incluindo toque retal para a avaliação de paramétrios, citologia
oncótica, colposcopia e biópsia de colo uterino. O diagnóstico citopatológico seguiu
a classificação de BETHESDA (KURMAN; SOLOMON, 1994) e a de Richart (1990)
(SILVEIRA; PESSINI, 2000), sendo as lâminas avaliadas pelos citopatologistas da
instituição (HE-UFTM). As análises das biópsias guiadas por colposcopia foram
efetuadas pelo serviço de Patologia Cirúrgica do HE-UFTM.
Para estadiamento e avaliação pré-tratamento, foram utilizados Raio X de
tórax; eletrocardiograma; ultrassonografia de abdome total e pélvico; tomografia
computadorizada de abdome total e tórax; rotina de sangue, incluindo hemograma,
eletrólitos, uréia, creatinina, transaminases, bilirrubina (total e frações), glicemia de
jejum, proteínas (total e frações), urina I e urocultura com antibiograma.
Foram considerados critérios de exclusão, as pacientes submetidas a
tratamento anterior ou em estado de imunossupressão (diagnóstico de doença
imunossupressora ou uso de medicamentos).
As pacientes avaliadas tiveram diagnóstico de NIC (grupo NIC), carcinoma
Pacientes e Métodos _______________________________________________________ 37
microinvasivo (grupo MICRO) ou carcinoma invasivo (grupo INV). Posteriormente,
foram agrupadas em estadiamento inicial (grupo NIC/MICRO) ou avançado (grupo
INV).
Os controles foram mulheres adultas (≥ 18 anos) voluntárias sadias, isto é,
sem doença diagnosticada, sem uso de medicamentos imunossupressores, e com
citologia cervicovaginal normal nos últimos 12 meses, abordadas quando da
realização dos experimentos.
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres
Humanos em 19 de dezembro de 2003 (Protocolo número 445). O “Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido para Participação em Pesquisa” (Anexo J) foi
lido e assinado pelas participantes ou seu responsável, quando de acordo em
participar da pesquisa.
4.2. Tratamento
Conforme o estadiamento, as pacientes foram submetidas a tratamento
cirúrgico (grupo NIC e MICRO) ou quimioterapia (grupo INV). O tratamento cirúrgico
consistiu de um dos seguintes procedimentos: 1) conização: procedimento
diagnóstico, mas que, em muitos casos, promove uma terapia definitiva, descrito
como sendo a retirada de um cone de tecido do colo uterino contendo toda a lesão;
2) histerectomia simples: retirada do útero; 3) cirurgia de Wertheim-Meigs: remoção
do útero, ovários, tubas uterinas, paramétrios, linfadenectomia pélvica.
O tratamento quimioterápico foi realizado com cisplatina (100 mg/m2) em
infusão intravenosa, durante 2 h no primeiro dia (D1), associada ao 5-fluorouracil (5-
Pacientes e Métodos _______________________________________________________ 38
FU, 1000 mg/m2 por dia) em infusão contínua do primeiro ao quinto dia (D1 a D5). O
intervalo entre os ciclos foi cerca de 21 dias.
Nas pacientes submetidas ao tratamento cirúrgico, foi efetuada uma segunda
coleta de sangue, cerca de 30 dias após a cirurgia, para nova avaliação.
4.3. Avaliação do Número de Neutrófilos Circulantes de Pacientes
Em todas as pacientes, foi realizado o leucograma no diagnóstico, como parte
da rotina de avaliação pré-tratamento. Mediante este exame, foram avaliados os
seguintes parâmetros: 1) Relação neutrófilo/linfócito (RNL), que é a divisão entre
número absoluto de neutrófilos e linfócitos. A RNL foi calculada para cada paciente e
determinada se <5 ou ≥5 (WALSH et al., 2005). 2) Presença ou não de neutrofilia,
definida como número de neutrófilos absolutos >6.500/mm3 ou ≥70% do número de
leucócitos totais, de acordo com o critério do laboratório no qual foi efetivado o
exame (Laboratório de Patologia Clínica HE-UFTM).
4.4. Avaliação da Função Quimiotática e Fagocítica de Neutrófilos
Circulantes
4.4.1. Coleta de Sangue
As amostras de sangue foram coletadas em 2 tempos: 1) no diagnóstico,
antes de qualquer tratamento; 2) cerca de 30 dias após o tratamento cirúrgico. A
coleta foi feita utilizando material descartável e esterilizado, seguindo os princípios
de assepsia. Em cada tempo, foi coletada 1 amostra de sangue (5 ml) em tubo
Pacientes e Métodos _______________________________________________________ 39
contendo anti-coagulante (heparina 100 UI/ml), empregada para o ensaio de
quimiotaxia e fagocitose de neutrófilos. O mesmo procedimento foi realizado para a
coleta de sangue das mulheres voluntárias sadias, em um único tempo.
4.4.2. Obtenção e Preparo dos Neutrófilos Circulantes
Os neutrófilos presentes no sangue venoso coletado de pacientes e controles
foram isoladas pelo meio Histopaque (densidade 1,119), utilizado de acordo com as
instruções do fabricante (Sigma Chemical, St. Louis, MO). O sangue coletado foi
adicionado a um tubo contendo Histopaque, na proporção de 5,0 ml sangue/4,5 ml
Histopaque. Os tubos foram centrifugados (150 x g), em temperatura ambiente, até a
completa separação das bandas celulares (Figura 4). A camada de neutrófilos foi
coletada com o auxílio de micropipeta, e, a seguir, as células foram lavadas com
meio de cultura RPMI-1640 (Sigma Chemical, St. Louis, MO) contendo soroalbumina
bovina (BSA) 0,01%, por meio de centrifugação (150 x g, 10 min, temperatura
ambiente), procedimento que foi repetido outras duas vezes. Logo após, as células
foram ressuspensas em 1,0 ml do mesmo meio.
Pacientes e Métodos _______________________________________________________ 40
A
B
PLASMA
MONUCLEARES
NEUTRÓFILOS
HISTOPAQUE
HEMÁCIAS
Figura 4: Separação de leucócitos a partir do sangue total contendo anticoagulante. A) Tubos de centrífuga mostrando as camadas das
subpopulações de leucócitos isolados. B) Esquema demonstrativo da
purificação de neutrófilos.
Foi realizada a contagem total e diferencial das células purificadas. Para a
contagem total, 20 µl da solução de células foram adicionados à solução de Turk
(400 µl), e as células foram contadas em câmara de Neubauer. A contagem
diferencial foi feita em lâmina preparada com 20 µl da solução de células em
citocentrífuga (150 x g, 5 min, Cito-Spin). A lâmina foi corada (corante de Rosenfeld)
e observada em microscópio de luz com objetiva em óleo de imersão (100x). Foram
contadas 100 células, diferenciando-se os tipos celulares – mononucleares,
neutrófilos, eosinófilos e basófilos. Uma solução final de neutrófilos foi preparada
contendo 1,0 x 106 neutrófilos/ml RPMI-BSA.
4.4.3. Ensaio de Quimiotaxia
A quimiotaxia foi efetuada em microcâmara de 48 poços (Neuro Probe, Cabin
John, MD), separados por membrana de policarbonato com poros de 5 µm de
Pacientes e Métodos _______________________________________________________ 41
diâmetro (Figura 5). Na câmara inferior, foram colocados 28,5 µl do meio de cultura
RPMI-BSA 0,01% (controle) ou de um dos estímulos quimiotáticos: fMLP, LTB4 ou
IL-8, diluídos em RPMI-BSA. Uma solução (50 µl) de células purificadas (1,0 x 106
células/ml) foi colocada na câmara superior. O ensaio foi feito em triplicata para cada
uma das amostras (paciente e controle). As câmaras foram incubadas por 60 min, a
37ºC e 5% CO2. Em seguida, a membrana de policarbonato foi removida, fixada e
corada (kit de coloração Hema 3 Stain set, Biochemical Sciences, Bridgeport, NJ).
O número de células emigradas para a parte inferior do filtro foi contado
(objetiva 100x) em 10 campos aleatórios (Prancha 1). Os resultados foram
expressos com base no número de neutrófilos por campo. As células que migraram
em direção aos estímulos quimiotáticos foram consideradas como migração
direcionada, e as células que migraram em direção ao RPMI foram caracterizadas
como de controle (migração randomizada ou aleatória).
Foi realizado um ensaio inicial para avaliar o grau de migração de neutrófilos
induzida por diferentes concentrações dos estímulos quimiotáticos fMLP, LTB4 ou IL8. Para isso, foram utilizados neutrófilos obtidos de voluntárias sadias e foi
quantificada a resposta quimiotática de neutrófilos frente a diferentes concentrações
(10-8, 10-7 e 10-6 M) das substâncias quimioatraentes. A Figura 6 mostra o número
de neutrófilos emigrados em resposta ao fMLP, LTB4 e IL-8, sendo que a
concentração de 10-7 M, que promoveu efeito máximo, foi selecionada para uso nos
demais experimentos.
Pacientes e Métodos _______________________________________________________ 42
50 µl de neutrófilos
Membrana de policarbonato
28,5 µl de RPMI ou estímulos
(fMLP, LTB4 e IL-8, 10-7M)
Figura 5: Microcâmara de quimiotaxia: os
6
neutrófilos (10 células/ml) foram colocados
na câmara superior e os estímulos
-7
quimiotáticos (10 M) fMLP, LTB4 e IL-8 na
câmara inferior.
Pacientes e Métodos _______________________________________________________ 43
Prancha 1
1
2
3
Pacientes e Métodos _______________________________________________________ 44
Prancha 1
Foto 1. QUIMIOTAXIA DE NEUTRÓFILOS-10X-400-VEZES.jpg
Foto 2. QUIMIOTAXIA DE NEUTRÓFILOS-50X-2000-VEZES.jpg
Foto 3. QUIMIOTAXIA DE NEUTRÓFILOS -100X-4000-VEZES.jpg
Neutrófilos purificados coloração de Rosenfeld.
Microscópio KS-300, Laboratório de Patologia Geral, UFTM.
N° DE NEUTRÓFILOS / CAM P O
Pacientes e Métodos _______________________________________________________ 45
60
50
40
30
20
10
0
RPMI
10 -8
10 -7
10 -6
N° DE NEUTRÓFILOS / CAM PO
ffMLP
M LP (M
)
(M)
50
40
30
20
10
0
RPMI
10 -8
10 -7
10 -6
LTB
N° DE NEUTRÓFILOS / CAM P O
4
LTB4 (M)
60
50
40
30
20
10
0
RPMI
10 -8
10 -7
10 -6
IL-8 (M)
Figura 6. Curva Dose-Efeito do Número de
Neutrófilos Emigrados. As barras indicam a
migração de neutrófilos, obtidos de voluntárias,
-6
em resposta a diferentes concentrações (10 ,
-7
-8
10 ou 10 M) de fMLP, LTB4 ou IL-8. O meio
de cultura RPMI foi utilizado como controle.
*p<0,01, **p<0,001 comparado ao RPMI
(ANOVA + Teste de Bonferroni).
Pacientes e Métodos _______________________________________________________ 46
4.4.4. Ensaio de Fagocitose
Para o ensaio de fagocitose, os neutrófilos purificados foram utilizados na
concentração de 2,0 x 106/ml, e o zimosan sensibilizado (com plasma normal fresco
a 10%) foi utilizado como partícula fagocítica. As partículas de zimosan foram
pesadas e diluídas em PBS (1,0 ml). Desta suspensão, foram pipetados 10 µl e
colocados em 1,0 ml de plasma (10%) e incubados (37ºC, 5% CO2) sob agitação
para sensibilização das partículas. Esta mistura foi centrifugada (150 x g, 10 min) e
adicionada sobre o concentrado de células (1,0 ml). A solução de células e
partículas foi incubada durante 60 min (37ºC, 5% CO2), e, após esse tempo, as
células foram citocentrifugadas e coradas. Foram contadas 100 células em cada
lâmina, com e sem fagocitose, como também o número de partículas fagocitadas
(Prancha 2). Os resultados foram expressos por meio do Índice Fagocítico (IF):
IF = % neutrófilos em fagocitose x número médio de partículas fagocitadas
Pacientes e Métodos _______________________________________________________ 47
Prancha 2
1
2
3
Pacientes e Métodos _______________________________________________________ 48
Prancha 2
Foto 1. FAGOCITOSE EM NEUTRÓFILOS -10x-jpg.jpg
Foto 2. FAGOCITOSE EM NEUTRÓFILOS-100x-jpg.jpg
Foto 3. FAGOCITOSE EM NEUTRÓFILOS -100X.-jpg.jpg
Neutrófilos purificados coloração de Rosenfeld.
Microscópio KS-300, Laboratório de Patologia Geral, UFTM.
Pacientes e Métodos _______________________________________________________ 49
4.5. Preparo de Meios de Cultura, Soluções, Reagentes e Drogas
4.5.1. Meios de Cultura e Soluções
a) Meio de cultura RPMI-1640 simples, com glutamina, sem bicarbonato de
sódio:
RPMI 1640 (Sigma)
10,4 g
Bicarbonato do sódio (Merck)
2,2 g
Água bidestilada e deionizada q.s.p.
1,0 l
O pH do meio foi acertado para 7,45 e a solução foi filtrada (filtros de Milipore
0,22 µm) e armazenada em geladeira antes do uso.
b) Meio de cultura RPMI-1640 contendo BSA 0,01%:
O meio de cultura foi preparado conforme descrito no item a, acrescido de
BSA fração V (Sigma), na concentração de 0,01g/100 ml, imediatamente antes do
uso, e esterilizado por filtros Milipore 0,22 µm antes do uso.
c) Solução salina tamponada com fosfato (PBS):
Cloreto de sódio P.A. (Merck)
80,0 g
Cloreto de potássio P.A. (Merck)
2,0 g
Fosfato de sódio dibásico P.A. (Merck)
11,5 g
Fosfato de potássio monobásico P.A. (Merck)
2,0 g
Água bidestilada e deionizada q.s.p.
1,0 l
O pH da solução final foi acertado para 7,45 com NaOH 0,1 N, e a solução
autoclavada (127°C) antes do uso.
Pacientes e Métodos _______________________________________________________ 50
4.5.2. Corantes e Reagentes
a) Corante pancrômico de Rosenfeld
Giemsa-azul-eosina-azul de metileno
97 mg
May-Grunwald-eosina-azul de metileno
53 mg
Metanol (Merck)
100 ml
Após o preparo, o corante foi filtrado e estocado em temperatura ambiente.
b) Solução de Turk
Ácido acético glacial P.A. (Merck)
20,0 ml
Azul de metileno (Merck)
0,5 g
Água bidestilada e deionizada q.s.p.
1,0 l
c) Azul de Tripan
Azul de Tripan (Reagen)
100 mg
PBS q.s.p.
100 ml
4.5.3. Drogas e Citocinas
a) fMLP (Sigma): a solução-mãe foi preparada na concentração de 5mg/ml,
diluída em 10% de DMSO (dimetil sulfóxido, Sigma) e água estéril. A solução
utilizada nos experimentos foi, a seguir, diluída em RPMI-BSA.
b) LTB4 ou IL-8 (Sigma): foram diluídos em RPMI-BSA para obter a
concentração empregada.
Pacientes e Métodos _______________________________________________________ 51
4.5.4. Zimosan
Partículas de zimosan, na concentração de 5,0 mg/ml, foram diluídas em 1,0 ml
de PBS e estocadas em geladeira antes do uso.
4.6. Análise Estatística
Os resultados foram avaliados mediante o programa SigmaStat 2.0 e
apresentaram distribuição não paramétrica. As diferenças entre dois grupos e três ou
mais grupos não pareados foram comparadas por meio do teste de Mann-Whitney e
teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Dunn, respectivamente. Diferenças
entre dois grupos pareados (pré e pós-tratamento) foram comparadas por meio do
teste de Wilcoxon. Os resultados foram expressos por medianas e percentis, valores
mínimo e máximo.
A significância estatística foi estabelecida em p<0,05.
______________________________________________
RESULTADOS
Resultados _______________________________________________________________ 53
5. RESULTADOS
5.1. População de Estudo
Foram avaliadas 23 pacientes com neoplasia de colo uterino, registrando
idade (média ± DP) de 47,8 ± 13,8 anos, sendo a média menor no grupo
apresentando estadiamento inicial (42 ± 12 anos) e maior no grupo com diagnóstico
de estádio mais avançado (53 ± 14 anos), porém sem diferenças estatisticamente
significativas. Os controles foram 21 mulheres adultas, voluntárias, na faixa etária de
34,9 ± 9,5 anos. Dentre as pacientes, 11 tiveram diagnóstico de NIC e/ou carcinoma
microinvasivo e 12 apresentaram carcinoma invasivo.
5.2. Avaliação do Leucograma
A análise deste exame, no momento do diagnóstico, mostrou que apenas
uma (10%) paciente do grupo NIC/MICRO apresentou RNL ≥5, comparado a 8
(67%) pacientes do grupo INV (p<0,05) (Figura 7). Em 22 pacientes o leucograma
foi avaliado, sendo que 1 paciente do grupo NIC/MICRO não apresentava
leucograma no momento do diagnóstico.
Analisando o número absoluto de neutrófilos, foi observado aumento nas
pacientes do grupo INV comparado ao grupo NIC/MICRO (p<0,05) (Figura 8). A
análise de outros parâmetros de neutrofilia mostrou que quando esta foi considerada
como número absoluto de neutrófilos ≥70% do número de leucócitos totais, 9
pacientes (90%) em estadiamento inicial não apresentaram neutrofilia, enquanto que
Resultados _______________________________________________________________ 54
em mais de 80% das pacientes do grupo INV a neutrofilia foi observada (Figura 9).
Considerando neutrofilia como número absoluto de neutrófilos ≥6.500/mm3, de
acordo com o padrão do Laboratório de Patologia Clínica da UFTM, não foram
observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos NIC/MICRO e
INV (Figura 10).
Resultados _______________________________________________________________ 55
NIC/MICRO
≥ 5 (n=1)
RNL < 5 (n=9)
RNL
10%
90%
INV
RNL ≥ 5 (n=8)
RNL < 5 (n=4)
33%
67%
Figura 7. Relação neutrófilo-linfócito (RNL) em pacientes com neoplasia de
colo uterino dos grupos NIC/MICRO (n=10) e INV (n=12). A RNL foi
determinada pela divisão entre o número absoluto de neutrófilos e linfócitos
apresentados no leucograma. *p<0,05 (Teste exato de Fisher).
No. de absoluto de neutrófilos
Resultados _______________________________________________________________ 56
25000
20000
15000
10000
5000
0
(n=10)
NIC/M ICRO
(n=12)
INV
Figura 8: Número absoluto de neutrófilos em pacientes com neoplasia de colo
uterino em estadiamento inicial (NIC/MICRO) e avançado (INV). p<0,05 (MannWhitney)
Resultados _______________________________________________________________ 57
INV
NIC/MICRO
16,6%
10%
83,3%
90%
Sem neutrofilia (n=2)
Sem neutrofilia (n=9)
Com neutrofilia (n=10)
Com neutrofilia (n=1)
Figura 9. Presença ou não de neutrofilia em pacientes com neoplasia de colo
uterino dos grupos NIC/MICRO (n=10) e INV (n=12). A neutrofilia foi definida como
número de neutrófilos ≥70% em relação ao número de leucócitos totais
apresentado no leucograma. *p<0,01 comparado aos grupos NIC/MICRO e INV
(Teste exato de Fisher).
INV
NIC/MICRO
30%
33%
70%
67%
Sem neutrofilia (n=7)
Sem neutrofilia (n=4)
Com neutrofilia (n=3)
Com neutrofilia (n=8)
Figura 10. Presença ou não de neutrofilia em pacientes com neoplasia de colo
uterino dos grupos NIC/MICRO (n=10) e INV (n=12). A neutrofilia foi definida com
3
número absoluto de neutrófilos >6.500/mm determinado pelo leucograma. p>0,05
(Teste exato de Fisher).
Resultados _______________________________________________________________ 58
5.3. Avaliação da Função Quimiotática de Neutrófilos entre Controles e
Pacientes
A função quimiotática foi avaliada em 22 pacientes e 15 controles, sendo que,
em cada ensaio, foi utilizado pelo menos 01 controle. Não foi possível realizar o
ensaio de quimiotaxia na paciente de número 11 pelo número insuficiente de células
obtidas na purificação (Anexo D).
As pacientes (grupo total) apresentaram migração de neutrófilos frente aos
estímulos quimiotáticos (fMLP, LTB4, IL-8), comparada à migração aleatória (RPMI),
assim como o grupo controle (Figura 11). Porém, quando comparados cada
estímulo entre os grupos, essa migração foi menor para LTB4 e IL-8 nas pacientes
com neoplasia de colo uterino comparada ao grupo controle (p<0,05) (Figura 12).
Resultados _______________________________________________________________ 59
No. de neutrófilos/campo
25
A
20
LTB4
IL-8
15
10
5
0
RPMI
No. de neutrófilos/campo
25
fMLP
B
20
15
10
5
0
RPMI
fMLP
LTB4
IL-8
Figura 11. Quimiotaxia de neutrófilos nos grupos
controle (n=15, painel A) e de pacientes com neoplasia
de colo uterino (n=22, painel B) em resposta ao RPMI
e aos estímulos quimiotáticos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL8. As barras representam as medianas (linha
horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas
verticais os valores mínimo e máximo. Kruskal-Wallis
(p<0,001) seguido do teste de Dunn: *p<0,05
comparado ao respectivo RPMI.
Resultados _______________________________________________________________ 60
No. de neutrófilos/campo
25
RPMI
Controles
Pacientes
20
15
10
5
0
No. de neutrófilos/campo
25
fMLP
20
15
10
5
0
No. de neutrófilos/campo
25
LTB4
20
15
10
5
0
No. de neutrófilos/campo
25
IL-8
20
15
10
5
0
Figura 12. Quimiotaxia de neutrófilos nos grupos
controle (n=15) e de pacientes com neoplasia de
colo uterino (n=22) comparando-se a resposta
-7
aos
quimioatraentes
(10 M).
As
barras
representam as medianas (linha horizontal) e os
percentis 25% e 75%,e as linhas verticais os
valores mínimo e máximo. *p<0,05 comparado ao
grupo controle (Mann-Whitney).
Resultados _______________________________________________________________ 61
5.4. Avaliação da Função Quimiotática de acordo com o Estadiamento
Tanto as pacientes do grupo NIC/MICRO quanto do grupo INV apresentaram
significativa migração de neutrófilos frente aos estímulos fMLP, LTB4 e IL-8,
comparada à migração aleatória (RPMI) (Figura 13).
Entretanto quando comparados cada estímulo entre os grupos, foi observado
que as pacientes do grupo INV tiveram migração de neutrófilos reduzida frente a
todos os estímulos quimiotáticos comparado ao grupo NIC/MICRO (Figura 14).
Grupo NIC/MICRO
No. de neutrófilos/campo
20
A
15
10
5
0
RPMI
fMLP
LTB4
IL-8
Grupo INV
No. de neutrófilos/campo
20
B
15
10
5
0
RPMI
fMLP
LTB4
IL-8
Figura 13. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes do grupo NIC/MICRO
(n=10, painel A) e INV (n=12, painel B) em resposta ao RPMI e aos estímulos
-7
quimiotáticos (10 M) fMLP, LTB4 e IL-8. As barras representam as medianas
(linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os valores
mínimo e máximo. Kruskal-Wallis (p<0,001) seguido do teste de Dunn:
*p<0,05 comparado ao respectivo RPMI.
Resultados _______________________________________________________________ 62
No. de neutrófilos/campo
20
RPMI
NIC/M ICRO
INV
15
10
5
0
No. de neutrófilos/campo
20
fMLP
15
10
5
0
LTB4
No. de neutrófilos/campo
20
15
10
5
0
No. de neutrófilos/campo
20
IL-8
15
10
5
0
Figura 14. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes
dos grupos NIC/MICRO (n=10) e INV (n=12),
-7
comparando-se a resposta aos estímulos (10 M)
fMLP, LTB4 e IL-8. As barras representam as
medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e
75%, e as linhas verticais os valores mínimo e
máximo. *p<0,01 comparado ao grupo controle
(Mann-Whitney).
Resultados _______________________________________________________________ 63
5.5. Avaliação da Função Quimiotática nas Pacientes com Estadiamento
Inicial antes e após tratamento
Após o tratamento cirúrgico (cerca de 30 dias) manteve-se preservada a
migração dos neutrófilos frente aos estímulos fMLP, LTB4 e IL-8 em pacientes do
grupo NIC/MICRO, da mesma forma como observado no momento do diagnóstico
(Figura 15). Porém a comparação de cada estímulo quimiotático entre os grupos,
mostrou que houve um aumento da migração dos neutrófilos em resposta ao fMLP e
LTB4 , quando comparada ao tempo pré-cirurgia (Figura 16).
No. de neutrófilos/campo
30
PRÉ
A
20
10
0
RPMI
fMLP
LTB4
IL-8
PÓS
No. de neutrófilos/campo
30
B
20
10
0
RPMI
fMLP
LTB 4
IL-8
Figura 15. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes do grupo
NIC/MICRO (n=4) antes (PRÉ, painel A) e cerca de 30 dias após
(PÓS, painel B) tratamento cirúrgico, em resposta ao RPMI e aos
-7
estímulos (10 M) fMLP, LTB4 e IL-8. As barras representam as
medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas
verticais os valores mínimo e máximo. Kruskal-Wallis (p<0,05)
seguido do teste de Dunn: *p<0,05 comparado ao respectivo RPMI.
Resultados _______________________________________________________________ 64
No. de neutrófilos/campo
25
RPMI
Pré-tratamento
Pós-tratamento
20
15
10
5
0
fMLP
No. de neutrófilos/campo
25
20
15
10
5
0
LTB4
No. de neutrófilos/campo
25
20
15
10
5
0
IL-8
No. de neutrófilos/campo
25
20
15
10
5
0
Figura 16. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes
do grupo NIC/MICRO (n=4) antes e cerca de 30 dias
após tratamento cirúrgico, comparando-se a resposta
-7
ao RPMI e aos estímulos (10 M) fMLP, LTB4 e IL-8.
As barras representam as medianas (linha horizontal)
e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os
valores mínimo e máximo. *p<0,05 comparado ao
tempo pré-tratamento (teste de Wilcoxon).
Resultados _______________________________________________________________ 65
5.6. Avaliação da Função Fagocítica
O índice fagocítico foi avaliado em 17 pacientes, sendo 09 do grupo
NIC/MICRO e 08 do grupo INV, e em 18 controles.
A função fagocítica avaliada, utilizando zimosan sensibilizado como partícula
fagocítica, não demonstrou diferença entre controles e pacientes (Figura 17, Painel
esquerdo), mas, considerando o estadiamento, o IF foi menor em pacientes do
grupo INV, comparado ao grupo NIC/MICRO (p=0,015) (Figura 17, Painel direito).
Não foi observada variação significativa quanto ao IF antes e após cirurgia em
pacientes do grupo NIC/MICRO (Figura 18).
70
Índice Fagocítico
60
50
40
30
20
10
0
CONTROLES
(n=18)
PACIENTES
(n=17)
NIC/M ICRO
(n=9)
INV
(n=8)
Pacientes
Figura 17. Índice fagocítico (IF) de controles e pacientes com neoplasia de colo
uterino (painel esquerdo) e pacientes divididas em grupos NIC/MICRO e INV, de
acordo com o estadiamento (painel direito). As barras representam as medianas
(linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os valores mínimo e
máximo. Kruskall-Wallis (p<0,05) seguido do teste de Dunn: *p<0,05 comparado ao
grupo NIC/MICRO.
Resultados _______________________________________________________________ 66
70
Índice Fagocítico
60
50
40
30
20
10
0
PRÉ
PÓS
Figura 18. Índice fagocítico do grupo NIC/MICRO (n=6) nos tempos
antes (PRÉ) e cerca de 30 dias após (PÓS) tratamento cirúrgico. As
barras representam as medianas (linha horizontal) e os percentis
25% e 75%, e as linhas verticais os valores mínimo e máximo.
__________________________________________________
DISCUSSÃO
Discussão _______________________________________________________________ 68
6. DISCUSSÃO
Alterações de funções celulares em pacientes com câncer já são estudadas
há algum tempo e constituem-se em tema de controvérsias. Trabalhos específicos
em câncer de colo uterino são escassos, desta forma, no presente estudo, foram
avaliadas as funções quimiotática e fagocítica de neutrófilos circulantes de pacientes
com neoplasia de colo uterino, comparando a mulheres voluntárias sem doença
diagnosticada, utilizadas como grupo controle.
A incidência do câncer de colo uterino já é evidenciada em mulheres na faixa
etária de 20 a 29 anos, e o risco aumenta rapidamente até atingir seu pico,
geralmente, na faixa etária de 45 a 49 anos (MS-INCA, 2006). Em acordo, neste
estudo, a idade média do grupo total de pacientes foi de 48 anos, sendo a média
menor no grupo apresentando estádio inicial (43 anos) e maior no grupo com
diagnóstico em estádio mais avançado (53 anos). Porém tem sido observado
aumento da incidência de estadiamentos mais avançados, assim como as lesões
precursoras, em pacientes mais jovens (HERBST et al., 1992; PALO et al., 2002).
Trabalhos clássicos demonstram que o câncer do colo uterino é mais agressivo em
mulheres jovens, com idade inferior a 40 anos (CHAVES et al., 1984).
Recentemente, tem sido proposto que o microambiente tumoral é capaz de
controlar, por meio da liberação de mediadores específicos, como as quimiocinas, a
migração de leucócitos e outras funções desempenhadas por essas células após
sua chegada no sítio tumoral, sendo essencial para o início e a regulação da
resposta inflamatória/imune (FINE et al., 2001; BALKWILL; MANTOVANI, 2001).
Discussão _______________________________________________________________ 69
A maioria dos estudos relacionados aos mecanismos envolvidos na
eliminação de células tumorais in vivo tem-se centralizado, principalmente, nas
funções de macrófagos e linfócitos. Porém os neutrófilos também são capazes de
exercer atividade anti-tumoral (KIM et al., 2000, DALLEGRI et al. , 1991; KOGA et
al., 2004).
Os neutrófilos são os mais numerosos leucócitos circulantes, representando
cerca de 50-60% do total dessas células. Seu citoplasma possui grânulos que
contêm enzimas digestivas e proteínas microbicidas denominadas defensinas, estas
com alto potencial tóxico contra os vários tipos de células tumorais. As membranas
plasmáticas podem expressar diversos receptores e outras estruturas necessárias
para o reconhecimento e eliminação de microorganismos. Seus alvos constituem as
bactérias, fungos, protozoários, vírus e células tumorais (KOGA et al., 2004).
Neste estudo, procuramos avaliar possíveis alterações no número e/ou
função de neutrófilos circulantes em pacientes com neoplasia de colo uterino,
relacionadas ao estadiamento da doença. Nossos resultados demonstraram clara
associação entre alterações no número de neutrófilos circulantes - neutrofilia - e
estádios mais avançados da doença (figuras 8, 9 e 10), em acordo com recentes
relatos.
Outro estudo em pacientes com câncer de colo uterino encontrou leucocitose
com aumento do número de neutrófilos comparado a controles. Ainda, foi observado
aumento nos níveis plasmáticos de IL-10 e redução de IFN-ϒ, caracterizando desvio
na produção sistêmica de citocinas do perfil Th2, no grupo de pacientes com câncer
e, também, já em pacientes com displasia severa (NICIII). Os resultados
demonstravam que a displasia grave apresenta alterações sistêmicas semelhantes
Discussão _______________________________________________________________ 70
ao câncer invasivo, e dados clínicos reforçam que a maioria das lesões desse tipo
não regridem espontaneamente e, ao contrário, podem progredir para carcinoma
invasivo se não tratadas (BAIS et al., 2005)
Dentre as várias alterações observadas em pacientes portadores de sarcoma
de partes moles, entre as mais freqüentes, estão a leucocitose e a neutrofilia.
Quanto mais avançada a doença, maior foi a tendência em apresentar alterações
hematológicas. Em pacientes com tumores sólidos malignos, também se observam
freqüentemente, alterações hematológicas (leucocitose, neutrofilia, monocitose,
trombocitose e diminuição da hemoglobina) correlacionadas de maneira significativa
com o prognóstico do paciente (RUKA et al., 2001).
Em pacientes com melanoma metastático, a neutrofilia foi considerada como
fator prognóstico independente, associada à redução da sobrevida, avaliado por
meio de testes estatísticos específicos (SCHMIDT et al., 2005).
Em pacientes com carcinoma renal metastático, o aumento do número de
neutrófilos e monócitos circulantes foi considerado fator determinante para pior
prognóstico (NEGRIER et al., 2005) e também para resposta reduzida ao tratamento
com IL-2 (DONSKOV et al., 2006). Outro recente estudo também mostrou que, em
pacientes com carcinoma pancreático, a neutrofilia esteve associada a um
prognóstico desfavorável (FOGAR et al., 2006).
Em pacientes com vários tipos de câncer - mama, próstata e glioma - a
população de células dendríticas circulantes também demonstrou estar alterada,
sendo constituída, essencialmente, (30-65%) de células imaturas, diferente da
população reconhecida como linhagem mielóide e plasmacitóide normal. Esta
Discussão _______________________________________________________________ 71
alteração foi ainda mais evidente em pacientes com a doença em estadiamentos
mais avançados (PINZON-CHARRY et al., 2005).
A relação neutrófilo-linfócito (RNL) tem sido sugerida como um índice da
resposta inflamatória sistêmica em pacientes com doenças críticas (ZAHOREC,
2001). Recentemente, foi demonstrado que pacientes com câncer colo-retal e RNL
elevada (≥5) tiveram menor sobrevida, avaliada em dois anos, comparado a
pacientes com RNL <5. Foi sugerido que a RNL é um método simples para
identificar os pacientes com pior prognóstico (WALSH et al., 2005). Em acordo,
nossos resultados foram semelhantes, em que a RNL ≥5 foi encontrada na grande
maioria das pacientes com neoplasia de colo uterino em estadiamento mais
avançado, em oposto ao observado em pacientes do grupo NIC/MICRO (figura 7).
De maneira semelhante, foi observado, em pacientes com câncer de colo de útero,
neutrofilia associada a linfocitopenia (GARCIA-GONZALES et al., 1992), o que fala a
favor de um aumento da RNL.
É possível que, em pacientes com neoplasia de colo uterino, tais parâmetros,
obtidos a partir do leucograma no momento do diagnóstico, sejam de valor
prognóstico, embora isso não tenha sido aqui avaliado. Esses parâmetros podem ser
calculados com base nos dados disponíveis nos serviços de rotina, não requerendo
gasto adicional, além de possuir razoável sensibilidade e especificidade.
Um aspecto intrigante desses relatos é como a progressão do câncer
contribui com alterações no número de populações de células circulantes. Como
possíveis mecanismos estão: 1) produção de fatores por células tumorais, por
exemplo, GM-CSF (Fator estimulador de colônia de granulócitos e monócitos),
capazes de mobilizar precursores pela medula óssea; e 2) produção de fatores por
Discussão _______________________________________________________________ 72
células tumorais, VEGF (Fator de crescimento do endotélio vascular), IL-6, M-CSF
(Fator estimulador de colônia de monócitos), prostanóides, capazes de alterar a
diferenciação das células, por exemplo, no caso de células dendríticas a partir de
seus progenitores (PINZON-CHARRY et al., 2005). O conhecimento dos
mecanismos envolvidos nessas alterações pode contribuir para o desenvolvimento
de novas estratégias terapêuticas no câncer.
Considerando as funções de neutrófilos, em todos os ensaios de quimiotaxia,
foi utilizada uma única concentração dos estímulos fMLP, LTB4 e IL-8, selecionada
por meio da análise da curva dose-efeito (Figura 6). Os agentes quimiotáticos
utilizados possuem diferentes vias de produção. O fMLP é identificado como um
peptídeo derivado de bactérias, capaz de estimular monócitos e neutrófilos humanos
e de outras espécies animais (SUGAWARA et al., 1995). As quimiocinas são uma
complexa família de pequenas proteínas, que diferem de fatores quimiotáticos
clássicos, como o fMLP, em relação à especificidade que apresentam para
determinados tipos de leucócitos (PROOST, WUYTS; VAN DAMME, 1996). A IL-8 é
uma quimiocina produzida por vários tipos celulares e reconhecida, particularmente
por sua habilidade em atrair e ativar neutrófilos no sítio inflamatório, promovendo
liberação de enzimas e atividade oxidativa. A IL-8 aumenta a expressão de
moléculas de adesão, como as integrinas, na superfície dos neutrófilos, favorecendo
a adesão leucócito-endotélio, mediante a ligação a receptores (CXCR1 e CXCR2) na
superfície dessas células (FURIE; RANDOLPH, 1995). Os leucotrienos são
mediadores lipídicos resultantes do metabolismo de ácidos graxos poliinsaturados
por uma família de enzimas denominadas lipooxigenases. São sintetizados por
células inflamatórias, notadamente, neutrófilos e macrófagos, após diferentes
estímulos como endotoxina e citocinas. Dentre os tipos de LTs, o LTB4, atua
Discussão _______________________________________________________________ 73
especialmente, sobre os neutrófilos, induzindo sua quimiotaxia e ativação (FORDHUTCHINSON et al., 1984)
Considerando o grupo total de pacientes houve migração de neutrófilos aos
quimioatraentes (Figura 11), embora esta já se mostrasse reduzida (Figura 12),
comparada ao grupo controle. Já a fagocitose não mostrou diferenças entre os
grupos controle e pacientes (Figura 17, painel esquerdo). Em outro estudo,
neutrófilos de pacientes com carcinoma do colo uterino, comparados ao grupo
controle, apresentaram atividade microbicida semelhante. (GARCIA-GONZALES., et
al., 1992). Alterações de funções de leucócitos são descritas em pacientes com
câncer de diferentes sítios primários. Em pacientes com câncer gastrointestinal, foi
observada redução da função quimiotática de neutrófilos, comparada a voluntários
sadios no momento do diagnóstico (DUIGNAN et al.; 1986). Neutrófilos obtidos do
sangue de pacientes com câncer de pulmão apresentam reduzida atividade
citotóxica, demonstrada mediante a redução da produção de radicais superóxidos
por essas células (HARA et al., 1992).
A atividade fagocítica de neutrófilos de pacientes com câncer de diferentes
origens e em idade mais avançada encontrou-se aumentada, comparada ao grupo
de pacientes jovens e saudáveis (GÖÇER et al., 2005). Também em pacientes com
carcinomatose peritoneal, foi observado aumento da atividade fagocítica quando
comparada com controles saudáveis (BASKIC et al., 2003).
Em pacientes com câncer de mama, foi verificada redução na atividade
microbicida de monócitos (LUKAC et al., 1994). Porém outros trabalhos não
encontraram diferenças na função quimiotática de neutrófilos avaliada no momento
do diagnóstico, comparada a mulheres voluntárias (MENDONÇA et al., 2006).
Discussão _______________________________________________________________ 74
Uma possível explicação para as diferenças constatadas, quanto a alterações
em funções de leucócitos descritas em literatura, pode ser decorrente do
estadiamento do tumor. Já foi sugerido que o aumento de funções leucocitárias
poderia ser resultado da ativação do sistema imune celular em resposta à célula
tumoral, em fases iniciais (SUSS, BAKACS; RINGWALD, 1984), enquanto que a
redução nessas funções seria, principalmente, conseqüência da progressão da
doença (GEBHARD et al., 2000)
Neste trabalho, no grupo de pacientes com estadiamento avançado, embora
tenha ocorrido resposta quimiotática aos estímulos inflamatórios (Figura 13), esta foi
reduzida para todos os estímulos testados, comparada ao grupo em estadiamento
inicial (Figura 14).
Em mulheres com câncer ginecológico de diferentes origens, incluindo o colo
uterino, foi encontrada redução na produção de radicais superóxidos, já em estádios
iniciais e de forma mais marcada com a evolução da doença. Não está claro se as
alterações na produção de superóxidos apresentam relação causal ou se seriam
conseqüência do desenvolvimento da doença (PÓKA et al., 2000). Neste contexto,
um estudo prospectivo, que avaliou funções de neutrófilos e monócitos em pacientes
com câncer de mama, demonstrou que, após seguimento de 3 anos, o grupo com
alterações funcionais detectadas no momento do diagnóstico revelou pior
prognóstico (LUKAC et al., 1994).
A avaliação de pacientes com câncer gástrico em diversos estádios não
demonstrou diferenças na função fagocítica, quando comparada com pacientes
portadoras de patologias benignas (YAMAUE et al., 2000). Em nosso estudo,
quando as pacientes foram avaliadas como grupo total, não foram observadas
Discussão _______________________________________________________________ 75
diferenças significantes no IF comparado ao grupo controle. Em experimentos
utilizando ratos com nefroma mesoblástico, foi notado em fases iniciais do
desenvolvimento tumoral, aumento da atividade fagocítica. Posteriormente, houve
redução desta, coincidindo com o aparecimento de metástase (SZÜCS et al., 1996).
De forma semelhante, em nosso trabalho, pacientes com estadiamento avançado
apresentaram redução dessa função celular.
Após o tratamento cirúrgico do grupo em estádio inicial (Grupo NIC/MICRO,
houve aumento significativo da quimiotaxia em resposta ao fMLP e LTB4 (Figura 16),
sugerindo que a retirada do agente lesivo (célula tumoral) aumentou a função
quimiotática do neutrófilo. Esses resultados, em conjunto com a redução da função
de neutrófilos nas pacientes com neoplasia de colo uterino, sugerem que as células
neoplásicas estimulam a produção de mediadores circulantes, capazes de interferir
no número e na função de leucócitos.
O acúmulo de células circulantes imaturas ou com sua capacidade funcional
reduzida poderia facilitar uma disfunção imune sistêmica, assim como a presença
dessas células no sítio tumoral poderia facilitar a progressão da neoplasia (PINZONCHARRY et al., 2005). É proposto que, em termos de resposta inflamatória, as
neoplasias constituem um paradoxo. Os tumores produzem citocinas e quimiocinas
que recrutam leucócitos. Entretanto existe uma deficiência em promover respostas
inflamatórias em outros sítios que não o tumoral. O mais provável é que as
quimiocinas produzidas pelo próprio tumor, quando presentes na circulação, possam
dessensibilizar os leucócitos ou, ainda, o tumor pode produzir citocinas
antiinflamatórias. Assim, uma capacidade defeituosa em promover uma resposta
inflamatória para outro local poderia coexistir com o contínuo recrutamento de
leucócitos para o sítio tumoral (BALKWILL; MANTOVANI, 2001).
Discussão _______________________________________________________________ 76
Os neutrófilos podem exercer atividade anti-tumoral por meio de apoptose
(KIM et al., 2000), morte celular direta causada por liberação de radicais superóxidos
(DALLEGRI et al., 1991), e expressão de genes indutores de apoptose em células
malignas (KOGA et al., 2004). Foi demonstrado que o gene denominado ligante
indutor de apoptose, relacionado ao fator de necrose tumoral (TNF-α, TRAIL, TNFrelated apoptosis-inducing ligand) encontra-se expresso em nível 10 vezes superior
ao detectado em células mononucleares. Ainda, foi demonstrado que o efeito
citotóxico de neutrófilos sobre células leucêmicas é mediado em parte via TRAIL
(KOGA et al., 2004). Estudos pré-clínicos, avaliando o tratamento combinado de
carcinoma renal avançado, utilizando anticorpos anti-receptores tumorais específicos
e G-CSF ou GM-CSF, demonstraram que os granulócitos são a população de
células efetoras mais ativa (ELSASSER et al., 1996). O GM-CSF é capaz de
aumentar a citotoxicidade dos neutrófilos frente a células de melanoma,
neuroblastoma e de carcinoma colo-retal (DI CARLO et al., 2001). A observação de
que existe número substancial de neutrófilos em ascites (LICHTENSTEIN & KAHLE,
1985) e líquidos císticos (TAVARES-MURTA et al., 2004) de pacientes com câncer
pode sugerir que os neutrófilos desempenham papel ativo na depuração de células
tumorais (DI CARLO et al., 2001).
Apesar de apresentar potencial para controlar um tumor, o sistema imune,
freqüentemente, falha em prevenir a progressão tumoral. Defeitos em funções de
células dendríticas são peça chave nesse processo (PINZON-CHARRY et al., 2005).
Nossos resultados também evidenciam que a redução da função quimiotática e
fagocítica de neutrófilos foi associada ao estadiamento avançado, sugerindo a
participação
dessas
células
na
resposta
imune
ao
carcinoma
cervical.
Recentemente, foi demonstrado que α-defensinas, conhecidas como peptídeos de
Discussão _______________________________________________________________ 77
neutrófilos humanos, bloqueiam a infecção pelo HPV, o que leva a crer que a
presença local dessas substâncias seria uma barreira natural à transmissão sexual
do HPV (BUCK et al., 2006).
Novas perspectivas têm sido abertas para explorar a função dos neutrófilos
no tratamento do câncer. A elaboração de sistemas capazes de direcionar e ativar
os neutrófilos no microambiente tumoral poderia ser uma proposta de estratégia
terapêutica (DI CARLO et al., 2001).
________________________________________________
CONCLUSÃO
Conclusão _______________________________________________________________ 79
7. CONCLUSÃO
As alterações observadas, 1) em número e capacidade funcional de
neutrófilos circulantes em pacientes com neoplasia de colo uterino e 2) após a
retirada cirúrgica da lesão com aumento da migração de neutrófilos, sugerem a
produção de mediadores circulantes pelas células tumorais, ainda em estadiamentos
iniciais. Além disso, as alterações em número e função dos neutrófilos associadas
ao estadiamento invasivo indicam a participação dessas células circulantes na
resposta imune ao tumor.
A neoplasia de colo uterino, mesmo em estadiamentos pré-invasivos, poderia
ser vista como uma doença com repercussões sistêmicas.
__________
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Referências Bibliográficas __________________________________________________ 81
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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_________________________________________________________
ANEXOS
Anexos __________________________________________________________________ 93
ANEXOS
Anexo A
Pacientes com Neoplasia de Colo de Uterino
PACIENTES
IDADE
COR DA
PELE*
ESTADIAMENTO**
TRATAMENTO
1
67
B
NIC III
Cirurgia
2
35
B
NIC III
Cirurgia
3
35
B
NIC III
Cirurgia
4
36
B
NIC III
Cirurgia
5
48
B
NIC III
Cirurgia
6
52
NB
I A1
Cirurgia
7
32
B
I A1
Cirurgia
8
33
B
I A1
Cirurgia
9
58
B
I A1
Cirurgia
10
31
B
NIC III
Cirurgia
11
40
B
NIC III
Cirurgia
12
67
B
II B
Quimioterapia
13
31
B
II B
Quimioterapia
14
52
B
II B
Quimioterapia
15
26
B
II B
Quimioterapia
16
67
B
III B
Quimioterapia
17
66
B
III B
Quimioterapia
18
62
B
III B
Quimioterapia
19
53
B
III B
Quimioterapia
20
66
B
III B
Quimioterapia
21
43
B
II B
Quimioterapia
22
48
B
III A
Quimioterapia
23
52
B
IV B
Quimioterapia
*COR DA PELE: B=Branco NB=Não Branco
**ESTADIAMENTO: Neoplasia Intraepitelial Alto Grau/Carcinoma in situ= NICIII
IA1= Carcinoma Microinvasivo
Anexos __________________________________________________________________ 94
Anexo B
Leucograma das Pacientes com Neoplasia de Colo Uterino no momento do
diagnóstico
PACIENTES ESTADIAMENTO
NÚMERO DE
LEUCÓCITOS
3
TOTAIS/mm
70% DO
NÚMERO DE NÚMERO DE
NEUTRÓFILOS LEUCÓCITOS
3
3
TOTAIS/mm
TOTAIS/mm
RNL
1
NICIII
6200
3782
4340
1,8
2
NICIII
3300
1683
2310
1,2
3
-
-
-
-
-
4
NICIII
12900
8514
9030
4,1
5
NICIII
4600
2852
3220
1,9
6
IA1
4400
1584
3080
0,6
7
IA1
11100
6771
7770
2
8
IA1
14300
11869
10010
6,3
9
IA1
6380
3636
4466
1,7
10
NIC III
6000
3060
4200
1,2
11
NIC III
6000
2820
4200
1,3
12
IIB
6600
4488
4620
2,8
13
IIB
8250
5775
5775
3,3
14
IIB
7300
5840
5110
5,7
15
IIB
7490
3595
5243
1,5
16
IIIB
9600
7680
6720
5,3
17
IIIB
12700
9652
8890
6,9
18
IIIB
12300
10824
8610
14,3
19
IIIB
8667
7020
6066
5,7
20
IIIB
25500
19500
17500
5,2
21
IIB
8800
6864
6160
7,1
22
IIIB
9000
6570
6300
2,9
8200
6724
5740
6,8
23
IVB
RNL= Relação Neutrófilo/Linfócito
Anexos __________________________________________________________________ 95
Anexo C
Quimiotaxia de neutrófilos em mulheres do grupo controle
CONTROLES
RPMI
fMLP
LTB4
IL-8
2
0,7
6
4,9
5,5
3
2,4
13,3
11,7
12
5
1,5
9,9
20,2
19,4
6
1,9
4,2
4,4
12,7
9
1,8
10,7
12,4
13,2
11
1,8
10,2
11,1
8,9
12
3,4
13,3
12,4
13,8
13
2,9
12,8
19,5
14,2
14
6,5
12,2
11,7
11,1
16
5,3
12,1
12,1
13,6
17
1,1
10,5
10,4
13,4
18
1,3
7,9
9,7
11
19
1,6
18,2
19
18
20
1,3
6,5
7,9
10,7
21
1,1
4,9
3,1
6,3
Os valores indicam os números de neutrófilos emigrados
por campo em resposta ao RPMI e aos estímulos fMLP,
LTB4, e IL-8. (objetiva 100 x)
Anexos __________________________________________________________________ 96
Anexo D
Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes com Neoplasia de Colo Uterino em
diferentes estadiamentos
Pacientes Estadiamento
RPMI
fMLP
LTB4
IL-8
1
NICIII
1,7
8,7
9,2
12,2
2
NICIII
2,4
12,9
9,8
9,1
3
NICIII
2,6
12,9
10,5
12
4
NICIII
2,2
16,5
18,6
15,7
5
NICIII
3,3
9,9
10,5
11,4
6
IA1
0,8
10,7
9,3
10,3
7
IA1
3,2
10,5
10,9
9,4
8
IA1
1,2
11,2
11,9
15,6
9
IA1
2,2
7,3
10,3
7,3
10
NICIII
1,4
7,5
9,3
12,1
11
-
-
-
-
-
12
II B
1,3
4,9
8,3
8,8
13
II B
2
9,6
10,6
8,8
14
II B
1,5
8,5
4,4
7,3
15
II B
1,5
6,3
4,7
5,3
16
III B
1,3
8,7
8,5
9
17
III B
3,3
6,9
10
7,3
18
III B
1,3
6,4
4,7
5,9
19
III B
3
3,1
3,4
9,8
20
III B
1,2
1,6
2,1
2,3
21
II B
2,9
9,7
8,4
5,5
22
III A
0,8
1,6
1,5
1,6
23
IV B
1
1,6
2,3
2,4
Os valores indicam os números de neutrófilos emigrados por campo
em resposta ao RPMI e aos estímulos fMLP, LTB4, e IL-8. (objetiva
100 x)
Anexos __________________________________________________________________ 97
Anexo E
Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes com estadiamento inicial antes e após
o tratamento cirúrgico
PACIENTES Estadiamento*
RPMI
pré
fMLP
pré
LTB4
pré
IL-8
pré
RPMI
pós
fMLP
pós
LTB4 IL-8
pós pós
1
NICIII
1,7
8,7
9,2
12,2
-
-
-
-
2
NICIII
2,4
12,9
9,8
9,1
3,6
21,8
17,2
22,9
3
NICIII
2,6
12,9
10,5
12
4,7
22
14,1
23,2
4
NICIII
2,2
16,5
18,6
15,7
-
-
-
-
5
NICIII
3,3
9,9
10,5
11,4
2,4
12,1
14,3
12,7
6
IA1
0,8
10,7
9,3
10,3
-
-
-
-
7
IA1
3,2
10,5
10,9
9,4
3,5
16,2
19,6
15,1
8
IA1
1,2
11,2
11,9
15,6
-
-
-
-
9
IA1
2,2
7,3
10,3
7,3
-
-
-
-
10
NICIII
1,4
7,5
9,3
12,1
-
-
-
-
Número de neutrófilos por campo (objetiva 100x)
*ESTADIAMENTO: Neoplasia Intracervical Alto Grau/Carcinoma in situ= NICIII
IA1= Carcinoma Microinvasivo
(-) Não foi realizado o ensaio
Anexos __________________________________________________________________ 98
Anexo F
Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes com estadiamento avançado antes e
após o tratamento quimioterápico
IL-8
pré
RPMI
pós
fMLP
pós
LTB4
pós
IL-8
pós
8,3
8,8
-
-
-
-
9,6
10,6
8,8
-
-
-
-
1,5
8,5
4,4
7,3
-
-
-
-
II B
1,5
6,3
4,7
5,3
2
3,1
6,7
10
16
III B
1,3
8,7
8,5
9
0,9
7,1
4,2
2,1
17
III B
3,3
6,9
10
7,3
-
-
-
-
18
III B
1,3
6,4
4,7
5,9
-
-
-
-
19
III B
3
3,1
3,4
9,8
2,4
10,5
6,7
10,2
20
III B
1,2
1,6
2,1
2,3
-
-
-
-
21
II B
2,9
9,7
8,4
5,5
-
-
-
-
22
III A
0,8
1,6
1,5
1,6
-
-
-
-
23
IV B
1
1,6
2,3
2,4
-
-
-
-
RPMI fMLP LTB4
pré
pré
pré
Pacientes
Estadiamento
12
II B
1,3
4,9
13
II B
2
14
II B
15
Número de neutrófilos por campo (objetiva 100x)
(-) Não foi realizado o ensaio
Anexos __________________________________________________________________ 99
Anexo G
Índice Fagocítico em Mulheres do Grupo Controle
NÚMERO
ÍNDICE FAGOCÍTICO
1
20
2
34
3
31
4
35
5
34
6
33
7
34
8
38
9
48
10
46
11
25
12
29
13
24
14
42
15
27
16
48
17
23
18
38
Índice Fagocítico = % neutrófilos em fagocitose x n° médio de partículas fagocitadas
Anexos __________________________________________________________________ 100
Anexo H
Índice Fagocítico em Pacientes com estadiamento inicial antes e após o
tratamento cirúrgico
NÚMERO
ÍNDICE FAGOCÍTICO
PRÉ – OP
ÍNDICE FAGOCÍTICO
PÓS-OP
1
40
-
2
40
13,5
3
27
26
4
28
-
5
39
20
6
65
-
7
34
27
8
42
67
9
43
28
Índice Fagocítico = % neutrófilos em fagocitose x n° médio de partículas fagocitadas
(-) Não foi realizado o ensaio
Anexo I
Índice Fagocítico em pacientes com estadiamento avançado antes e após o
tratamento quimioterápico
NÚMERO
ÍNDICE FAGOCÍTICO
ÍNDICE FAGOCÍTICO
PRÉ-QT
PÓS-QT
-
12
23
13
55
14
23,8
-
15
21
10
16
20
-
17
13
-
18
22,1
-
19
32
19
-
Índice Fagocítico = % neutrófilos em fagocitose x n° médio de partículas fagocitadas
(-) Não foi realizado o ensaio
Anexos__________________________________________________________________ 101
Anexo J
Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) e termo de consentimento
livre e esclarecido