Fagocitose De Células
Apoptóticas Por
Macrófagos Humanos
Análise Por Citometria De
Fluxo
Células apoptóticas
são fagocitadas pelos
macrófagos humanos?
Materiais


Populações de
• Macrófagos
• Neutrófilos
• Células apoptóticas
Marcadores:
• CMFDA (5-cloromethylfluorescein diacetate)
• CD 14
• CD 15
• CD 16
• CD 62
Métodos

Citometria de Fluxo

Microscopia

Fluorescência
Problemas

Lavagem dos macrófagos – perda de
células

Dificuldade na discriminação de células
interiorizadas e periféricas

Quantificação microscópica demorada e
pode conter erros significativos
Métodos

Amostra em fases – Percoll
• Sangue periférico
• Células mononucleares
• Células polimorfonucleares

Separar os polimorfonucleares
neutrófilos)
• Ressuspender
• Centrifugar
• Incubar
(95%
Métodos

Neutrófilos são marcados com CMFDA

Macrófagos incubados com neutrófilos

Promove-se a fagocitose

Análise por citometria
Resultados – CMFDA

CMFDA marca os
neutrófilos sem afectar
o processo de
apoptose.
•
•
•
Não altera a velocidade
da fagocitose
Não interfere na
superfície da célula
Não altera a viabilidade
dos macrófagos
Resultados – Fluorescência

Duas populações distintas de neutrófilos
• Uniformidade da marcação
• Intensidade da fluorescência
Resultados – Fagocitose

R1 analisado por
fotomicroscopia
•

96% macrófagos
fagocitaram.
R2 e R3
percentagem
reduzida (3%)
Resultados – Taxa Fagocítica

Variações da taxa de
fagocitose com
estímulos exteriores
Resultados – Resposta Fagocítica

Resposta fagocítica
máxima demorada

Subestimada
Resultados – Lavagens

Perda de células

Diminuição da
capacidade
fagocítica

Subestimada
Discussão

Apoptose e remoção das células
apoptóticas é fundamental

A quantidade de ensaios aumenta a
hipótese de erros
Discussão

A citometria de fluxo é um importante
mecanismo:
• Na distinção das células interiorizadas, das
•
•
•
periféricas,
Remoção do erro do observador,
Elevado número de amostras,
Não necessita de lavagens.
Ciência Viva

Sara Jorge

Julho 2010