UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DANILO SARAIVA ARAÚJO
USO DO LEITE NA DETECÇÃO SOROLÓGICA E MOLECULAR DA
CAE EM ANIMAIS NATURALMENTE INFECTADOS.
FORTALEZA
2012
DANILO SARAIVA ARAÚJO
USO DO LEITE NA DETECÇÃO SOROLÓGICA E MOLECULAR DA
CAE EM ANIMAIS NATURALMENTE INFECTADOS.
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós Graduação em Ciências Veterinárias da
Universidade Estadual do Ceará, como
requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e
Sanidade Animal
Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade
de Pequenos Ruminantes.
Orientadora: Profa.Drª. Maria Fátima da
Silva Teixeira
FORTALEZA
2012
Dados Internacionais de Catalogaۥo na Publicaۥo
Universidade Estadual do Cear‚
Biblioteca Central Prof. Antƒnio Martins Filho
Bibliotec‚ria Respons‚vel – Leila S‚tiro – CRB-3 / 544
A663u
Ara€jo, Danilo Saraiva.
Uso do leite na detec•‚o sorolƒgica e molecular da CAE em
animais naturalmente infectados / Danilo Saraiva Ara€jo. — 2012.
CD-ROM : 64f. il. (algumas color.) ; 4 … pol.
“CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho
acad‡mico, acondicionado em caixa de DVD Slin (19 x 14 cm x 7
mm)”.
Disserta•‚o (mestrado) – Universidade Estadual do CearŠ,
Faculdade de VeterinŠria, Curso de Mestrado Acad‡mico em
Ci‡ncias VeterinŠrias, Fortaleza, 2012.
‹rea de Concentra•‚o: Reprodu•‚o e sanidade de pequenos
ruminantes.
Orienta•‚o: ProfŒ. DrŒ. Maria FŠtima da Silva Teixeira.
1. CAEV. 2. IDGA. 3. Leite. 4. PCR. 5. Sangue. I. T•tulo.
CDD: 636.089
DANILO SARAIVA ARAÚJO
USO DO LEITE NA DETECÇÃO SOROLÓGICA E MOLECULAR DA
CAE EM ANIMAIS NATURALMENTE INFECTADOS.
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em
Ciências
Veterinárias
da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências
Veterinárias.
Aprovada em: ____/_____/_____
BANCA EXAMINADORA
_________________________________
Profa. Drª. Maria Fátima da Silva Teixeira
Universidade Estadual do Ceará
Orientadora
________________________________
________________________________
Profª Drª. Edmara Chaves Costa
Examinadora
Universidade da Integração
Internacional da Lusofonia AfroBrasileira
Prof. Dr. Isaac Neto Goes da Silva
Examinador
Universidade Estadual do Ceará
DEDICO
\Em especial,
a você Ana Luisa,
por ser minha força e
fonte de inspiração.
AGRADECIMENTOS
A Funda•‚o Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cient•fico e
Tecnolƒgico, CAPES, pela bolsa concedida durante os anos do curso. A
Universidade Estadual do CearŠ – UECE e ao Programa de Pƒs-Gradua•‚o em
Ci‡ncias VeterinŠrias – PPGCV.
E de forma particular:
Agrade•o e ofere•o esta disserta•‚o ao Deus grandioso que criou os
elementos bŠsicos para o desenvolvimento desta pesquisa (as cabras, o leite, a
mim, a minha orientadora etc) e a voc‡ que me ajudou a constru•-la. A todos os
meus amigos que, de uma forma ou de outra, contribu•ram com sugestŽes efetivas
para a concretiza•‚o desta pesquisa, gostaria de anunciar a minha gratid‚o.
Agrade•o aos meus pais (Antonio Alcy e Angela Maria) por serem meus
primeiros orientadores e que de uma forma muito particular estimularam-me e
guiaram-me a este mundo cient•fico.
Agrade•o tamb•m de forma muito carinhosa, a atua•‚o da minha querida
esposa Ana Luisa, no per•odo de constru•‚o deste trabalho e aos meus grandes
amigos Carlos (Schucruta) e Larissa por atuarem como conselheiros, psicƒlogos e
amigos.
Aos “Labovirenses” (minha fam•lia) Rosivaldo, Ronaldo, Lu•s, DŠvila, Kelma,
Gabrielle, Apoliana, Rebeca, Igor, Allan, Victor, Steffi, Expedito e a grande amiga
Maria Moura (Ely) pela cobertura direta ou indireta, que me deram nesse projeto.
• Professora DrŒ. Maria FŠtima da Silva Teixeira que, com sua dedica•‚o ‘
Universidade e ao LABOVIR, ensinou-me preciosas li•Žes. Sou grato por seu
esfor•o, carinho e preocupa•‚o para comigo.
"N€o atar•s a boca do boi
quando debulha”
(Deuteronƒmio 25:4)
RESUMO
A Artrite Encefalite Caprina (CAE) é uma doença infecciosa, multissistêmica,
causada por um lentivírus, pertencente à família Retroviridae, que acomete caprinos
de todas as idades. É uma enfermidade de caráter crônico que ocasiona prejuízos
econômicos à caprinocultura. A falta de uma vacina eficaz contra o vírus faz com
que se adote um conjunto de medidas preventivas para controlar a disseminação da
CAE. Os testes diagnósticos da CAE mais utilizados atualmente são os sorológicos:
imunodifusão em gel de agarose (IDGA), ensaio imunoenzimático (ELISA), e os
moleculares: Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Western Blotting, todos eles
tendo como principal insumo o sangue. O uso do leite como material biológico no
exame diagnóstico traria vantagens ao pequeno e médio produtor, como a facilidade
na coleta e redução de custos. Esta pesquisa teve como objetivo comparar o
desempenho do leite no diagnóstico da artrite e encefalite caprina utilizando IDGA e
PCR em relação ao sangue. A PCR leader gag, das amostras de sangue e leite,
detectou 100 e 96,7% respectivamente, dos animais infectados enquanto que o
IDGA detectou 60 e 16,6%. Os resultados obtidos confirmam a possibilidade de
utilização do leite como insumo para a realização da PCR.
Palavras-chave: CAEV. IDGA. Leite. PCR. Sangue
ABSTRACT
The caprine arthritis encephalitis (CAE) is an infectious disease, multisystem, caused
by a lentivirus belonging to the Retroviridae family, which affects goats of all ages. It
is a chronic disease that causes economic losses in goat farming. The lack of an
effective vaccine against the virus that causes adopt a set of preventive measures to
control the spread of CAE. The most widely used diagnostic tests of CAE are the
serologic agarose gel immunodiffusion (AGID), enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA), and the molecular Polymerase Chain Reaction (PCR) Western Blotting, all
with the primary sample the blood of infected animals. The use of milk as biological
material in diagnostic test would bring some advantages to small and medium
producers, such as ease of collection and reduce costs. This study aimed to compare
the performance of milk in diagnosis of caprine arthritis and encephalitis using PCR
and AGID in relation to blood. PCR gag leader, samples of blood and milk, detected
100 and 96.7% respectively of animals infected while the AGID detected 60 and
16.6%. The results confirm the possibility of using milk as material for the PCR.
Keywords: AGID, Blood, CAEV, Milk, PCR
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura do vírus da artrite encefalite caprina...........................................21
Figura 2: Genoma do vírus da artrite encefalite caprina............................................22
Figura 3: Reação de precipitação de IDGA ...............................................................31
Figura 4: Concordância (%) dos resultados das amostras de sangue e leite utilizando
os testes de IDGA e PCR..........................................................................................31
Figura 5: Eletroforese em gel de agarose 1% PCR leader gag (nested) de amostras
de leite.......................................................................................................................31
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Sigla
Nome
Ac
Anticorpo
Ag
Antígeno
AIEV
Vírus da Anemia Infecciosa Equina
CAE
Artrite Encefalite Caprina
CAEV
Vírus da Artrite Encefalite Caprina
CEUA
Comitê de Ética para Uso de Animais
DNA
Ácido desoxirribonucléico
ELISA
Ensaio Imunoenzimático
env
gene que codifica as proteínas do envelope viral
FAO
Food and Agriculture Organization
FIV
Vírus da Imunodeficiência Felina
xg
Unidade da força centrífuga relativa
gag
Gene viral que codifica as proteínas interna do vírus
Glicoproteína
gp
Glicoproteína
HIV
Vírus da Imunodeficiência Humana
ICTV
The Universal Database of the International Committee on
Taxonomy of Viruses
IDGA
Imunodifusão em gel de agarose
LABOVIR
Laboratório de Virologia
LTR
Sequências longas repetidas
LVPR
Lentivírus de pequenos ruminantes
MVV
Vírus Maedi-Visna
nm
Nanômetro
ºC
Graus Celsius
OIE
Organização Internacional de Epizootias
PBS
Solução de tampão de fosfato
PCR
Reação em Cadeia de Polimerase
pH
Potencial Hidrogeniônico
pol
Gene encontrado no genoma retroviral que codifica a
transcriptase reversa
PPGCV
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
rev
Gene de regulação viral
RNA
Ácido ribonucléico
SDS
Dodecil sulfato de sódio
SIV
Vírus da imunodeficiência símia
tat
Gene de regulação viral
tm
Trademark
TNE
Tampão Tris -HCl
UECE
Universidade Estadual do Ceará
vif
Gene de regulação viral
WB
Western Blot
µg
Micrograma
µL
Microlitro
µm
Micrômetro
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................15
2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................16
2.1 Caprinocultura leiteira e características do leite caprino..................................16
2.2 Artrite encefalite caprina ..................................................................................20
2.2.1 Histórico..................................................................................................20
2.2.2 Agente etiológico ....................................................................................20
2.2.3 Sinais clínicos .........................................................................................23
2.2.4 Transmissão ...........................................................................................23
2.2.5 Controle e prevenção..............................................................................24
2.2.6 Epidemiologia .........................................................................................25
2.3 Testes diagnósticos .........................................................................................26
2.3.1 Principais testes......................................................................................26
2.3.2 IDGA .......................................................................................................27
2.3.4 PCR ........................................................................................................28
3. JUSTIFICATIVA ....................................................................................................31
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA .......................................................................................32
5. OBJETIVOS ..........................................................................................................33
5.1 Objetivos gerais ..............................................................................................33
5.2 Objetivos específicos .......................................................................................33
CAPITULO I: Diagnóstico Sorológico e Molecular da CAE a Partir de Amostras
de Leite de Cabras Naturalmente Infectadas. .......................................................34
Resumo .....................................................................................................................34
Introdução .................................................................................................................35
Materiais e Métodos ..................................................................................................37
Animais e amostras ...............................................................................................37
Processamento das amostras ...............................................................................37
IDGA ......................................................................................................................38
PCR .......................................................................................................................38
Análise Estatística..................................................................................................39
Resultados e Discussão ............................................................................................39
Conclusão .................................................................................................................41
Referências ...............................................................................................................41
6. CONCLUSÕES .....................................................................................................45
7. PERSPECTIVAS ...................................................................................................46
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..........................................................................47
ANEXOS ...................................................................................................................63
Anexo 1: Comprovante de submissão de artigo ....................................................64
Anexo 2: Declaração do Comitê de Ética ..............................................................65
1. INTRODUÇÃO
A Artrite Encefalite Caprina conhecida como “CAE”, abrevia•‚o do ingl‡s “caprine
arthritis-encephalitis”, foi descrita pela primeira vez por Cork, 1974 e, somente
alguns anos depois, foi identificado o seu agente etiolƒgico. A CAE • uma doen•a de
carŠter cr’nico que ocasiona preju•zos econ’micos ‘ caprinocultura mundial.
A falta de uma vacina eficaz contra o v•rus faz com que se adote um conjunto de
medidas preventivas para controlar a dissemina•‚o da CAE, instituindo-se um Plano
de Saneamento da CAE o qual tem como meta a forma•‚o de rebanhos livres da
doen•a. Esse plano • baseado em exames sorolƒgicos de todos os caprinos da
propriedade, realizados a cada seis meses sob o acompanhamento de um m•dico
veterinŠrio.
VŠrios s‚o os m•todos diagnƒsticos utilizados, sendo o IDGA o mais simples e
exequ•vel, com alta especificidade e baixa sensibilidade, por•m com boa
aplicabilidade na triagem de rebanhos por ser de fŠcil execu•‚o e n‚o exigir
equipamentos nem instala•Žes sofisticadas, sendo recomendada pela OIE (Oficce
International dês Epizooties, 2004). O IDGA • o teste diagnƒstico mais utilizado em
todo mundo, principalmente em programas de controle da doen•a que jŠ s‚o
empregados em vŠrios pa•ses (Moojen, 2001).
Outras t•cnicas mais precisas v‡m sendo usadas, como a rea•‚o em cadeia de
polimerase (PCR) que consegue detectar a infec•‚o logo no in•cio, no entanto o seu
uso n‚o se justifica para rebanhos, e sim, em situa•Žes espec•ficas de
monitoramento de rebanhos negativos.
Geralmente temos uso do sangue como material biolƒgico de elei•‚o para
exames diagnƒsticos da CAE, o qual requer pessoa qualificada para realiza•‚o da
coleta, trata-se de um m•todo invasivo e muitas vezes estressante para o animal.
O uso do leite como material biolƒgico para diagnƒstico • mais uma alternativa
diagnƒstica na avalia•‚o da CAE em rebanhos caprinos, sendo um avan•o no
controle e preven•‚o dessa enfermidade, por n‚o ser considerado um m•todo
invasivo, e n‚o requerer pessoa qualificada para a coleta das amostras.
15
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Caprinocultura leiteira e características do leite caprino
A cabra foi o primeiro animal a ser domesticado para fins subsistenciais,
desde a produção de leite assim como a produção da carne e obtenção da pele. A
cabra doméstica de hoje é a Capra hircus. Provavelmente os ancestrais mais antigos
dessa cabra sejam dois: a Capra sivalencis e Capra perimensis, conhecidos apenas
em forma de fósseis. Os ancestrais que ainda são encontrados vivos e que
formaram as nossas cabras são: a Capra aegagrus, da qual descende a maioria das
raças (Alpina, Angorá etc.), da região da Pérsia e da Ásia Menor; e a Capra falconezi
que resultou nas cabras de cachemira, da região do Egito (Lev-Yadun et al.,2000).
No Brasil os caprinos foram introduzidos com os colonizadores portugueses,
franceses e holandeses. Porém, somente em 1910 é que figuram importações de
animais com maior potencial de produção (Campos et al., 2003;Egito et al.,2002).
No Brasil a Região Nordeste é detentora de grande parte do rebanho caprino
do país, aproximadamente 91,4% dos 9.450 milhões de caprinos existentes segundo
dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2007), correspondente
a 1,1 % do rebanho mundial (FAO, 2008). Em 2007 o Brasil ocupou a 19º posição na
produção de leite de cabra mundial, segundo a FAO. A Bahia é o grande estado
produtor de caprinos no Brasil, detendo 33,7% do efetivo nacional. Não por
coincidência, dos dez principais municípios produtores, sete são da Bahia.
A criação deste rebanho é direcionada economicamente para a produção de
pele e carne, mas a produção de leite tem sua taxa de participação neste processo,
mesmo que ínfima (apenas 1,3% da produção total de leite produzida no mundo,
aproximadamente 141 toneladas). Muito dos produtores têm a produção de leite
como uma atividade secundária, mas que de certa forma tem alcançado uma
participação importante na economia do país, sendo considerada em algumas áreas
a atividade principal (FAO, 2008).
16
A criação de caprinos na Região Nordeste visando à produção leiteira tem
gerado emprego e renda no setor rural, com alto impacto social e econômico para o
crescimento da região. De acordo com Costa (2005) a produção nacional diária de
leite de cabra é de 22.000 litros, sendo a produção mensal de 660.000 litros e a
produção anual de 7.920.000 litros. O potencial de demanda, mesmo se
considerando que a clientela para o leite de cabra é formada por um público
diferenciado é, com certeza, o dobro destes valores de produção, havendo, portanto,
um déficit de oferta de 22.000 litros de leite por dia e 660.000 litros de leite por mês.
A região Nordeste produz diariamente 10.000 litros de leite de cabra, 45.4%
da produção nacional. O Estado do Rio Grande do Norte é o principal produtor, com
8.500 litros-dia. No Estado do Ceará, a produção de leite diária chega aos 1.000
litros, sendo que a região Norte do Estado apresenta um potencial de produção de
400 litros de leite por dia. A produção do Sudeste é de 12.000 litros, 54.6% de todo o
leite de cabra que é produzido no País, e por apresentar uma cadeia produtiva
organizada, com processamento industrial e a garantia de comercialização do leite e
de seus derivados, o que assegura a evolução do setor. O mercado está subdividido
em venda de leite fluído (93%), venda de leite em pó (4%) e venda de queijos, doces
e iogurtes (3%). O preço médio do leite in natura adquirido aos produtores é de R$
0,70 e o leite pasteurizado chega aos varejistas com o preço médio de R$ 1,30 e
estes repassam aos consumidores a um preço médio de R$ 1,80 (Costa, 2005).
Em propriedades com exploração leiteira, o período de lactação e a produção
de leite diária são características obviamente importantes e são influenciadas por
vários fatores referentes ao indivíduo e ao meio onde ele está inserido. Neste, pode
ser incluídos os fatores reprodutivos como número de parições e número de cabritos
nascidos. Também vale ressaltar que a manutenção prolongada da lactação
resultará em redução na eficiência reprodutiva da cabra no decorrer da sua vida
produtiva. Todas as raças leiteiras carecem de um período de repouso entre as
lactações, que é cerca de 60 dias antes da provável data do parto. Essa interrupção
na lactação tem resultado positivo no acúmulo de colostro na glândula mamária, no
17
desenvolvimento do feto, no ganho nutricional da m‚e e na sua lacta•‚o
subsequente (Andrioli et al., 2006b).
A lacta•‚o • a fase final do ciclo reprodutivo dos mam•feros, sendo que seu
desencadeamento ocorre nas proximidades do parto e sua dura•‚o varia de forma
considerŠvel nas diferentes esp•cies animais. Logo apƒs o parto a secre•‚o • de
colostro, que • rico em gorduras, prote•nas e imunoglobulinas, por•m pobre em
lactose, a mudan•a da sua composi•‚o para o leite normal se dŠ na maioria dos
casos em torno do terceiro ao quarto dia da lacta•‚o (Hafez, 1988).
As gl“ndulas mamŠrias s‚o ƒrg‚os especializados da pele originados
embriologicamente pela invagina•‚o de brotos ectod•rmicos para o interior do
mesoderma subjacente. Seu desenvolvimento come•a no embri‚o e continua de
modo muito lento, durante o per•odo pr•-puberal. Na f‡mea, o seu crescimento
aumenta, apƒs a puberdade, como resultado da estimula•‚o hormonal c•clica
(Dellmann e Brown, 1982).
A gl“ndula mamŠria consiste em gl“ndula t€bulo-alveolar composta. A
unidade secretora consiste em um alv•olo e um ducto, ambos com estrutura
semelhante (Dellmann e Brown, 1982). As por•Žes secretoras t€bulos-alveolares da
gl“ndula mamŠria s‚o constitu•das por um epit•lio glandular que varia de c€bico a
cil•ndrico, e c•lulas mioepiteliais. O l€men apresenta at• 1 mm de largura. As c•lulas
epiteliais apresentam um abaulamento apical que se projeta para dentro da luz, qual
se dispŽem got•culas lip•dicas de at• 5 μm de di“metro, secretadas de modo
apƒcrino. No l€men encontram-se frequentemente glƒbulos de gordura de leite e
material basƒfilo finamente floculado (prote•nas do leite). O citoplasma • basƒfilo
(rico em RE granular, onde s‚o produzidas a prote•nas do leite) (Welsch, 2003).
A gl“ndula mamŠria • dotada da capacidade bioss•ntetizadora de todos os
seus componentes maiores, que s‚o as prote•nas, lactose e gorduras (Bacila, 2003),
possui uma alta atividade metabƒlica e os produtos secretados s‚o os mesmos para
outros tecidos do organismo (Fonseca, 1995).
O leite de cabra possui valor nutritivo e • conhecido contendo os elementos
necessŠrios ‘ nutri•‚o humana, como a•€car (lactose), prote•nas, gorduras,
18
vitaminas, ferro, cálcio, fósforo e outros minerais. O produto tem reação alcalina e
dificilmente azeda no estômago humano, tornando-se assim, um fator de alta
eficiência no tratamento de cólicas em crianças. Ocupa lugar de destaque dentre os
alimentos de origem animal utilizados na alimentação humana, uma vez que fornece
também calorias e aminoácidos essenciais em proporções iguais ou superiores aos
recomendados pela OMS (Gomes et al., 2004).
Sua digestibilidade é elevada e ocorre pelo tamanho reduzido e fácil
dispersão dos seus glóbulos de gordura e pela sua proteína de coagulação que
forma uma coalhada fina, macia e com perfeita digestão em um curto espaço de
tempo (Costa, 2002). Em função disso trata-se de um alimento que não vai ficar
muito tempo no trato digestivo (cerca 30-40 de minutos) evitando ocorrência de
azedamento deste no trato e, como consequência, ocorrência de cólicas. Diferente
do leite caprino, o leite bovino leva em média duas horas ou mais para ser digerido.
Em geral, trata-se de um alimento de alta digestibilidade e com excelente valor
nutricional. O leite caprino quando comparado ao leite bovino é menos alérgeno,
sendo indicado na alimentação de crianças, pessoas idosas e/ou que apresentem
sensibilidade a algumas proteínas encontradas no leite de vaca, como a caseína e a
lactoalbumina, que podem provocar asma brônquica, eczemas na pele, dores
abdominais e diarréias. O leite de cabra também é indicado para pessoas alérgicas à
proteína do leite de vaca ou que estejam com problemas nutricionais ou
gastrointestinais (Silveira, 2008).
Constitui um líquido branco, puro, de odor e sabor especiais e agradáveis. A
cor se deve ao fato de não apresentar caroteno e sim a pró-vitamina A. Possui um
gosto típico que, dependendo de onde os animais estão instalados e da alimentação
que recebem, pode se apresentar mais forte, muitas vezes indesejável. O mau
cheiro, denominado hírcino, é transmitido pelo bode quando este se encontra perto
das cabras em lactação, impregnando-as, além de poder transmiti-lo diretamente ao
leite (Quadros, 2008).
Um dos componentes mais abundantes do leite é a gordura e é o que mais
sofre variação, pois ao contrário da lactose e da proteína do leite, a concentração de
19
gordura estŠ intimamente ligada ‘ nutri•‚o, as condi•Žes ambientais e a a•‚o de
alguns microrganismos, como o CAEV, que reduz os n•veis de gordura do leite,
principalmente de cabras infectadas, que apresentam mastite indurativa (Birgel
J€nior et al., 2007).
Cerca de 50% da gordura do leite • produzida no €bere e • composta por
Šcidos graxos, que s‚o sintetizados na gl“ndula mamŠria e por Šcidos graxos de
cadeia longa, com mais de 18 carbonos, provenientes do plasma sangu•neo (Bacila,
2003). O leite caprino • tamb•m naturalmente rico nos Šcidos graxos volŠteis
caprƒico, capr•lico e cŠprico, comumente utilizados em tratamentos de pessoas com
problemas de mŠ absor•‚o, pela habilidade de fornecer energia, al•m de inibir e
limitar a deposi•‚o de colesterol nos tecidos e dissolver as placas deste (Haenlein,
2004).
• importante que esse leite tenha boa preced‡ncia, ou seja, proveniente de
um rebanho livre de doen•as, entre elas principalmente a CAE (MAPA, 2000).
2.2 ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA
2.2.1 Histƒrico
Inicialmente, a CAE foi caracterizada por artrite progressiva em animais
adultos e encefalomielite desmielinizante em cabritos com idade menor que seis
meses (Cork et al., 1974). O reconhecimento internacional da CAE como uma virose
ocorreu em 1980, apƒs a identifica•‚o do agente, classificado como um lentiv•rus da
fam•lia Retroviridae, denominado CAEV (Crawford et al., 1980; Narayan et al., 1980).
No Brasil, a primeira descri•‚o foi feita no Rio Grande do Sul, com
identifica•‚o de caprinos soropositivos (Moojen et al., 1986). A presen•a do v•rus foi
confirmada atrav•s de posterior isolamento do v•rus de caprinos (H–tzel et al., 1993;
Castro et al., 1999).
2.2.2 Agente etiolƒgico
O v•rus da Artrite-Encefalite Caprina • complexo, n‚o oncog‡nico, esf•rico e
envelopado (Figura 1), possui di“metro de aproximadamente 80 a 100 ηm e um
20
n€cleo c’nico e denso (Gonda et al., 1986; Joag et al., 1996; Jones et al., 2000), no
qual estŠ inserido o RNA gen’mico (Figura 2) que tem aproximadamente 10
Kilobase (Kb), sendo formado por genes estruturais gag (do ingl‡s “group especific
antigens”, ant•genos espec•ficos de grupo), pol (polimerase) e env (envoltƒrio);
genes que regulam a express‚o do genoma viral (tat, rev e vif); e n‚o possui os
genes auxiliares (vpr/vpx, vpu e nef) encontrados no v•rus da Imunodefici‡ncia
Humana e no v•rus da Imunodefici‡ncia S•mia (Narayan et al., 1997; Zee; Hirsh,
2003; Rea-Boutrois et al., 2009).
Figura 1: Estrutura do v•rus da artrite encefalite caprina. (Coffin, 1996) Adaptado.
21
Figura 2: Genoma do vírus da artrite encefalite caprina. (Pinheiro 2001) Adaptado.
Segundo Leroux et al. (1997), a enzima transcriptase reversa (RT) apresenta
uma baixa fidelidade, a qual não apresenta atividade de reparo (exonuclease) e
aliada à recombinação com o genoma de células co-infectadas, contribuiria para
uma elevada taxa de mutação viral.
O ciclo de replicação do CAEV pode ser dividido em duas etapas principais:
infecção e expressão. A fase de infecção dá origem ao provírus e a fase de
expressão resulta na produção do RNA viral e formação de vírions (Gonda, 1994).
O ciclo de replicação do CAEV consiste, resumidamente, na ligação do vírus
pelas glicoproteínas do seu envelope aos receptores da superfície celular; fusão do
envelope à membrana celular; liberação do RNA viral no citoplasma da célula, onde
é transcrito em DNA por ação enzimática da transcriptase reversa; trânsito do DNA
pró-viral para o núcleo da célula parasitada; integração desse DNA em sítios do DNA
celular por meio da enzima integrase, para a formação do provírus; síntese do RNA
viral pela RNA polimerase II celular, utilizando o provírus como molde; transcrição do
genoma em RNA-mensageiros (RNAm); síntese das proteínas virais; montagem;
construção do capsídeo e brotamento do vírus (Coffin, 1996; Perturson; Andrésdótir;
Andrésson, 1992).
22
O provírus, uma vez integrado, é estável, não existindo evidência de qualquer
mecanismo para remoção dos provírus do DNA celular, transposição direta dele para
outro sítio ou replicação independente (Coffin, 1996). A integração do DNA proviral
ao DNA celular não é essencial à replicação dos lentivírus, mas é fundamental para
a persistência da infecção (Haase, 1986).
2.2.3 Sinais clínicos
A forma articular é a mais comum e se manifesta essencialmente nos adultos
(Russo, 1984), bem como a forma pulmonar e mamária. O sistema respiratório e a
glândula mamária foram considerados como passíveis de comprometimento durante
a evolução da CAE, causando, respectivamente, pneumonia intersticial crônica,
frequentemente denominada por pneumonia progressiva dos caprinos, e mamite
intersticial (Lara et al., 2005).
A forma mamária da CAE é frequente e apresenta grande significado
econômico em rebanhos caprinos leiteiros devido ao comprometimento da produção
de leite e predisposição a infecções secundárias da glândula mamária. As cabras
afetadas poderão apresentar mastite aguda ou crônica, sendo que na aguda,
geralmente observada antes da lactogênese, há endurecimento não edematoso do
úbere e uma baixa ou nenhuma produção leiteira. Já na crônica, observada durante
a lactação, há endurecimento e assimetria da mama e o leite aparece com aspecto
normal. Em ambas as formas há hipertrofia persistente dos linfonodos retromamários
e histologicamente se observa mastite intersticial com presença de nódulos linfóides
(Callado et al., 2001).
A sintomatologia nervosa, causada pela encefalite, é a mais rara e ocorre com
maior frequência em cabritos, o que leva a quadros de ataxia secundária e paresia.
Muitos
animais
infectados
não
apresentam
sintomatologia
clínica,
porém
permanecem soropositivos durante toda a sua existência (Cutlip et al., 1992).
2.2.4 Transmissão
23
Caprinos infectados funcionam como reservatório e fonte de infecção do
vírus. A transmissão ocorre por meio de secreções ou excreções ricas em células do
sistema monocítico-fagocitário, principalmente macrófagos, caracterizado pelo
tropismo peculiar do vírus por estas células (Gorrel et al., 1992). A replicação viral
acontece nos macrófagos produzindo lesões do tipo inflamatória. No entanto, outros
tipos de células, como fibroblastos, células epiteliais e células endoteliais também
são suscetíveis à infecção in vivo (Carrozza et al., 2003).
A principal via de transmissão que corresponde a um total de 69% segundo
os apontamentos de Rowe et al. (1991) é a digestiva, geralmente, no período
neonatal, através do leite e ou colostro de cabras infectadas, onde o vírus pode se
encontrar tanto livre como em células somáticas.
A infecção dos cabritos pode
ocorrer pelo contato vaginal com a cria, ingestão acidental de colostro de cabras
infectadas ou transmissão pela mãe para cria através da saliva ou secreções
respiratórias durante a limpeza do neonato (Rowe; East, 1997).
2.2.5 Controle e Prevenção
Não há tratamento especifico para a CAE (East, 1993). A maioria dos animais
que apresentam sintomatologia clínica são descartados ou sacrificados devido à
claudicação, decúbito, perda de peso e redução da produção (Reilly et al., 2002),
sendo que a única forma de evitar sua transmissão é estabelecer medidas de
controle e prevenção da doença. A maneira mais efetiva de controlar a infecção
consiste em se proceder à remoção dos animais infectados e interromper a difusão
do agente. As medidas sanitárias adotadas para o controle e a erradicação da
infecção pelo CAEV estão diretamente relacionadas com o tamanho, o tipo de
exploração, o manejo e o grau de infecção dos rebanhos. Ademais, incluem
medidas, como aplicação de testes sorológicos sensíveis e específicos a serem
realizados semestralmente em todos os caprinos.
O controle e erradicação do CAEV são, principalmente, baseados na
substituição do colostro de cabras infectadas, separação das crias e controle
sorológico regular. Na Suíça, um programa de erradicação do CAEV foi iniciado em
24
1984, e levou à redução da soroprevalência de mais de 60% para menos de 5% no
ano de 1996 (Zanoni et al., 1998).
2.2.6 Epidemiologia
O CAEV foi isolado de caprinos em 1980, embora a artrite-encefalite caprina
(CAE) tenha sido descrita pela primeira vez na década de 1970, nos EUA (Cork,
1974). A partir de então, essa enfermidade se distribuiu mundialmente. Com isso,
diversas técnicas sorológicas são empregadas, com o objetivo de realizar um
levantamento epidemiológico, para se ter conhecimento da prevalência ou da
ocorrência do vírus da CAE (Pinheiro, 2001).
No Brasil, em estudos realizados na região Nordeste, a ocorrência de
caprinos soropositivos para o CAEV no Ceará foi de 40,73% (Melo; Franke, 1997).
Em outro estudo nesse mesmo Estado, foi verificada uma prevalência da infecção
pelo CAEV de 1% (40/ 4019) e, quando os caprinos soropositivos foram agrupados
em faixas etárias, observou-se que aqueles com mais de três anos representaram
32,5% dos animais soropositivos; os de dois a três anos representaram 25%; de um
ano e meio a dois anos, 15%; de um ano a um ano e meio, 20% e, de seis meses a
um ano, 7,5% (Pinheiro; Gouveia; Alves, 2001).
Avaliando somente os reprodutores caprinos desse Estado, Pinheiro;
Gouveia; Andrioli, (1999) verificaram 13,20% de soropositividade e alertaram para o
fato de que a contaminação do rebanho nativo estava ocorrendo por meio da
compra de machos melhorados, que apresentavam anticorpos para o vírus da CAE,
mas que não tinham confirmação diagnóstica para a CAE. Caminha et al, (2008)
realizaram o levantamento sorológico por IDGA, de CAEV, na região metropolitana
de Fortaleza e encontraram 16 (12,8%) positivos entre os 125 caprinos testados.
Nos outros estados da região Nordeste, a prevalência encontrada foi de
13,40%; 0,73% e 26,1% na Bahia (Almeida et al., 2001; Oliveira et al., 2006; Tigre et
al., 2006), de 4,4% e 2,5% no Piauí (Pinheiro et al., 1996; Batista et al., 2004), de
2,2% e 8,2% na Paraíba (Castro et al., 2002; Bandeira et al., 2008), de 11,0% no Rio
Grande do Norte (Silva et al., 2005), de 50,6% no Maranhão (Alves; Pinheiro, 1997),
25
de 17,7% e 3,9% em Pernambuco (Castro et al., 1994; Castro et al., 2002) e de
4,25% em Sergipe (Melo et al., 2003).
Silva, et al. (2005) analisaram amostras de soro caprino no Estado do Rio
Grande do Norte, verificando na ocasião que, do total dos 184 animais testados,
2,71 % foram positivos. Em Pernambuco, Oliveira et al. (2006), analisando amostras
de soro caprino, provenientes de abatedouros, notificaram o fato de que 3,8% eram
positivos a CAEV.
Nos estados da região Sudeste do Brasil, a ocorrência de animais com CAE
observada em São Paulo foi de 43,01% e 34,93% (Leite et al., 2004; Madureira;
Gomes, 2007), em Minas Gerais de 33,3% e 23,6% (Assis; Gouveia, 1994; Gouveia
et al., 1998), Espírito Santo de 47,5% (Gouveia et al., 1998) e no Rio de Janeiro de
29,7%; 21,0% e 10,6% (Assis; Gouveia, 1994; Cunha; Nascimento, 1995; Gouveia et
al., 1998).
Na região Sul do Brasil a prevalência encontrada no Paraná foi de 28,2%
(Sotomayor; Milczewski, 1997). No Rio Grande do Sul, de 6,0% (Moojen et al., 1986)
e em Santa Catarina de 6,72% (Sell, 2000). Em estados de outras regiões brasileiras
como, Goiás, a prevalência relatada foi de 10,0% (Gouveia et al., 1998) e no Pará de
40,0% (Ramos et al., 1996).
2.3 TESTES DIAGNÓSTICOS
2.3.1 Principais testes
Uma vez que não há nenhum tratamento eficaz ou vacina para CAE, medidas
profiláticas devem ser tomadas para reduzir ou eliminar os danos causados pela
doença, tais como a baixa produção de leite, o abate prematuro e perda de potencial
genético de animais afectados. As medidas são baseadas na identificação precisa
dos animais infectados através de testes sorológicos e moleculares adequados,
segregação ou abate dos soropositivos, e controle de colostro e leite destinados à
animais jovens (Callado et al. 2011).
Varios métodos podem ser utilizados no diagnostico da doença sendo eles:
Ensaio Imunoenzimático (ELISA), Reação em cadeia da polimerase (PCR), Reação
26
de
Imunofluorescência
Indireta
(RIFI),
Hibridização
in
situ
(HIS),
Radioimunoprecipitação (RIPA), Western Blot (WB) e Isolamento Viral.
Vários estudos têm descrito o uso da PCR como metodologia para detectar
lentivírus de pequenos ruminantes (LVPR) no sangue e outros tecidos, embora
poucas estimativas de sensibilidade e especificidade tenham sido feitas. As duas
principais dificuldades no desenvolvimento de testes de PCR adequados para LVPR
são a variação da cepa e carga viral baixa in vivo. As sequências alvo para primers
são por toda extensão do genoma e incluem os genes das regiões LTR, gag, pol e
env (De Andrés et al., 2005). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido
aplicada para a pesquisa do DNA proviral de lentivírus caprinos em diferentes
amostras, tais como: sangue, líquido sinovial, leite e soro do leite, tecidos e sêmen
(Reddy et al., 1993; Rimstad et al., 1994; Barlough et al., 1994; Clavijo, Thorsen,
1996; Andrioli et al., 2006).
2.3.2 IDGA
Para o diagnóstico sorológico, o teste de Imunodifusão em Gel de Agarose
(IDGA) é recomendado pela OIE (2004), por ser de fácil aplicabilidade e não exigir
equipamentos nem instalações sofisticadas. Este método é a forma diagnóstica mais
utilizada em todo mundo, principalmente em programas de controle da doença que
já são empregados em vários países (Moojen, 2001). Além da fácil aplicabilidade, o
IDGA tem alta especificidade o que acaba credenciando-o para a realização dos
diagnósticos de triagem nos programas de controle da enfermidade (Varea et al.,
2001).
O IDGA utiliza a partícula viral íntegra concentrada a partir de sobrenadantes
de cultura ou parte do vírion (proteínas virais) adquiridas pela ação de detergentes
ou outros tratamentos. O IDGA detecta anticorpos contra a proteína p28 do capsídeo
do CAEV e contra a glicoproteína de superfície gp135. A técnica baseia-se na
migração radial dupla de antígeno (Ag) e anticorpo (Ac), através da agarose. O
encontro dos reagentes, em proporções ótimas, leva à formação de complexos AgAc insolúveis que precipitam, tornando-se visíveis sob a forma de uma linha ou
banda de precipitação (Figura 03).
27
Figura 03. Reação de precipitação de IDGA
A sensibilidade e a especificidade do teste IDGA para CAEV foram relatadas
sendo 91% e 100%, respectivamente, em relação à Radioimunoprecipitação (RIPA)
utilizando 218 amostras de cabra campo (Knowles et al., 1994). Um recente estudo
examinou 1.941 soros de 693 ovelhas em sequência, no período de 3-4 anos e
encontraram sensibilidade e especificidade para 76,3% e 98,3%, respectivamente,
em relação aos escores consenso obtido pelo Teste Imunoenzimático (ELISA) e
Western Blot (WB) (Varea et al. 2001).
2.3.3 PCR
A detecção de DNA proviral pode ser feita também através da PCR. Esta é
sensível na detecção de pequenas quantidades de ácidos nucléicos virais e é
utilizada para demonstrar a presença de DNA proviral tanto in vivo, como in vitro.
Vários trabalhos têm demonstrado, com sucesso, o uso da técnica de PCR na
detecção do DNA proviral dos LVPR. A PCR permite por amplificação direta de parte
do ácido nucléico viral específica de fluidos e tecidos de um animal infectado (Zanoni
et al.,1990; Reddy et al., 1993; Rimstad et al., 1993; Wagter et al., 1998). DNA
proviral pode ser detectado em células mononucleares e granulócitos presentes no
28
soro de leite, inferindo que o soro lácteo pode ser infectante, difundindo,
consequentemente, os vírus (Russo et al., 1997).
As variações de PCR já estão sendo aplicadas, tais como PCR quantitativa,
desenvolvida por Zhang et al (2000), real-time PCR que foi desenvolvida e
caracterizada in vitro (Gudmundsson et al., 2003) e semi-nested PCR utilizando
primers degenerados, desenvolvida por Eltahir et al. (2006).
Reddy et al. (1993) verificaram também que três animais negativos por IDGA
foram positivos por PCR, enquanto dois animais positivos por IDGA apresentaram
resultado negativo por PCR.
Devido à alta variabilidade genômica dos lentivírus, a escolha dos primers em
genes relativamente conservados como pol, gag e da LTR, combinado a com as
condições de reação para a máxima sensibilidade é decisiva para detecção de um
grande espectro de cepas de campo de ambos CAEV e MVV (Zanoni, 1998).
Wagter e colaboradores (1998) através de PCR, utilizando um mix de seis
primers de três cepas de lentivírus ovino e um de caprino da região conservada do
gene gag, encontraram resultados discordantes com quantidades diferentes de
amostras de sangue (monócitos) demonstrando que a sensibilidade do teste é
limitada ao tamanho da amostra.
Verificaram que quando amostraram 1 mL de sangue de seis animais nenhum
reagiu positivamente, entretanto quando aumentaram a alíquota para 5 mL, cinco
dos seis animais foram positivos e quando utilizaram 10 mL de sangue todos os
animais foram positivos. De 60 animais soropositivos pela IDGA, o PCR do sangue
detectou somente 53. Observaram, também, que a resposta sorológica pode ser
bem lenta até 18 meses após a detecção pelo PCR ou até mesmo não soroconverter
e que o PCR é mais eficiente em detectar DNA no sangue nos estágios iniciais da
doença. A detecção de infecção por LVPR através de PCR é indicativa de uma
infecção persistente e é dependente da quantidade amplificada da sequência alvo e
da especificidade do primer.
Entretanto esta técnica poderá ser utilizada em programas de erradicação,
quando
estiver
disponível
rotineiramente,
para
identificar
os
animais
não
29
diagnosticados por sorologia. É recomendado que esta técnica seja empregada para
esclarecer resultados sorológicos indeterminados ou negativos, devido ao alto custo
e aos resultados discordantes entre testes sorológicos e PCR (Knowles, 1997).
30
3. JUSTIFICATIVA
A busca por métodos diagnósticos que tornem mais eficaz a aplicação de
medidas de prevenção e controle é uma constante, sendo a utilização do soro
extraído do leite mais uma possibilidade na execução do IDGA e PCR. O uso do
soro extraído do leite consiste em um método não invasivo, simples e exequível,
com potencial de produzir respostas nos testes diagnósticos iguais ou superiores
quando comparadas soro sanguíneo.
O emprego do leite como material biológico no exame diagnóstico traria
vantagens ao pequeno e médio produtor, como: facilidade na coleta e redução de
custos, visto que não se faz necessária a mão de obra especializada, onde até o
próprio produtor poderia fazer a coleta das amostras do leite; permitiria a análise
individual e/ou em um pool de amostras de leite de um rebanho; o fato de ser um
método não invasivo mostra uma preocupação com o bem-estar animal; e
apresentar uma sensibilidade semelhante ao método convencional.
Desta forma, este trabalho propõe elucidar e desenvolver uma metodologia
diagnóstica complementar as vigentes, mas que ao mesmo tempo seja de fácil
execução, acessível ao produtor e que tenha acurácia semelhante ou superior à
metodologia convencional.
31
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA
O uso do leite de cabras tem aplicação e eficácia semelhante à apresentada
pelo sangue na realização de métodos diagnósticos (IDGA e PCR) para a CAE.
32
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo geral
Utilizar o leite caprino como amostra clínica para diagnóstico sorológico e
molecular do vírus da CAE.
5.2 Objetivos específicos

Sugerir um protocolo de IDGA para o soro do leite como amostra diagnóstica
em rebanhos caprinos leiteiros;

Realizar os testes sorológico e molecular dos rebanhos envolvidos no projeto
para detecção de anticorpos anti CAEV e DNA proviral no leite e no sangue,
visando medidas de controle preventiva desta enfermidade;

Comparar a eficácia do IDGA e PCR em amostras de soro sanguíneo e leite
no diagnóstico da CAE.
33
CAP˜TULO I: Diagnóstico sorológico e molecular da CAE a partir de amostras
de leite de cabras naturalmente infectadas
Danilo Saraiva Ara€jo 1, Kelma Costa de Souza1, Apoliana de Sousa Rodrigues1,
Victor Manoel de Lacerda Freitas1, Maria FŠtima da Silva Teixeira1
1 Laboratƒrio de Virologia - Faculdade de VeterinŠria – Universidade Estadual do
CearŠ – Fortaleza,CE. Av. Paranjana, 1700, 60740-903, e-mail:
[email protected]
Resumo
A Artrite encefalite caprina (CAE) • uma doen•a infecciosa, multissist‡mica, causada
por um lentiv•rus, pertencente ‘ fam•lia Retroviridae, que acomete caprinos de todas
as idades. • uma enfermidade de carŠter cr’nico que ocasiona preju•zos
econ’micos na caprinocultura. A falta de uma vacina eficaz contra o v•rus faz com
que se adote um conjunto de medidas preventivas para controlar a dissemina•‚o da
CAE. Os testes diagnƒsticos da CAE mais utilizados atualmente s‚o os sorolƒgicos:
imunodifus‚o em gel de agarose (IDGA), ensaio imunoenzimŠtico (ELISA), e os
moleculares: Rea•‚o em Cadeia da Polimerase (PCR) Western Blotting, todos eles
tendo como principal insumo o sangue. O uso do leite como material biolƒgico no
exame diagnƒstico traria vantagens ao pequeno e m•dio produtor, como a facilidade
na coleta e redu•‚o de custos. Esta pesquisa teve como objetivo comparar o
desempenho do leite no diagnƒstico da artrite e encefalite caprina utilizando IDGA e
PCR em rela•‚o ao sangue. A PCR leader gag, das amostras de sangue e leite,
detectou 100 e 96,7% respectivamente, dos animais infectados enquanto que o
IDGA detectou 60 e 16,6%. Os resultados obtidos confirmam a possibilidade de
utiliza•‚o do leite como insumo para a realiza•‚o da PCR.
Palavras-chave: CAEV, IDGA, Leite, PCR, Sangue
34
Abstract
The caprine arthritis encephalitis (CAE) is a multisystemic infectious disease, caused
by lentivirus belonging to the Retroviridae family, which affects goats of all ages. It is
a chronic disease that causes economic losses in goat farming. The lack of an
effective vaccine against the virus that causes adopt a set of preventive measures to
control the spread of CAE. The most widely used diagnostic tests of CAE are the
serologic agarose gel immunodiffusion (AGID), enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA), and the molecular Polymerase Chain Reaction (PCR) Western Blotting, all
with the primary sample the blood of infected animals. The use of milk as biological
material in diagnostic test would bring some advantages to small and medium
producers, such as ease of collection and reduce costs. This study aimed to compare
the performance of milk in diagnosis of caprine arthritis and encephalitis using PCR
and AGID in relation to blood. PCR gag leader, samples of blood and milk, detected
100 and 96.7% respectively of animals infected while the AGID detected 60 and
16.6%. The results confirm the possibility of using milk as material for the PCR.
Keywords: AGID, Blood, CAEV, Milk, PCR,
1. Introdução
A
Artrite
encefalite
caprina
(CAE)
é uma
doença
infecciosa,
multissistêmica, causada por um lentivírus, pertencente à família Retroviridae, que
acomete caprinos de todas as idades. É uma doença de caráter crônico que
ocasiona prejuízos econômicos na caprinocultura. A falta de uma vacina eficaz
contra o vírus faz com que se adote um conjunto de medidas preventivas para
controlar a disseminação da CAE.
As principais manifestações clínicas da doença são a leucoencefalomielite
que acomete caprinos jovens (Cork et al., 1974) e artrite mais frequente nos adultos
(Crawford et al., 1980). Existem registros que pulmões e glândulas mamárias
também podem ser afetados, causando, respectivamente, uma pneumonia crônica
35
intersticial, denominada por pneumonia progressiva dos caprinos, e uma mamite
intersticial endurativa (Sims et al., 1983; Lerondelle, et al., 1989).
Dentre as principais vias de transmissão a ingestão de colostro e de leite de
cabras infectadas são as formas mais importantes de transmissão da doença
(Crawford e Adams, 1981; Adams et al., 1983; East et al., 1987; Rowe et al., 1992).
O diagnóstico laboratorial pode ser realizado por técnicas diretas ou indiretas.
A detecção direta da presença do vírus pode se dar tanto pelo isolamento em cultura
celular e evidenciação do vírus em microscopia eletrônica, como também através da
reação em cadeia da polimerase e da hibridização in situ. A determinação indireta da
infecção pelo CAEV se faz pela detecção da presença de anticorpos por técnicas
sorológicas como: imunodifusão em gel de agarose (IDGA), ensaio imunoenzimático
(ELISA), imunofluorescência indireta (IFI) e Western Blotting (WB) (Reischak, 2000).
Embora a IDGA seja a principal forma de detecção de animais infectados pelo
CAEV e o teste indicado pela World Organization for Animal Health (OIE), possui um
valor limitado na identificação de animais em fase inicial da infecção (Frota et al.,
2005). Por isso, para o diagnóstico precoce da enfermidade técnicas moleculares de
detecção viral têm sido aplicadas, dentre elas a PCR, cujo objetivo é a amplificação
in vitro dos ácidos nucleicos, permitindo a obtenção de milhares de cópias de uma
sequência específica de DNA (Frota et al., 2005; Andrioli et al., 2006).
De acordo com Brinkhof et al.(2010), grande parte dos custos dos testes
estão relacionados à coleta das amostras de sangue que em muitos países é
legalmente restrito à veterinários. O uso do leite como material biológico no exame
diagnóstico traria vantagens ao pequeno e médio produtor, como: facilidade na
coleta e redução de custos, já que não se faz necessária à mão de obra
especializada, onde até o próprio produtor poderia fazer a coleta das amostras do
leite.
Diante do exposto, esta pesquisa teve como objetivo comparar o desempenho
do leite no diagnóstico do vírus da artrite e encefalite caprina utilizando IDGA e PCR
em relação ao sangue.
36
2. Material e Métodos
2.1 Animais e amostras
Amostras de sangue e leite oriundas de cabras Saanen e mesti•os f1 Saanen
x Anglo nubiana naturalmente infectadas com CAEV (n=30) foram coletadas em uma
propriedade leiteira na regi‚o metropolitana de Fortaleza, CearŠ. O sangue foi
coletado por venopun•‚o da jugular em dois tipos de tubos, um contendo
anticoagulante (heparina) e outro com ativador de coŠgulo, e mantido sob
refrigera•‚o em caixas isot•rmicas. As amostras de leite foram coletadas em tubos
tipo falcon de propileno de 50mL diretamente do teto higienizado (pr• dipping).
2.2 Processamento das Amostras
a. Sangue
As amostras de sangue foram submetidas ‘ centrifuga•‚o a 1500g durante 10
minutos. As amostras contendo heparina que foram centrifugadas tiveram a fra•‚o
de leucƒcitos removida para extra•‚o do DNA. Os soros das amostras sem o
anticoagulante foram removidos e conservados a -20™C at• a realiza•‚o do IDGA.
Para a extra•‚o do DNA proviral das amostras foi utilizado o protocolo
descrito por Caldas e colaboradores (2000), onde a fra•‚o de leucƒcitos (≅ 100šL)
foi transferida para um tubo de 1,5 mL contendo 500šL de TE (10 mM Tris, 1 mM
EDTA) e centrifugada a 2700g por cinco minutos. O sobrenadante foi descartado e a
opera•‚o repetida. Em seguida o pellet foi ressuspenso em 500šL de tamp‚o k
(10mM de Tris HCl pH 8,0; 50mM de KCl; 2mM de MgCl2; 0,5% de Tween 20;
100μg/mL de proteinase K= 0,1μg/μL) agitado em vƒrtex, incubado a 56› C por
45minutos e para inativa•‚o da proteinase K, a amostra foi submetida a 95› C
durante 10 minutos.
b. Leite
37
As amostras de leite foram aliquotadas em dois tubos tipo Falcon de 15 mL
sendo o primeiro destinado à sorologia e o segundo à PCR.
Para a utilização do soro do leite, as amostras foram centrifugadas a 1500g
durante 10 minutos sendo o soro removido com micropipeta e submetido à repetição
deste procedimento por mais duas vezes. Ao final, o soro do leite foi transferido para
tubos de 1,5 mL e armazenados a -4º C até a utilização.
As amostras de leite foram diluídas 1:3 em solução salina tamponada (PBS) e
submetidas a centrifugação a 1500 g por dez minutos. Após a centrifugação a
gordura foi mecanicamente removida com o auxílio de algodão e o sobrenadante
desprezado. Este procedimento foi repetido por duas vezes. O sedimento foi diluído
em 100µL de PBS e destinado à extração (Caldart, 2011). Posteriormente, as
amostras foram submetidas à extração do DNA proviral utilizando o mesmo
protocolo das células sanguíneas.
2.3 IDGA
Para o diagnóstico do CAEV foi utilizado o kit de IDGA (Biovetech®). As
placas tiveram suas leituras realizadas após 48 horas de incubação em câmara
úmida, de acordo com as recomendações do fabricante.
2.4 PCR
Foram realizadas duas rodadas de amplificação (PCR-Nested) para amplificar
os fragmentos de 187 pb do DNA proviral, correspondente a sequência leader gag
do genoma do CAEV. Os primers utilizados com base na sequência publicada das
cepas CAEV-Co, conforme descrito por Saltarelli et al. (1990) e adaptado por Feitosa
(2007). Os primers GEX5 (5-CAAGCAGCAGGAGGGAGAAGCTG-3) e GEX3 (5TCCTACCCCCATAATTTGATCCAC-3)
correspondentes
às
bases
953-975
foram
e
utilizados
o
para
complemento
a
de
amplificação,
1249-1226,
respectivamente. Os primers GIN5 (5-GTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATG-3)
e GIN3 (5-ACCTTTCTGCTTCTTCATTTAATTTCCC-3) foram utilizados para a
segunda amplificação, correspondendo às bases 997-1024 e o complemento de
38
1181-1154,
respectivamente.
A
amplificação
foi
realizada
utilizando
um
termociclador MG96+ (Biocycler). O primeiro e o segundo round da PCR foram
realizadas utilizando 35 ciclos de.: 5 min a 94°C, 1 min a 94°C, 1 min a 56°C, 45 s
em 72°C, após o último ciclo, as amostras foram incubadas a 72°C por 7 min. Após
a amplificação, os produtos de PCR de cada amostra foram visualizados por
eletroforese em gel de agarose 1,0% contendo brometo de etídio em tampão
TBE(Tris-borato-EDTA) 1X.
2.5 Análise Estatística
Os dados foram tabulados no programa Microsoft Office Excel 2007 e,
posteriormente, processados utilizando, estatística descritiva. Sendo distribuídos em
tabelas, gráficos e figuras.
3. Resultados e Discussão
As amostras de sangue e leite na PCR leader gag detectaram o vírus em 100
e 96,7%,respectivamente, dos animais infectados (Fig.1).O desempenho do leite na
PCR leader gag foi semelhante ao sangue. Entretanto, esses dados diferem dos
resultados encontrados por Brinkhof et al. (2010) que obteve 39% de sensibilidade
nas amostras de sangue e 61% de sensibilidade nas amostras de leite.
Figura 1-Concordância (%) dos resultados das amostras de sangue e leite utilizando os testes de IDGA e PCR.
Outro estudo realizado por Gregory et al. (2009) utilizando amostras de leite
oriundas de caprinos infectados detectou apenas 22,6% dos animais positivos
39
utilizando PCR nested. Os resultados do PCR utilizando o leite como insumo foram
equivalentes aos observados no sangue, divergindo em apenas um animal. Os
dados, com PCR do leite, obtidos nesse estudo apresentam subs•dios para
utiliza•‚o
do
leite
em
programas
de
monitoramento
podendo
reduzir
significativamente os custos, aumentando sua viabilidade (Bartels et al., 2005; van
Weering et al., 2007; Kramps et al., 2008).
Figura 2-Eletroforese em gel de agarose 1% PCR leader gag (nested) de amostras de leite. L-Marcador
molecular 1-6- amostras de leite positivas, 7- amostra de leite negativa, - controle negativo e + controle positivo.
A imunodifus‚o em gel de agarose para o sangue apresentou um
desempenho inferior a PCR, detectando apenas 18 dos 30 animais positivos, como
descritos em outro estudos (Modolo et al., 2009; Wagter et al., 1998) (Tabela 01).
Tabela 01- Compara•‚o dos testes IDGA e PCR utilizando leite e sangue.
IDGA
PCR
Sangue
18/30*
30 /30*
Leite
5 /30*
29 /30*
*Animais positivos/Total de animais
A utiliza•‚o de leite no IDGA detectou apenas 5 dos 30 animais positivos
(Tabela 01). O leite de cabra possui em m•dia 3,3g de prote•nas: case•na,
Lactoalbumina, β-Lactoglobulina dentre outras (Hafez, 1988; Bacila, 2003). A
presen•a de outras prote•nas e outros debris podem interferir diretamente na
difusibilidade dos anticorpos presentes no soro do leite. Outros fatores como o
40
per•odo de lacta•‚o e per•odo de infec•‚o podem ainda influenciar a elimina•‚o de
anticorpos no leite (Tizard, 1998). O IDGA necessita de uma quantidade de
anticorpos relativamente alta (30 šg/cm•) para ser identificado (Tizard, 1998). Wagter
et al., (1998) afirmam que a produ•‚o de anticorpos detectŠveis pelo IDGA • lenta,
podendo ocorrer em per•odos maiores que um ano apƒs a detec•‚o pelo PCR ou
at• mesmo n‚o acontecer.
Esses dados corroboram com os achados desse estudo em rela•‚o a
utiliza•‚o do leite como insumo do teste de IDGA. Diante disso a perspectiva do uso
de leite em IDGA com resultados mais prƒximos dos obtidos com o sangue deve ser
investigada para elucidar os fatores que podem influenciar esse teste.
4. Conclusão
Os resultados obtidos confirmam a possibilidade de utiliza•‚o do leite como insumo
da PCR. Entretanto, outros estudos s‚o necessŠrios para validar seu uso em
programas de monitoramento.
5. Referências
ADAMS, D.S.; KLEVJER-ANDERSON, P.; CARLSON, J.L.; MCGUIRE, T.C.;
GORHAM, J. R. Transmission and control of caprine arthritisencephalitis virus. Am.
J. Vet. Res., V. 44, p.1670–1675, 1983.
BACILA, M. Bioqu•mica VeterinŠria S‚o Paulo: ROBE Editorial, 2003, p. 429-447.
BARTELS, C.J., VAN MAANEN, C., VAN DER MEULEN, A.M., DIJKSTRA, T.,
WOUDA, W., 2005. Evaluation of three enzyme-linked immunosorbent assays for
detection of antibodies to Neospora caninum in bulk milk. Vet. Parasitol. 131, 235–
246
41
BRINKHOF, J. M.; HOUWERS, D. J.; MOLL, L.; DERCKSEN, D.; VAN MAANEN, C.
Diagnostic performance of ELISA and PCR in identifying SRLV-infected sheep and
goats using serum, plasma and milk samples and in early detection of infection in
dairy flocks through bulk milk testing. Vet Microbiol, v.142, p.193-8, 2010.
CALDART, E.T; CHIAPPETTA, C.M; LOPES, E.F; RAVAZZOLO, A.P. AnŠlise
comparativa de m•todos de extra•‚o de DNA gen’mico de celulas do sangue e do
leite de pequenos ruminantes. Acta Scientiae Veterinariae. 39(1): 945, 2011.
CORK, L.C.; HADLOW, W.J.; CRAWFORD, T.B.; GORHAM, J.R.; PIPER, R.C.
Infectious leukoencephalomyelitis of young goats. J. Infect. Dis., v.129, n.2, p.134141, 1974.
CRAWFORD, T.B.; ADAMS, D.S.; CHEEVERS, W.P. Chronic arthritis in goats
caused by a retrovirus. Science, v.207, n.29, p.997-999, 1980.
CRAWFORD, T.B; ADAMS, D.S. Caprine arthritisencephalitis: clinical features and
presence of antibody in selected goat populations. J. Am. Vet. Med. Assoc., v.178,
n.7, p.713-719, 1981.
EAST, N.E., ROWER, J.D., MADEWELL, B.R., FLOYD, K. Serologic prevalence of
caprine arthritis encephalitis virus in California goat dairies. J. Am. Vet. Assoc. 190,
182-186, 1987.
FEITOSA, A. L. V. L. AnŠlise filogen•tica de lentiv•rus de pequenos ruminantes
isolados do CearŠ. 2007. 84p. Disserta•‚o (Mestrado em Ci‡ncias VeterinŠrias) –
Programa de Pƒs Gradua•‚o em Ci‡ncias VeterinŠrias, Universidade Estadual do
CearŠ.
42
FROTA, M. N. L.; SILVA, J. B. A.; ARAžJO, S. A. C.; TEIXEIRA, M. F. S.
Artriteencefalite caprina em cabritos de rebanhos com programa de controle no
Estado do CearŠ. Arquivos do Instituto Biolƒgico, S‚o Paulo, v. 72, n. 2, p. 147 –
152, 2005.
GREGORY, L.; LARA, M.C.C.S.H.; VILLALOBOS, E.M.C.; HASEGAWA, M.Y.;
CASTRO, R.S.; RODRIGUES, J.N.M.; ARAžJO, J.; KELLER, L.W.; DURIGON, E.L.
Detec•‚o do v•rus da Artrite Encefalite Caprina em amostras de leite de cabras pela
rea•‚o em cadeia da polimerase (PCR) e nested-PCR.Ars VeterinŠria, v.25, n.3,
p.142-146, 2009.
HAFEZ, E. S. E. Reprodu•‚o Animal. 4 ed. S‚o Paulo: MANOLE, p. 322-345, 1988.
KRAMPS, J.A., van MAANEN, K., MARS, M.H., POPMA, J.K., van RIJN, P.A.
Validation of a commercial ELISA for the detection of bluetongue virus (BTV)-specific
antibodies in individual milk samples of Dutch dairy cows. Vet. Microbiol. 130, 80–87,
2008.
LERONDELLE, C.; FLEURY, C.; VIALARD, J. Le glande mammaire: organe cible de
l’infection par le virus de l’arthrite et de l’enc•phalite caprine. Ann. Rech. Vet., v.20,
n.1, p.57-63, 1989.
MODOLO, J. R., C. R. STACHISSINI, C. R. PADOVANI, J. P. ARAžJO JžNIOR, R.
S. CASTRO, A. P. RAVAZZOLO e B. L. S. LEITE. PCR associated with agar gel
immudiffusion assay improve caprine arthritis-encephalitis (CAEV) control. Small.
Rumin. Res., v. 81, p. 18-20, 2009.
REISCHAK, D. Lentiv•rus de Pequenos Ruminantes: Imunofluoresc‡ncia utilizando
isolados brasileiros para diagnƒstico sorolƒgico de infec•‚o em ovinos e caprinos.
43
Porto Alegre, 2000. 132p. [Disserta•‚o (Mestrado) – Faculdade de VeterinŠria,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul].
ROWE, J. D.; EAST, N. E.; THURMOND, M. C.; FRANTI, C. E.; PEDERSEN, N. C.
Cohort study of natural transmission and two methods for control of caprine arthritisencephalitis virus infection in goats on a California dairy. Am. J. Vet. Res., v.53,
p.2386–2395, 1992.
SALTARELLI, M., QUERAT, G., KONINGS, D.A., VIGNE, R., CLEMENTS, J.E.
Nucleotide sequence and transcriptional analysis of molecular clones of CAEV which
generate infectious virus. Virology 179, 347–364, 1990.
SIMS, L.D.; HALE, C.J.; MCCORMICK, B.M. Progressive intersticial pneumonia in
goats. Aust. Vet. J., v.60, n.12, p.368-371, 1983.
TIZARD, I. R. Introdu•‚o ‘ Imunologia veterinŠria. 2. S‚o Paulo: Roca, 1998. ISBN
978-85-352-3087-1.
van WEERING, H., van SCHAIK, G., van der MEULEN, A., WAAL, M., FRANKEN,
P., van MAANEN, K., 2007. Diagnostic performance of the Pourquier ELISA for
detection of antibodies against Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in
individual milk and bulk milk samples of dairy herds. Vet. Microbiol. 125, 49–58.
WAGTER, L.H.A., JANSEN, A., BLEUMINK-PLUYM, J.A., LENSTRA, J.A.,
HOUWERS, D.J. PCR detection of lentiviral gag segment DNA in the white blood
cells of sheep and goats. Vet. Res. Communin., v.22, p.355-262, 1998.
44
6. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos confirmam a possibilidade de utilização do leite como
insumo da PCR. Entretanto, outros estudos são necessários para validar seu
uso em programas de monitoramento.
.
45
7. PERSPECTIVAS
Esses dados corroboram com os achados de outros estudos que utilizaram o
leite como insumo de diagnóstico. No entanto, os fatores que podem influenciar o
uso do leite no IDGA devem ser investigados, utilizando diferentes tratamentos das
amostras de leite com o objetivo de melhorar a difusibilidade.
Surge também a perspectiva da utilização de um pool de amostras de leite
como uma forma de aumentar a viabilidade financeira dos testes de PCR.
46
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADAMS, D.S; CRAWFORD, T.B.; BANKS, K.L.; MCGUIRE, T.C.; PERRYMAN, L.E.
Immune responses of goats persistently infected with caprine arthritis-encephalitis
virus. Infect. Immun., v.28, n.2, p.421-427, 1980.
ADAMS, D.S.; KLEVJER-ANDERSON, P.; CARLSON, J.L.; MCGUIRE, T.C.;
GORHAM, J. R. Transmission and control of caprine arthritisencephalitis virus. Am.
J. Vet. Res., V. 44, p.1670–1675, 1983.
ALMEIDA, M. G. A. R.; ANUNCIA ¡O, A. V. M.; FIGUEREDO, A.; MARTINEZ, T. C.
N.; LABORDA, S. S. Dados sorolƒgicos sobre a presen•a e distribui•‚o da Artrite Encefalite Caprina (CAE) no estado da Bahia, Brasil. Revista Brasileira de Saúde e
Produção Animal, v. 1, n. 3, p. 78 – 83, 2001.
ALVES, F. S. F.; PINHEIRO, R. R. A import“ncia do leite de cabra na
nutri•‚ohumana. Revista Agropecuária Catarinense, v. 16, n. 1, 2003.
ANDRIOLI, A.; GOUVEIA, A. M. G.; PINHEIRO, R. R.; ROCHA, M. A.; MARTINS, A.;
Detec•‚o do DNA prƒ-viral do lentiv•rus caprino em s‡men de bodes naturalmente
infectados. Revista Brasileira de Reprodu•‚o Animal, v. 23, n.3, p.420-421, 1999.
ANDRIOLI, A.; SOUZA, K. C.; PINHEIRO, R. R.; SOUSA, F. M. L. Dez. Protocolos
para extra•‚o do DNA-proviral e PCR do lentiv•rus caprino em sangue. Comunicado
T•cnico Embrapa. 2006a.
ANDRIOLI, A.; GOUVEIA, A. M. G.; MARTINS, A. S.; PINHEIRO, R. R.; SANTOS, D.
O. Fatores de risco na transmiss‚o do lentiv•rus caprino pelo s‡men. Pesquisa
AgropecuŠria Brasileira, Bras•lia, v. 41, n. 8, p. 1313 – 1319, agosto, 2006b.
47
ANDRIOLI, A.; SANTOS, D. O.; ELOY, A. M. X. Manejo reprodutivo de matrizes e
reprodutores caprinos em sistema de produ•‚o de leite. Sobral, CE: Embrapa
Caprinos, 2006b. 33 p. (S•rie documento, 65)
ASSIS, A. P. M. V.; GOUVEIA, A. M. G. Evid‡ncia sorolƒgica de Lentiv•rus (Maedi
Visna/Atrite-encefalite caprina) em rebanhos nos Estados de MG, RJ, BA e CE. In:
94 CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERIN‹RIA, XXIII, 1994, Recife.
Anais... Recife: SPMV, 1994. p. 104.
BACILA, M. Bioqu•mica VeterinŠria S‚o Paulo: ROBE Editorial, 2003, p. 429-447.
BANDEIRA, D. A. B.; DE CASTRO, R. S.; AZEVEDO, E. O.; MELO, L. S. S.; MELO,
C. B. Seroprevalence of Caprine Arthritis–Encephalitis Virus in goats in the Cariri
region, Paraiba state, Brazil. The Veterinary Journal, v. 180, n. 3, p. 399-401, 2009.
BARLOUGH, J.; EAST, N.; ROWE, J. D.; HOOSEAR, K. V.; DEROCK, E.;
BIGORNIA, L.; RIMSTAD, E. Double-nested polymerase chain reaction for detection
of caprine arthritis-encephalitis virus proviral DNA in blood, milk, and tissues of
infected goats. Journal of Virological Methods, v.50, p.101-114, 1994.
BARTELS, C.J., VAN MAANEN, C., VAN DER MEULEN, A.M., DIJKSTRA, T.,
WOUDA, W., 2005. Evaluation of three enzyme-linked immunosorbent assays for
detection of antibodies to Neospora caninum in bulk milk. Vet. Parasitol. 131, 235–
246
BATISTA, M. C. S.; DE CASTRO, R. S.; CARVALHO, F. A. A.; CRUZ, M. S.
P.;SILVA, S. M. M. S.; REGO, E. W.; LOPES, J. B. Anticorpos anti-Lentiv•rus
depequenos ruminantes em caprinos integrantes de nove munic•pios Piauienses.
Ciência Veterinária nos Trópicos, v.7, n 2 e 3, p. 75 – 81, 2004.
48
BIRGEL JžNIOR, E. H.; CESTARI, V.; SAMPAIO, R. M.; LARA, M. C. C. S. H.;
BIRGEL, D. B.; RAIMONDO, R. F. S.; BRANDESPIN, F. B.; BIRGEL, E. H. Influ‡ncia
da infec•‚o pelo v•rus da Artrite-Encefalite Caprina nas caracter•sticas f•sicoqu•micas
e celulares do leite de caprinos. Arquivos do Instituto Biolƒgico, S‚o Paulo v. 74, n.
3, p. 199 – 206, julho/ setembro, 2007.
BRINKHOF, J. M.; HOUWERS, D. J.; MOLL, L.; DERCKSEN, D.; VAN MAANEN, C.
Diagnostic performance of ELISA and PCR in identifying SRLV-infected sheep and
goats using serum, plasma and milk samples and in early detection of infection in
dairy flocks through bulk milk testing. Vet Microbiol, v.142, p.193-8, 2010.
CALDART, E.T; CHIAPPETTA, C.M; LOPES, E.F; RAVAZZOLO, A.P. AnŠlise
comparativa de m•todos de extra•‚o de DNA gen’mico de celulas do sangue e do
leite de pequenos ruminantes. Acta Scientiae Veterinariae. 39(1): 945, 2011.
CALLADO, A. K. C.; DE CASTRO, R. S.; TEIXEIRA, M. F. S. Lentiv•rus de pequenos
ruminantes (CAEV e Maedi-visna): revis‚o e perspectivas. Pesquisa VeterinŠria
Brasileira, v. 21, n. 3, p. 87 – 97, 2001.
CARROZZA, M. L.et al. In situ PCR-associated immunohistochemistry identifies cell
types harbouring the Maedi-Visna virus genome in tissue sections of sheep infected
naturally. In: (Ed.). J VirolMethods. Netherlands, v.107, 2003. p.121-7. ISBN 01660934.
CASTRO, R. S.; NASCIMENTO, S. A.; ABREU, S. R. O. Evid‡ncia sorolƒgica de
infec•‚o pelo v•rus da artrite-encefalite caprina em caprinos leiteiros do Estado de
Pernambuco. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.46, n. 5, p.
571-572, 1994.
CASTRO, R.S.; LEITE, R.C.; RESENDE, M.; MARTINS, A. & GOUVEIA, A.M.G.
Caprine arthritis encephalitis virus isolation and identification using fluorescente
49
antibody and polymerase chain reaction. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.51, n.3,
p.235-240, 1999.
CASTRO, R. S.; AZEVEDO, E. O.; TABOSA, I.; NASCIMENTO, S. A.; OLIVEIRA, M.
M. M. Anticorpos para o V•rus da Artrite-Encefalite Caprina em animais sem ra•a
definida (SRD) de abatedouros dos estados de Pernambuco e Para•ba. Ciência
Veterinária nos Trópicos, v. 5, n. 2 – 3, p. 121 – 123, 2002.
CLAVIJO, A.; THORSEN, J. Application of polymerase chain reaction for the
diagnosis of caprine arthritis-encephalitis. Small Ruminant Research, v.22, p.69-77,
1996.
COFFIN, J. M. Retroviridae: the virus their of replication. In: ____. Fields Virology.
3eds. Philadelphia: Lippincoh-Raven, 1996. cap.5, p. 1767-1847.
CORK, L. C.; HADLOW, W.J.; CRAWFORD, T. B.; GORHAM, J. R.; PIPER, R. C.
infectious leukoencephalomyelitis of young goats. Journal Infectious Disease, v. 129,
p. 134-141, 1974.
COSTA, A. L. Leite caprino: um novo enfoque de pesquisa – EMBRAPA Caprinos.
2005.
Acesso
em
15
de
fevereiro
de
2010.
Dispon•vel
em:
http://www.cnpc.embrapa.br/artigo4.htm.
CAMPOS,A.C.N;NUNES,J.F;SILVA
FILHO,
A.H.S;
MONTEIRO,
A.
W.
U.
Par“metros biom•tricos do trato genital masculino de caprinos sem ra•a definida
(SRD) criados no semi-Šrido nordestino durante o per•odo seco e chuvoso. Brazilian
Journal of Veterinary Research and Animal Science v.40 p.185-189, 2003.
CRAWFORD, T.B.; ADAMS D,.S.; CHEEVERS, W.P.; CORK, L.C. Chronic arthritis
in goats caused by a retrovirus. Science, v.207, n.29, p.997-999, 1980.
50
CRAWFORD, T.B; ADAMS, D.S. Caprine arthritisencephalitis: clinical features and
presence of antibody in selected goat populations. J. Am. Vet. Med. Assoc., v.178,
n.7, p.713-719, 1981.
CUNHA, R. G.; NASCIMENTO, M. D. Ocorr‡ncia de anticorpos para o v•rus
daartrite-encefalite caprina em soros de caprinos do estado do Rio de Janeiro.
Revista Brasileira de Medicina Veterinária, v. 17, n. 2, p. 72 - 75, 1995.
CUTLIP, R. C.
et al. Ovine progressive pneumonia (maedi-visna) in sheep.
Veterinary Microbiology, v. 17, n. 3, p. 237-250, 1988.
CUTLIP, R. C.; LEHMKUHL, H. D.; SACKS, J. M.; WEAVER, A. L. Prevalence of
antibody to caprine arthritis-encephalitis virus in goat in the United States. Journal of
American Veterinary Medical Association, v. 200, p. 802 – 805, 1992.
DE ANDR•S, D.; KLEIN, D.; WATT, N. J.; BERRIATUA, E.; TORSTEINSDOTTIR,
S.; BLACKLAWS, B. A. & HARKISS, G. D. Diagnostic tests for small ruminant
lentiviruses. Veterinary Microbiology, v.107, p.49-62, 2005.
DELLMANN, H.; BROWN E. M. Histologia veterinŠria. 1. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 1982.
EAST, N.E; ENCEFALITE/ARTRITE CAPRINA, In: SMITH, B.P., Tratado de
Medicina Interna de Grandes Animais. S‚o Paulo: Manole, 1993. p.1738.
EGITO, A.A; MARIANTE, A.S; ALBUQUERQUE, M.S.M. Programa brasileiro de
conserva•‚o de recursos. Archivos de zootecnia v. 51, p. 40, 2002.
ELTAHIR, Y. M., DOVAS, C.I., PAPANASTASSOPOULOU, M., KOUMBATI,
M.,GIADINIS, N., VERGHESE-NIKOLAKAKI, S., KOPTOPOULOS, G.Development
of a semi-nested PCR using degenerate primers for the generic detection ofsmall
ruminant lentivirus proviral DNA. Journal of Virological Methods 135, 240–246, 2006
51
FAO - (Food and Agriculture Organization of United Nations). Acesso em 25 de
agosto de 2010. Dispon•vel em: http://www.fao.org/corp/statistics/en/.
FEITOSA, A. L. V. L. AnŠlise filogen•tica de lentiv•rus de pequenos ruminantes
isolados do CearŠ. 2007. 84p. Disserta•‚o (Mestrado em Ci‡ncias VeterinŠrias) –
Programa de Pƒs Gradua•‚o em Ci‡ncias VeterinŠrias, Universidade Estadual do
CearŠ.
FIENI, F.; ROWE, J.; VAN HOOSEAR, K.; BURUCOA, C.; OPPENHEIM, S.;
ANDERSON, G.; MURRAY, J.; BONDURANT, R. Presence of caprine arthritisencephalitis virus (CAEV) infected cells in flushing media following oviductal-stage
embryo collection. Theriogenology, v.57, p.931-40, 2002.
FONSECA, F. A. Fisiologia da lacta•‚o.Vi•osa: Imprensa UniversitŠria, 1995. 137p.
FROTA, M. N. L.; SILVA, J. B. A.; ARAžJO, S. A. C.; TEIXEIRA, M. F. S.
Artriteencefalite caprina em cabritos de rebanhos com programa de controle no
Estado do CearŠ. Arquivos do Instituto Biolƒgico, S‚o Paulo, v. 72, n. 2, p. 147 –
152, 2005.
GOMES, V.; LIBERA, A. M. M. P. D.; MADUREIRA, K. M.; ARAžJO, W. P. Influ‡ncia
do estŠgio de lacta•‚o na composi•‚o do leite de cabras (Capra hircus). Brazilian
Journal al of Veterinary Research and Animal Science, S‚o Paulo, v.41, p.339-342,
2004.
GONDA, M. A.; BRAUN, M. J.; CLEMENTS, J. E.; PYPER, J. M.; WONG-STAAL, F.;
GALLO, R. C.; GILDEN, R. V. Human T-cell lymphotropic virus type III shares
sequence homology with a family of pathogenic lentiviruses. Proceedings of the
National Academy of Sciences, v. 83, n. 11, p. 4007 – 4011, June, 1986.
52
GONDA, M. A. Molecular biology and v•rus-host interations of lentiruses. Annals of
the New York Academy of Sciences, v. 724, p. 22-42, 1994.
GORRELL, M. D.et al. Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate
productively in T lymphocytes. J Virol, v. 66, n. 5, p. 2679-88, 1992.
GOUVEIA, A. M. G.; COURA, M. A.; BRAND¡O, H. M.; ATAN‹SIO, C. Distribui•‚o
sorolƒgica do lentiv•rus caprino em amostragem por demanda. In: ENCONTRO DE
PESQUISA DA ESCOLA DE VETERIN‹RIA DA UFMG, Belo Horizonte. Anais...
Belo Horizonte, 1998, p. 116.
GREGORY, L.; LARA, M. D. C. C. d. S. H.; HASEGAWA, M. Y.; CASTRO, R. S.;
RODRIGES, J. N. M.; ARAUJO, J.; KELLER, L. W.; DURIGON, e. L. Detec•‚o do
v•rus da Artrite Encefalite Caprina em leite por PCR e Nested-PCR. ARS VeterinŠria,
v.25, p.142-146, 2009.
GUDMUNDSSON, B., BJARNADOTTIR, H., KRISTJANSDOTTIR, S., JONSSON,
J.J.,2003. Quantitative assays for Maedi-visna virus genetic sequences and RNAm’s
based onRT-PCR with real-time FRET measurements. Virology 307, 135–142.
HAASE, A. T. Pathogenesis lentivirus infection. Nature, v. 322, n. 6075, p. 130-136,
1986
HAENLEIN, G. F. W. Goat Milk in human nutrition. Small Ruminant Research. v.
51,p. 155-163, 2004.
HAFEZ, E. S. E. Reprodu•‚o animal. S‚o Paulo: Manole, 1988, p. 322-345.
H¢TZEL, I.; BASTOS, S.E.; RAVAZZOLO, A.P. & MOOJEN, V. Caprine
arthritisencephalitis virus: isolation and identification in Rio Grande do Sul, Brazil.
Braz. J. Med. Biol. Res., v.26, p.1175-1179, 1993.
53
IBGE. Diretoria de Pesquisas, Coordena•‚o de AgropecuŠria, Pesquisa da PecuŠria
Municipal, 2007.
ICTV - International Comitee on Taxonomy of Viruses. Acesso em 27 de agosto de
2010. Dispon•vel em: http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2009
JOAG, S. V.; STEPHENS, E. B.; NARAYAN, O. Lentiviruses. In: FIELDS, M. D.;
KNIPE, D. M. Fields Virology. 3Πed. New York: Raven Press, 1996. p. 1977 Р1996.
JONES, T. C.; HUNT, R. D.; KING, N. W. Patologia veterinŠria. S‚o Paulo:
Manole.2000. p. 339 – 343.
KNOWLES JR, D. P.; EVERMANN, J. F.; SHROPSHIRE, C.; VANDERSCHALIE, J.;
BRADWAY, D.; GEZON, H. M.; CHEEVERS, W. P. Evaluation of agar gel
immunodiffusion serology using caprine and ovine lentiviral antigens for detection of
antibody to caprine arthritis-encephalitis virus. J Clin Microbiol, v.32, p.243-5; 1994.
KNOWLES, D. P. Laboratory diagnostic test for Retrovirus infections of small
ruminants. Veterinary Clinics of North American: Food Animal Practice, v. 13, n.1, p.
1-11, 1997.
KRAMPS, J.A., van MAANEN, K., MARS, M.H., POPMA, J.K., van RIJN, P.A.
Validation of a commercial ELISA for the detection of bluetongue virus (BTV)-specific
antibodies in individual milk samples of Dutch dairy cows. Vet. Microbiol. 130, 80–87,
2008.
LEITE, B. L. S.; MODOLO, J. R.; PADOVANI, C. R.; STACHISSINI, A. V. M.;
CASTRO, R. S.; SIM£ES, L. B. Avalia•‚o da taxa comparativa de ocorr‡ncia da
Artrite-Encefalite Caprina a V•rus pelas regionais de defesa agropecuŠria do estado
de S‚o Paulo, Brasil, e seu mapeamento por meio de sistema de informa•Žes
geogrŠficas. Arquivos do Instituto Biológico, v. 71, n. 1, p. 21 -26, 2004.
54
LERONDELLE, C.; FLEURY, C.; VIALARD, J. Le glande mammaire: organe cible de
l’infection par le virus de l’arthrite et de l’enc•phalite caprine. Ann. Rech. Vet., v.20,
n.1, p.57-63, 1989.
LEROUX, C.; CHASTANG, J.; GREENLAND, T.; MORNEX, J.F. Genomic
heterogeneity of small ruminant lentiviruses: existence of heterogeneous populations
in sheep and of the same lentiviral genotypes in sheep and goats. Archives of
Virology, v.142, n.6, p.1125–1137, 1997.
LEV-YADUN, S., GOPHER, A.; ABBO, S. The cradle of agriculture. Science 288,
p.1602–1603 ,2000
MADUREIRA, K. M.; GOMES, V. Prevalência da Artrite-Encefalite Caprina (CAE) em
propriedades
leiteiras
do
estado
de
São
Paulo.
2007.
Dispon•vel
em:104<http://www.unifian.edu.br/programasinst/Revistas/revistas2007/veterinaria/P
revalencia_da_artrite_encefalite.pdf>. Acesso em: 18 dez. 2011
MAPA - MINIST•RIO DA AGRICULTURA, PECU‹RIA E DO ABASTECIMENTO
(BRASIL). Instru•‚o Normativa N› 37, de 31 de outubro de 2000. Regulamento
Técnico de Identidade e
Qualidade de Leite
de Cabra. Dispon•vel em:
http://www.engetecno.com.br/legislacao/leite_rtfiq_leite_cabra.htm.
Acesso
em:
22/09/2010.
MELO, A. C. M.; FRANKE, R. F. Soropreval‡ncia da artrite-encefalite caprina (CAE)
norebanho caprino leiteiro da regi‚o da grande Fortaleza, CearŠ, Brasil. Ciência
Rural, v.27, n.1,p. 113-117, 1997.
MELO, C. B.; DE CASTRO, R. S.; OLIVEIRA, A. A.; FONTES, L. B.; CALLADO,A. K.
C.; NASCIMENTO, S. A. Estudo preliminar sobre a infec•‚o por lentiv•rus
depequenos ruminantes em ovinos e caprinos de Sergipe. In: CONGRESSO
55
LATINOAMERICANO DE BUIATRIA, 5™, Salvador. Anais... Salvador: SBB,
2003,p.47 – 48.
MODOLO, J. R., C. R. STACHISSINI, C. R. PADOVANI, J. P. ARAžJO JžNIOR, R.
S. CASTRO, A. P. RAVAZZOLO e B. L. S. LEITE. PCR associated with agar gel
immudiffusion assay improve caprine arthritis-encephalitis (CAEV) control. Small.
Rumin. Res., v. 81, p. 18-20, 2009.
MOOJEN V.; SOARES H.C.; RAVAZZOLO A.P.; PIZZOL M. & GOMES, M.
Evid‡ncia de infec•‚o pelo lentivirus (maedi/visna – Artrite-encefalite Caprina) em
caprinos no Rio Grande do Sul, Brasil. Arq. Fac. Med. Vet. v.1, p.77-78, 1986.
MOOJEN, V. Maedi-Visna dos ovinos. In: Varela (ed.) Doen•as dos ruminantes e
dos equinos. In: Riet-Correa, F.; Schild, A. L.; M•ndez, M. D. C., Lemos, R. A. A.,
S‚o Paulo, 2001.
NARAYAN O.; CLEMENTS J.E.; STRANDBERG J.D.; CORK L.C. & GRIFFIN D.E.
Biological characterization of virus causing leukoencephalitis and arthritis in goats. J.
Gen. Virol. v.50, p.69-79, 1980.
NARAYAN,
O.;
chronicpneumonia,
CORK,
L.
C.
Lentiviral
leukoencephalomyelitis
diseases
and
of
arthritis.
sheep
and
Research
goats:
Infectious
Disease. v. 7,p. 89-97, 1985.
NARAYAN, O.; WOLINSKY, J. S.; CLEMENTS, J. E.; STRANDBERG, J. D.;
GRIFFIN, D. E.; CORK, L. C. Slow virus replication: the role of macrophages in the
persistence and expression of visna viruses of sheep and goats. J Gen Virol, v.59,
p.345-56, 1982.
56
NARAYAN, O.; JOAG, S. V.; CHEBLOUNE, Y.; ZINK, M. C.; CLEMENTS, J. E.;
Visna-maedi:
the
prototype
lentiviral
disease.
In:
NATHANSON,
N.
Viral
Pathogenesis. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1997. p. 657 – 668.
OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES. Manual of standards for diagnostic
tests and vaccines. World Organization for Animal Health, Paris: OIE, 1996. p.369373.
OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES. Manual of standards diagnostic tests
and vaccines. World Organization for Animal Health, Paris: OIE, 2004. p.1178, 5.ed.
OLIVEIRA, M. M. M.; CASTRO, R. S.; CARNEIRO, K. L.; NASCIMENTO, S.
A.;CALLADO, A. K. C.; ALENCAR, C. S. A.; COSTA L. S. P. Anticorpos contra
lentiv•rus depequenos ruminantes em caprinos e ovinos em abatedouros do estado
de Pernambuco.Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 58, n.5, p.
947-949, 2006.
PEREIRA, R. A. G.; QUEIROGA, R. C. R. E.; VIANNA, R. P. T.; OLIVEIRA, M. E. G.
Qualidade qu•mica e f•sica do leite de cabra distribu•do no Programa Social “Pacto
Novo Cariri” no Estado da Para•ba. Revista do Instituto Adolfo Lutz, v.64, p.205-211,
2005.
PERTURSON, G.; ANDR•SD¤TIR, O. S.; ANDR•SSON, G. Lentiv•rus disease of
sheepand goat: Maedi –Visna an caprine Arthritis encephalitis. In: ___ SPEEDY, A.
W. Progressin sheep and Goat Research, Keldur:Hardcover, 1992. p. 107-129.
PINHEIRO, R. R.; ALVES, F. S. F.; GIR¡O, E. S.; MEDEIROS, L. P. A.; GIR¡O,
R.N. Presen•a da Artrite-Encefalite Caprina a V•rus (CAEV), em Teresina – Piau•.
In:CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERIN‹RIA, 24™, Goi“nia.
Anais...Goi“nia. 1996. p. 161.
57
PINHEIRO, R. R.; GOUVEIA, A. M. G.; ALVES, F. S. F. Preval‡ncia da infec•‚o
peloV•rus da Artrite-Encefalite Caprina no estado do CearŠ, Brasil. Ciência Rural,v.
31, n. 3, p. 449 – 454, 2001.
PRATA, L. F., RIBEIRO, A. C., REZENDE, K. T., CARVALHO, M. R. B., RIBEIRO, S.
D. A. & COSTA, R. G. Composi•‚o, perfil nitrogenado e caracter•sticas do leite
caprino (Saanen). Ci‡ncia e Tecnolog•a Alimentar, Campinas, v.18, p.428-432, 1998.
PUGH, D. G. Cl•nica de ovinos e caprinos. Roca, S‚o Paulo, 2004, 513p.
QUADROS, D. G. Leite de cabra: produ•‚o e qualidade. Pubvet. v. 2, n. 1, jan.
2008.Dispon•vel em: <http://www.pubvet.com.br/texto.php?id=110>. Acesso em 19
ago.2008.
QUEIROGA, R. C. R. E.; COSTA, R. G.; BISCOTINI, T. M. B.; MEDEIROS, A. N.;
MADRUGA, M. S.; SHULER, A. R. P. Influ‡ncia do manejo do rebanho, das
condi•Žes higi‡nicas da ordenha e da fase de lacta•‚o na composi•‚o qu•mica do
leite de cabras Saanen. Revista Brasileira de Zootecnia, v.36, p.430-437, 2007.
QUEIROGA, R. C. R. E.; TRIGUEIRO, I. N. S.; FERREIRA, M. C. C. Caracteriza•‚o
do leite de cabras mesti•as do Brejo Paraibano, durante o per•odo de lacta•‚o.
Higiene Alimentar, v. 12, p. 77-80, 1998.
RAJYA, B. S.; SINGH, C. M. The pathology of pneumonia and associated respiratory
disease of sheep and goats. I. Occurrence of jagziekte and maedi in sheep and
goats in india. Am. J. Vet. Res., v.25, p.61-7, 1964.
RAMOS, O. S.; SILVA, A. C. S; MONTENEGRO, A. J. D.; FREITAS, J. A.;
WATANABE,N. A. Anticorpos para o V•rus da Artrite EncefŠlica no munic•pio de
Castanhal – ParŠ.Revista de Ciências Agrárias (Belém), v. 26, p. 107 – 111, 1996.
58
REA-BOUTROIS, A.; VILLET, S.; GREENLAND, T.; MEHLEN, P.; CHEBLOUNE, Y.;
VERDIER, G.; LEGRAS-LACHUER, C. Small ruminant lentiv•rus tat protein induces
apoptosis in caprine cells in vitro by the intrinsic pathway. Virology, v. 383, n. 1, p. 93
– 102, 2009.
REDDY, P. G.; SAPP, W. J.; HENEINE, W. Detection of caprine arthritis-encephalitis
virus by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, v.31, p.3042-3, 1993.
REILLY,
L.
K.;
BAIRD,
A.
N.;
PUGH,
D.
G.
DISEASES
OF
THE
MUSCULOSKELETAL SYSTEM, In: PUGH, D.G. Sheep & Goat Medicine, 1 ed.
Philadelphia: Saunders, 2002. p. 239-240.
REISCHAK, D. Lentiv•rus de Pequenos Ruminantes: Imunofluoresc‡ncia utilizando
isolados brasileiros para diagnƒstico sorolƒgico de infec•‚o em ovinos e caprinos.
Porto Alegre, 2000. 132p. [Disserta•‚o (Mestrado) – Faculdade de VeterinŠria,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul].
RIMSTAD, E.et al. Delayed seroconversion following naturally acquired caprine
arthritis-encephalitis virus infection in goats. Am J Vet Res, v. 54, n. 11, p. 1858-62,
1993.
RIMSTAD, E.; EAST, N.; DEROCK, E.; HIGGINS, J.; PEDERSEN, N. C. Detection of
antibodies to caprine arthritis-encephalitis virus using recombinant gag proteins. Arch
Virol, v.134, p.345-56, 1994.
ROWE, J. D. et al. Risk factors associated with caprine arthritis-encephalitis virus
infection in goats on California dairies. Am J Vet Res, v. 52, n. 3, p. 510-4, 1991.
ROWE, J. D.; EAST, N. E.; THURMOND, M. C.; FRANTI, C. E.; PEDERSEN, N. C.
Cohort study of natural transmission and two methods for control of caprine arthritis-
59
encephalitis virus infection in goats on a California dairy. Am. J. Vet. Res., v.53,
p.2386–2395, 1992.
ROWE, J. D.; EAST, N. E. Risk factors for transmission and methods for control of
caprine arthritis-encephalitis virus infection. Vet Clin North Am Food Anim Pract,
v.13, p.35-53, 1997.
RUSSO, P. Virus de l’arthrite-enc•phalite caprine (CAEV). Br•ve Revue. Annales de
Recherches V•t•rinaires, v. 15, n. 1, p. 3-6, 1984.
RUSSO, P. et al. Caprine arthritis-encephalitis virus: detection of proviral DNA in
lactoserum cells. Vet Rec, v. 140, n. 18, p. 483-4, 1997.
SALTARELLI, M.; QUERAT, G.; KONINGS, D. A.; VIGNE, R.; CLEMENTS, J. E.
Nucleotide sequence and transcriptional analysis of molecular clones of CAEV which
generate infectious virus. Virology, v.179, p.347-64, 1990.
SELL, B. E. Prevalência de anticorpos para o vírus da Artrite-Encefalite Caprinaem
soros
de
caprinos
no
estado
de
Santa
Catarina.
2000.
23
f.
Monografia(Especializa•‚o em Sanidade Animal) – Universidade do Estado de
Santa Catarina,Lages, 2000.
SILVA, J. S.; CASTRO, R. S.; MELO, C. B.; FEIJ¤, F. M. C.. Infec•‚o pelo v•rus da
artriteencefalite caprina no Rio Grande do Norte. Arquivo Brasileiro de Medicina
Veterinária eZootecnia, v. 57, n.6, p. 727-731, 2005.
SILVEIRA, J. A. D. Leite de Cabra. S‚o Jos• dos Campos, SP. Dispon•vel
em:<http://www.riocapri.com.br/artigo7.pdf>. Acesso em 18 ago 2008.
SIMS, L.D.; HALE, C.J.; MCCORMICK, B.M. Progressive intersticial pneumonia in
goats. Aust. Vet. J., v.60, n.12, p.368-371, 1983.
60
SOTOMAIOR C.; MILCZEWSKI V. Relato de um rebanho ovino infectado pelo
v•rusmaedi-visna no Estado do ParanŠ. In: In: CONGRESSO BRASILEIRO.DE
MEDICINAVETERIN‹RIA,25, 1997, Gramado. Anais...Gramado, 1997. p. 179.
ST¥NZI H., B. H. F.; LE ROY H.L.; LEEMANN, W. Endemische arthritis chronica bei
Ziege. Schweizer Archiv F¦rur T-ier§rkunden, p.778-788, 1964.
TIGRE, D. M.; CAMPOS, G. S.; SARDI, S. I. Isolamento e identifica•‚o do V•rus da
Artrite Encefalite Caprina, a partir do co-cultivo de c•lulas mononucleares do sangue
com c•lulas de membrana sinovial de cabra. Revista de Ci‡ncias M•dicas e
Biolƒgicas, v. 5, n. 2, p. 124-131, 2006.
TIZARD, I. R. Introdu•‚o ‘ Imunologia veterinŠria. 2. S‚o Paulo: Roca, 1998. ISBN
978-85-352-3087-1.
van WEERING, H., van SCHAIK, G., van der MEULEN, A., WAAL, M., FRANKEN,
P., van MAANEN, K., 2007. Diagnostic performance of the Pourquier ELISA for
detection of antibodies against Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in
individual milk and bulk milk samples of dairy herds. Vet. Microbiol. 125, 49–58.
VAREA, R., MONLEON, E., PACHECO, C., LUJAN, L., BOLEA, R., VARGAS, M. A.,
VAN EYNDE, G., SAMAN, E., DICKSON, L., HARKISS, G., AMORENA, B. &
BADIOLA, J. J. Early detection of maedi-visna (ovine progressive pneumonia) virus
seroconversion in field sheep samples. J Vet Diagn Invest, v.13, p.301-7, 2001.
WAGTER, L.H.A., JANSEN, A., BLEUMINK-PLUYM, J.A., LENSTRA, J.A.,
HOUWERS, D.J. PCR detection of lentiviral gag segment DNA in the white blood
cells of sheep and goats. Vet. Res. Communin., v.22, p.355-262, 1998.
WELSCH; U. Atlas de. Histologia - Citologia, Histologia e Anatomia. Microscƒpica.
6™. Rio de Janeiro, Guanabara. Koogan, 2003
61
ZANONI,
R.;
PAULI,
L.
T.;
PETERHANS,
E.
Detection
of
caprine
arthritisencephalitisand maedi-visna viruses using polymerase chain reaction.
Experientia. v.46, p. 316-319, 1990.
ZANONI, R. G. Phylogenetic analysis of small ruminant lentiviruses. J. Gen. Virol.,
v.79, p.1951–1961, 1998.
ZEE, Y. C.; HIRSH, D. C. Microbiologia veterinŠria. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 2003. p. 411 – 424.
ZHANG, Z., WATT, N.J., HOPKINS, J., HARKISS, G., WOODALL, C.J.,
2000.Quantitative analysis of Maedi-visna virus DNA load in peripheral blood
monocytes andalveolar macrophages. J. Virol. Methods 86, 13–20.
ZINK, M. C., NARAYAN, O., KENNEDY, P. G. & CLEMENTS, J. E. Pathogenesis of
visna/maedi and caprine arthritis-encephalitis: new leads on the mechanism of
restricted virus replication and persistent inflammation. Vet Immunol Immunopathol,
v.15, p.167-80, 1987.
I
62
ANEXOS
63
Anexo 1: Comprovante de submissão de artigo
64
Anexo 2: Declaração do Comitê de Ética
Este projeto passou pelo comitê de ética da Universidade Estadual do Ceará
(UECE), apresentando-se sob numeração 10130900-7/32.
65