i
JACKELINE MARQUES FARIA
GERMINAÇÃO E CULTIVO IN VITRO DE Alpinia purpurata
(Vieill.) Schum, VARIEDADES JUNGLE KING E KIMI
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Agronomia, da Universidade
Federal de Goiás, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Agronomia,
área
de
concentração:
Genética
e
Melhoramento de Plantas.
Orientadora:
Profa. Dra. Larissa Leandro Pires
Goiânia, GO - Brasil
2011
ii
Aos meus pais, com carinho.
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida e por colocar em minha vida pessoas especiais,
fundamentais para que eu me tornasse a pessoa que sou hoje.
Aos meus pais, Adenir e Silvana, meus exemplos de vida, por sonharem
comigo os meus sonhos. Por acreditarem em mim e por investirem tudo, sempre e em
primeiro lugar, no futuro de suas filhas. Sem dúvida, vocês foram mais do que essenciais
pra que eu chegasse até aqui e conquistasse a realização de mais este sonho. Obrigada por
serem tão especiais e por se fazerem sempre presentes, independente da ocasião, situação
ou condição. É por vocês e pra vocês!
Às minhas irmãs, Adriana e Patrícia, por torcerem por mim e me apoiarem nas
minhas idéias, mesmo quando já pensavam em transformar o meu quarto no “quarto da
bagunça”, ou apenas para pegar minha cama, minha escrivaninha... Vocês também foram
fundamentais para que eu chegasse até aqui. Obrigada pelas conversas, pelos conselhos,
pelo apoio.
À minha sobrinha Stella, que tem o dom de acordar as pessoas com um imenso
sorriso no rosto às 6 horas da manhã. Muito obrigada pelos bolos de rolo no café da
manhã, pelas tardes na sala dos brinquedos e pelas sessões cinema à noite. Tudo sempre foi
muito bom, apesar de cansativo! Você sempre vai ser a minha princesinha!
Ao Emmanuel, que acompanhou grande parte deste estudo comigo. Obrigada
pelo companheirismo dedicado a mim nestes meses. Obrigada por estar sempre presente,
quer fosse no campo, arrancando rizomas, procurando frutos, atolando o carro, quer fosse
no laboratório, repicando ou pesando plantas, quer fosse em casa, corrigindo meus textos.
Sem seu apoio teria sido mais difícil concretizar este sonho. Obrigada por toda a atenção
dispensada à concretização deste meu sonho e pela disposição em me ajudar, em todas as
etapas do desenvolvimento deste trabalho.
À minha orientadora Larissa Leandro Pires, cujo apoio foi também de
fundamental importância para a realização desta pesquisa. Por sempre ter torcido por mim
e para que eu finalizasse, com êxito, este trabalho. Nossas conversas, sua opinião, suas
idéias, seus conselhos, foram fundamentais para que eu estivesse hoje aqui, concluindo
esta dissertação.
iv
Ao professor Sérgio Tadeu Sibov, que deu um empurrãozinho para que eu me
interessasse e trabalhasse com cultura de tecidos vegetais. Obrigada pelo apoio e por
aceitar participar da banca!
À Biofábrica Governador Miguel Arraes, pela concessão do espaço físico e dos
materiais de consumo. A todos os funcionários que me ajudaram de alguma forma, em
especial à Andréa, pela oportunidade oferecida e por ter aceito o convite para compor a
banca de defesa dessa dissertação; e à Verônica, pela amizade e auxílio em algumas etapas
deste trabalho. A todos, um obrigado especial.
Aos amigos da Genética, Bruna, Gisele, Thiago e Carol, pelo apoio e por
sempre se mostrarem torcendo pelo êxito deste trabalho. É muito bom poder contar com o
carinho e torcida de vocês. Vocês também fazem parte desta conquista!
Ao professor Wilson Mozena, pela ajuda na parte estatística.
Aos amigos da Nematologia, por me “agregarem” de forma tão carinhosa no
primeiro ano do mestrado, especialmente à Cristiane e ao Leonardo, pelas tardes não
saudáveis que passamos na Richesse. Obrigada pelo companheirismo! Adorei fazer parte
deste grupo de amigos.
À Universidade Federal de Goiás, pela oportunidade de realização do Curso.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
pela concessão da bolsa de estudos.
A todos, familiares e amigos, que me ajudaram a chegar até aqui, obrigada pela
torcida e incentivo. Tenham certeza, lembro-me, com muito carinho do apoio de cada um.
Essa conquista não é somente minha, é de todos que, de alguma forma, me ajudaram nesta
jornada!
v
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS.........................................................................................
vii
LISTA DE FIGURAS..........................................................................................
ix
RESUMO GERAL...............................................................................................
x
GENERAL ABSTRACT.....................................................................................
xi
1
INTRODUÇÃO GERAL.........................................................................
1
2
REVISÃO DE LITERATURA...............................................................
3
2.1
A FLORICULTURA.................................................................................
3
2.2
Alpinia purpurata.......................................................................................
7
2.3
MICROPROPAGAÇÃO............................................................................
11
2.4
APLICAÇÃO DE BIORREATORES NA CULTURA DE TECIDOS
VEGETAIS.................................................................................................
15
2.5
REFERÊNCIAS.........................................................................................
17
3
ESTABELECIMENTO DE PROTOCOLO DE PROPAGAÇÃO IN
VITRO DE VARIEDADES DE ALPÍNIA A PARTIR DE
SEMENTES................................................................................................
25
RESUMO...................................................................................................................
25
ABSTRACT............................................................................................................
25
3.1
INTRODUÇÃO...........................................................................................
26
3.2
MATERIAL E MÉTODOS........................................................................
28
3.2.1
Ensaio I: desinfestação de sementes e estabelecimento..........................
28
3.2.2
Ensaio II......................................................................................................
29
3.2.2.1 Multiplicação...............................................................................................
30
3.2.2.2 Enraizamento...............................................................................................
31
3.2.2.3 Aclimatização..............................................................................................
31
3.3
RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................
32
3.3.1
Ensaio I: desinfestação de sementes e estabelecimento..........................
32
3.3.2
Ensaio II......................................................................................................
33
3.3.2.1 Multiplicação...............................................................................................
33
3.3.2.2 Enraizamento...............................................................................................
38
3.3.2.3 Aclimatização..............................................................................................
40
vi
3.4
CONCLUSÕES...........................................................................................
44
3.5
REFERÊNCIAS........................................................................................... 44
4
ACLIMATIZAÇÃO DE MUDAS MICROPROPAGADAS DE
Alpinia purpurata VAR. JUNGLE KING EM DIFERENTES
SUBSTRATOS...........................................................................................
51
RESUMO...................................................................................................................
51
ABSTRACT...............................................................................................................
51
4.1
INTRODUÇÃO...........................................................................................
52
4.2
MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................
53
4.3
RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................
54
4.4
CONCLUSÃO.............................................................................................
59
4.5
REFERÊNCIAS........................................................................................... 59
5
UTILIZAÇÃO DE BIORREATOR DE IMERSÃO TEMPORÁRIA
NA MULTIPLICAÇÃO DE Alpinia purpurata......................................
63
RESUMO...................................................................................................................
63
ABSTRACT...............................................................................................................
63
5.1
INTRODUÇÃO...........................................................................................
64
5.2
MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................
65
5.3
RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................. 67
5.4
CONCLUSÕES...........................................................................................
5.5
REFERÊNCIAS........................................................................................... 70
6
CONSIDERAÇÕES FINAIS....................................................................
70
74
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1
Tabela 3.2
Tabela 3.3
Tabela 3.4
Tabela 3.5
Tabela 3.6
Tabela 3.7
Tabela 3.8
Tabela 3.9
Tabela 3.10
Tabela 3.11
Tabela 3.12
Tabela 3.13
Tabela 4.1
Tratamentos avaliados para a multiplicação in vitro de plântulas de
Alpinia
purpurata,
variedades
Jungle
King
e
Kimi.....................................................................................................
Altura média da planta principal (cm) de Alpinia purpurata,
variedades Jungle King e Kimi, durante 91 dias de cultivo in vitro
em diferentes meios indutores de multiplicação..................................
Número médio de brotos de Alpinia purpurata, variedades Jungle
King e Kimi, obtidos durante 91 dias de cultivo in vitro em
diferentes meios indutores de multiplicação........................................
Número médio de folhas por planta de Alpinia purpurata,
variedades Jungle King e Kimi, durante 91 dias de cultivo in vitro
em meios indutores de multiplicação..................................................
Número médio de raízes por planta de Alpinia purpurata,
variedades Jungle King e Kimi, durante 91 dias de cultivo in vitro
em meios indutores de multiplicação..................................................
Médias da massa da matéria fresca e seca da parte aérea de Alpinia
purpurata, variedades Jungle King e Kimi, advindas dos meios
indutores de multiplicação e cultivadas por 30 dias em meio indutor
de enraizamento...................................................................................
Médias da massa da matéria fresca e seca do sistema radicular de
Alpinia purpurata, variedades Jungle King e Kimi, advindas de
meios indutores de multiplicação e cultivadas por 30 dias em meio
indutor
de
enraizamento........................................................................................
Altura média (cm) de mudas de Alpinia purpurata, variedades
Jungle King e Kimi, após 30 dias na fase de
aclimatização.......................................................................................
Número médio de brotos por planta de Alpinia purpurata, var.
Jungle King e Kimi, após 30 dias em aclimatização...........................
Número médio de folhas em mudas de Alpinia purpurata,
variedades Jungle King e Kimi, após 30 dias na fase de
aclimatização.......................................................................................
Médias das massas das matérias fresca e seca da parte aérea de
mudas de Alpinia purpurata, variedades Jungle King e Kimi, após
30 dias na fase de aclimatização..........................................................
Médias das massas das matérias fresca e seca do sistema radicular
de mudas de Alpinia purpurata, variedades Jungle King e Kimi,
após
30
dias
na
fase
de
aclimatização.......................................................................................
Percentagem de sobrevivência de plantas aclimatizadas de Alpinia
purpurata, variedades Jungle King e Kimi, após 30 dias em casa de
vegetação.............................................................................................
Percentagem de sobrevivência de plantas de Alpinia purpurata,
variedade Jungle King, em função do tempo, em aclimatização em
casa de vegetação.................................................................................
30
34
34
37
38
39
39
41
41
42
42
43
44
57
viii
Tabela 4.2
Tabela 5.1
Tabela 5.2
Médias das massas das matérias frescas e secas da parte aérea e do
sistema radicular de plantas micropropagadas de Alpinia purpurata,
variedade Jungle King, em função do tempo, após 45 dias de
aclimatização
em
casa
de
vegetação.............................................................................................
Cultivo de Alpinia purpurata, variedade Jungle King, após 45 dias
em
diferentes
meios
em
biorreator
de
imersão
temporária............................................................................................
Médias das massas das matérias frescas e secas da parte aérea e do
sistema radicular de Alpinia purpurata, variedade Jungle King,
cultivada em diferentes meios líquidos, em biorreator de imersão
temporária, após 45 dias......................................................................
58
67
69
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1
Variedades de Alpinia purpurata (Teixeira & Loges, 2008)...................
Figura 4.1
Altura média de plantas micropropagadas de Alpinia purpurata,
variedade Jungle King, em função do tempo, em aclimatização em
casa de vegetação.....................................................................................
Diâmetro médio do pseudocaule de plantas micropropagadas de
Alpinia purpurata, variedade Jungle King, em aclimatização em casa
de vegetação.............................................................................................
Número médio de folhas em plantas micropropagadas de Alpinia
purpurata, variedade Jungle King, em função do tempo, em
aclimatização
em
casa
de
vegetação.................................................................................................
Figura 4.2
Figura 4.3
Figura 5.1
Figura 5.2
Biorreator com sistema de imersão temporária: A) frasco contendo os
explantes;
B)
frasco
com
o
meio
de
cultivo
líquido......................................................................................................
Plantas de Alpinia purpurata, variedade Jungle King, após 45 dias de
multiplicação
em
biorreator
de
imersão
temporária................................................................................................
10
55
55
57
68
70
x
RESUMO GERAL
FARIA, J. M. Germinação e cultivo in vitro de Alpinia purpurata (Vieill.) Schum,
variedades Jungle King e Kimi. 2011. 74 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia:
Genética e Melhoramento de Plantas)-Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos,
Universidade Federal de Goiás. Goiânia. 20111.
A floricultura, hoje uma realidade do agronegócio, se tornou visível por ser uma
atividade competitiva, altamente rentável, que exige a utilização de tecnologias,
conhecimento técnico e promove a fixação do homem no campo. Dentro desse âmbito, a
Alpinia purpurata (Vieill.) Schum (família Zingiberaceae), planta tropical herbácea, se
encontra bastante difundida no Brasil, sendo cultivada em jardins para a formação de
maciços florais e utilizada também como flor de corte, em função da grande durabilidade e
exuberância de suas inflorescências. Entretanto, devido à propagação desta espécie ser, na
maioria das vezes, vegetativa, pode haver acúmulo de doenças ao longo de sucessivos
plantios. Desta forma, o uso da biotecnologia vegetal, especialmente da propagação
vegetativa in vitro, permite a produção em larga escala de mudas de alta qualidade genética
e fitossanitária, em curto espaço de tempo e em pequena área física. Em vista disso, foram
conduzidos três experimentos na Biofábrica Miguel Arraes do Centro de Tecnologias
Estratégicas do Nordeste (Cetene). O primeiro experimento objetivou estabelecer protocolo
de propagação in vitro a partir de sementes de A. purpurata, variedades Jungle King e
Kimi, constando da assepsia das sementes, com posterior germinação, multiplicação e
enraizamento in vitro, finalizando com a aclimatização das plantas em casa de vegetação.
O segundo experimento foi realizado em casa de vegetação, objetivando-se avaliar a
eficiência de três substratos, Basaplant®, substrato orgânico e a mistura de ambos (1:1), na
aclimatização de mudas micropropagadas de A. purpurata, var. Jungle King, avaliando-se
crescimento, desenvolvimento e sobrevivência das plantas. O terceiro experimento avaliou
diferentes concentrações de reguladores de crescimento em meio de cultivo in vitro para a
multiplicação de A. purpurata, var. Jungle King, em biorreator de imersão temporária. De
acordo com os resultados obtidos no primeiro experimento, a assepsia das sementes com
solução aquosa de hipoclorito de sódio à 0,625%; 1,250%; 1,875% e 2,5% foi eficiente,
inibindo a contaminação por micro-organismos. Os meios de cultivo indutores de
multiplicação apresentaram diferenças significativas para as variáveis altura média das
plantas, número médio de brotos e número médio de raízes. Para a var. Jungle King, o
meio MS suplementado com 3 mg.L-1 de BAP e 0,1 mg.L-1 de AIA resultou em maior
média de brotos, e para a var. Kimi, o melhor resultado foi obtido com o meio MS
suplementado com 4 mg.L-1 de BAP e 0,1 mg.L-1 de AIA. A taxa de sobrevivência das
plantas foi superior à 92% após 30 dias de aclimatização. No segundo experimento, o
substrato comercial proporcionou melhores resultados, comparado ao uso de composto
orgânico e à mistura de ambos. Já no terceiro experimento, notou-se que a utilização dos
biorreatores de imersão temporária foi influenciada pela concentração dos reguladores de
crescimento, sendo o meio MS acrescido de 2 mg.L-1 de BAP e 0,1 mg.L-1 de AIA aquele
que apresentou melhores resultados.
Palavras-chave: planta ornamental, alpínia, micropropagação, sementes, substrato,
biorreator.
__________________
1
Orientadora: Profa. Dra. Larissa Leandro Pires. EA-UFG.
xi
GENERAL ABSTRACT
FARIA, J. M. Germination and in vitro cultivation of Alpinia purpurata (Vieill.)
Schum, Jungle King and Kimi varieties. 2011. 74 f. Dissertation (Master in Agronomy:
Genetic and Plant Breeding)-Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos,
Universidade Federal de Goiás. Goiânia. 20111.
Floriculture, a reality of agribusiness, has become visible by being a
competitive activity, highly profitable, which requires the use of technology, expertise and
promotes the fixation of men in the field. Within this context, Alpinia purpurata (Vieill.)
Schum (Zingiberaceae family), herbaceous tropical plant, has been widespread in Brazil
and is cultivated in gardens for the formation of massive floral and also used as cut
flowers, due to the large durability and exuberance of its inflorescences. However, due to
the spread of this species is, in most cases, vegetative, there is the accumulation of disease
over successive plantings. Thus, the use of plant biotechnology, especially the propagation
in vitro, allows large scale production of high quality seedlings and plant genetics, in a
short time and small physical area. Thus, three experiments were performed in Biofactory
Miguel Arraes of Strategic Technologies Center of Northeast (Cetene). The first
experiment aimed to establish a protocol for in vitro propagation from seed, to A.
purpurata, Jungle King and Kimi varieties, consisting of sterile seeds and subsequent
germination, multiplication and rooting, ending with the acclimatization of the seedlings in
the greenhouse. The second experiment was conducted in a greenhouse, aiming to evaluate
the efficiency of three substrates, Basaplant®, organic substrate and a mixture of both (1:1)
in the acclimatization of plantlets of the variety Jungle King, evaluating growth,
development and survival of plants. In the third experiment evaluated different
concentrations of growth regulators in culture medium for in vitro multiplication of
alpinias var. Jungle King in temporary immersion bioreactor. According to the results, the
sterilization of seeds using aqueous solution of sodium hypochlorite 0,625%; 1,250%;
1,875% e 2,5 was effective, inhibiting contamination by microorganisms. The culture
medium inducing proliferation showed significant differences for the variables plant
height, number of shoots and average number of roots, and for variety Jungle King, MS
medium supplemented with 3 mg.L-1 BAP and 0.1 mg.L-1 IAA resulted in higher average
shoots, and for variety Kimi, the best result was using MS medium supplemented with 4
mg L-1 BAP and 0.1 mg.L-1 IAA. The survival rate of micropropagated plants was higher
than 92% after 30 days of acclimatization. The second experiment, the commercial
substrate provided better results when compared to the use of organic compost and mixture
of both. Already, in the third experiment, it was noted that the use of temporary immersion
bioreactors is influenced by the concentration of growth regulators, and the MS medium
supplemented with 2 mg.L-1 BAP and 0.1 mg.L-1 IAA who showed better results.
Key words: ornamental plant, alpine, micropropagation, seeds, substrate, bioreactor.
__________________
1
Adviser: Profa. Dra. Larissa Leandro Pires. EA-UFG.
1
1 INTRODUÇÃO GERAL
As transformações ocorridas no movimento paisagístico e no cenário
socioeconômico mundial em meados do século XX influenciaram na valorização do senso
ecológico e na divulgação da beleza exótica. Integrando a projeção dos jardins com a
vegetação nativa preexistente, contribuindo para a difusão e a preservação de muitas
espécies tropicais com potencial para ornamentação. Neste contexto, a floricultura tropical
encontra-se em expansão, tornando-se uma atividade de maior expressão nas regiões Norte
e Nordeste brasileiras. Surgindo como alternativa para o desenvolvimento de pequenas
propriedades rurais. Isto porque promove a inclusão social, reduzindo o êxodo rural e
agregando novas tecnologias ao longo da cadeia produtiva de plantas ornamentais,
consolidando-se como atividade altamente competitiva e sustentável (Oliveira, 1996).
As plantas ornamentais pertencentes à família Zingiberacea são cultivadas,
principalmente, para a comercialização como flor de corte e o uso no paisagismo. Entre as
Zingiberáceas cultivadas para flor de corte, as alpínias destacam-se pela beleza de suas
inflorescências (Wood, 1995) e pela importância econômica (Castán Bañeras, 1997).
A Alpinia purpurata (Vieill.) Schum, alpínia vermelha, gengibre vermelho ou
panamá, conforme denominações populares, é uma planta tropical herbácea, originária das
florestas e campos da Indo - Malásia, bastante difundida no Brasil e cultivada em jardins
para formação de maciços florais. Seu uso como flor de corte cresceu substancialmente nos
últimos anos em função da durabilidade e exuberância de suas inflorescências, além da
possibilidade de contínuo florescimento no transcorrer do ano (Lamas, 2002).
A produção de mudas desta espécie é baseada na propagação vegetativa
realizada pela divisão de rizomas ou pelo enraizamento das brotações aéreas localizadas
nas axilas das brácteas das inflorescências. A desvantagem do primeiro método é que este
pode levar à disseminação e ao acúmulo de agentes causadores de importantes doenças,
transmitidas entre os plantios sucessivos. Enquanto que o segundo método apesar da
grande quantidade de mudas obtidas via inflorescência, algumas variedades não emitem
brotações aéreas (Criley, 1989, 1995), tais como as variedades aqui propostas, Jungle King
2
e Kimi. Estas apresentam brácteas coloridas que sustentam pequenas flores brancas que,
embora perfeitas, raramente produzem frutos.
Desta forma, a cultura de tecidos através da micropropagação, apresenta-se
como uma alternativa para a multiplicação destas variedades. Esta técnica possibilita maior
rapidez regenerativa dos explantes, facilita a propagação quando as tecnologias
convencionais são difíceis, obtendo plantas independentemente da estação do ano e
preservando o fenótipo e a atividade fisiológica da planta-matriz.
No entanto, a ocorrência de bons resultados na micropropagação depende da
otimização de inúmeras variáveis como: a adequação do meio de cultura, suprindo as
necessidades nutricionais para o crescimento, o desenvolvimento e a multiplicação das
plantas in vitro, a escolha do melhor substrato na fase de aclimatização, promovendo as
condições físicas e químicas favoráveis para a adaptação das plantas ao ambiente ex vitro e
o bom desenvolvimento do sistema radicular. Ao final, uma das principais dificuldades na
micropropagação de alpínias tem sido a contaminação bacteriana dos explantes in vitro,
que afeta o desenvolvimento da planta pela competição por nutrientes, ou ocorre a
exsudação de substâncias que acidificam o meio de cultura.
A germinação de sementes in vitro desta espécie constitui-se em uma opção
para a obtenção de explantes sadios para uso nesses tipos de cultivos. O fruto, apesar de
raro, possui centenas de sementes.
De acordo com Skirvin (1981), a utilização de plântulas germinadas in vitro,
em condições assépticas, é mais vantajosa e eficiente. Mas, segundo Corder & Borges Jr.
(1999), vários fatores podem afetar o vigor germinativo das sementes e promover a
formação de plântulas anormais ou sua morte, entre eles a dormência e a presença de
micro-organismos, sobretudo de fungos e bactérias. Por isso, os métodos de desinfestação
devem ser eficazes, para que a plântula sirva de fonte de explante livre de fungos e
bactérias. Quanto à dormência, ela pode ocorrer devido a diversos fatores, como: embrião
imaturo, impermeabilidade do tegumento, presença de inibidores químicos e ausência de
promotores de germinação e também exigências especiais de luz ou temperatura (Bewley
& Black, 1994),
Desta forma, este trabalho objetivou estabelecer protocolo de germinação in
vitro para a espécie Alpinia purpurata, avaliar a eficiência de substratos na aclimatização
de mudas micropropagadas e de diferentes meios de cultivo in vitro para a sua
multiplicação em biorreator de imersão temporária.
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A FLORICULTURA
A floricultura é um segmento da agricultura voltado para o cultivo e produção
de flores de corte, vasos e jardinagem (Gondim et al., 2004).
Esta atividade apresenta múltiplas funções, como social, por ser um ramo da
produção agrícola responsável por grande geração de empregos; econômica, por
proporcionar grande rentabilidade e técnica por exigir conhecimento de diversas áreas
(Kampf, 2000).
Segundo Motos (2000), citado por Tanio & Simões (2005), além dos
tradicionais países produtores de flores e plantas ornamentais, como a Holanda, Itália,
Dinamarca e Japão, esse mercado mundial está se expandindo como um todo. Países de
alto peso competitivo estão se inserindo, conquistando lugar de destaque, como o Canadá,
EUA, Colômbia, Costa Rica, Israel, Bélgica, Quênia, Brasil, Alemanha, entre outros.
Nas últimas décadas, a floricultura ganhou destaque e expressividade no
agronegócio brasileiro, principalmente no que diz respeito à estrutura de mercado,
diversificação de espécies e variedades de alto valor ornamental, difusão de novas
tecnologias de produção, profissionalização dos agentes da cadeia, bem como na sua
integração (Olivetti et al., 1994).
Aliado a esses fatores, estão iniciativas de incentivo à produção de flores no
País, como é o caso do Programa Brasileiro de Exportação de Flores e Plantas Ornamentais
(Programa FloraBrasilis), que visa ampliar as exportações de flores brasileiras.
Fundamenta-se em linhas de ação que englobam as áreas de marketing, capacitação e
prospecção de produtos e processos. Neste, os produtores estarão sob uma logomarca
“guarda chuva”, denominada “FloraBrasilis”, marca esta que identificará o produto
brasileiro no mundo. Este programa é uma parceria do Instituto Brasileiro de Floricultura
(Ibraflor) e a Agência de Promoção às Exportações (Apex), órgão ligado ao Serviço
Brasileiro de Apoio às Micro e Pequenas Empresas (Sebrae) e que tem por objetivo
alavancar as exportações brasileiras (Lamas, 2004).
4
As condições de produção do País, dotado de grande diversidade de solos e
climas, permitem o cultivo de grande número de espécies e conferem aos produtos
brasileiros oportunidades de conquistar outros espaços e se firmarem no mercado
internacional (Tanio & Simões, 2005). Ao longo dos últimos anos, o mercado brasileiro de
flores e plantas ornamentais mostrou-se crescente e vigoroso, exibindo taxas de
crescimento da ordem de 9% a 10% ao ano em valor, e de 8% a 12% nas quantidades
movimentadas, com estimativas bastante realistas de crescimento no valor das vendas,
entre 15% a 17% em 2009 (Junqueira & Peetz, 2009).
Assim, observa-se que os avanços científicos e tecnológicos têm consolidado o
desenvolvimento e a ampliação do setor de flores e plantas ornamentais no Brasil. Estes
foram obtidos por meio da melhoria dos controles fitossanitários, adoção de modernas
técnicas de gerenciamento e venda da produção, aprimoramento do sistema logístico,
padronização e melhoria das embalagens. Aliado à criação de um sistema de controle
produtivo, garantindo a rastreabilidade dos produtos, a desfronteirização das organizações
envolvidas nestas relações comerciais, a busca de maior competitividade e a seleção de
novas variedades com apelos comerciais e adaptadas às condições específicas do ambiente
em diferentes regiões (Buainain & Batalha, 2007).
O aumento da renda da população, a busca pela sustentabilidade, o maior
investimento na divulgação e a facilidade de acesso aos produtos, tanto nos pontos de
venda físicos, como via internet, são fatores de médio prazo que reforçam ainda mais o
crescimento do consumo de flores no mercado interno, que no momento atual, consome
praticamente tudo o que é produzido (Buainain & Batalha, 2007). No entanto, o consumo
per capita anual de flores no País é de US$ 7,49 (Junqueira & Peetz, 2009), valor
extremamente baixo em relação aos países desenvolvidos, como a Suíça, cujo consumo
alcança US$ 174 por ano, ou os Estados Unidos, com US$ 58 por ano (Buainain &
Batalha, 2007). Isto denota um mercado ainda pouco explorado, com amplas perspectivas
de desenvolvimento e alta capacidade de crescimento futuro (Buainain & Batalha, 2007;
Junqueira & Peetz, 2009).
Neste contexto, a expansão da floricultura se destaca como alternativa de
geração de emprego e renda no agronegócio nacional. O País, por possuir características de
clima e solo apropriadas à produção tanto de flores temperadas, como de flores tropicais.
Estima-se que, atualmente, sejam cultivados 8.400 ha de flores, agregando 5.152
produtores e movimentando em torno de 1,3 bilhão de dólares (Embrapa, 2010).
5
Tal crescimento pode ser devido à recuperação da economia mundial e à
melhoria na qualidade e acesso ao mercado de flores. Os produtos brasileiros estão cada
vez melhores, mais cidades comercializam flores e plantas ornamentais. Isto acontece, em
grande parte, pelo aumento da oferta em supermercados e grandes redes comerciais, como
os garden centers (SBFPO, 2010).
Destaca-se que, das duzentas espécies de flores mais cultivadas no Brasil, cerca
de 166 são consideradas tropicais (Carlini Jr. & Waldeck Filho, 2003). Isoladamente, o
mercado mundial de flores tropicais movimenta US$ 400 milhões por ano, e o setor
corresponde a menos de 5% das exportações brasileiras (Opitz, 2005).
As flores tradicionais, de clima temperado, sempre foram as espécies que se
colocaram no mercado. Em tempos mais recentes, descobriu-se que as flores tropicais,
além de apresentarem beleza e profusão de cores fortes e vibrantes, somavam outras
vantagens, como menor perecibilidade e maior resistência no transporte a maiores
distâncias, possibilitando sua grande aceitação no mercado da decoração. Assim, o produto
tem destinação bem específica: a ornamentação, que vai desde eventos festivos, datas
comemorativas e até cerimônias fúnebres. Com a expansão do turismo e a realização de
eventos de toda sorte, a ornamentação de ambientes com flores naturais tem tido uma
demanda crescente (Carlini Jr. & Waldeck Filho, 2003).
As profundas modificações no cenário socioeconômico mundial também
influenciaram na preferência dos consumidores, que, motivados pelo senso ecológico e
pela divulgação da beleza diferente, procuram, cada vez mais, produtos que representem o
apelo ecológico e de aparência peculiar, valorizando as plantas silvestres e tropicais
(Oliveira, 1996).
Observa-se, desta forma, que a floricultura tropical é uma atividade que está
em ascensão no Brasil e no mundo, por destacar-se como um agronegócio gerador de
renda, fixador de mão de obra no campo e adequado como cultura alternativa para
pequenos produtores (Lins & Coelho, 2004).
O cultivo das flores e folhagens tropicais, assim como os empreendimentos
relacionados, cresceram substancialmente no mercado interno. A exemplo da Associação
dos Produtores de Flores Tropicais de Recife (Reciflora), da Associação dos Produtores de
Flores e Plantas Ornamentais e Tropicais de Alagoas (Afloral), da Cooperativa dos
Produtores e Exportadores de Plantas, Flores e Folhagens Tropicais de Alagoas
(Comflora), entre outros estados. O lançamento do Programa Nacional de Floricultura pelo
6
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, em outubro de 2001, serviu como
marco referencial para o desenvolvimento do setor, no qual linhas de crédito específicas
foram criadas para o segmento, além de recursos para financiamento de pesquisas (Carlini
Jr. & Waldeck Filho, 2003).
Além destes incentivos, as regiões Nordeste, Norte e Centro-Oeste
apresentam ótimas condições para a expansão deste mercado, pois nestas áreas não existe
risco climático de baixas temperaturas, aliado à presença da água, e tendo encontrado
condições de solo com boa profundidade e matéria orgânica (Lamas, 2004), não sendo
indicado o uso de telados, devido ao seu alto custo.
Assim, em alguns estados brasileiros, as atividades relacionadas à floricultura
estão saindo de regiões tradicionais, como São Paulo e Santa Catarina, e passando a ser
praticadas, especialmente em Minas Gerais, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul, Goiás,
Pernambuco, Alagoas, Ceará, Bahia (Antunes, 2002), além do Pará, Maranhão, Rio Grande
do Norte, Piauí, Amazonas e Rondônia (Sebrae, 2005).
Entretanto, Goiás precisa importar 90% das flores e plantas que consome, por
faltar investimento em tecnologia, linhas de crédito mais acessíveis e capacitação técnica
para a maioria dos cerca de cem produtores goianos (Tavares, 2009).
Apesar do agronegócio de flores ainda ser pouco desenvolvido e recente no
Estado, com pouco uso de tecnologias, sua produção de flores e plantas ornamentais
passou de 4,879 milhões de unidades em 2007 para 6,060 milhões de unidades em 2008,
crescimento de 24,21%, graças à expansão da construção civil, que demandou
investimentos em paisagismo. O incremento foi revelado pelo Estudo do Mercado de
Flores em Goiás, realizado pelo Projeto da Cadeia de Floricultura de Goiás e divulgado
pelo Sebrae. O estudo envolveu 45 empreendimentos, entre produtores, paisagistas e
floricultores (Tavares, 2009).
A produção é escoada por meio de viveiros, floriculturas e supermercados.
Goiás possui aproximadamente duzentas floriculturas, e a rede de supermercados é
responsável por muitas vendas de flores envasadas (Buainain & Batalha, 2007).
Segundo pesquisa realizada pelo Sebrae-GO, por meio do Projeto da Cadeia de
Floricultura de Goiás, a maior produção do Estado está concentrada em arbustos, árvores,
forrações e gramas. De acordo com a pesquisa, a origem dos produtos ainda é procedente
de outros Estados, sendo São Paulo o maior fornecedor de flores envasadas, flores para
arranjos, mudas de bambu e folhagens. Contudo, Goiás abastece o mercado interno no que
7
se refere a mudas de árvores, arbustos, forrações, frutíferas, grama, palmeiras e flores
tropicais (Tavares, 2009).
Dentre as plantas tropicais, destaca-se a Alpinia purpurata, uma das tropicais
mais utilizadas, requisitada pela sua forma densa, volumosa e floração vistosa, duradoura e
que se estende por todo o ano. As variedades desta espécie são cultivadas como
ornamentais, usadas como planta isolada em local de destaque, preferencialmente à meiasombra ou sob sol brando, sendo utilizadas ainda em maciços formando canteiros, ou junto
a paredes e muros. Também são cultivadas para a produção de flores de corte, com uso em
arranjos florais, devido às belas e duradouras inflorescências (Criley, 1995).
2.2 Alpinia purpurata
As principais espécies de flores tropicais pertencem às famílias Araceae,
Heliconiaceae, Musaceae e Zingiberaceae, que vegetam naturalmente ou são exploradas
em plantios convencionais na faixa tropical da América, Ásia e Pacífico Oeste (Assis et al.,
2002). As plantas tropicais são herbáceas, rizomatosas, perenes, de reduzido porte ou
arborescentes, caracterizadas por suas brácteas de cores e formas variadas, maior
durabilidade pós-colheita, de grande beleza, utilizadas para ornamentação de ambientes
(Lins & Coelho, 2004).
No Brasil, existem grandes plantações de flores tropicais, especialmente na
região da mata úmida do Nordeste, com destaque para os estados de Pernambuco e
Alagoas, que já exportam flores para outros estados brasileiros. A temperatura ideal para o
seu cultivo está entre 22ºC e 25ºC (Lamas, 2002).
Atualmente, a família Zingiberacea, maior da ordem Zingiberales, apresenta
cinquenta gêneros, sendo os principais: Burbidgea, Curcuma, Etlingera, Globba,
Hedychium, Kaempfera, Renealmia, Zingiber e Alpinia (Ceap Design, 2011), e cerca de
1.400 espécies classificadas (Wagner et al.,1999).
Os gengibres (Zingiber sp.) são encontrados basicamente nos trópicos, com
espécies originárias da Ásia Tropical, Índia, Ilhas do Pacífico, Tailândia, Indonésia e
Malásia. São plantas distinguidas pela presença de labelo, formado pela fusão de dois
estames estéreis, e pela presença de óleos essenciais em seus tecidos. Além disso, o ovário
é geralmente trilocular e a maioria das sementes tem arilo plumoso. Todos os membros da
8
família têm flores coloridas e tubos florais plenos de néctar, provavelmente polinizadas por
borboletas, e suas flores são efêmeras.
Algumas espécies são utilizadas como corantes, aromatizantes, medicinais e
condimentos. Na culinária asiática, destaca-se o uso dos rizomas de gengibre (Zingiber
officinale) e de turmérico (Curcuma domestica), e as sementes de cardomono (Elettaria
cardamomum). Ainda há espécies em que todas as partes da planta são utilizadas, como a
Zingiber mioga, muito consumida no Japão; e outras que são consumidas como hortaliças
de folhas, como as do gênero Etlingera spp. (Castro, 1995; Chapman, 1995). As espécies
mais utilizadas no paisagismo são de procedência exótica, como a Alpinia purpurata, uma
das ornamentais mais difundidas da família (Ceap Design, 2011). Por sua facilidade de
adaptação, hoje é amplamente cultivada em todas as regiões tropicais do planeta (Wagner
et al., 1999).
As alpínias são plantas eretas, perenes, rizomatosas, entouceiradas pelos
pseudocaules herbáceos, formando touceiras frondosas de, aproximadamente, 1,5 m de
diâmetro e 5,0 m de altura, podendo chegar a 7,0 m. As folhas são coriáceas, grandes,
oblongas e de bordas orladas, com comprimento de 30 cm a 70 cm (podendo atingir até
80 cm), e com 10 cm a 22 cm de largura, cujas dimensões dependem da variedade e da
forma de cultivo (Pinto, 1998).
Os rizomas são caules modificados, cuja característica mais marcante é a perda
do geotropismo negativo, possibilitando seu crescimento horizontalmente, tanto acima
como abaixo da superfície do solo (Lopes & Barbosa, 2000; Lamas, 2004). Este caule é
compacto, rico em reserva (amido), com elevada capacidade de desenvolver raízes
adventícias, emitindo-as ao longo de toda a estrutura, nas diversas direções. Assim,
qualquer porção do rizoma, que apresente gemas, pode ser usada na propagação (Lopes &
Barbosa, 2000).
O pseudocaule é formado por bainhas foliares longas e sobrepostas e, nas
inflorescências, observa-se a presença de brácteas (folhas modificadas) semelhantes a
escamas, dispostas em espigas terminais, que protegem as flores verdadeiras, as quais se
ligam ao pedúnculo da inflorescência (Mattiuz, 2003).
Assim, as verdadeiras flores das alpínias se escondem na espiga da
inflorescência, na base da inserção de suas brácteas, e têm caráter bissexual (Luc-cayol &
Fereol, 1997). São discretas, de coloração branca e formato tubular e, próximo à antese,
após a abertura das brácteas, emergem da inflorescência contrastando com a cor das
9
brácteas (Criley & Paull, 1993). Frequentemente, essas flores sofrem abscisão um dia
depois da antese (Criley, 1989).
A floração ocorre durante o ano todo, com picos de produção, a exemplo do
que ocorre nos Estados do Nordeste, que são nos meses de novembro a abril (Luz et al.,
2005).
Em Pernambuco, as variedades mais cultivadas de A. purpurata para uso como
flor de corte são: Red Ginger, Pink Ginger, Eillen Mcdonald e as cultivares do grupo
Ginoza (Jungle King, Jungle Queen e Kimi - Figura 2.1, e o híbrido de Eileen Macdonald
com Jungle King) (Teixeira & Loges, 2008).
A variedade Jungle King possui inflorescência grande, de coloração vermelho
escuro (magenta), com o tamanho variando de 6 cm a 13 cm, arredondada em forma de
globo, sem produção de ramificações aéreas e de crescimento lento. Já, a Kimi apresenta a
inflorescência mais rosada, de tamanho menor, variando de 4 cm a 8 cm e também sem
produção de ramificações aéreas (Kobayashi et al., 2007).
Algumas variedades, como Jungle King, Kimi e Jungle Queen, produzem raras
cápsulas de frutos, com sementes viáveis. Essas cápsulas são globosas, com cerca de 1 cm
a 5 cm de comprimento e de 2 cm a 3 cm de diâmetro, as quais se abrem quando as
sementes estão maduras. As sementes possuem 0,25 cm de comprimento, são pretas,
oleosas e podem ter arilo vermelho (Kobayashi et al., 2007).
As hastes florais mais velhas senescem após o florescimento e novas plantas, já
portando raízes, brotam em grande número das axilas das brácteas das variedades mais
comuns, Red Ginger e Pink Ginger (Terao et al., 2005).
Em termos de propagação, as plantas de alpínia podem ser propagadas por
divisão de touceiras de plantas adultas, por sementes (Teixeira & Loges, 2008), ou pelas
numerosas mudas que surgem nas brácteas da inflorescência após o florescimento (Lorenzi
& Souza, 2001).
10
Figura 2.1. Variedades de Alpinia purpurata (Teixeira & Loges, 2008).
O processo de divisão de touceiras é possibilitado quando novas brotações são
formadas da planta-mãe que, em geral, são caracterizadas pela sua posição de origem, ou
seja, brotam da porção subterrânea da planta (do caule ou mesmo das raízes) e, como tal,
possuem muitas raízes (Lopes & Barbosa, 2000). Para a espécie, esse método tem sido o
mais utilizado pelos produtores em Pernambuco, por promover o desenvolvimento mais
rápido da planta (Teixeira & Loges, 2008). Porém, conduz à disseminação e ao acúmulo de
agentes causais de importantes doenças que são transmitidas entre plantios sucessivos, via
rizomas contaminados por fungos, bactérias e, principalmente, vírus e nematóides, que
dificultam ou impedem a manifestação do verdadeiro potencial produtivo (Nathan et al.,
1992).
11
O método de propagação por divisão de rizomas é o mais utilizado (Mattiuz,
2003); contudo, tem apresentado problemas, entre os quais a transmissão de doenças e a
dormência dos rizomas (Mello et al., 2000). Isto porque algumas plantas rizomatosas
podem apresentar dormência no período frio (Lopes & Barbosa, 2000).
Além destas formas de propagação, observa-se que determinadas espécies do
gênero Alpinia apresentam estruturas de propagação vegetativa chamadas de brotos aéreos,
que se formam nas axilas das brácteas florais (Criley, 1988). As plantas propagadas desta
forma possuem desenvolvimento muito lento, demorando mais de três anos para
produzirem inflorescências com qualidade, sendo inadequadas para o uso em cultivos
comerciais (Teixeira & Loges, 2008). Apesar da propagação de alpínias por sementes ser
uma alternativa, não foram encontrados relatos na literatura sobre o assunto.
Em plantas ornamentais, a qualidade da muda é de grande importância para
que se alcance os objetivos almejados. Portanto, diante do crescimento no ramo da
floricultura, a produção de uma boa muda depende da qualidade das matrizes e das
técnicas de propagação utilizadas (Lamas, 2004).
Segundo Bachraz (1995), as práticas convencionais de propagação comercial
muitas vezes desperdiçam tempo, trabalho e dinheiro com sementes improdutivas,
disseminação de patógenos por rizomas contaminados ou pelos ferimentos nas plantas com
o processo da enxertia. Estes, além de tornarem-nas mais suscetíveis ao ataque de fungos,
bactérias, vírus, insetos e outros fatores ambientais, exigem uso intensivo de manejo
químico na obtenção de matrizes de qualidade.
Desta forma, a produção de mudas desta espécie via cultura de tecidos tem se
apresentado como alternativa viável para superar tais problemas, por favorecer a rápida
multiplicação e produção de plantas da família Zingiberaceae, em quantidade e qualidade
superiores às obtidas pelos métodos convencionais (Mello et al., 2000).
2.3 MICROPROPAGAÇÃO
A cultura de tecidos compreende um conjunto de técnicas, nas quais um
explante (célula, tecido ou órgão) é cultivado sob condições assépticas em meio nutritivo.
Este processo fundamenta-se na totipotencialidade, ou seja, na capacidade de qualquer
célula do organismo vegetal apresentar todas as informações genéticas necessárias à
regeneração de uma planta completa (Fráguas et al., 1999).
12
Esse é considerado um método importante de propagação, por permitir a
produção de mudas sadias e viáveis, diminuir o período até a colheita, por ser uma forma
de multiplicação rápida e em grande escala, tanto de plantas matrizes com características
desejáveis, como de híbridos, por permitir a produção de plantas independentemente das
condições climáticas e ao longo de todo o ano, livres de nematóides, e por possibilitar
maior uniformidade no florescimento. Apesar das plantas provenientes da cultura de
tecidos não serem imunes ao ataque de doenças, essas apresentam sistema radicular bem
desenvolvido e bom estado nutricional, ou seja, a planta sadia é uma das principais
características para a maior resistência contra as doenças (Nakano, 2008).
Dentre as técnicas de cultura de tecidos, a propagação vegetativa in vitro,
também denominada de micropropagação por causa do tamanho dos propágulos utilizados,
é a de maior impacto na agricultura, principalmente por permitir a produção de genótipos
superiores em larga escala e isenta de patógenos, além de acelerar os métodos
convencionais de propagação vegetativa (Grattapaglia & Machado, 1998).
O uso das técnicas de micropropagação destaca-se principalmente no
lançamento de novas variedades, possibilitando o rápido acesso dos agricultores às novas
cultivares desenvolvidas pelos programas de melhoramento genético. De maior uso em
espécies de propagação vegetativa, tornou-se viável também para a formação de clones de
genótipos superiores de espécies que se reproduzem por sementes (Grattapaglia &
Machado, 1998), ampliando, desta maneira, seu leque de aplicação.
O uso dessa técnica, além das condições estéreis, requer meios nutritivos, os
quais são usados para a cultura de células, tecidos e órgãos de plantas, fornecendo as
substâncias essenciais para o crescimento dos tecidos e controlando, em grande parte, o
padrão de desenvolvimento in vitro (Caldas et al., 1998). São compostos por elementos
essenciais e componentes opcionais, sendo cada um dos meios identificado por sua
composição em sais minerais, e variando a composição e concentração de vitaminas,
reguladores de crescimento e outros suplementos orgânicos (Grattapaglia & Machado,
1998). A escolha do tipo de meio depende da espécie em questão e do propósito da cultura
(cultura de meristemas, organogênese, embriogênese somática, etc.). O meio MS
(Murashige & Skoog, 1962) é universalmente usado, especialmente para morfogênese,
cultura de meristemas e regeneração de plantas, caracterizando-se pela sua elevada
concentração em sais minerais.
13
Assim, além dos macro e micronutrientes, dos carboidratos, vitaminas, mio
inositol, podem ser acrescidos ao meio de cultura MS, os reguladores de crescimento
(Caldas et al., 1998).
Nos protocolos de cultura de tecidos, a adição de reguladores de crescimento
(auxinas, citocininas, giberelinas, ácido abscísico e etileno) supre as possíveis deficiências
dos teores endógenos de reguladores de crescimento nos explantes isolados da planta
matriz (Tagliacozzo, 1998).
A composição e concentração de reguladores de crescimento no meio vão
depender do tecido utilizado, como explante, e da espécie vegetal (Tagliacozzo, 1998),
além de serem fatores determinantes no crescimento e no padrão de desenvolvimento na
maioria dos sistemas de cultura de tecidos (Caldas et al., 1998). As auxinas e citocininas
são as classes de reguladores de crescimento mais usadas na cultura de tecidos. A
formação de raiz, parte aérea e calo é regulada pela disponibilidade e interação dessas duas
classes (Skoog & Miller, 1957, citados por Caldas et al., 1998).
As citocininas são indispensáveis para a superação da dominância apical e
indução de proliferação de gemas axilares. O tipo de citocinina e a sua concentração são os
fatores que mais influenciam o sucesso da multiplicação in vitro. Dentre as citocininas, a
6-benzilaminopurina (BAP) é uma das mais utilizadas, possibilitando a formação de
grande número de brotos e alta taxa de multiplicação em muitos sistemas de
micropropagação, sendo muito eficaz para promover multiplicação de partes aéreas e
indução de gemas adventícias, além de apresentar um custo acessível com relação a outras
citocininas (Hu & Wang, 1983).
A etapa de transplantio envolve a transferência da planta da condição in vitro
para a casa de vegetação, onde é submetida à fase de aclimatização. Esta passagem é
crítica e representa, em alguns casos, fator limitante do processo de micropropagação.
Neste período, a planta passa de uma situação de reduzido fluxo transpiratório para um
ambiente que demanda incremento na taxa de transpiração; passa da condição de
heterotrófica para autotrófica; da condição de alta disponibilidade de nutrientes no meio de
cultura para outra onde precisa, rapidamente, incrementar a absorção de sais. Além do que,
essa sai de ambiente asséptico para outro onde está sujeita ao ataque de micro-organismos
saprofíticos e, eventualmente, patogênicos (Grattapaglia & Machado, 1998).
Assim, a aclimatização das mudas obtidas a partir de métodos de cultivo in
vitro é uma fase essencial para o sucesso da micropropagação (Sciutti & Morini, 1993).
14
Marques et al. (2003) avaliaram o efeito de cinco substratos, com combinações variadas de
casca de arroz carbonizada, Vitasolo®, pó da casca de coco seco e Orgafil®, na formação
de mudas de cajueiro anão precoce (Anacardium occidentale L.). Os autores concluíram
que, de maneira geral, apesar de não serem observadas diferenças marcantes, o uso do
Vitasolo® combinado com os outros substratos orgânicos, além de ter proporcionado bons
resultados na produção de mudas em tubetes, ainda contribuiu para a valorização de
resíduos agroindustriais.
Existem poucos trabalhos que relatam detalhadamente os procedimentos de
transplantio e de aclimatização de espécies micropropagadas. As informações sobre o
manejo das plantas nessa etapa, incluindo tanto os problemas quanto as soluções
encontradas, são muito importantes, no sentido de proporcionar o melhor aproveitamento
das plântulas propagadas in vitro e a obtenção de mudas aclimatizadas de melhor
qualidade.
Neste contexto, é fundamental a determinação dos substratos adequados para a
aclimatização, os quais devem garantir a manutenção mecânica do sistema radicular, a
estabilidade da planta, o suprimento de água e nutrientes e as trocas gasosas entre as raízes
e o ar atmosférico (Silveira et al., 2002).
Atualmente, diversas técnicas biotecnológicas são utilizadas em trabalhos de
melhoramento genético com flores tropicais, destacando-se a micropropagação e o cultivo
de embriões em espécies das famílias Heliconiaceae e Zingiberaceae (Rodrigues, 2005;
Torres et al., 2005). Entretanto, ainda não foram encontrados trabalhos relacionados à
germinação in vitro de sementes de Alpinia purpurata na literatura corrente indexada.
Apesar do potencial de uso de qualquer tecido vegetal como explante, tendo
em vista a totipotência das células (Grattapaglia & Machado, 1998), a micropropagação de
alpínias é realizada, basicamente, pelo uso de explantes provenientes de gemas axilares das
brácteas das inflorescências. Assim, aquelas variedades que não emitem brotações em suas
inflorescências não são contempladas pelo uso desta técnica de cultivo (Brian & Criley
1993; Illg & Faria, 1995). Existe ainda a possibilidade de uso de gemas axilares do rizoma,
sendo este mais difícil de se trabalhar, por apresentar alta incidência de contaminação
(Kochuthressia et al., 2010). Desta forma, a micropropagação, associada à germinação in
vitro, apresentam-se como alternativas à multiplicação destas variedades.
Estes processos possibilitam maior rapidez na obtenção dos explantes,
facilitando a propagação quando as tecnologias convencionais são difíceis, a obtenção de
15
plantas independente da estação do ano e a preservação do fenótipo e da atividade
fisiológica da planta-matriz. No entanto, a ocorrência de bons resultados na
micropropagação e na germinação in vitro dependem da otimização de inúmeras variáveis,
como a adequação do meio de cultura, utilização ou não de reguladores de crescimento e a
escolha do melhor substrato na fase de aclimatização.
Além disso, sabe-se que pode existir variabilidade na resposta morfogenética in
vitro tanto entre espécies do mesmo gênero, como também entre genótipos da mesma
espécie (diferentes cultivares ou clones), devido às diferenças em termos de exigências
requeridas para o crescimento de um tecido nessas condições. Isso leva à necessidade de se
definir protocolos diferenciados, necessitando otimizar os meios de cultura para cada uma
destas situações (Nagao et al., 1994; Grattapaglia & Machado, 1998).
2.4 APLICAÇÃO DE BIORREATORES NA CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS
Os primeiros biorreatores utilizados para a cultura de tecidos vegetais surgiram
a partir dos equipamentos denominados fermentadores, desenvolvidos há muitas décadas
para o cultivo de fungos e bactérias para fins industriais (Preil & Beck, 1991).
Recentemente, os biorreatores começaram a ser utilizados para o cultivo de
células, tecidos, gemas e plântulas, tendo como objetivo final a produção de mudas em
larga escala. A utilização da tecnologia dos biorreatores permite, às empresas
especializadas na produção de mudas, acelerar o ciclo de produção, reduzindo os custos e
aumentando a produtividade, com preços bastante competitivos (Ribeiro & Bastos, 2008).
Os biorreatores utilizam meio de cultura líquido, o que permite a renovação do
ar e de nutrientes durante o cultivo, resultando em maior crescimento e multiplicação,
quando comparado com o meio semissólido. Essas condições podem propiciar crescimento
ótimo das células vegetais mediante regulação precisa dos fatores ambientais e
fornecimento contínuo de água, nutrientes e oxigênio (Perez Ponce, 1998).
Os sistemas de imersão do material vegetal são divididos em imersão
permanente e temporária. No sistema de imersão permanente, o material permanece imerso
continuamente no meio de cultura. No cultivo sob imersão temporária, atualmente o mais
utilizado, o material fica temporariamente imerso no meio de cultura (Alvard et al., 1993;
George, 1996).
16
O sistema de imersão temporária (SIT) é constituído por dois frascos
conectados por tubos de silicone. Um dos frascos acondiciona o meio de cultura, enquanto
que no outro são incubados os explantes. Neste sistema, o ar fornecido por um compressor
é esterilizado ao passar por um filtro de 0,22 µm (Millipore®), entra no frasco que contém
o meio de cultura e a pressão de ar bombeia o meio de cultura líquido, fazendo com que
chegue ao frasco que contém os explantes. O ar promove a renovação da atmosfera do
frasco de cultivo. Após o tempo de imersão pré-estabelecido, ocorre a reversão do
processo, o meio nutritivo retorna ao frasco de armazenamento. A frequência de imersões é
controlada por temporizadores eletrônicos e válvulas solenóides. A duração e o intervalo
(frequência) entre imersões dependem, principalmente, da espécie utilizada (Medeiros,
2011).
A propagação em larga escala, com a utilização de biorreatores, já foi relatada
com sucesso para várias espécies, como bananeira (Alvard et al., 1993), cana-de-açúcar
(Lorenzo et al., 1998), orquídea (Paek et al., 2001) e abacaxizeiro (Escalona et al., 1999),
com taxa de multiplicação sempre superior à micropropagação convencional.
Lemos et al. (2001) realizaram a micropropagação de bananeiras cultivar Terra,
utilizando biorreatores de imersão temporária, com objetivo de aumentar a taxa de
multiplicação e diminuir os custos de produção das mudas. Os autores observaram que o
ciclo de imersão de 4 horas e a renovação do meio de cultura aos 30 dias foram essenciais
para maior produção de biomassa e crescimento dos explantes. A composição do meio de
cultura também influenciou o desenvolvimento dos explantes de banana cultivados nos
biorreatores. Explantes cultivados em meio MS + 3,0 mg.L-1 de BAP, com renovação para
MS após 30 dias, apresentaram maior produção de biomassa e alta taxa de multiplicação.
Comparando o biorreator de imersão temporária com o sistema tradicional usando meio
semissólido, os autores observaram que, no primeiro, as plantas apresentaram maior
comprimento, produção de biomassa de 2,86 vezes maior e 2,2 vezes mais brotos do que
no sistema tradicional.
A utilização do SIT, no entanto, não tem sido mais abrangente devido à
ausência de protocolos estabelecidos. Até o momento, são inexistentes na literatura
protocolos ou mesmo pesquisas envolvendo o cultivo de plantas do gênero Alpinia em
sistema de imersão temporária. No ajuste de protocolo é importante garantir bons índices
de multiplicação e reduzida ocorrência de desordens fisiológicas, como o estiolamento, o
albinismo e as alterações morfogenéticas. As principais desvantagens na utilização de
17
biorreatores em sistema de imersão temporária são a variação no tamanho das mudas
formadas, gerando desuniformidade na aclimatização, a contaminação microbiana que
pode afetar milhares de plantas em um único recipiente, a recalcitrância e a hiperidricidade
dos explantes (Medeiros, 2011).
2.5 REFERÊNCIAS
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18
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25
3 ESTABELECIMENTO DE PROTOCOLO DE PROPAGAÇÃO IN VITRO DE
VARIEDADES DE ALPÍNIA A PARTIR DE SEMENTES
RESUMO
Alpinia purpurata (Vieill.) K. Schum. (Zingiberaceae) é uma planta largamente
utilizada como ornamental em projetos paisagísticos e, atualmente, tem expandido suas
fronteiras de uso como flor de corte. É originária das florestas e campos da Nova
Caledônia, Ilhas Salomão e Virgens e dos arquipélagos de Bismarck e Bouganville, na
região da Indo-Malásia. Por sua facilidade de adaptação, passou a ser largamente cultivada
nesses locais e, atualmente, encontra-se estabelecida em condições naturais nas mais
diversas regiões tropicais do mundo. As alpínias podem ser propagadas por semente, por
divisão de touceiras de plantas adultas, por rizomas e por micropropagação. Esta última
forma de propagação vem ganhando destaque, por favorecer a rápida multiplicação e
produção de mudas em quantidade e qualidade superiores àquelas obtidas por meio de
métodos convencionais, contornando problemas como a transmissão de doenças, comum
em sistemas de propagação vegetativa. O objetivo deste trabalho foi desenvolver protocolo
de propagação in vitro a partir de sementes de A. purpurata, variedades Jungle King e
Kimi, determinando-se a melhor concentração do agente desinfestante, o melhor meio para
multiplicação e sua posterior aclimatização, bem como o comportamento das duas
variedades em cada fase. Inicialmente, para o processo de assepsia das sementes foram
avaliadas cinco concentrações de hipoclorito de sódio (0%; 0,625%; 1,250%; 1,875% e
2,5%). Posteriormente, essas plântulas foram inoculadas em meio MS acrescido de cinco
concentrações de BAP (0 mg.L-1; 1 mg.L-1; 2 mg.L-1; 3 mg.L-1 e 4 mg.L-1) mais 0,1 mg.L-1
de AIA. Após 91 dias, os explantes foram transferidos para meio indutor de enraizamento
(MS + 1 mg.L-1 de AIB), no qual permaneceram por 30 dias. Por último, as plantas foram
aclimatizadas em casa de vegetação. Em todas as fases utilizou-se o delineamento
inteiramente casualizado com vinte repetições por tratamento. De acordo com os
resultados, o uso do hipoclorito de sódio mostrou-se eficiente na assepsia das sementes,
havendo contaminação apenas no tratamento controle. Na fase seguinte, os meios MS +
3 mg.L-1 de BAP + 0,1 mg.L-1 de AIA e MS + 4 mg.L-1 de BAP + 0,1 mg.L-1 de AIA
resultaram em maior quantidade de brotos para as variedades Jungle King e Kimi,
respectivamente. O uso de 1 mg.L-1 de AIB promoveu bom enraizamento das plantas. A
taxa de sobrevivência das plantas aclimatizadas foi satisfatória, sendo superior à 90%. Para
a maior parte das variáveis avaliadas, as duas variedades apresentaram comportamentos
diferentes entre si, mesmo quando cultivadas em meios de cultivo idênticos.
Palavras-chave: alpínia, germinação in vitro, desinfestação, micropropagação, semente.
ABSTRACT
26
ESTABLISHMENT OF PROTOCOL FOR IN VITRO PROPAGATION OF VARIETY
ALPINIA FROM SEEDS
Alpinia purpurata (Vieill.) K. Schum. (Zingiberaceae) is widely used as an
ornamental plant in landscaping projects, and currently has expanded its borders to use as
cut flowers. It is in forests and fields of New Caledonia, Solomon Islands and Virgin and
the Bismarck Archipelago and Bouganville in the region of Indo-Malaysia. For ease of
adaptation, became widely cultivated in these places, and now is set out in the wild in
several tropical regions of the world. The alpinias can be propagated by seed, by division
of clumps of mature plants by rhizomes and by micropropagation. The latter form of
propagation is gaining prominence, promote the rapid multiplication and production of
seedlings in quantity and quality superior to those obtained by conventional methods,
circumventing problems such as disease transmission, common systems of vegetative
propagation. The aim of this study was to develop in vitro propagation protocol from seed
for the varieties of A. purpurata, Jungle King and Kimi, determining the best concentration
of the agent disinfest, the best means for its multiplication and acclimatization, as well as
the behavior of the two varieties in each phase. Initially, the process of sterile seeds were
five concentrations of sodium hypochlorite (0%; 0,625%; 1,250%; 1,875% e 2,5%). Later,
they were inoculated on MS medium supplemented with different concentrations of BAP
(0 mg.L-1, 1 mg.L-1, 2 mg.L-1, 3 mg.L-1 and 4 mg.L-1 mg.L-1) and 0.1 mg.L-1 IAA. After 91
days, the explants were transferred to rooting induction medium (MS + 1 mg L-1 EIA),
where they remained for 30 days. Finally, the plants were acclimatized in a greenhouse. At
all stages we used a completely randomized design with twenty replicates. According to
the results, the use of sodium hypochlorite was efficient in sterile seeds, contamination was
observed only in the control treatment. In the next phase, the MS medium + 3 mg L-1 BAP
+ 0.1 mg.L-1 IAA and MS + 4 mg.L-1 BAP + 0.1 mg.L-1 IAA result in greater quantity for
the varieties of sprouts Jungle King and Kimi respectively. The use of 1 mg.L-1 IBA
promoted rooting of the good plants. The survival rate of acclimatized plants was
satisfactory, being higher than 90%. For the majority of variables, the two varieties showed
different performance, even when grown in culture media identical.
Key words: alpinia, germination in vitro, disinfestation, micropropagation, seed.
3.1 INTRODUÇÃO
O aumento da produção de flores tropicais, nativas e exóticas, é de grande
importância para a floricultura brasileira. Espécies como Alpinia purpurata são exemplos
de flores exóticas, com centro de origem na Ásia, que se adaptaram muito bem ao cultivo
como plantas ornamentais e flores de corte, na maioria das regiões brasileiras (Loges et al.,
2009).
As alpínias podem ser propagadas por semente, por divisão de touceiras de
plantas adultas e por rizomas (Teixeira & Loges, 2008). A propagação comercial desta
27
espécie é geralmente vegetativa, por meio de divisão dos rizomas (Nathan et al., 1992). Em
Pernambuco, o processo de divisão de touceiras tem sido o mais utilizado pelos produtores
por promover um desenvolvimento mais rápido da planta (Teixeira & Loges, 2008).
Porém, estes métodos conduzem à disseminação e ao acúmulo de agentes causais de
importantes doenças que são transmitidas entre plantios sucessivos, via rizomas
contaminados por fungos, bactérias e, principalmente, vírus e nematóides, que dificultam
ou impedem a manifestação do verdadeiro potencial produtivo (Nathan et al., 1992).
Observa-se, ainda, que determinadas espécies do gênero Alpinia apresentam
estruturas de propagação vegetativa chamadas de brotos aéreos, que se formam nas axilas
das brácteas florais (Criley, 1988). As plantas propagadas desta forma apresentam
desenvolvimento muito lento, demorando mais de três anos para produzirem
inflorescências com qualidade, sendo inadequadas para o uso em cultivos comerciais
(Teixeira & Loges, 2008).
Assim, a micropropagação associada à germinação in vitro, apresenta-se como
uma alternativa para a multiplicação das variedades que não apresentam essas brotações
aéreas. Além disso, este processo possibilita maior rapidez na obtenção dos explantes,
facilitando a propagação quando as tecnologias convencionais são difíceis, a obtenção de
plantas independente da estação do ano e a preservação do fenótipo e da atividade
fisiológica da planta-matriz. No entanto, a ocorrência de bons resultados na
micropropagação e na germinação in vitro dependem da otimização de inúmeras variáveis.
Nagao et al. (1994) relatam que as exigências requeridas para o crescimento de um tecido
em condições in vitro variam entre as espécies, entre variedades e até mesmo dentro da
própria planta, necessitando, assim, otimizar os meios de cultura para cada uma desta
situações.
A técnica de germinação de sementes in vitro pode ser utilizada tanto para a
produção de mudas, como ponto de partida para a obtenção de explantes sadios (plântulas)
para posterior repicagem. Essa técnica já é utilizada em outras espécies, como por
exemplo, em orquídeas. Devido ao seu pequeno tamanho e limitadas reservas, é possível
que essas sementes sejam perdidas ou apresentem baixa sobrevivência quando semeadas in
vivo (Moraes, 2007).
Outra vantagem é que a germinação e o desenvolvimento são mais rápidos in
vitro, por causa das condições ambientais controladas, e por geralmente não haver
competição com fungos ou bactérias (Pierik, 1990). Bach & Castro (2004), estudando a
28
germinação de sementes de Cattleya sp. (Orchidaceae) in vitro, obtiveram grande número
de mudas. Resultados semelhantes foram alcançados por Castro & Bach (2007) com
Dendrobium sp. (Orchidaceae). Entretanto, a ocorrência de segregação genética ocasionada
pela ocorrência de fecundação cruzada, devido à grande variabilidade quando do uso de
sementes (Moraes, 2007), é um aspecto que deve ser levado em consideração e melhor
abordado pela pesquisa científica.
Desta forma, por não terem sido encontradas pesquisas referentes à germinação
de alpínia, este trabalho objetivou estabelecer protocolo de propagação in vitro a partir de
sementes, para diferentes variedades de Alpinia purpurata, e identificar eventuais
diferenças nas respostas de regeneração in vitro entre os genótipos avaliados.
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
A pesquisa foi realizada no Laboratório de Pesquisa Aplicada à Biofábrica de
Plantas (Lapab) do Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste (Cetene), localizado no
Recife, Pernambuco, com duas variedades de Alpinia purpurata, Jungle King e Kimi.
Frutos maduros foram coletados de plantas matrizes vigorosas cultivadas a
campo, cedidos da produção comercial do Sítio Vale das Flores, localizado na zona rural
de Gravatá, PE, em agosto de 2010.
Os frutos foram lavados com detergente comercial e água corrente. Em
seguida, as sementes foram extraídas e, com auxílio de uma peneira, removeu-se a
mucilagem sob água corrente. Inicialmente, as sementes passaram por processo de assepsia
por meio de imersão em álcool 70%, por dois minutos. Em seguida, alguns ensaios foram
conduzidos, conforme dispostos a seguir.
3.2.1 Ensaio I: desinfestação de sementes e estabelecimento
Para se estabelecer um procedimento de assepsia, as sementes foram
submetidas a cinco tratamentos, constituídos por diferentes concentrações de hipoclorito de
sódio comercial, sendo: T0 – 0% (controle); T1 – 0,625%; T2 – 1,250%; T3 – 1,875%; e
T4 – 2,5%. As sementes foram mantidas imersas na solução aquosa de hipoclorito durante
cinco minutos sob agitação manual constante, sendo imersas somente em água no T0. O
29
agente desinfestante foi removido por meio de tríplice lavagem com água destilada e
autoclavada.
Foram inoculadas quatro sementes por frasco (capacidade de 250 mL),
constituindo a unidade experimental, cada qual contendo 30 mL do meio de cultivo MS
(Murashige & Skoog, 1962) semissólido, solidificado com 6 g.L-1 de ágar, e tendo seu pH
ajustado para 5,8 antes da autoclavagem à 121°C. Após inoculação, os frascos foram
mantidos em sala de crescimento à 25ºC ± 2°C, irradiância de 40 μmol.m-2.s-1, proveniente
de duas lâmpadas de luz fria de 20 W e fotoperíodo de 16 horas.
A avaliação dos tratamentos foi realizada no sétimo dia após a inoculação,
considerando-se a presença ou não de contaminação fúngica ou bacteriana no frasco.
O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, arranjado em
fatorial de 2 x 5 (variedades de alpínia x concentrações de hipoclorito de sódio), com vinte
repetições por tratamento, totalizando oitenta sementes por variedade. Os dados foram
submetidos à análise de variância e as médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste
de Tukey à 5% de probabilidade. Utilizou-se o programa estatístico Assitat 7.6 (Assis &
Silva, 2006).
3.2.2 Ensaio II
Inicialmente, para a desinfestação, as sementes foram imersas em 0,625% de
solução comercial de hipoclorito de sódio comercial, acrescida de duas gotas do detergente
Tween 80, por cinco minutos e sob agitação manual constante. O agente desinfestante foi
removido por meio de tríplice lavagem em água destilada e autoclavada, e as sementes
permaneceram embebidas no último enxágue, por cerca de dez minutos, até o momento da
inoculação.
Para a fase de estabelecimento, inoculou-se, em câmara de fluxo laminar, cinco
sementes por pote (capacidade de 250 mL), fechado com tampa plástica branca translúcida
e vedado com filme plástico de PVC. Cada pote continha 30 mL de meio de cultura básico
MS, suplementado com 30 g.L-1 de sacarose, solidificado com 6 g.L-1 de ágar, tendo o pH
ajustado para 5,8 antes da autoclavagem à 121°C por 20 minutos, segundo metodologia
utilizada pelos pesquisadores do Lapab1.
1
Informações do Pesquisador Deivid Almeida Costa (Lapab/Cetene), em 01/06/2010.
30
Após inoculação, as culturas foram mantidas em sala de crescimento à 25ºC ±
2°C, irradiância de 40 μmol.m-2.s-1, proveniente de duas lâmpadas de luz fria de 20 W,
fotoperíodo de 16 horas e umidade relativa ao redor de 60%.
3.2.2.1 Multiplicação
Após 30 dias de cultivo, as plântulas provenientes da fase de estabelecimento,
com aproximadamente 2 cm de altura, foram subcultivadas individualmente em pote
(capacidade de 250 mL), em novo meio de cultura básico MS, acrescido ou não dos
reguladores de crescimento ácido 3-indol acético (AIA - 0,1 mg.L-1) e diferentes doses de
6-benzilaminopurina (BAP) para indução da multiplicação, segundo o tratamento avaliado
(Tabela 3.1).
Tabela 3.1. Tratamentos avaliados para a multiplicação in vitro de plântulas de Alpinia
purpurata, variedades Jungle King e Kimi.
Tratamento
Composição do meio de cultura
T0
MS sem reguladores de crescimento
T1
MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP
T2
MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 2 mg.L-1 de BAP
T3
MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 3 mg.L-1 de BAP
T4
MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 4 mg.L-1 de BAP
As avaliações foram realizadas semanalmente durante 91 dias, totalizando 13
avaliações, considerando-se os seguintes parâmetros: altura média da planta (da região do
colo até a extremidade superior formada pela folha mais alta), número médio de folhas, de
brotos e de raízes por planta. A cada 30 dias, as plantas foram subcultivadas para meio
fresco idêntico ao anterior, sendo realizados, ao todo, dois subcultivos.
O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, arranjado em
fatorial de 2 x 5 (variedades de alpínia x concentrações de reguladores de crescimento),
com vinte repetições por tratamento. Cada planta constituía uma repetição. Os dados foram
submetidos à análise de variância e as médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste
de Tukey à 5% de probabilidade. Utilizou-se o programa estatístico Assitat 7.6 (Assis &
Silva, 2006).
31
3.2.2.2 Enraizamento
Após 91 dias de cultivo em meio indutor de multiplicação, as plantas foram
repicadas, preservando-se a identidade e origem de cada planta, de acordo com os
tratamentos avaliados na fase de multiplicação (Tabela 3.1). A planta principal foi separada
dos brotos e colocada individualmente em pote (capacidade de 250 mL) contendo 30 mL
de meio de cultura MS básico, acrescido de 1 mg.L-1 de ácido indolbutírico (AIB), tendo o
pH ajustado para 5,8 antes da autoclavagem à 121°C por 20 minutos. Após inoculação, os
potes foram mantidos em sala de crescimento à 25ºC ± 2°C, irradiância de 40 μmol.m-2.s-1,
proveniente de duas lâmpadas de luz fria de 20 W e fotoperíodo de 16 horas.
Após 30 dias em meio indutor de enraizamento foram retiradas de cada
tratamento (Tabela 3.1) cinco plantas ao acaso para a determinação das massas das
matérias frescas da parte aérea e do sistema radicular. A massa da matéria seca foi
determinada após secagem das partes em estufa com circulação forçada de ar, pelo método
gravimétrico rápido, à 135ºC (± 2ºC), durante uma hora (Bezerra Neto & Barreto, 2004), e
pesagem em balança analítica digital.
3.2.2.3 Aclimatização
Após 30 dias no meio indutor de enraizamento, retirou-se o excesso de meio de
cultivo das raízes das plantas com auxílio de papel toalha. As plantas foram colocadas
diretamente em sacos plásticos (10 cm x 7 cm) contendo o substrato comercial
Basaplant®. Foram mantidas em casa de vegetação sob condição usual: 70% de
sombreamento e sistema de irrigação/nebulização intermitente por 5 minutos, a intervalos
de 3 horas.
Após 30 dias de aclimatização, foram determinados os seguintes parâmetros:
altura média da planta (da região do colo até a extremidade superior formada pela folha
mais alta), número médio de folhas e de brotos por planta, percentagem de sobrevivência e
massas das matérias fresca e seca da parte aérea e do sistema radicular. A massa da matéria
seca foi determinada após secagem das partes em estufa com circulação forçada de ar, pelo
método gravimétrico rápido, à 135ºC (± 2ºC), durante uma hora (Bezerra Neto & Barreto,
2004), e pesagem em balança analítica digital.
32
O experimento foi instalado seguindo o delineamento inteiramente casualizado,
arranjado em fatorial 2 x 5 (variedades de alpínia x concentrações de reguladores de
crescimento), com vinte repetições por tratamento. Foram mantidos como tratamentos
(Tabela 3.1) a influência dos cinco meios de indução de multiplicação para cada variedade.
As avaliações foram submetidas à análise de variância e as médias comparadas pelo teste
de Tukey à 5% de probabilidade. Utilizou-se o programa estatístico Assitat 7.6 (Assis &
Silva, 2006).
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.3.1 Ensaio I: desinfestação de sementes e estabelecimento
Não houve contaminação fúngica e/ou bacteriana após a assepsia das sementes
de alpínia com o uso de hipoclorito de sódio, independente da concentração. Já, nos
tratamentos controle, houve 100% de contaminação, sendo a maioria fúngica (60% e 77%),
seguida por bacteriana (40% e 23%), respectivamente nas variedades Jungle King e Kimi.
Os resultados obtidos comprovaram a eficiência do hipoclorito de sódio na
assepsia das sementes para ambas as variedades, mesmo na menor concentração avaliada,
de 0,625%; o que se torna interessante devido à possibilidade de menor consumo do
produto e menor custo. Além disso, segundo Miyoshi & Mii (1998) e Kaneko &
Morohashi (2003), a manipulação desse produto exige determinados cuidados, sendo
necessário evitar o contato com a pele ou inalação, para diminuir o risco de irritações nas
mãos ou na mucosa bronquial.
Resultados positivos também foram observados por Rodrigues et al. (2009) na
assepsia de sementes de Heliconia spp. (Heliconiaceae), visando o resgate de embriões,
usando solução aquosa à base de hipoclorito de sódio comercial (2,5% de cloro ativo), na
proporção de 2:1, contendo 0,1% de Tween 80, por aproximadamente 30 minutos.
Diferentemente, devido a problemas de contaminação, Oliveira (2007) obteve melhor
resultado usando o fungicida tiofanato metílico (Cercobim 700 PM) à 2 g.L-1 e imersão das
sementes de Etlingera elatior (Zingiberaceae) por 30 minutos em solução de hipoclorito de
sódio à 0,6%, juntamente com duas gotas de Tween 80.
Neves et al. (2002) avaliaram o desenvolvimento in vitro de plântulas de
progênies de oito genótipos de bananeira, sendo quatro espécies selvagens Calcutta e
33
Malaccensis (Musa acuminata-AA), Butuhan e França (M. balbisiana-BB) e os híbridos
0304-02, 1304-06, 4252-04 e 9379-09 (M. acuminata-AA), obtidos a partir de cultura de
embriões. Os autores verificaram eficiência de 85% na assepsia das sementes, ao utilizar
nitrato de prata à 0,5% por 10 minutos, seguido de cloreto de sódio à 5% por 5 minutos.
Gutiérrez Miceli et al. (2008) obtiveram sucesso ao desinfestar sementes de Renealmia
mexicana (Zingiberaceae), imergindo-as em solução aquosa de hipoclorito de cálcio à 10%
por 10 minutos.
Juntamente com o etanol, o cloro é o princípio ativo mais utilizado com a
finalidade de assepsia, geralmente na forma de hipoclorito de sódio, sendo facilmente
encontrado em formulações comerciais de água sanitária, além de ser facilmente removível
pela água de lavagem. As concentrações de cloro ativo encontradas em água sanitária
comercial podem variar de uma marca para outra, e até mesmo dentro de uma mesma
marca. Além de sua efetividade como agentes desinfestantes, os hipocloritos têm sido
citados como estimulantes da germinação, em virtude de sua capacidade de estimular a
atividade da α-amilase, ou, ainda, pelo fato de promoverem a superação da dormência
(Miyoshi & Mii, 1998; Kaneko & Morohashi, 2003).
3.3.2 Ensaio II
3.3.2.1. Multiplicação
De forma geral, para a altura da planta, não houve diferença entre as variedades
de alpínia, apresentando ambas, em média, 4,4 cm de altura aos 91 dias de cultivo in vitro.
Independente da variedade, o meio T0 proporcionou maior crescimento em altura das
plantas, com 4,8 cm, seguido pelo meio T1, com 4,7 cm, em média (Tabela 3.2).
A altura média das plantas foi inversamente proporcional ao aumento da
concentração de BAP no meio de cultura, ou seja, quanto maior a concentração desse
regulador, menor a altura da planta principal. Este resultado pode ser justificado pelo uso
do BAP que, normalmente, tende a inibir a altura das plantas. Malik et al. (2005) afirmam
que em diversas espécies foi observado que a exposição dos explantes à alta concentração
de BAP pode levar ao acúmulo desta citocinina, o que inibe o crescimento da parte aérea.
34
Tabela 3.2. Altura média da planta principal (cm) de Alpinia purpurata, variedades Jungle
King e Kimi, durante 91 dias de cultivo in vitro em diferentes meios indutores
de multiplicação.
Variedade
T01
T1
T2
T3
T4
Média
2
Jungle King
4,9 A
4,7 AB
4,3 BC
4,2 BC
4,1 C
4,4 ns
Kimi
4,7 A
4,6 A
4,4 AB
4,3 AB
3,9 B
4,4
Média
4,8 A
4,7 AB
4,3 BC
4,2 C
4,0 C
--1
ns
2
F
0,54
--F
10,7 7 **
----F1 x F2
0,51 **
--C.V.(%)
13,77
----1
T0 (MS padrão); T1 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP); T2 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 2 mg.L-1 de BAP); T3 (MS + 0,1
mg.L-1 de AIA + 3 mg.L-1 de BAP); T4 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 4 mg.L-1 de BAP).
2
Médias seguidas de mesma letra maiúscula na linha não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey à 5%; ** significativo ao
nível de 1% de probabilidade; nsnão significativo.
F1 (variedades de alpínia); F2 (meios de cultivo); F1 x F2 (interação entre variedades e meios de cultivo); C.V. (coeficiente de variação).
Nota-se 19,5% e 20,5% a mais de altura do meio T0 para o T4 nas variedades
Jungle King e Kimi, respectivamente (Tabela 3.2). Resultado semelhante foi obtido por
Oliveira et al. (2001), com Musa sp. cv. FHIA-01 (Musaceae), mesma ordem das espécies
de alpínias (Zingiberaceae). Segundo os autores, plantas submetidas a altas concentrações
de BAP, como 5,0 mg.L-1 e 7,5 mg.L-1, apresentaram tamanho reduzido, sempre inferior à
1,5 cm. Plantas pequenas não são desejáveis no processo de micropropagação, por
necessitarem sofrer alongamento antes do processo de enraizamento, a fim de que não haja
perdas elevadas na fase de aclimatização.
Para o número médio de brotos por planta, houve diferença entre as variedades,
sendo que a Jungle King mostrou-se superior à Kimi em cada meio de cultivo,
apresentando de 20% a 35% a mais de brotos; exceção feita quando do uso do meio T0, no
qual ambas comportaram-se de forma semelhante em meio de cultivo isento de reguladores
(Tabela 3.3). Assim, nota-se que a variedade Jungle King respondeu melhor à adição de
reguladores de crescimento ao meio.
Tabela 3.3. Número médio de brotos de Alpinia purpurata, variedades Jungle King e
Kimi, obtidos durante 91 dias de cultivo in vitro em diferentes meios indutores
de multiplicação.
Variedade
T01
T1
T2
T3
T4
Média
2
Jungle King
2,7 aD
4,0 aC
4,2 aBC
5,3 aAB
6,4 aA
4,5 a
Kimi
2,8 aB
3,1 bB
3,2 bB
3,9 bB
5,3 bA
3,7 b
Média
2,7 D
3,6 CD
3,7 C
4,6 B
5,8 A
--F1
17,80 **
--F2
27,80 **
----1
2
F xF
1,74 **
--C.V. (%)
34,1
----1
T0 (MS padrão); T1 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP); T2 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 2 mg.L-1 de BAP); T3 (MS + 0,1
mg.L-1 de AIA + 3 mg.L-1 de BAP); T4 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 4 mg.L-1 de BAP).
2
Médias seguidas de mesma letra maiúscula na linha e de mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo
teste de Tukey a 5%; ** significativo ao nível de 1% de probabilidade; nsnão significativo.
F1 (variedades de alpínia); F2 (meios de cultivo); F1 x F2 (interação entre variedades e meios de cultivo); C.V. (coeficiente de variação).
35
Notou-se que mesmo as plantas de alpínia colocadas em meio sem regulador de
crescimento apresentaram brotações laterais. Sabe-se que um dos principais determinantes
da forma vegetal é o grau de dominância apical. As plantas com forte dominância apical,
como o milho (Zea mays), apresentam um único eixo de crescimento com poucas
ramificações laterais. Por outro lado, em plantas arbustivas, como é o caso das alpínias,
ocorre o crescimento de muitas gemas laterais (Taiz & Zeiger, 2004).
Entretanto, resultados contrários já foram obtidos em alguns trabalhos. Wong
(1986), trabalhando com nove cultivares de bananeira (Musa spp.), não obteve
multiplicação das plantas na ausência de citocinina; assim como Fráguas et al. (2009),
estudando o abacaxi IAC Gomo-de-mel (Bromeliaceae), no qual também não ocorreu
proliferação de brotos. De acordo com Santos-Serejo et al. (2006), quando o explante é
cultivado em meio basal sem reguladores de crescimento ocorre o desenvolvimento de uma
única planta, em decorrência do efeito da dominância apical; ao contrário, quando esse é
cultivado em meio contendo citocininas, ocorre a formação de brotos que proliferam-se,
formando grupos de brotos secundários e terciários, os quais podem ser subdivididos e
separados no próximo subcultivo, dando origem a novos brotos, e assim por diante.
A multiplicação de plantas sem reguladores de crescimento é importante nos
casos em que se deseja diminuir os riscos de variação somaclonal, pois o BAP é um dos
principais agentes causadores de alterações genotípicas (Smith, 1988). Porém, em plantas
ornamentais, a ocorrência de alguma variação somaclonal pode ser interessante, desde que
esta não seja apenas fenotípica, e sim genotípica, garantindo a transmissão desta nova
característica aos seus descendentes (Cid & Teixeira, 2010).
Ao contrário do observado para a altura média da planta, o número médio de
brotos foi diretamente proporcional à concentração de BAP no meio de cultivo, para ambas
as variedades (Tabela 3.3). Semelhantemente, Debiasi (2000), trabalhando com
micropropagação de bananeira, relatou que a altura média das plantas foi inversamente
proporcional à taxa de multiplicação, ou seja, quanto maior a altura média da planta, menor
o número médio de brotos formados.
O meio T4 foi estatisticamente superior aos demais, resultando em mais que o
dobro do número de brotos, em comparação ao meio isento de reguladores de crescimento
(Tabela 3.3). Estes resultados podem ser justificados pela superação da dominância apical,
provocada pela ação da citocinina. Embora a dominância apical possa ser determinada
inicialmente pela auxina, estudos fisiológicos indicam que as citocininas desempenham um
36
papel importante no crescimento inicial das gemas laterais, estimulando a divisão celular e
o crescimento das gemas (Taiz & Zeiger, 2004), como foi observado neste estudo.
Com esses resultados foi possível observar que o aumento do número médio de
brotos foi consequência do aumento na concentração de BAP no meio e da interação entre
genótipo e citocinina, corroborando com os estudos de Marciani-Bendezú et al. (1990). Os
autores testaram diferentes concentrações de BAP na multiplicação de abacaxi Smooth
Cayenne e concluíram que a melhor proliferação de brotos foi obtida quando se utilizaram
5 mg.L-1 da citocinina. No entanto, Almeida et al. (1997), também trabalhando com
abacaxi, cvs. Pérola e Primavera, observaram que concentrações bem menores de BAP, de
1 mg.L-1 e 2 mg.L-1, respectivamente, foram eficientes para a obtenção de altas taxas de
proliferação.
Esses resultados estão em consonância com a importância da citocinina em
vários aspectos do crescimento e desenvolvimento da planta, tais como a divisão celular
(Skoog & Miller, 1957), a superação da dominância apical e desenvolvimento das gemas
laterais (Sachs & Thimman, 1964), e a indução e multiplicação de brotações in vitro
(Murashige, 1974; Grattapaglia & Machado, 1998; Joshi & Dhawan, 2007). Também, o
tipo de citocinina e sua concentração são determinantes no processo de micropropagação
(Grattapaglia & Machado, 1998). Em Alpinia sp., o BAP tem sido preferencialmente usado
na proliferação de brotações in vitro (Chang & Criley, 1993; Illg & Faria, 1995; Borthakur
et al., 1999; Jinu & Aravinthan, 2008).
Os resultados obtidos no presente trabalho se assemelham aos obtidos por
Gutiérrez Miceli et al. (2008). Os autores, estudando a germinação in vitro de sementes de
Renealmia mexicana (Zingiberaceae), avaliaram o meio de cultura MS suplementado com
4,4 μmol; 6,7 μmol e 8,9 μmol de BAP, combinado com 0,5 μmol; 2,5 μmol e 4,9 μmol de
AIB. Os autores observaram a produção de 5,5 brotos por planta quando cultivado em 4,4
μmol de BAP + 2,5 μmol de AIB. Loc et al. (2005), testando diferentes combinações de
reguladores de crescimento, 1 mg.L-1 e 3 mg.L-1 de BAP combinado à 0,5 mg.L-1 de AIB,
na multiplicação de Curcuma zedoaria Roscoe (Zingiberaceae), obtiveram melhor
resultado (5,6 brotos por explante) em meio MS adicionado de 3 mg.L-1 de BAP e 0,5
mg.L-1 de AIB.
Quanto ao número médio de folhas por planta, a variedade Jungle King
mostrou-se superior à Kimi em T0 e T4, mas estatisticamente semelhantes entre si em T1,
T2 e T3 (Tabela 3.4).
37
Tabela 3.4. Número médio de folhas por planta de Alpinia purpurata, variedades Jungle
King e Kimi, durante 91 dias de cultivo in vitro em meios indutores de
multiplicação.
Variedade
T01
T1
T2
T3
T4
Média
2
Jungle King
8,5 a
7,9 a
7,7 a
7,7 a
8,3 a
8,0 a
Kimi
7,7 b
8,1 a
7,6 a
7,5 a
7,5 b
7,7 b
Média
8,1 ns
8,0
7,7
7,6
7,9
--1
2
ns
F
5,6*
--F
2,0
----F1 x F2
2,0*
--C.V. (%)
12,1
----1
T0 (MS padrão); T1 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP); T2 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 2 mg.L-1 de BAP); T3 (MS + 0,1
mg.L-1 de AIA + 3 mg.L-1 de BAP); T4 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 4 mg.L-1 de BAP).
2
Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5%; *significativo ao
nível de 5% de probabilidade.
F1 (variedades de alpínia); F2 (meios de cultivo); F1 x F2 (interação entre variedades e meios de cultivo); C.V. (coeficiente de variação).
Não houve diferença entre os meios de cultivo para cada variedade, ou seja, a
adição de reguladores de crescimento não influenciou a emissão de folhas pela planta
(Tabela 3.4). Semelhantemente, Gutiérrez Miceli et al. (2008), pesquisando a germinação
in vitro de sementes de Renealmia mexicana, observaram que o número de folhas não foi
influenciado pela presença ou ausência do BAP, adicionado de AIA.
A emissão de novas folhas é importante, pois estas são consideradas como
órgãos de estoque de nutrientes que, posteriormente, afetarão a fase de aclimatização
(Grout & Millan, 1985).
Diniz et al. (1999) afirmam que os teores de nutrientes necessários para as
plantas de bananeira variam entre as cultivares, assim como entre os diferentes estádios de
desenvolvimento. Desta forma, como foi observado neste trabalho, as diferentes variedades
de alpínia responderam diferentemente ao mesmo meio de cultura durante a multiplicação.
Isto sugere a necessidade de estudo mais aprofundado na determinação da composição
orgânica e mineral do meio de cultura para diferentes variedades, focalizando a quantidade
nutricional imprescindível para manter o desenvolvimento e a diferenciação in vitro
(Mezzetti et al., 1991).
Quanto ao número de raízes por planta, não houve superioridade de uma
variedade em relação à outra, apresentando ambas 4,2 raízes, em média. Contudo, maior
número de raízes foi obtido quando do cultivo nos meios T0, T1 e T2 para a variedade
Jungle King, os quais proporcionaram crescimento de 4,7 a 5,2 raízes por planta; e no meio
T1 para a variedade Kimi, apresentando 5,9 raízes por planta, o dobro do valor quando
comparado à T3. O menor número médio de raízes ocorreu nos meios T3 e T4 para ambas
as variedades (Tabela 3.5), provavelmente por possuírem maiores concentrações de BAP.
De acordo com Santos et al. (2009), este regulador pode inibir o crescimento de raízes,
38
como observado no cultivo da orquídea Epidendrum ibaguense, na concentração de 3,6
mg.L-1. Segundos os autores, as citocininas não são específicas para formação dessas
estruturas, o que estaria mais relacionado à ação das auxinas.
Tabela 3.5. Número médio de raízes por planta de Alpinia purpurata, variedades Jungle
King e Kimi, durante 91 dias de cultivo in vitro em meios indutores de
multiplicação.
Variedade
T01
T1
T2
T3
T4
Média
Jungle King
4,9 A2
5,2 A
4,7 A
3,0 B
3,2 B
4,2 ns
Kimi
3,7 BC
5,9 A
4,7 B
2,9 C
3,6 C
4,2
Média
4,3 B
5,5 A
4,7 AB
3,0 C
3,4 C
--F1
0,03 ns
--F2
24,5 **
----F1 x F2
3,1 *
--C.V. (%)
31,0
----1
T0 (MS padrão); T1 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP); T2 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 2 mg.L-1 de BAP); T3 (MS + 0,1
mg.L-1 de AIA + 3 mg.L-1 de BAP); T4 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 4 mg.L-1 de BAP).
2
Médias seguidas de mesma letra maiúscula na linha não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey à 5%; ** significativo ao
nível de 1% de probabilidade; *significativo ao nível de 5% de probabilidade; nsnão significativo.
F1 (variedades de alpínia); F2 (meios de cultivo); F1 x F2 (interação entre variedades e meios de cultivo); C.V. (coeficiente de variação).
Assim, acredita-se que a baixa concentração de BAP em T1 (1 mg.L-1) e a
presença de 0,1 mg.L-1 de AIA influenciaram positivamente no aumento do número de
raízes por planta.
3.3.2.2 Enraizamento
De maneira geral, ambas as variedades se comportaram de forma semelhante
em relação às massas das matérias fresca e seca, tanto da parte aérea (Tabela 3.6) como do
sistema radicular (Tabela 3.7). Exceção feita nas plantas de Jungle King provenientes de
T0 e T1, resultando em 50% e 41% a mais de massa fresca de parte aérea, respectivamente,
em comparação à Kimi.
A variedade Jungle King foi mais influenciada pelos diferentes meios de cultivo
do que a Kimi. Na Kimi, somente a massa da matéria seca da parte aérea foi afetada pela
concentração de BAP (Tabelas 3.6 e 3.7), sendo maior em plantas provenientes de T0 e T1;
praticamente não houve influência dos meios para as plantas dessa variedade.
Para a Jungle King, as plantas provenientes dos meios T0 e T1 apresentaram
maiores valores de massas da matéria fresca e seca da parte aérea (Tabela 3.6) e do sistema
radicular (Tabela 3.7); e os menores valores foram obtidos em T2 e T3 para parte aérea, e
T3 e T4 para sistema radicular. Isso indica que concentrações altas de BAP afetaram
39
negativamente o acúmulo de massa de matéria seca na planta. Estes resultados eram
esperados visto que as plantas advindas de meios com menores concentrações do regulador
de crescimento já apresentavam alturas superiores e maior número de raízes quando
transferidas para o meio indutor de enraizamento.
Tabela 3.6. Médias da massa da matéria fresca e seca da parte aérea de Alpinia purpurata,
variedades Jungle King e Kimi, advindas dos meios indutores de multiplicação
e cultivadas por 30 dias em meio indutor de enraizamento.
Variedade
T01
T1
T2
T3
T4
Média
Massa da matéria fresca (g)
Jungle King
1,36 aA2
1,20 aA
0,71 aB
0,73 aB
0,91 aAB
0,98 a
Kimi
0,90 bA
0,85 bA
0,75 aA
0,65 aA 0,83 aA
0,80 b
Média
1,13 A
1,02 AB
0,73 BC
0,69 C
0,87 ABC
--F1
6,77 *
--F2
5,64 **
----1
2
F xF
1,69 **
--C.V. (%)
27,98
----Massa da matéria seca (g)
Jungle King 0,1209 A
0,1026AB 0,7000 C
0,0621 C 0,0798 BC
0,087 ns
Kimi
0,1116 A 0,0933 AB 0,0673 BC 0,0561 C 0,0739 BC
0,080
Média
0,1162 A 0,0979 A
0,0686 B
0,0590 B 0,0768 B
--F1
2,1258 ns
--F2
20,5938**
----1
2
F xF
0,0735 *
--C.V. (%)
19,24
----1
T0 (MS padrão); T1 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP); T2 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 2 mg.L-1 de BAP); T3 (MS + 0,1
mg.L-1 de AIA + 3 mg.L-1 de BAP); T4 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 4 mg.L-1 de BAP).
2
Médias seguidas de mesma letra maiúscula na linha e de mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo
teste de Tukey à 5%; **significativo ao nível de 1% de probabilidade; *significativo ao nível de 5% de probabilidade; ns não
significativo.
F1 (variedades de alpínia); F2 (meios de cultivo); F1 x F2 (interação entre variedades e meios de cultivo); C.V. (coeficiente de variação).
Tabela 3.7. Médias da massa da matéria fresca e seca do sistema radicular de Alpinia
purpurata, variedades Jungle King e Kimi, advindas de meios indutores de
multiplicação e cultivadas por 30 dias em meio indutor de enraizamento.
Variedade
T01
T1
T2
T3
T4
Média
Massa da matéria fresca (g)
Jungle King
0,48 A2
0,41 AB
0,31 B
0,24 B
0,29 B
0,34 ns
Kimi
0,43 A
0,41 A
0,35 A
0,28 A
0,34 A
0,36
Média
0,45 A
0,41 AB
0,33 BC
0,26 C
0,31 BC
--F1
0,44 ns
--F2
6,50 **
----1
2
F xF
0,52 *
--C.V. (%)
27,2
----Massa da matéria seca (g)
Jungle King 0,0290 A
0,0224 AB 0,0206 AB 0,0158 B
0,0149 B
0,0205 ns
Kimi
0,0263 A
0,0262 A
0,0201 A
0,0168 A
0,0239 A
0,0226
Média
0,0276 AB 0,0243AB 0,0203 AB 0,0162 B
0,0194AB
--F1
1,3232 ns
--F2
4,6493 **
----1
2
F xF
1,1990 **
--C.V. (%)
30,12
----1
T0 (MS padrão); T1 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP); T2 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 2 mg.L-1 de BAP); T3 (MS + 0,1
mg.L-1 de AIA + 3 mg.L-1 de BAP); T4 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 4 mg.L-1 de BAP).
2
Médias seguidas de mesma letra maiúscula na linha não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey à 5%; **significativo ao
nível de 1% de probabilidade; *significativo ao nível de 5% de probabilidade; ns não significativo.
F1 (variedades de alpínia); F2 (meios de cultivo); F1 x F2 (interação entre variedades e meios de cultivo); C.V. (coeficiente de variação).
40
Desta forma, o meio indutor de enraizamento se mostrou eficiente
principalmente para a variedade Kimi, pois todas as médias foram estatisticamente
semelhantes entre si, não sofrendo efeito residual do meio anterior. Já, para a Jungle King,
o efeito residual do BAP foi verificado nas plantas provenientes dos meios T2 e,
especialmente T3 e T4. Mesmo quando colocadas em meio indutor de enraizamento, houve
ainda decréscimo das massas frescas e secas do sistema radicular. Estes resultados
confirmam o efeito residual e inibidor do BAP sobre o desenvolvimento das raízes,
registrado também em outros estudos em Zingiberaceas, como observado por Oliveira
(2007) em Etlingera elatior, e por Borthakur et al. (1999) em Alpinia galanga.
De acordo com Grattapaglia & Machado (1998), o efeito das citocininas não se
restringe a uma subcultura, pois diversas vezes constata-se efeito residual de uma
subcultura para outra. Esse efeito residual é positivo quando se trata, por exemplo, do
processo de rejuvenescimento in vitro de espécies lenhosas pelas seguidas exposições à
citocinina. Porém, pode ser problemático quando afeta o alongamento e tornar-se fator
limitante na fase de enraizamento.
3.3.2.3 Aclimatização
A variedade Jungle King mostrou-se superior à Kimi em todos os parâmetros
avaliados; com exceção da massa da matéria seca da parte aérea e da percentagem de
sobrevivência das plantas, nas quais ambas se mostraram estatisticamente semelhantes
entre si.
Contudo, a Kimi não sofreu influência dos diferentes meios de cultivo para
nenhum dos parâmetros determinados, ou seja, a adição de reguladores de crescimento ao
meio não afetou as plantas na fase de aclimatização. O mesmo não ocorreu para a Jungle
King. Após um mês de aclimatização, as plantas dessa variedade, advindas dos meios
indutores de multiplicação T0 e T1, apresentaram maiores alturas (Tabela 3.8).
O contrário foi observado para o número de brotos por planta, sendo esse maior
com a adição de BAP ao meio e quanto maior for sua concentração (Tabela 3.9). Para a
Jungle King, as plantas provenientes dos meios T3 e T4, com 1,78 e 2,07 brotos,
respectivamente, foram estatisticamente diferentes daquelas provenientes do meio sem
reguladores de crescimento (T0), no qual atingiram apenas 0,71 broto por planta, em
média. Desta forma, as plantas provenientes do meio T4 apresentam quase o triplo do
41
número médio de brotos quando comparadas às do meio T0. Esta superioridade no número
médio de brotos pode ser explicada por um possível efeito residual do BAP. As plantas
provenientes do T4, apesar de terem apresentado maior valor numérico, foram
estatisticamente semelhantes às de T2 e T3, sendo todas estatisticamente superiores em
comparação àquelas advindas do meio T0 (Tabela 3.9).
Tabela 3.8. Altura média (cm) de mudas de Alpinia purpurata, variedades Jungle King e
Kimi, após 30 dias na fase de aclimatização.
Variedade
T01
T1
T2
T3
T4
Média
Jungle King
9,55 aA2 8,51 aAB
8,06 aB
7,51 aB
7,54 aB
8,25 a
Kimi
7,10 bA 7,02 bA
7,20 aA
6,77 aA
6,9 aA
7,07 b
Média
8,3 A
7,8 AB
7,6 AB
7,1 B
7,2 B
--1
2
F
36,7 **
--F
4,28 **
----F1 x F2
2,78 *
--C.V.(%)
15,94
----1
T0 (MS padrão); T1 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP); T2 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 2 mg.L-1 de BAP); T3 (MS + 0,1
mg.L-1 de AIA + 3 mg.L-1 de BAP); T4 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 4 mg.L-1 de BAP).
2
Médias seguidas de mesma letra maiúscula na linha e de mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo
teste de Tukey à 5%; **significativo ao nível de 1% de probabilidade; *significativo ao nível de 5% de probabilidade.
F1 (variedades de alpínia); F2 (meios de cultivo); F1 x F2 (interação entre variedades e meios de cultivo); C.V. (coeficiente de variação).
Tabela 3.9. Número médio de brotos por planta de Alpinia purpurata, variedades Jungle
King e Kimi, após 30 dias em aclimatização.
Variedade
T01
T1
T2
T3
T4
Média
3
Jungle King
0,71 aB 1,28 aAB
1,57 aAB
1,78 aA
2,07 aA
1,48 a
Kimi
0,64 aA 1,00 aA
1,14 aA
1,21 aA
1,35 bA
1,07 b
Média
0,67 B
1,14 AB
1,35 A
1,50 A
1,71 A
--F1
7,73**
--F2
5,62 **
----1
2
F xF
0,56 **
--C.V.(%)
68,91
----1
T0 (MS padrão); T1 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP); T2 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 2 mg.L-1 de BAP); T3 (MS + 0,1
mg.L-1 de AIA + 3 mg.L-1 de BAP); T4 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 4 mg.L-1 de BAP).
2
Médias seguidas de mesma letra maiúscula na linha e de mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo
teste de Tukey à 5%; **significativo ao nível de 1% de probabilidade.
F1 (variedades de alpínia); F2 (meios de cultivo); F1 x F2 (interação entre variedades e meios de cultivo); C.V. (coeficiente de variação).
Por outro lado, não houve influência dos diferentes meios de cultivo no número
de folhas por planta (Tabela 3.10) e nas massas das matérias fresca e seca da parte aérea
(Tabela 3.11).
O número de folhas é característica importante e, possivelmente, mudas com
maior número de folhas têm maiores índices de pegamento no campo, por serem as
estruturas responsáveis pela captação de energia solar e pela produção de matéria orgânica
por meio da fotossíntese (Sousa, 1994).
Diferentemente da parte aérea, nota-se o efeito do meio de cultivo nas massas
da matéria fresca do sistema radicular para as plantas aclimatizadas de ambas as
variedades, cujos menores valores foram obtidos em T4 para Jungle King (0,39 g) e em T3
42
para Kimi (0,29 g). Entretanto, esse efeito não prevaleceu na massa seca do sistema
radicular dessas variedades (Tabela 3.12).
Tabela 3.10. Número médio de folhas em mudas de Alpinia purpurata, variedades Jungle
King e Kimi, após 30 dias na fase de aclimatização.
Variedade
T01
T1
T2
T3
T4
Média
2
Jungle King
9,35 a
8,50 a
8,42 a
8,92 a
8,64 a
8,77 a
Kimi
8,64 a
7,64 a
7,71 a
7,64 b
7,64 a
7,85 b
Média
9,00 ns
8,07
8,07
8,28
8,14
--F1
10,56 **
--F2
1,56 ns
----1
2
F xF
0,14 **
--C.V.(%)
20,01
----1
T0 (MS padrão); T1 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP); T2 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 2 mg.L-1 de BAP); T3 (MS + 0,1
mg.L-1 de AIA + 3 mg.L-1 de BAP); T4 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 4 mg.L-1 de BAP).
2
Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey à 5%; **significativo ao
nível de 1% de probabilidade; nsnão significativo.
1
F (variedades de alpínia); F2 (meios de cultivo); F1 x F2 (interação entre variedades e meios de cultivo); C.V. (coeficiente de variação).
Tabela 3.11. Médias das massas das matérias fresca e seca da parte aérea de mudas de
Alpinia purpurata, variedades Jungle King e Kimi, após 30 dias na fase de
aclimatização.
Variedade
T01
T1
T2
T3
T4
Média
Massa da matéria fresca (g)
Jungle King
2,10 a2
1,90 a
1,88 a
1,56 a
1,60 a
1,81 a
Kimi
1,41 b
1,59 a
1,49 a
1,63 a
1,45 a
1,51 b
Média
1,76 ns
1,74
1,68
1,60
1,53
--F1
11,05 **
--F2
1,01 ns
----1
2
F xF
2,07 **
--C.V. (%)
16,64
----Massa da matéria seca (g)
J King
0,22
0,19
0,20
0,18
0,20
0,19 ns
Kimi
0,17
0,19
0,16
0,20
0,15
0,17
Média
0,19
0,19
0,18
0,19
0,18
--F1
3,25 ns
--F2
0,34 ns
----1
2
ns
F xF
1,23
--C.V. (%)
20,95
----1
T0 (MS padrão); T1 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP); T2 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 2 mg.L-1 de BAP); T3 (MS + 0,1
mg.L-1 de AIA + 3 mg.L-1 de BAP); T4 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 4 mg.L-1 de BAP).
2
Médias seguidas de mesma letra maiúscula na linha e de mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo
teste de Tukey à 5%; **significativo ao nível de 1% de probabilidade; nsnão significativo.
F1 (variedades de alpínia); F2 (meios de cultivo); F1 x F2 (interação entre variedades e meios de cultivo); C.V. (coeficiente de variação).
De forma geral, plantas aclimatizadas da variedade Jungle King emitiram
maior número de folhas e de brotos, e apresentaram maiores massas das matérias fresca da
parte aérea, e das matérias fresca e seca do sistema radicular, quando comparada à Kimi.
De acordo com Pedrotti & Voltolini (2001), a baixa luminosidade e a alta
umidade relativa nos frascos de cultura in vitro dificultam o estabelecimento de condições
autotróficas normais para algumas espécies, quando transferidas para aclimatização. Os
autores relatam ainda que, para as mudas apresentarem alta taxa de sobrevivência na
43
aclimatização, é necessário que estas produzam novas raízes em substratos, como foi
observado neste trabalho, e que estes possuam condições físicas e nutricionais adequadas.
Segundo Pio et al. (2002), a obtenção de uma planta com sistema radicular bem
desenvolvido é de grande importância para sua sobrevivência e crescimento em novas
condições ambientais, como as proporcionadas na aclimatização.
Tabela 3.12. Médias das massas das matérias fresca e seca do sistema radicular de mudas
de Alpinia purpurata, variedades Jungle King e Kimi, após 30 dias na fase de
aclimatização.
Variedade
T01
T1
T2
T3
T4
Média
Massa da matéria fresca (g)
Jungle King
0,71 aA2
0,53 aAB
0,70 aA
0,62 aAB 0,39 aB
0,59 a
Kimi
0,57 aA
0,41 aAB
0,37 bAB 0,29 bB
0,40 aAB
0,41 b
Média
0,64 A
0,47 AB
0,54 AB
0,46 B
0,40 B
--F1
23,82 **
--F2
4,94 **
----1
2
F xF
3,12 *
--C.V. (%)
23,19
----Massa da matéria seca (g)
Jungle King
0,0950 a
0,0750 a
0,0850 a
0,0875 a
0,0625 a
0,0810 a
Kimi
0,0600 b
0,0400 b
0,0425 b
0,0350 b
0,0700 a
0,0495 b
Média
0,0775 ns
0,0575
0,0637
0,0612
0,0662
--F1
24,34 **
--F2
1,12 ns
----1
2
F xF
2,58 **
--C.V. (%)
30,93
----1
T0 (MS padrão); T1 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP); T2 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 2 mg.L-1 de BAP); T3 (MS + 0,1
mg.L-1 de AIA + 3 mg.L-1 de BAP); T4 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 4 mg.L-1 de BAP).
2
Médias seguidas de mesma letra maiúscula na linha e de mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo
teste de Tukey à 5%; **significativo ao nível de 1% de probabilidade; *significativo ao nível de 5% de probabilidade; nsnão
significativo.
F1 (variedades de alpínia); F2 (meios de cultivo); F1 x F2 (interação entre variedades e meios de cultivo); C.V. (coeficiente de variação).
Após 30 dias em casa de vegetação visando aclimatização, foi verificada a
sobrevivência de 98,57% das plantas da variedade Jungle King, havendo a perda de apenas
uma planta (1,43%), proveniente do meio indutor de multiplicação T2. Já, para a Kimi, a
perda foi um pouco maior, de aproximadamente 4%, representando três plantas, sendo
cada uma proveniente dos meios T0, T1 e T3 (Tabela 3.13). As plantas sobreviventes
mostraram-se totalmente adaptadas, apresentando visível crescimento no diâmetro do
pseudocaule e da área foliar, estando prontas para o plantio em campo.
O alto percentual de sobrevivência das mudas micropropagadas desta espécie e
da família Zingiberacea já foi relatado por diversos autores, como em Zingiber officinalle
por Debiasi et al. (2004), que obtiveram 95% de sobrevivência; em E. elatior que
apresentaram pegamento superior à 80% (Oliveira, 2007), e em Alpinia purpurata por
Kochuthressia et al. (2010), que observaram 100% de sobrevivência.
44
Tabela 3.13. Percentagem de sobrevivência de plantas aclimatizadas de Alpinia purpurata,
variedades Jungle King e Kimi, após 30 dias em casa de vegetação.
Variedade
T01
T1
T2
T3
T4
Média
ns
ns
ns
ns
ns
Jungle King
100,00
100,00
92,85
100,00
100,00
98,57 ns
Kimi
92,85
92,85
100,00
92,85
100,00
95,71
Média
96,43
96,43
96,43
96,43
100,00
--1
ns
2
ns
F
0,97
--F
0,24
----F1 x F2
0,98 ns
--C.V.(%)
17,62
----1
T0 (MS padrão); T1 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP); T2 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 2 mg.L-1 de BAP); T3 (MS + 0,1
mg.L-1 de AIA + 3 mg.L-1 de BAP); T4 (MS + 0,1 mg.L-1 de AIA + 4 mg.L-1 de BAP).
ns
não significativo pelo teste de Tukey à 5%.
F1 (variedades de alpínia); F2 (meios de cultivo); F1 x F2 (interação entre variedades e meios de cultivo); C.V. (coeficiente de variação).
Desta forma, o substrato comercial proporcionou bons resultados para a
aclimatização de plantas de alpínia provenientes do cultivo in vitro, independente da
variedade e do meio indutor de multiplicação usado.
3.4 CONCLUSÕES
A utilização de 0,625% de solução de cloro comercial é eficiente na assepsia de
sementes de Alpinia purpurata, variedades Jungle King e Kimi.
A variedade Jungle King responde melhor ao acréscimo de reguladores de
crescimento ao meio, em comparação à Kimi.
O melhor meio para multiplicação da variedade Jungle King é o MS
suplementado com 3 mg.L-1 de BAP e 0,1 mg.L-1 de AIA, e para a variedade Kimi é o MS
suplementado com 4 mg.L-1 de BAP e 0,1 mg.L-1 de AIA.
O uso de 1 mg.L-1 de AIB na fase de enraizamento in vitro promove bom
enraizamento das plantas de alpínia.
Indica-se a aclimatização de mudas micropropagadas de alpínia por 30 dias em
substrato comercial.
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51
4 ACLIMATIZAÇÃO DE MUDAS MICROPROPAGADAS DE Alpinia purpurata
VAR. JUNGLE KING EM DIFERENTES SUBSTRATOS
RESUMO
As plantas ornamentais tropicais possuem características únicas, tais como
formas exóticas, durabilidade e alta produtividade, além de beleza peculiar. O mercado
dessas plantas tem crescido por apresentarem boa aceitação, e por outro lado, por existir
saturação na oferta das flores tradicionais. Contudo, um grande problema de seu cultivo
está na produção de mudas, convencionalmente envolta por problemas fitossanitários. Uma
alternativa é a utilização da biotecnologia vegetal, especialmente a propagação vegetativa
in vitro, que permite a produção em larga escala de mudas de alta qualidade genética e
fitossanitária, em curto espaço de tempo e pequena área física. Porém, seu sucesso não
depende somente de fatores inerentes ao tecido vegetal, mas de outros aspectos que
envolvem o cultivo in vitro propriamente dito dentro do laboratório, e também de fases
posteriores, como a aclimatização das mudas. A etapa de aclimatização é uma fase crítica
da micropropagação vegetal, podendo ser responsável por altos índices de mortalidade,
baixas taxas de crescimento e desuniformidade das mudas. Um fator fundamental nessa
fase refere-se ao tipo de substrato a ser utilizado. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi
avaliar o efeito de diferentes combinações de substratos sobre o desenvolvimento de mudas
de Alpinia purpurata, var. Jungle King, durante a aclimatização. Os tratamentos avaliados
foram: substrato comercial Basaplant®, substrato orgânico; e a mistura de ambos
(proporção de 1:1). O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado
com três tratamentos, em vinte repetições cada. Os dados foram submetidos à análise de
variância e as médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade. As avaliações foram realizadas no momento do transplantio das mudas e
aos 15, 30 e 45 dias após, determinando-se a altura da planta, o número de folhas por
planta, o diâmetro do pseudocaule, a percentagem de sobrevivência, e as massas das
matérias fresca e seca da parte aérea e do sistema radicular. Houve diferenças estatísticas
apenas para o número médio de folhas aos 45 dias, a percentagem de sobrevivência das
plantas e as massas das matérias fresca e seca da parte aérea, com o substrato comercial
apresentando melhores resultados.
Palavras-chave: alpínia, ornamental, micropropagação, aclimatização, substratos.
ABSTRACT
ACCLIMATIZATION OF MICROPROPAGATED PLANTS OF Alpinia purpurata
VAR. JUNGLE KING IN DIFFERENT SUBSTRATES
52
Tropical ornamental plants have unique characteristics, such as exotic shapes,
durability and high productivity, and peculiar beauty. The market has been growing these
plants due to their good acceptance, and secondly because there is saturation in the
traditional offering of flowers. However, one big problem is its culture in plant
propagation, conventionally surrounded by disease problems. An alternative is the use of
plant biotechnology, especially in vitro vegetative propagation, which allows large scale
production of high quality seedlings and plant genetics, in a short time and small physical
area. However, its success depends not only on factors inherent to plant tissue, but other
aspects involving in vitro culture in the laboratory itself, and also later stages, as seedling
acclimatization. The acclimatization stage is a critical stage of plant micropropagation, and
may be responsible for high mortality rates, low growth rates and differences in plants. A
key factor in this phase refers to the type of substrate being used. Thus, the objective was
to evaluate the effect of different combinations of substrates on the development of
seedlings of Alpinia purpurata var. Jungle King, during acclimatization. The treatments
were: commercial Basaplant® substrate, organic substrate, and the mixture of both (1:1).
The experiment was a completely randomized design with three treatments in twenty
repetitions each. Data were subjected to analysis of variance and treatment means were
compared by Tukey test at 5% probability. Evaluations were performed at the time of
transplanting of seedlings and at 15, 30 and 45 days, to determine plant height, number of
leaves per plant, stem diameter, the percentage of survival, and the masses of raw fresh and
dry shoot and root system. There was statistical difference only for the average number of
leaves at 45 days, the percentage of seedling survival and masses of fresh and dry weights
of shoot, with the commercial substrate showing better results.
Key words: alpinia, ornamental, micropropagation, acclimatization, substrates.
4.1 INTRODUÇÃO
A produção de flores e plantas ornamentais constitui uma atividade altamente
promissora. No entanto, é necessário o uso de tecnologias avançadas para atender à grande
demanda do mercado (Terceiro Neto et al., 2004).
A micropropagação é uma técnica que vem sendo utilizada como meio rápido
de propagação vegetativa na indústria da horticultura ornamental que, juntamente com
outras biotecnologias, permitem a obtenção de grande número de plantas com
autenticidade varietal e em qualquer época do ano (Nagao et al., 1994).
A aclimatização vem sendo considerada uma das etapas mais importantes nesse
processo. Brainerd & Fucchigami (1981) relatam a necessidade da aclimatização de plantas
provenientes da cultura in vitro, por serem sensíveis e tenras, pois não desenvolveram
cutícula, resultando em alta evapotranspiração, e sua parede celular não apresenta rigidez
suficiente para a sustentação; as folhas são delgadas e suaves, fotossinteticamente inativas,
53
deixando a planta em franco heterotrofismo; os estômatos não operam eficientemente,
provocando, assim, estresses nas primeiras horas após sair dos tubos de ensaio.
Esta transferência do ambiente heterotrófico para o autotrófico tem sido um
grande entrave na micropropagação de muitas espécies. Entretanto, as espécies do gênero
Alpinia têm apresentado excelente desempenho nesta etapa em diversas condições em
termos de tipo e fertilidade de substrato, intensidade luminosa, umidade e aeração, entre
outros fatores (Illg & Faria, 1995; Borthakur et al., 1999; Rezende et al., 2003;
Kochuthressia et al., 2010).
O substrato, por meio de suas características químicas, físicas e biológicas,
exerce grande influência na adaptação e desenvolvimento inicial das plantas em condições
naturais. Assim, é fundamental a determinação de substratos adequados para a
aclimatização, os quais devem garantir a sustentação mecânica do sistema radicular, a
estabilidade da planta, o suprimento de água e de nutrientes e as trocas gasosas entre as
raízes e o ar atmosférico. A crescente utilização de compostos orgânicos como substrato
durante esta fase reflete a necessidade de práticas agrícolas sustentáveis que minimizem o
impacto ambiental (Schmitz et al., 2002).
Outra alternativa é a utilização de substratos comerciais, que muitas vezes são
utilizados indistintamente em diferentes espécies vegetais, como a exemplo do
Basaplant®, comercializado regionalmente.
Porém, é importante que se avalie os substratos adequados ao desenvolvimento
de cada cultura. Desta forma, considerando-se a escassez de estudos na literatura científica
referentes à aclimatização de mudas micropropagadas de Alpinia purpurata, e a crescente
necessidade da utilização de práticas agrícolas sustentáveis e economicamente viáveis, o
objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência de substratos na aclimatização de mudas
micropropagadas de A. purpurata, variedade Jungle King.
4.2 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado na Biofábrica Miguel Arraes do Centro de
Tecnologias Estratégicas do Nordeste (Cetene), localizado no Recife, PE, durante o
segundo semestre de 2010.
Foram utilizadas plantas micropropagadas de Alpinia purpurata, variedade
Jungle King, que se encontravam em meio MS (Murashige & Skoog, 1962) sem
54
reguladores de crescimento, com cerca de 6 cm de altura. As plantas foram retiradas do
meio, tendo suas raízes lavadas e plantadas em sacos plásticos pretos (10 cm x 7 cm).
Os tratamentos avaliados foram: T1. substrato comercial Basaplant®; T2.
substrato orgânico; e T3. mistura dos substratos orgânico e Basaplant® (1:1). O composto
orgânico é produzido pelos funcionários responsáveis pela aclimatização das mudas
micropropagadas da Biofábrica, apresentando a seguinte composição: 70% de bagaço de
cana-de-açúcar mais 30% de torta de filtro. Já, o Basaplant® é tradicionalmente
comercializado no mercado regional, sendo um substrato à base de casca de árvore
decomposta, apresentando pH variando de 5,3 a 6,3 e condutividade elétrica de
1,2 mS.cm-1 a 1,8 mS.cm-1.
Após o transplantio, as plantas foram mantidas em casa de vegetação com 70%
de sombreamento e com sistema de irrigação/nebulização intermitente por 5 minutos, a
intervalos de três horas, durante 45 dias, tempo necessário para finalização da
aclimatização.
As avaliações foram realizadas no momento do transplantio das mudas (tempo
zero), e aos 15, 30 e 45 dias após, determinando-se os seguintes parâmetros: altura da
planta (da região do colo até a extremidade superior formada pela folha mais alta), número
de folhas por planta, diâmetro do pseudocaule (obtido por meio de paquímetro digital) e
percentagem de sobrevivência (através da contagem das plantas sobreviventes). Na última
avaliação, aos 45 dias, determinou-se também as massas da matéria fresca (MF) e da
matéria seca (MS) do sistema radicular e da parte aérea. A MS foi determinada por meio
de secagem em estufa, realizada pelo método gravimétrico rápido, à 135ºC (± 2ºC), durante
uma hora (Bezerra Neto & Barreto, 2004), e posterior pesagem em balança analítica
digital.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com três
tratamentos, em vinte repetições cada, totalizando sessenta plantas. Para a determinação
das massas das matérias fresca e seca do sistema radicular e da parte aérea, foram
realizadas quatro repetições por tratamento. Os dados foram submetidos à análise de
variância e as médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey à 5% de
probabilidade. Usou-se o programa estatístico Assistat 7.6 (Assis & Silva, 2006).
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
55
Houve uma tendência no aumento tanto da altura (Figura 4.1), como do
diâmetro do pseudocaule (Figura 4.2) das plantas de alpínia, durante os 45 dias de
aclimatização. Este fato é importante tendo em vista que a redução de perdas por morte,
associada ao rápido crescimento de mudas na aclimatização, são fatores que podem
contribuir significativamente para que mudas micropropagadas cheguem ao setor
produtivo de forma mais rápida e barata (Pereira & Fortes, 2004).
Figura4.1. Altura média de plantas micropropagadas de Alpinia purpurata, variedade
Jungle King, em função do tempo, em aclimatização em casa de vegetação.
Figura 4.2. Diâmetro médio do pseudocaule de plantas micropropagadas de Alpinia
purpurata, variedade Jungle King, em aclimatização em casa de vegetação.
Hoffmann et al. (2001) também relatam que, após 35 dias de cultivo, não
ocorreu aumento significativo na altura das mudas aclimatizadas de gengibre (Zingiber
56
officinale) nos diferentes substratos testados (Plantmax, vermiculita, solo + areia (1:1 v/v),
composto orgânico + areia (1:1 v/v) e solo + composto orgânico + areia (2:2:1 v/v)). Este
resultado pode ter ocorrido devido ao fato de que as plantas micropropagadas, ao sofrerem
mudanças abruptas de ambiente, ou seja, ao passarem de condições in vitro para ex vitro,
normalmente mostram uma parada ou redução do crescimento até que se adaptem às novas
condições, podendo levar dias ou até mesmo semanas até que retornem ao crescimento
(Pereira & Fortes, 2000; Pereira et al., 2001). Contudo, notou-se que após 45 dias de
aclimatização, as plantas mostraram-se totalmente adaptadas.
Rocha et al. (2009) também avaliaram o efeito de um composto orgânico e um
substrato comercial na aclimatização de mudas micropropagadas de Heliconia lingulata.
Segundo os autores, o melhor desenvolvimento das mudas ocorreu quando cultivadas no
substrato Hortimix e na combinação de pó-de-coco verde, húmus de minhoca e Hortimix
(1:1:1). Ainda de acordo com os autores, o uso isolado do substrato comercial apresentou
melhores resultados em termos de altura de planta e diâmetro do pseudocaule.
Rodrigues et al. (2005) avaliaram o comportamento de mudas micropropagadas
de Heliconia bihai no processo de aclimatização, em diferentes substratos, areia lavada,
vermiculita (textura média) e PlantMax® Horticultura, durante 28 dias. Os autores
observaram que o desempenho foi superior nos substratos areia lavada e PlantMax®
Horticultura.
Nota-se crescimento em termos de número de folhas por planta, especialmente
após 30 dias de aclimatização, com destaque para as plantas cultivadas no substrato
comercial, que apresentaram 11,8 folhas, comparadas à 9,8 folhas e 9,5 folhas naquelas na
mistura dos substratos comercial com o orgânico, e no substrato orgânico sozinho,
respectivamente; ou seja, aproximadamente duas folhas a menos que aquelas de
provenientes do substrato comercial, ao final dos 45 dias (Figura 4.3).
Houve influência, ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F, do tipo de
substrato somente no número médio de folhas aos 45 dias de aclimatização, quando as
plantas cultivadas em substrato comercial se destacaram das demais (Figura 4.3). O
número de folhas é uma característica importante, já que, possivelmente, mudas com maior
número de folhas têm maiores índices de pegamento no campo, por serem as folhas as
estruturas responsáveis pela captação de energia solar e pela produção de matéria orgânica
por meio da fotossíntese (Sousa, 1994).
57
Figura 4.3. Número médio de folhas em plantas micropropagadas de Alpinia purpurata,
variedade Jungle King, em função do tempo, em aclimatização em casa de
vegetação.
As plantas aclimatizadas usando o substrato comercial apresentaram 100% de
sobrevivência ao longo dos 45 dias de aclimatização. Não houve influência do tempo na
aclimatização das plantas. Entre 15 e 30 dias de aclimatização, a sobrevivência das plantas
cultivadas em T3 e em T2 reduziu-se para níveis de 85% e 65%, respectivamente; e ao
final, com 45 dias, a sobrevivência manteve-se inalterada, estabilizando-se a partir de 30
dias (Tabela 4.1). Comportamento semelhante foi observado por Marin & Gella (1988),
cuja redução drástica ocorreu em torno de 14 dias após o início da aclimatização. Segundo
os autores, isso se deve à inanição das plantas, que é causada pela baixa eficiência na troca
do metabolismo heterotrófico/mixotrófico (com dependência total ou parcial de uma fonte
externa de carbono) para o metabolismo heterotrófico do carbono (com dependência total
da fotossíntese).
Tabela 4.1. Percentagem de sobrevivência de plantas de Alpinia purpurata, variedade
Jungle King, em função do tempo, em aclimatização em casa de vegetação.
Tempo de aclimatização (dias)
Tratamento1
Média
15
30
45
T1
100,00 ns
100,00 ns
100,00 ns
100,00 a2
T2
70,00
65,00
65,00
66,67 c
T3
90,00
85,00
85,00
86,67 b
Média
86,67
83,33
83,33
--1
ns
2
F
0,27
F
20,81 *
--F1 x F2
0,07 ns
C.V.(%)
33,73
--1
T1 (composto comercial); T2 (composto orgânico); T3 (composto orgânico + composto comercial).
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade; * significativo ao nível de
5% de probabilidade; nsnão significativo.
F1 (tempos); F2 (sobrevivência); F1 x F2 (interação entre tempos e sobrevivência); C.V. (coeficiente de variação).
2
58
As plantas de alpínia, além de terem mostrado maior crescimento quando
cultivadas em substrato comercial, após 45 dias de aclimatização também apresentaram
valores médios significativamente superiores para a produção de massas das matérias
fresca e seca da parte aérea; já, para as massas do sistema radicular não houve diferenças
significativas (Tabela 4.2).
Tabela 4.2. Médias das massas das matérias frescas e secas da parte aérea e do sistema
radicular de plantas micropropagadas de Alpinia purpurata, variedade Jungle
King, em função do tempo, após 45 dias de aclimatização em casa de
vegetação.
Parte aérea
Sistema radicular
1
Tratamento
Massa fresca
Massa seca
Massa fresca
Massa seca
(g)
(g)
(g)
(g)
2
ns
T1
4,35 a
0,54 a
4,07
0,36 ns
T2
2,97 b
0,30 b
2,75
0,21
T3
3,23 b
0,33 b
2,79
0,24
Média
3,52
0,39
3,20
0,27
ns
F
7,84 *
8,36 **
3,23
2,71 ns
C.V. (%)
14,80
23,79
25,98
36,73
1
T1 (composto comercial); T2 (composto orgânico); T3 (composto orgânico + composto comercial);
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade;**significativo
ao nível de 1% de probabilidade; *significativo ao nível de 5% de probabilidade; nsnão significativo; C.V. (coeficiente de variação).
2
O substrato é o meio de sustentação ou suporte durante a aclimatização das
plantas. Também é um fator externo de marcada influência no processo de enraizamento
adventício e sobre a qualidade das raízes formadas, desempenhando papel importante na
sobrevivência e desenvolvimento inicial da nova planta. Além de afetar principalmente a
aeração, pode interferir no escurecimento do ambiente de enraizamento, pH, umidade e
resistência física ao crescimento das raízes, entre outros (George, 1993; Leite, 1995).
Hartmann et al. (1990) mencionam que os principais efeitos dos substratos manifestam-se
sobre as raízes, podendo acarretar algumas influências sobre o crescimento da parte aérea.
No caso deste experimento, como as massas fresca e seca do sistema radicular
apresentaram maiores valores, é provável que estes tenham influenciado no maior
crescimento das plantas cultivadas.
O substrato serve de suporte para as plantas, podendo ainda regular a
disponibilidade de nutrientes para as raízes. Um bom substrato se dá pela qualidade dos
componentes usados, a partir do exame de suas propriedades físicas e químicas, como
densidade, porosidade e disponibilidade de ar e água, e as propriedades químicas, como
valor de pH, capacidade de troca de cátions e salinidade (Kämpf, 2000).
59
Provavelmente, a melhor resposta proporcionada pelo substrato comercial se
deve à uma composição química melhor balanceada. A vantagem de se trabalhar com
substratos comerciais é por se conhecer suas características biológicas, físicas e químicas.
Porém, podem apresentar custo mais elevado, em comparação aos substratos derivados de
resíduos agroindustriais.
Já, o uso de materiais orgânicos deve considerar o fato de que estes podem
causar excesso ou deficiência de nutrientes, devido à não quantificação precisa dos
nutrientes existentes na matéria orgânica, além da necessidade de estarem bem curtidos,
não sendo aconselhável o uso de resíduos em fermentação ou com elevada relação C/N
(Hoffmann et al., 1996).
4.4 CONCLUSÃO
Plantas micropropagadas de Alpinia purpurata, var. Jungle King, se
desenvolvem melhor quando aclimatizadas em substrato comercial Basaplant.
O substrato Basaplant promove maior número de folhas, aumento no acúmulo
de massa fresca e seca da parte aérea, além de proporcionar maior índice de sobrevivência
para mudas micropropagadas de alpínia.
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63
5 UTILIZAÇÃO DE BIORREATOR DE IMERSÃO TEMPORÁRIA NA
MULTIPLICAÇÃO DE Alpinia purpurata
RESUMO
O Brasil vem, a cada ano, aumentando a produção de plantas ornamentais, e as
exportações vêm alcançando marcas recordes. O clima e solo propícios, a rica variação de
ecossistemas e a crescente busca de profissionalização, confirmam a vocação brasileira
para a floricultura. Nesse contexto, as flores tropicais, em especial as alpínias, mostram-se
como excelente oportunidade para o País expandir suas fronteiras agrícolas e aumentar a
capacidade geradora de emprego e de renda no campo. Contudo, um entrave para os
produtores de fores tropicais é a qualidade das mudas, que convencionalmente são
produzidas por meio de divisão de touceiras, acarretando em problemas sanitários. Uma
alternativa é o uso da micropropagação, porém alguns fatores oneram o preço final, como
mão de obra especializada, necessidade de laboratórios bem equipados, estrutura de
aclimatização apropriada, baixa taxa de multiplicação de algumas variedades, etc. Por isto,
a utilização da tecnologia dos biorreatores permite às empresas especializadas na produção
de mudas acelerar o ciclo de produção, reduzindo os custos e aumentando a produtividade,
com preços bastante competitivos. O presente trabalho objetivou avaliar a composição dos
meios de cultura para a micropropagação de Alpinia purpurata, variedade Jungle King, em
biorreatores de imersão temporária, sendo os seguintes tratamentos: 1. meio MS; 2. meio
MS + 2 mg.L-1 de BAP + 0,1 mg.L-1 de AIA, e 3. meio MS + 4 mg.L-1de BAP + 0,1 mg.L-1
de AIA. Determinou-se o número de brotos por plântula, a altura do broto e da planta, as
massas das matérias frescas e secas do sistema radicular e da parte aérea, e percentagem de
sobrevivência das plântulas. O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado com
três tratamentos, em quatro repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância e
as médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey à 5% de probabilidade.
Os resultados obtidos mostraram que o meio MS + 2 mg.L-1 de BAP + 0,1 mg.L-1 de AIA
foi o que proporcionou melhores resultados, apresentando maior número médio de brotos e
maior produção de massa seca da parte aérea.
Palavras-chave: alpínia, multiplicação, biorreator de imersão temporária, BAP, AIA.
ABSTRACT
USE OF BIOREACTOR OF TEMPORARY IMMERSION IN THE MULTIPLICATION
OF Alpinia purpurata
64
Brazil has, each year, increasing the production of ornamental plants, and
exports have reached record highs. The favorable climate and soil, the rich range of
ecosystems and the increasing search for professionalization, confirms the Brazilian
vocation for floriculture. In this context, the tropical flowers, especially the alpinia show is
an excellent opportunity for the country to expand its agricultural frontiers and increase the
capacity of generating employment and income in rural areas. However, one obstacle for
producers of tropical thou is the quality of the seedlings, which are conventionally
produced by division of clumps, resulting in health problems. An alternative is the use of
micropropagation, but some factors borne the ultimate price, as skilled labor, need for
well-equipped laboratories, acclimatization structure, low multiplication rate of some
varieties, etc.. Therefore, the use of bioreactor technology allows companies to specialize
in the production of seedlings accelerate the production cycle, reducing costs and
increasing productivity, with very competitive pricing. This study aimed to evaluate the
composition of culture media for micropropagation of Alpinia purpurata, variety Jungle
King in temporary immersion bioreactors, and the following treatments: 1. MS medium, 2.
MS medium + 2 mg.L-1 BAP + 0.1 mg.L-1 IAA, and 3. MS medium + 4 mg L-1of BAP +
0.1 mg.L-1 IAA. We determined the number of shoots per seedling, the height of the bud
and plant, the masses of raw fresh and dry root and shoot, and percentage of seedling
survival. The design was a completely randomized design with three treatments in four
replications. Data were subjected to analysis of variance and treatment means were
compared by Tukey test at 5% probability. The results showed that MS medium + 2 mg.L-1
BAP + 0.1 mg.L-1 IAA was the highest values, with higher number of shoots and greater
dry weight of plant.
Key words: alpinia, multiplication, bioreactor of temporary immersion, BAP, IAA.
5.1 INTRODUÇÃO
A metodologia tradicional de micropropagação fundamenta-se em cultivos em
pequenos frascos, com número reduzido de plântulas por frasco e uso de meio nutritivo
semissólido ou líquido, o que acarreta intensa manipulação das culturas, aumentando a
necessidade de mão-de-obra especializada (Perez Ponce, 1998).
A preocupação com os elevados custos de produção tem mobilizado a atenção
de alguns pesquisadores durante as últimas quatro décadas a proporem inovações
tecnológicas, visando
aumentar a produtividade e automatizar as rotinas da
micropropagação, e exigindo menos mão de obra, a qual representa de 50% a 75% do
custo de produção (Anderson & Meagher, 1977; Donnan, 1986; Kodym & Zapata-Arias,
2001).
Alguns fatores, como a composição do meio de cultura, o seu contato com os
tecidos e a sua oxigenação, podem influir na capacidade propagativa dos explantes
(Lemos, 1996). Debergh (1982) observou que quanto maior a área de contato da planta
65
com o meio, maior é a absorção dos seus componentes e, em consequência, ocorre
aumento também da taxa de crescimento dos explantes.
Segundo Teixeira (2006), a utilização de biorreatores, comparada à tecnologia
de micropropagação tradicional, apresenta uma série de vantagens que tornam esta técnica
de extrema importância para a área de cultura de tecidos vegetais, como por exemplo:
aceleração do processo de multiplicação, redução significativa dos custos com mão de
obra, adaptável a diversas espécies vegetais, uniformização da produção, simplicidade de
montagem do sistema, eliminação dos estresses gasoso e mecânico, e redução do custo
total por unidade produzida.
As principais desvantagens na utilização de biorreatores em sistema de imersão
temporária são a variação no tamanho das mudas formadas que gera desuniformidade na
aclimatização, a contaminação microbiana que pode afetar milhares de plantas em um
único recipiente, a recalcitrância e a hiperidricidade dos explantes (Medeiros, 2011).
O sistema de imersão temporária vem sendo utilizado com sucesso na
micropropagação de diversas espécies (Alvard et al., 1993; Lorenzo et al., 1998; SaareSurminski et al., 2008), inclusive entre Zingiberaceas como Curcuma zedoaria e Zingiber
zerumbet (Stanly et al., 2010).
Entretanto, por ser uma técnica recente no Brasil, ainda pouco usada e estudada,
há a necessidade de se desenvolver protocolos de multiplicação de espécies vegetais.
Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes meios de cultivo in vitro para a
multiplicação de Alpinia purpurata em biorreator de imersão temporária.
5.2 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido na Biofábrica Governador Miguel Arraes do
Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste (Cetene), localizado no Recife, PE,
durante o segundo semestre de 2010.
Os explantes de Alpinia purpurata, var. Jungle King, foram provenientes da
multiplicação de plantas obtidas a partir da germinação de sementes in vitro. As plantas,
inicialmente cultivadas primeiramente em pote (capacidade de 250 mL) contendo meio MS
básico (Murashige & Skoog, 1962), apresentavam altura média de 4 cm e ausência de
brotações.
66
Em câmara de fluxo laminar, foram montados 12 sistemas de imersão
temporária, constituídos cada qual por dois frascos plásticos (capacidade de 5 L cada)
interligados entre si por tubos de silicone através das tampas. O primeiro frasco continha
1,0 L de meio de cultura líquido; e no segundo frasco foram colocados dez explantes,
imersos por 5 minutos a cada 3 horas (período de tempo utilizado na Biofábrica para a
cultura da cana de açúcar), após bombeamento de um frasco para outro (Figura 5.1).
A
B
Figura 5.1. Biorreator com sistema de imersão temporária: A) frasco contendo os
explantes; B) frasco com o meio de cultivo líquido.
Os biorreatores foram mantidos em sala de crescimento, submetidos a
fotoperíodo de 16 horas, com intensidade luminosa de 40 μmol.m-2.s-1, proveniente de duas
lâmpadas de luz fria de 20 W.
Foram avaliados três tratamentos em quatro repetições cada: T1. meio básico
MS; T2. meio MS suplementado com 2 mg.L-1 de BAP e 0,1 mg.L-1 de AIA; T3. meio MS
suplementado com 4 mg.L-1de BAP e 0,1 mg.L-1 de AIA.
Após 45 dias de cultivo em biorreator, determinou-se o número de brotos por
planta (considerando-se somente aqueles maiores que 1 cm de altura), altura do broto (da
região do colo até a extremidade superior formada pela folha mais alta), altura da planta, e
massas das matérias fresca e seca do sistema radicular e da parte aérea (planta + brotos).
De cada biorreator foram retiradas cinco touceiras ao acaso, separando-se a parte aérea do
sistema radicular para pesagem e obtenção da massa da matéria fresca. Para obtenção da
matéria seca, essas foram colocadas em envelopes de papel e secas em estufa pelo método
67
gravimétrico rápido, à 135ºC (± 2 ºC) durante uma hora (Bezerra Neto & Barreto, 2004),
seguido por pesagem em balança analítica digital.
Em seguida, dez plantas de cada tratamento foram aclimatizadas em casa de
vegetação, utilizando-se sacos de plástico preto (7 cm x 10 cm), contendo substrato
comercial Basaplant. As plantas foram mantidas com 70% de sombreamento e sistema de
irrigação/nebulização intermitente por 5 minutos, a intervalos de três horas, durante 30
dias. Após este período, determinou-se, ainda, a percentagem de sobrevivência (contagem
das plantas sobreviventes) e a altura da planta.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com três
tratamentos, com quatro repetições cada. Os dados foram submetidos à análise de variância
e as médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey à 5% de probabilidade.
Usou-se o programa estatístico Assistat 7.6 (Assis & Silva, 2006).
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
As plantas de alpínia foram mantidas in vitro durante 95 dias, englobando
desde a fase de germinação (20 dias), mais 30 dias para estabelecimento e 45 dias em
iorreator. Após esse período, as plantas apresentaram, em média, 5,6 cm de altura, quase
quatro brotos por planta, sendo esses com cerca de 3,0 cm de altura (Tabela 5.1).
Tabela 5.1. Cultivo de Alpinia purpurata, variedade Jungle King, após 45 dias em
diferentes meios em biorreator de imersão temporária.
Altura média da
Número médio de
Altura média dos
Tratamento1
planta (cm)
brotos por planta
brotos (cm)
2
T1
6,9 a
2,0 b
3,4 a
T2
5,3 b
5,1 a
2,7 b
T3
4,6 c
4,6 a
2,8 b
Média
5,6
3,9
3,0
F
47,51**
34,30 **
8,66**
C.V. (%)
13,05
32,17
18,20
1
T1 (MS padrão);T2 (MS + 2 mg.L-1 de BAP + 0,1 mg.L-1 de AIA); T3 (MS + 4 mg.L-1 de BAP + 0,1 mg.L-1 de AIA);
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade; **significativo
ao nível de 1% de probabilidade; C.V. (coeficiente de variação).
2
Houve diferenças significativas entre os tratamentos para todas as variáveis
avaliadas. A ausência dos reguladores de crescimento favoreceu a maior altura da planta
(6,9 cm) e dos brotos (3,4 cm), comparado aos tratamentos com o uso de reguladores de
crescimento. Contudo, o meio sem reguladores proporcionou o menor número de brotos,
68
de dois brotos por planta, comparado a 5,1 brotos em T2 e 4,6 brotos em T3, ou seja, 3,1 e
2,6 brotos a menos, respectivamente (Tabela 5.1).
A altura média das plantas foi inversamente proporcional à concentração de
BAP adicionado de AIA no meio de cultivo (Tabela 5.1). Esta relação já foi estudada por
Oliveira et al. (2001) em tetraplóide em Musa sp. cv. FHIA-01, grupo AAAB, sendo que as
plantas obtidas nas concentrações de 5,0 mg.L-1 e 7,5 mg.L-1 de BAP apresentaram
tamanho reduzido, sempre inferior a 1,5 cm. Plantas pequenas não são desejáveis no
processo de micropropagação por necessitarem sofrer alongamento antes do enraizamento,
a fim de que não haja perdas elevadas na aclimatização.
O número médio de brotos foi inversamente proporcional ao tamanho médio
destes, ou seja, quanto maior o número de brotos produzidos, menor foi a sua altura
(Tabela 5.1). Essa relação vem sendo mais comumente relatada por diversos autores em
espécies da família Zingiberaceae, como o Etlingera elatior, pesquisado por Oliveira
(2007). Segundo a autora, obteve-se maior número médio e menor comprimento médio de
brotações à medida que houve aumento na concentração de BAP, adicionado de AIA ao
meio. Resultados similares foram mostrados por Debiasi et al. (2004), cujos autores ainda
verificaram que quando as mudas eram retiradas da suplementação de reguladores
vegetais, AIA e BAP, a sua altura aumentava e a emissão de brotos diminuía. Este fato é
justificado por ser o BAP uma citocinina responsável pela superação da dominância do
meristema apical e indução de proliferação de gemas axilares.
Diversas combinações de citocinina com outros reguladores de crescimento,
como as auxinas, são muito comuns para o ajuste dos meios. A determinação do balanço
entre citocinina e auxina otimiza o protocolo de micropropagação, produzindo partes
aéreas suficientemente alongadas e maior equilíbrio do desenvolvimento entre a parte
aérea e o sistema radicular (Grattapaglia & Machado, 1998).
Todas as plantas retiradas dos biorreatores, independente do meio de cultivo
usado, apresentaram brotações. Victório et al. (2008) também verificaram 100% de
perfilhamento de A. purpurata cultivada em meio MS líquido em pote, e redução de
aproximadamente 40% quando cultivada em meios semissólidos contendo 2 mg.L-1 de
BAP + 2 mg.L-1 de AIA.
Em estudo comparativo entre o sistema de imersão temporária e o cultivo
convencional em meio semissólido para duas Zingiberaceas (C. zedoaria e Z. zerumbet),
Stanly et al. (2010) indicaram o primeiro sistema como mais eficiente para a multiplicação
69
destas espécies, produzindo cerca de 4,7 brotos por explante para as duas espécies,
utilizando 0,5 mg.L-1 de BAP + 0,5 mg.L-1 de AIA.
É provável que esses resultados sejam por causa do aumento da disponibilidade
de água e nutrientes proporcionado por esse meio de cultivo (Levin et al., 1997; Chen &
Ziv, 2001), no qual não existe resistência física para a difusão dos nutrientes, quando
comparado aos meios de cultura de consistência semissólida. Além disso, o maior contato
dos explantes e raízes com o meio faz com que a taxa de assimilação de nutrientes e
reguladores de crescimento pelo material vegetal em cultivo seja favorecida no meio
líquido (Ziv, 1995). Provavelmente, isso poderá levar ao uso desses em menores
concentrações.
Houve diferenças significativas para a produção das massas das matérias fresca
e seca, tanto da parte aérea quanto do sistema radicular. Observa-se que, ao contrário do
que ocorreu para a altura da planta e do broto (Tabela 5.1), os meios com reguladores de
crescimento, especialmente o T2, proporcionaram maior produção de biomassa na parte
aérea. Em contrapartida, nota-se que quanto maior a concentração do regulador de
crescimento BAP no meio, menor produção das massas de matérias fresca e seca pelo
sistema radicular. O meio T1 teve maior efeito sobre o sistema radicular, cujas raízes das
plantas apresentaram 6,4 vezes mais massa fresca e cinco vezes a mais de massa seca,
respectivamente, quando comparado aos meios T2 e T3 (Tabela 5.2).
Tabela 5.2. Médias das massas das matérias frescas e secas da parte aérea e do sistema
radicular de Alpinia purpurata, variedade Jungle King, cultivada em diferentes
meios líquidos, em biorreator de imersão temporária, após 45 dias.
Parte aérea
Sistema radicular
1
Tratamento
Massa fresca
Massa seca
Massa fresca
Massa seca
(g)
(g)
(g)
(g)
2
T1
1,72 b
0,18 b
0,64 a
0,05 a
T2
2,27 a
0,24 a
0,38 b
0,03 b
T3
2,48 a
0,20 b
0,10 c
0,01 c
Média
2,16
0,21
0,37
0,03
F
9,44 **
7,27 **
80,07 **
52,30 **
C.V. (%)
26,53
24,18
35,32
29,42
1
T1(MS padrão); T2 (MS + 2 mg.L-1 de BAP + 0,1 mg.L-1 de AIA); T3 (MS + 4 mg.L-1 de BAP + 0,1 mg.L-1 de AIA);
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si pelo Teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade; **significativo
ao nível de 1% de probabilidade (p <0,01); C.V. (coeficiente de variação).
2
O efeito inibitório da citocinina na indução de raízes pôde ser observado nos
tratamentos T2 e T3, principalmente neste último, com maior concentração de BAP
(4 mg.L-1), visualizado na Figura 5.2. Este corrobora com os resultados de que as
70
citocininas são responsáveis pela inibição do crescimento e divisão celular das raízes in
vitro, quando presentes em concentrações elevadas (Taiz & Zeiger, 2004).
T1
T2
T3
Figura 5.2. Plantas de Alpinia purpurata, variedade Jungle King, após 45 dias de
multiplicação em biorreator de imersão temporária.
As plantas obtidas em biorreator via sistema de imersão temporária, após
aclimatização por 30 dias em casa de vegetação, apresentaram 100% de sobrevivência, em
média 15 cm de altura e sistema radicular abundante, estando aptas para serem transferidas
para o campo, independente do meio de cultivo usado in vitro para sua multiplicação.
5.4 CONCLUSÕES
A utilização de biorreator de imersão temporária permite a multiplicação de
plantas de Alpinia purpurata, var. Jungle King.
Para a multiplicação de Alpinia purpurata, var. Jungle King, em biorretor
imersão temporária, a melhor concentração de reguladores de crescimento é 2 mg.L-1 de
BAP e 0,1 mg.L-1 de AIA.
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6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os procedimentos utilizados nesta pesquisa possibilitaram o estabelecimento
de um protocolo para a micropropagação de Alpinia purpurata, variedades Jungle King e
Kimi, a partir de sementes germinadas in vitro, permitindo a produção, em quantidade, de
mudas dessa espécie, isentas de insetos, pragas e doenças.
O uso de plântulas germinadas in vitro a partir das sementes apresenta-se como
alternativa viável e eficiente para obtenção de explantes para posterior cultivo in vitro,
devido à facilidade de assepsia das sementes e por não ocorrerem oxidações dos explantes.
Recomenda-se cuidado ao utilizar um substrato produzido a partir de resíduos
agroindustriais, pois esse se não esterilizado, pode conter contaminantes prejudiciais ao
sistema radicular das mudas, ou possuir deficiência de algum nutriente mineral, e,
consequentemente, todo o trabalho realizado no laboratório pode ser perdido durante a
aclimatização. Outros resíduos, como casca de arroz ou fibra de coco, devem ser testados
como alternativas na composição de substratos de menor custo para a aclimatização de
mudas de alpínia.
O uso de biorreatores de imersão temporária já é uma realidade para culturas
como cana de açúcar e banana. Por isso, novos estudos devem ser realizados para a
multiplicação de alpínias neste sistema, verificando-se, por exemplo, diferentes tempos de
imersão ou outras composições do meio de cultura. Isto poderá permitir redução do custo
de produção de mudas, o que pode ser repassado ao produtor rural, visando o aumento da
produtividade e competitividade.