Governo do Estado do Rio Grande do Norte
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE - UERN
Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação – PROPEG
Departamento de Pesquisa
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FORMULÁRIO PARA APRESENTAÇÃO DE PROJETO DE PESQUISA - PIBIC
TÍTULO DO PROJETO
Traço falciforme em doadores de sangue da cidade de Mossoró-RN
COORDENADOR
Wogelsanger Oliveira Pereira
Co-ORIENTADOR
(Opcional)
Thales Allyrio Araújo de Medeiros Fernandes
ORIENTANDO
Ulysses Madureira Maia
Heloísa Helane Almeida Silva
RENOVAÇÃO DE
PROJETO *
SIM
NÃO
1. RESUMO DO PROJETO (até 2000 caracteres com espaço)
O traço falciforme – heterozigose para o gene da hemoglobina S – constitui-se em uma condição
relativamente comum e clinicamente benigna Os portadores dessa condição genética, embora
assintomáticos, apresentam chance de gerarem filhos com doença falciforme. Somado a isso, sabe-se que
a transfusão de hemácias contendo hemoglobina A (Hb A) e hemoglobina S (Hb S) possui algumas contraindicações específicas. Portanto, a identificação de doadores com traço falciforme se faz necessária não
só para garantir a qualidade do sangue a ser transfundido, mas também para abrir espaço para a educação
de pessoas portadoras do traço falciforme sobre o risco de gerarem crianças com doença falciforme.
Estudos realizados na cidade de Natal-RN relataram uma freqüência de 1,5% de portadores do traço
falciforme entre os recém-nascidos. No entanto, até o presente momento, nenhum estudo a respeito da
freqüência de heterozigotos HbAS foi realizado na população do interior do Rio Grande do Norte. Diante
disso, o presente projeto pretende determinar a prevalência de portadores do traço falciforme na
população de Mossoró-RN, através da realização de uma triagem em doadores de sangue da cidade, além
de oferecer orientações e aconselhamento genético aos portadores desta e de outras hemoglobinas
variantes. Para isso, serão analisadas amostras de aproximadamente 700 indivíduos que voluntariamente
se dirigirem ao HEMOCENTRO para realização da doação de sangue. De cada indivíduo serão coletados
cerca de 5ml de sangue venoso periférico. A determinação do genótipo dos doadores será feita através do
procedimento de eletroforese de hemoglobina em pH alcalino. As amostras que apresentarem perfil
eletroforético compatível com o da hemoglobina S serão submetidos à confirmação da presença da
hemoglobina S, através do teste de solubilidade. Uma vez diagnosticados pelos exames acima citados, os
portadores da hemoglobina S serão convidados para a realização de uma consulta de orientação genética.
2. INTRODUÇÃO/JUSTIFICATIVA (até 7000 caracteres com espaço)
As hemoglobinopatias constituem-se nas doenças genéticas mais freqüentes em todo o mundo, afetando
a população brasileira em freqüências variáveis, dependendo da sua composição étnica (Cançado & Jesus,
2007; Domingos et al., 2004). Dados da Organização Mundial de Saúde estimam que aproximadamente 7%
da população mundial seja portadora de algum destes tipos de anemias hereditárias (Weatherall & Clegg,
2001; Nussbaum et al., 2008).
Dentre os diversos tipos de hemoglobinopatias já descritos, as doenças falciformes [homozigose para a
hemoglobina S (HbSS), ou heterozigose com outras hemoglobinas variantes (HbSC, Hb SD-Punjab, etc.),
ou ainda em interação com as talassemias] constituem-se nas mais prevalentes em todas as regiões
pesquisadas, ganhando significativa importância epidemiológica em virtude da prevalência e da morbimortalidade que apresenta, tendo, por isso, sido apontada como uma questão de saúde pública (Paiva e
1
Silva et al., 1993; Cançado e Jesus, 2007; Ferraz & Murao, 2007).
O defeito molecular básico da doença falciforme consiste na substituição de um único nucleotídeo,
alterando o códon do sexto aminoácido da globina β de ácido glutâmico para a valina (GAG>GTG;
Glu6Val), levando a produção de uma hemoglobina anômala – a hemoglobina S (Ferraz & Murao, 2007).
Essa alteração faz com que as moléculas de hemoglobina S, quando desoxigenadas e em altas
concentrações, apresentem redução na sua solubilidade e se organizem em longos polímeros de
filamentos duplos, formando feixes de “cristais” dentro das hemácias que determinam deformações
nestas células. Dentre as deformações, a mais conhecida é provocada por feixes de polímeros se
organizando mais ou menos paralelamente, dando à hemácia uma forma alongada conhecida por “hemácia
em foice” ou “falcizada”, característica que deu o nome à patologia (Zago & Pinto, 2007).
As hemácias falcizadas são menos flexíveis que as normais e, diferentemente destas, não podem se
comprimir em fila única durante seu fluxo através dos capilares, bloqueando, assim, o fluxo sanguíneo e
causando isquemia nos tecidos irrigados por estes vasos (Nussbaum et al., 2008). Os eritrócitos
falciformes expressam, ainda, maior número de moléculas de adesão na superfície externa da membrana
celular, favorecendo a interação com o endotélio e com outras células e propagando e agravando o
processo de vaso oclusão, ao mesmo tempo em que desencadeia fenômenos inflamatórios, que serão
mais intensos se houver necrose dos tecidos. Ao mesmo tempo, ocorrem ainda alterações da coagulação,
além da mobilização de células inflamatórias agudas (granulócitos) e crônicas (monócitos) (Zago & Pinto,
2007)
Dentre as características clínicas de um paciente com doença falciforme, a anemia se apresenta como
uma das mais freqüentes, e geralmente resulta da menor sobrevida das hemácias, tratando-se, portanto,
de uma anemia hemolítica. A dor, na sua forma aguda ou crônica, e em intensidades variáveis, é outra
característica muito comum nos pacientes falcêmicos (Lobo et al., 2007). A evolução das doenças
falciformes é marcada, ainda, por um amplo espectro de complicações clínicas que atingem a maioria dos
órgãos e aparelhos (Zago & Pinto, 2007)
O traço falciforme – heterozigose para o gene da hemoglobina S – constitui-se em uma condição
relativamente comum e clinicamente benigna, em que o indivíduo herda de um dos pais o gene da
hemoglobina A (normal) e do outro o gene para a hemoglobina S (Steinberg et al., 2001). Os portadores
dessa característica são geralmente assintomáticos. No entanto, sabe-se que a transfusão de hemácias
contendo hemoglobina S (Hb S), mesmo que em heterozigose com a hemoglobina A, possui algumas
contra-indicações bem específicas, como em transfusão em recém-nascidos (sobretudo em prematuros),
em pacientes com anemia falciforme em crises de falcização e em indivíduos com hipóxia intensa (Vivas et
al., 2006).
A distribuição do gene S no país é bastante heterogênea, dependendo da composição negróide ou
caucasóide da população. Assim, a prevalência de heterozigotos é maior na região nordeste, e menor nas
regiões sul e sudeste. Dados do ministério da saúde relatam uma freqüência geral de 4% (variando de 2 a
8%) na população geral, sendo de 6 a 10 % entre os afrodescendentes (Cançado e Jesus, 2007), estimandose a existência de mais de 2 milhões de portadores do gene da HbS e o nascimento de setecentos a mil
novos casos anuais de doenças falciformes no país (Bandeira et al., 2007). Estudos realizados por Araújo
et al., 2004, relataram uma freqüência de 1,5% de portadores do traço falciforme entre os recém-nascidos
da cidade de Natal-RN. No entanto, até o presente momento, nenhum estudo sobre a respeito da
freqüência de heterozigotos HbAS foi realizado na população do interior do Rio Grande do Norte.
No Brasil, desde 2002, existe a recomendação para a investigação da Hb S em todos doadores de sangue
(Brasil 2002; Brasil 2004). Entretanto, a implementação integral destas medidas ainda se constituem
verdadeiros desafios, principalmente em áreas e regiões menos favorecidas economicamente. No
HEMOCENTRO regional aqui em Mossoró, por exemplo, ainda não é realizada rotineiramente esta triagem,
o que pode se constituir em um risco para os indivíduos que vierem a receber bolsas de sangue com estas
características.
A identificação de doadores com traço falciforme, portanto, faz-se necessária para garantir a qualidade do
sangue a ser transfundido, uma vez que, para determinados quadros clínicos, é contra-indicado
transfundir sangue de doadores com hemoglobina AS (Marques Jr, 1994). Além disso, a identificação de
portadores dessa característica genética abre espaço para a educação dessas pessoas, visto que, caso
seu cônjuge também sejam portador desta ou de outras hemoglobinopatias, apresentarão risco
significativo (em torno de 25%) de gerarem crianças com doença falciforme (Diniz & Guedes, 2005).
Além desses aspectos citados, a realização de triagem populacional de doenças genéticas a partir dos
seus doadores de sangue apresenta vários aspectos favoráveis, tais como: a) o atual processo de doação
de sangue nos hemocentros, voluntário e não remunerado, favorece a heterogeneidade racial e sócioeconômica dos doadores, b) facilidade e segurança na obtenção das amostras para o estudo, visto que os
indivíduos já estarão colhendo voluntariamente amostras de sangue, em um ambiente totalmente
apropriado e com profissionais altamente qualificados tanto para a coleta, como para o atendimento ao
2
paciente em caso de eventuais necessidades; c) a doação ocorre de forma contínua durante todo o ano,
permitindo um fluxo igualmente contínuo de triagem (Compri et al., 2000).
Diante disso, o presente projeto pretende determinar a prevalência da hemoglobina S na população de
Mossoró-RN, através da realização uma triagem em doadores de sangue da cidade, além de oferecer
orientações e aconselhamento genético aos portadores desta e de outras hemoglobinas variantes.
* Em caso de renovação de projeto, o coordenador deverá explicitar as razões para tal, justificando com os
dados preliminares.
3. OBJETIVOS (até 2200 caracteres com espaço)
Objetivo Geral
•
Investigar o traço falciforme e outras hemoglobinopatias em doadores de sangue da cidade de
Mossoró-RN.
Objetivos específicos
•
Determinar a prevalência do traço falciforme e de outras hemoglobinopatias em doadores de
sangue da cidade de Mossoró-RN.
•
Realizar de serviço de orientação genética aos indivíduos portadores da hemoglobina S.
•
Auxiliar o HEMOCENTRO na realização de exames laboratoriais, que complementarão a triagem dos
doadores, contribuído, assim, para uma melhoria na qualidade do sangue a ser transfundido
4. METODOLOGIA (até 4000 caracteres com espaço)
Serão analisadas amostras de aproximadamente 700 indivíduos, de ambos os sexos, que voluntariamente
se dirigirem ao HEMOCENTRO de Mossoró para realização do procedimento de doação de sangue. Os
indivíduos serão esclarecidos sobre os objetivos e importância do trabalho a ser desenvolvido e serão
questionados sobre a disponibilidade em participar da pesquisa. Após isto, será aplicado e explicado o
conteúdo do termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) e de um questionário padronizado aos
indivíduos que aceitarem participar da pesquisa, elaborado afim de se obter determinados dados sóciodemográficos e laboratoriais dos mesmos. Após a entrevista e a realização dos procedimentos tradicionais
de triagem de doadores pela equipe do HEMOCENTRO, os indivíduos serão encaminhados para a sala de
coleta da unidade, aonde juntamente com o sangue destinado à doação e às análises laboratoriais de
rotina, serão coletados, pela própria equipe do HEMOCENTRO e aproveitando a mesma punção venosa da
doação, cerca de 5ml de sangue e colocados em tubos de ensaio 12x75 mm contendo 50 uL de solução de
EDTA a 10 %. As amostras de sangue serão, então, transportadas para o Laboratório de Bioquímica da
Faculdade de Ciências da Saúde da UERN, aonde serão realizadas as análises laboratoriais.
A determinação do perfil hemoglobínico dos doadores será feita através do procedimento de eletroforese
de hemoglobina em Ph alcalino, conforme descrito por Wild & Bain, 2006. Para isso, as amostras de
sangue total serão, inicialmente, hemolisadas em solução de saponina a 1% (na proporção de 20 uL de
sangue para 50 uL da solução hemolisante), e, posteriormente, aproximadamente 0,5 uL da amostra
hemolisada serão aplicados em uma fita de acetato de celulose, conjuntamente com uma amostra controle
com perfil hemoglobínico HbAS, e submetidos a uma corrente elétrica de 300 V durante 20 a 30 minutos,
ou até que as frações hemoglobínicas estejam bem separadas. Ao fim da corrida eletroforética, serão
analisadas as frações de hemoglobina sem fazer a coloração da fita. Desse modo, através da mobilidade
eletroforética, podemos identificar as hemoglobinas normais e grande parte das hemoglobinas anormais. A
identificação de hemoglobinas humanas pela eletroforese é feita comparando-se a velocidade de migração
da hemoglobina em estudo com a de padrões conhecidos.
A confirmação da presença da hemoglobina S será realizada através da realização do teste de solubilidade,
conforme descrito por Magalhães &Yashiro, 1977. Neste teste, uma alíquota do sangue total será
adicionada a um reagente teste contendo uma substância redutora (ditionito de sódio), um reagente lítico
(saponina) e um tampão altamente concentrado. Mistura-se a suspensão por 30 segundos e
posteriormente aplica-se uma gota da suspensão em papel de filtro para fazer a leitura. A presença de
hemoglobina S (hemoglobina insolúvel) confere ao papel de filtro uma precipitação em forma de botão. A
presença de hemoglobinas solúveis (hemoglobinas normais e outras hemoglobinas anormais) faz com que
3
haja uma distribuição homogênea do sangue aplicado no papel de filtro.
Uma vez diagnosticados pelos exames acima citados, os portadores do traço falciforme serão convidados
para a realização de uma consulta de orientação genética, aonde serão convidados a realizarem os testes
em seus cônjuges e parentes consangüíneos, e será explicada a sua condição genética e as chances de
terem filhos portadores da doença falciforme, juntamente com as características clínicas, cuidados
básicos e possíveis tratamentos para a doença falciforme.
Todos os indivíduos incluídos neste estudo terão seus dados adicionados em um banco de dados do
laboratório.
As análises estatísticas serão realizadas por meio do testes do Qui-Quadrado e Exato de Fisher, usando-se
os programas PEPI e SPSS 10.0.
O realização deste estudo já foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN sob o número de
protocolo 118/08.
5. RESULTADOS E APLICAÇÕES ESPERADAS (até 4000 caracteres com espaço)
Ao término desse projeto espera-se determinar a prevalência do traço falciforme, e de outras
hemoglobinas variantes comuns, na populaçao de doadores de sangue da cidade de Mossoró-RN,
correlacionando-a com as caractérísticas étnicas dos indivíduos analisados. Somado a isso, espera-se que
o serviço de orientação genética, previsto para ser prestado aos doadores que se mostrarem portadores
do traço falciforme, possa contribuir esclarecendo-os sobre a sua condição genética e as chances de
terem filhos apresentando doença falciforme, juntamente com as características clínicas, cuidados básicos
e possíveis tratamentos para esta doença.
Além disso, espera-se, também, que este trabalho auxilie na melhoria da qualidade do sangue a ser
transfundido, proveniente do HEMOCENTRO – Mossoró, através da identificação dos doadores que
possuem o traço falciforme, evitando, assim, a utilização desse sangue em indivíduos que possuam
condições clínicas incompatíveis com este tipo de transfusão.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS (até 3000 caracteres com espaço)
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União 2004; 14 de jun
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controle de qualidade de sangue e hemocomponentes para uso humano. Diário Oficial da União 2002; 13
dez
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7. ORÇAMENTO
RUBRICAS/DISCRIMINAÇÃO
Material de Consumo
Ácido Bórico – frasco com 500g
Ditionito de Sódio, Frasco com 500g
EDTA Dissódico – Frasco com 500g
Estante para tubos de ensaio e de hemólise
Fitas de acetato de celulose, 5,7 x 14 cm – Caixa com 100
tiras
Ponteira para Micropipeta universal, sem filtro, estéril, cor
amarela, 200 μL, livre de DNAse, RNAse, ATP e Pirógeno.
Pct c/ 1000
Ponteira para Micropipeta universal, sem filtro, estéril, cor
amarela, 200 μL, livre de DNAse, RNAse, ATP e Pirógeno.
Rack com 100 unidades
Ponteira para Micropipeta universal, sem filtro, estéril, cor
azul, 1000 μL, Rack com 100 unidades
Tris Base – Frasco com 500 g
Tubo Vacutainer c/EDTA de 05ml, (Tampa roxa)cx. c/100
Quantidade
1
1
1
10
1
Valor Individual
R$
R$300,00
R$200,00
R$280,00
R$10,00
R$900,00
1
R$40,00
5
R$25,00
5
R$15,00
1
8
R$250,00
R$72,10
Valor Total R$
R$300,00
R$200,00
280
100
900
40
125
R$75,00
R$250,00
R$576,80
5
Total de Material de Consumo
Serviço de Terceiros Pessoa Física
Quantidade Valor Unitário R$
R$2.846,80
Valor Total R$
Total de Serviço de Terceiros Pessoa Física
Serviço de Terceiros Pessoa Jurídica
Cópias - TCLE - Mil Cópias
Cópias - Protocolo de Pesquisa
Quantidade Valor Unitário R$
3
R$100,00
700
R$0,10
Total de Serviço de Terceiros Pessoa Jurídica
Passagens/Trecho
Natal/São Paulo
São Paulo/Natal
Quantidade Valor Unitário R$
1
R$400,00
1
R$400,00
Passagens – Total
Diárias
Diária para professor apresentar trabalho em congresso
Quantidade Valor Unitário R$
2
R$200,00
Diárias - Total
Valor Total R$
R$300,00
R$70,00
R$370,00
Valor Total R$
R$400,00
R$400,00
R$800,00
Valor Total R$
R$400,00
R$400,00
6
Bolsa de iniciação científica
PIBIC - CNPq
Quantidad
e
12
Valor Unitário R$
Valor Total R$
R$300,00
R$3.600,00
Bolsa de Iniciação Científica - Total
R$3.600,00
VALOR TOTAL DO PROJETO
R$8.016,80
8. TERMO DE COMPROMISSO DO SOLICITANTE
Declaro, para fins de direito, conhecer as normas gerais fixadas pelo presente edital, pelo CNPq e pela UERN para
a concessão de Bolsas de Iniciação Científica.
Mossoró, 26 de maio de 2009.
Assinatura do(a) Coordenador(a)
7