CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE MASSAS – GC‐MS
Princípios e Aplicações
p
p ç
Elias Paulo Tessaro
Elias
Paulo Tessaro
[email protected]
[email protected]
1
1. Introdução
Instrumentação
Direto
GC
HPLC
EI
CI
APCI
APPI
ESI
MALDI
B
Q
Tof
IT
LIT
ICR
Orbitrap
Multiplicador e‐
MCP
2
1. Introdução
O que é cromatografia??
• 1906 – Botânico russo Mikhail Tswett
3
1. Introdução
4
2.Cromatografia Gasosa
O principal mecanismo de separação da Cromatografia Gasosa (CG) está baseado
na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a fase
estacionária (líquida ou sólida).
sólida)
• Alto poder de resolução;
• Alta sensibilidade;
•A amostra e/ou seus componentes devem ser voláteis e termicamente
estáveis!!! (temperaturas até 300 °C);
• Tempos razoavelmente longos de analise.
5
2.Cromatografia Gasosa
Sinal Registrado
Introdução
de amostra
Conversor de sinal
Gás de Arraste
Coluna Cromatográfica
Coluna
Cromatográfica
e Forno
Detector
6
Instrumentação
Instrumentação
Direto
GC
HPLC
EI
CI
APCI
APPI
ESI
MALDI
B
Q
Tof
IT
LIT
ICR
Orbitrap
Multiplicador e‐
MCP
Sinal Registrado
Introdução
de amostra
Conversor de sinal
Gás de Arraste
Coluna Cromatográfica
e Forno
Detector
7
3. Ionização por Elétrons
8
3. Ionização por Elétrons
Moléculas neutras, na fase gasosa (dessorção térmica), a uma
pressão típica de 10‐5 torr, são bombardeadas por elétrons, com
energia
i típica
í i de
d 70 eV.
V Ocorre
O
principalmente
i i l
a retirada
i d ou captura
de um elétron formando íons M+. ou M‐.. Íons positivos são
predominantes. M‐. se tornam importantes para moléculas com alta
EA.
EA
M + e‐ (70 eV) → M+. (~ 5‐10 eV) + 2e‐ (~60‐65 eV)
9
3. Ionização por Elétrons
Fonte de EI
10
3. Ionização por Elétrons
I i ã
Ionização
70 eV
• Os espectros de massas
são reprodutíveis em
equipamentos similares
• Existem uma variedades
de
bibliotecas
de
espectros de massas:
Wil Nist,
Wiley,
Ni t entre
t outras
t
11
3. Ionização por Elétrons
Energia x Fragmentação
12
3. Ionização por Elétrons
E
Exemplos
l
C7H16 m=100
13
3. Ionização por Elétrons
Características
• Processo unimolecular. Os íons formados são rapidamente extraídos da fonte de
ionização pelo eletrodo de repulsão ("repeller“).
• Íons
Í
moleculares são formados com excesso de energia interna e se fragmentam
total ou parcialmente.
• EI é bastante popular: produz tanto o íon molecular (massa) como também
fragmentos (estrutura); espectros reprodutíveis; bibliotecas de espectros de EI a
70 eV; estável; fácil de operar; alta sensibilidade.
• Aplica‐se a moléculas de média e baixa polaridade e baixo peso molecular
(~500u), voláteis e termo‐estáveis: moléculas orgânicas relativamente pequenas.
• Quando o íon molecular não é observado (devido a dissociação excessiva),
existe um processo dissociativo exotérmico e portanto M+. é uma espécie instável.
• EI ocorre em ~10‐16 s. Uma
U
em cada
d 103‐105
103 105 moléculas
lé l que entram
t
na fonte
f t de
d
EI é ionizada.
14
4. Ionização Química
Munson and Field ‐ 1966
• EI:
– Simples
– Produz extensa fragmentação
– Muitas vezes tem M+.
– Quando não tem M+. ???
15
4. Ionização Química
Fonte de CI
16
4. Ionização Química
I i ã
Ionização
• Pressão ~ 10‐3 mbar;
• Método de ionização indireta e branda;
próton do ggás reagente
g
à molécula ‐
• Transferência de um p
íon molecular protonado [M‐H]+;
• Fragmentação leve ou quase ausente, ideal para obter o
íon molecular
17
4. Ionização Química
CH4
Exemplos
Iso‐C4H10
NH3
18
EI vs CI
E
Espectro de Massas: Comparação entre EI e CI
t d M
C
ã
t EI CI
IIonização Eletrônica
i ã El t ô i
• Fragmentação intensa – mais
informações sobre a molécula;
• Muitas vezes não é encontrado o
íon molecular.
Ionização Química
• Fragmentação branda – espectro
mais limpo;
• Sempre é encontrado o íon
molecular;
• Necessário a utilização de um gás
reagente.
reagente
19
Instrumentação Instrumentação
Direto
GC
HPLC
EI
CI
APCI
APPI
ESI
MALDI
B
Q
Tof
IT
LIT
ICR
Orbitrap
Multiplicador e‐
MCP
Sinal Registrado
Introdução
de amostra
Conversor de sinal
Gás de Arraste
Coluna Cromatográfica
e Forno
Detector
20
5. Setor Magnético S
Setor Magnético
M éi
21
5. Setor Magnético S
Setor Elétrico
Elé i
Devido a problemas de focalização dos íons após
passar pelo Setor Magnético
22
5. Setor Magnético D l F li ã
Dupla Focalização
23
5. Setor Magnético F
Francis Aston
i A
•1919
Francis Aston constrói o primeiro espectrógrafo de
massa com focalização de velocidade com poder de
resolução
l ã de
d 130.
130
•1937
Aston constrói um espectrógrafo de massa com poder
de resolução de 2000
• Descobriu 212 dos 287 isótopos naturais 1922
•Nobel
Nobel Prize in Chemistry "for
for his discovery, by means of
his mass spectrograph, of isotopes, in a large number of
non‐radioactive elements, and for his enunciation of the
whole number rule
whole‐number
24
5. Setor Magnético F
Francis Aston
i A
25
5. Setor Magnético Mi ã Viki
Missão Viking
26
5. Setor Magnético C l
Calutron
Main
M
i Calutron
C l
patents:
U.S. Patent 2709222 Methods of and apparatus for separating materials (Ernest O. Lawrence)
U.S. Patent 2719924 Magnetic shims (Robert Oppenheimer and Stanley Frankel)
U S Patent 2847576 Calutron
U.S.
2847576 Calutron system (Ernest O. Lawrence)
system (Ernest O Lawrence)
27
6. Razão Isotópica R ã I tó i
Razão Isotópica
28
6. Razão Isotópica R ã I tó i
Razão Isotópica
29
6. Razão Isotópica R ã I tó i
Razão Isotópica
30
6. Razão Isotópica R ã I tó i
Razão Isotópica
31
6. Razão Isotópica 32
6. Razão Isotópica 33
6. Razão Isotópica 34
6. Razão Isotópica Características
• Alta resolução (~50.000)
(
)
• Alta exatidão (~ 10‐20 ppm)
• Alta exatidão (
10 20 ppm)
• Analizador
Analizador discriminativo
• Feixe contínuo
35
7. Quadrupolo Quadrupolo
Quatro pólos acoplados diagonalmente
Quatro pólos
acoplados diagonalmente
• Idealmente hiperbólicos
– Substitui‐se por circulares
• Voltagem RF e DC
Para Quadrupolos Circulares D/d = 1.148 36
7. Quadrupolo Dimensões
Quadrupolo sintonizado para m/z 200 e íon de m/z 200
Freqüência = 880 kHz
Comprimento = 20 cm
Potencial de aceleração = 10 V
Potencial de aceleração = 10 V
Tempo de permanência aproximado = 64 s
37
7. Quadrupolo C
Características
t í ti
• Resolução unitária (1 Da) Resolução unitária (1 Da) ~ número de ciclos RF
número de ciclos RF
• Paralelismo é muito importante !
p
• Simples
• Varredura discriminatória
38
7. Quadrupolo EEspectrometria de Massas t
ti d M
Sequencial
39
7. Quadrupolo Tipos de Experimentos MS/MS
Tipos de Experimentos MS/MS
Experimentos
p
– Varredura (MS)
– SIM (MS)
SIM (MS)
– SRM / MRM (MS/MS)
– Varredura de Íons Produtos (MS/MS)
Varredura de Íons Produtos (MS/MS)
– Varredura de Íons Precursores (MS/MS)
– Varredura de Perda Neutra (MS/MS)
V
d
d P d N t (MS/MS)
40
7. Quadrupolo 41
8. Ion Trap
Ion Trap 3D
42
8. Ion Trap
I Trap
Ion
T 3D
Armadilha iônica desenvolvida por
Wolfgang
g g Paul ((Nobel de Física de 1989))
43
8. Ion Trap
I Trap
Ion
T 3D
• Consiste de um eletrodo em forma de Anel e dois eletrodos “tampa”
• Consiste de um eletrodo em forma de Anel e dois eletrodos tampa
• Conectados à uma voltagem RF/AC
• Forma um potencial oscilante de aprisionamento
• Forma um potencial oscilante de aprisionamento
• Segue a equação de Mathieu
44
8. Ion Trap
Sequência de Eventos (MS)
• Aprisionamento
p
• Resfriamento
• Varredura
• Detecção (por instabilidade de órbita)
Sequências no Tempo !!!
45
8. Ion Trap
Desvantagens
Chemical Shift
• Interações entre os íons causam desvio de órbita dentro do trap;
• Provoca um erro de massa em alguns casos.
Fonte
• Fonte de íons deve ficar afastada do trap; p;
• Possibilidade de reações Íon molécula (CI);
• Usa‐se um guia de íons para fazer a transferência de íons.
46
8. Ion Trap
Espectrometria de Massas Sequencial no d
l
Tempo (IT)
Tempo (IT) • Eventos de análise de m/z, dissociação e análise de m/z ocorrem /
/
no IT;
• Eventos ocorrem no tempo;
• Único analizador
Único anali ador m/z, vários experimentos;
m/ ários e perimentos
• Dissociação é realizada com He;
• Nova fonte de RF excita os íons axialmente, provocando o aumento da energia interna  Dissociação
aumento da energia interna 
47
8. Ion Trap
Desvantagens
Low Mass Cut
Cut‐Off
Off (LMCO)
• Nas condições de CID;
ç
;
• Íons de massa baixa não são estáveis nessas condições;
• Íons com massa < 1/3 do precursor são ejetados
48
8. Ion Trap
Low Mass Cut‐Off
ff ‐ (LMCO) (
)
49
8. Ion Trap
MSn
• Experimentos de MS sequencial com n > 2 são possíveis
sem custo;
• Basta
B
repetir
i os ciclos
i l
d seleção,
de
l ã
resfriamento,
fi
dissociação e varredura;
• Limitado pela sensibilidade (somente 1 acumulação !);
• Aplicações c/ n=3, demonstrado c/ n=12.
50
8. Ion Trap
Ion Trap Linear (LIT)
( )
• Outra forma de “Trap”; • Consiste em um arranjo quadrupolar com lentes de entrada saída;
• Consiste em um arranjo quadrupolar
com lentes de entrada saída;
• Várias melhorias em relação ao 3D:
– Maior capacidade
– Menor LMCO
– Menor chemical shifts
• Dois tipos extração:
– Radial (Thermo)
– Axial (Applied Biosystems)
51
8. Ion Trap
Configurações
f
Thermo
h
52
8. Ion Trap
Configurações
f
AB Sciex
53
8. Ion Trap
54
9. Time‐of‐Flight
Time‐of‐Flight ‐ TOF
• Princípio mais simples dos analizadores;
Princípio mais simples dos analizadores;
• Íons são acelerados por uma voltagem constante;
• As velocidades dos íons dependem da razão m/z;
• Mede‐se o tempo que o íon leva para percorrer uma certa distância.
55
9. Time‐of‐Flight
TOF Linear
• Analisador Pulsado (não‐contínuo)
• Grande sensibilidade (Não faz varredura)
• Sem limite teórico de massa
• Baixo
B i Custo
C t
•Baixa resolução (100‐400) devido à dispersões
56
9. Time‐of‐Flight
TOF Refletor
• Alta resolução (10000‐20000)
• Alta exatidão (~ 3‐10 ppm)
• Limite de massa (até 8000 a 10000)
• Menor sensibilidade
57
Instrumentação Instrumentação
Direto
GC
HPLC
EI
CI
APCI
APPI
ESI
MALDI
B
Q
Tof
IT
LIT
ICR
Orbitrap
Multiplicador e‐
MCP
Sinal Registrado
Introdução
de amostra
Conversor de sinal
Gás de Arraste
Coluna Cromatográfica
e Forno
Detector
58
10. Detectores Detectores
O detector tem a função de detectar e amplificar o sinal
d corrente
da
t de
d íons
í
que vem do
d analisador
li d e transferir
t
f i o
sinal para o sistema de processamento de dados.
Os principais tipos de detectores são:
• Multiplicador de elétrons
• MCP (micro‐channel plate)
59
10. Detectores Multiplicador de Elétrons
• Dinodo de conversão que é utilizado para converter íons positivos
ou negativos em elétrons.
• Potencias mais altos nos dinodos de conversão são utilizados para
acelerar íons de massa altas e assim melhorar a sensibilidade
60
10. Detectores M lti li d d Elét
Multiplicador de Elétrons
61
10. Detectores MCP
• O MCP é um multiplicador
lti li d de
d elétrons
lét
muito
it rápido
á id
• Um único íon pode gerar 107 elétrons sendo produzidos em um
período de 4‐5 ns
62
10. Detectores MCP
63
Instrumentação Instrumentação
Direto
GC
HPLC
EI
CI
APCI
APPI
ESI
MALDI
B
Q
Tof
IT
LIT
ICR
Orbitrap
Multiplicador e‐
MCP
Sinal Registrado
Introdução
de amostra
Conversor de sinal
Gás de Arraste
Coluna Cromatográfica
e Forno
Detector
64
11. Acoplamentos A l
Acoplamentos
t
65
11. Acoplamentos GC/MS:
Fred McLafferty
The direct coupling of gas chromatography (GC)
and TOF MS was achieved in the mid-1950s by Roland S.
Gohlke and McLafferty of Dow Chemical Co., Midland, Mich., in
collaboration
ll b
ti
with
ith Wiley,
Wil
M L
McLaren,
and
d Dan
D
H
Harrington
i t
att
Bendix. At about the same time, GC was coupled to a
magnetic sector instrument by Joseph C. Holmes and Frank A.
Morrell of Phillip Morris, Richmond, Va., among others.
Finnigan 1968 – Hewlett‐|Packard 1971
66
11. Acoplamentos The Perfect Couple !
The Perfect Couple !
67
Configurações Configurações de Equipamentos
f
d
68
Vantagens e Desvantagens Vantagens
• EI fornece fragmentos / Ion molecular
• GC tem alta resolução
• Quantificação feita através de monitoramento de 1 ou mais íons
f
f
é d
d
í
• Maior a massa → Maior sele vidade
D
Desvantagens
t
• Tempos razoavelmente longos
l
l
• Necessidade de derivatização em vários casos
69
Exemplos Hid
Hidrocarbonetos
b
t policíclicos
li í li
aromáticos
áti
• Amostra – Matriz simples ou complexa? solo,
águas, sedimentos, partículas no ar, entre
outros
o to ados e regulamentados
egu a e tados 16
6 HPAs
s ((7
• Monitorados
HPAs são classificados como
g
p
pela – IARC))
carcinogênicos
• Otimização da separação cromatográfica Quantificação necessário
Quantificação ‐
• Limites de detecção
IARC International Agency for Research on Cancer
Exemplos HPA Separação
HPA –
Exemplos Espectros de massas PHA
Espectros de massas ‐
128
100
152
100
50
50
26
0
39
51
64
20
30
40
50
60
MW: 128 C10H8 (ma inlib ) Na p htha lene
77
70
85 89
80
97
90
102
100
113
110
0
120
130
140
153
100
14
27
37
44 50 55
76
78 84 89
63
10
20
30
40
50
60
MW: 152 C12H8 (ma inlib ) Acena p hthylene
70
80
90
98
109
100
110
120 126
120
130
150
160
166
100
50
140
50
76
82
63
0
14
27 32
39
51
10
20
30
40
50
60
70
MW: 154 C12H10 (ma inlib ) Acena p hthene
87
80
90
98
100
126
110
110
120
130
139
140
0
150
160
170
14
26
39 44 51 56 63 69 74
10
20
30
40
50
60
MW: 166 C13H10 (ma inlib ) Fluorene
70
87
80
90
97
100
115
110
139
122
120
150
130
140
150
160
170
180
Exemplos Espectros de massas PHA
Espectros de massas ‐
178
100
50
0
50
27
38
63 69 76
50
20
30
40
50
60
70
MW: 178 C14H10 (ma inlib ) Anthra cene
80
76
89
98
90
110
100
110
120
152
139
126
130
140
150
163
160
0
170
180
190
50
39
27
152
89
63
98
20
30
40
50
60
70
80
MW: 178 C14H10 (ma inlib ) Phena nthrene
90
100
110
110
126
120
130
139
140
163
150
160
202
100
184
170
180
190
228
100
50
50
0
178
100
39
50
62
30
40
50
60
(ma inlib ) Fluora nthene
88
74
70
80
90
101
110
100 110
122
150
162
28
174
120 130 140 150 160 170 180 190 200
0
210
39
50
63
74
88
101
114
122
150
163 174
187
200
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240
MW: 228 C18H12 (ma inlib ) Benz[a ]a nthra cene
Exemplos Drogas de abuso
Drogas de abuso
• Substancias b
i
entorpecentes psicotrópicas, e seus metabólitos
– Anfetaminas e Metanfetaminas
– Cocaína ‐
Metabólitos
– Maconha ‐
Canabinoides
Exemplos Análise por CG/EM
Análise por CG/EM
Acidic/neutral drugs resolved to baseline Acidic / neutro drogas resolvidos com a base de referência
1. Methprylon
2. Butalbital
3. Amobarbital
4 Meprobamate
4.
5. Glutethimide
6. Phenobarbital
7. Methaqualone
8 Primidone
8.
Figure 1a Analyze underivatized acidic drugs or basic drugs under the same conditions, using an Rxi™‐5ms column (http://www.restek.com/aoi_forensics_A002.asp)
Exemplos Análise por CG/EM
Análise por CG/EM
Sensitive analysis for basic drugs in free base form
1. Amphetamine
2. Methamphetamine
3. Nicotine
4 Cotinine
4.
5. Caffeine
6. Benzphetamine
7. Ketamine
8. Phencyclidine
9. Methadone
10. Cocaine
11 Scopolamine
11.
12. Codeine
13. Alprazolam
Figure 1b Analyze underivatized acidic drugs or basic drugs under the same conditions, using an Rxi™‐5ms column (http://www.restek.com/aoi_forensics_A002.asp.)
Exemplos Análise MS/MS
Análise MS/MS
Atividades: • Entregar a Atividade 3; • 28/09 (sexta) – Reservado para Atividade 4:
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“Encontrar
cientifico publicado na Quimica Nova sobre o Uso d GC/MS
de GC/MS em analises orgânicas”
li
â i ”
78