CENTRO UNIVERSITÁRIO ESTADUAL DA ZONA OESTE
COLEGIADO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
ESTUDO DE POLIMORFISMOS NO GENE DO FATOR DE
CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR E
ASSOCIAÇÃO COM O DESENVOLVIMENTO DA
ENDOMETRIOSE
Jéssica Vilarinho Cardoso
Rio de Janeiro
2013
ii
JÉSSICA VILARINHO CARDOSO
Discente do curso de Tecnólogo em Produção de Fármacos
Matrícula n.° 1011337670
ESTUDO DE POLIMORFISMOS NO GENE DO FATOR DE
CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR E
ASSOCIAÇÃO COM O DESENVOLVIMENTO DA
ENDOMETRIOSE
Trabalho
de
Conclusão
de
Curso,
TCCII,
apresentado ao Curso de Graduação Tecnologia
em Produção de Fármacos da UEZO como parte
dos requisitos para a obtenção do grau de
Tecnólogo em Produção de Fármacos, sob a
orientação da professora Jamila Perini.
Rio de Janeiro
Janeiro de 2013
iii
ESTUDO DE POLIMORFISMOS NO GENE DO FATOR DE
CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR E
ASSOCIAÇÃO COM O DESENVOLVIMENTO DA
ENDOMETRIOSE
Elaborado por Jéssica Vilarinho Cardoso
Discente do Curso de Tecnologia em Produção de Fármacos da UEZO
Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com grau: NOVE
Rio de Janeiro, 18 Janeiro de 2013.
_______________________________________________
Profa. Jamila Alessandra Perini, Doutora (orientadora)
________________________________________________
Profa. Fabiana Kohlrausch, Doutora
________________________________________________
Prof. Arnaldo Couto, Doutor
________________________________________________
Prof. Daniel Escorsim Machado, Doutor (suplente)
RIO DE JANEIRO, RJ-BRASIL
JANEIRO DE 2013
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por ter me dado forças a seguir a diante e
me acompanhado todos os dias da minha vida, nos momentos bons ou ruins.
Aos meus pais, Márcia Vilarinho e Fernando Cardoso, por todos esses
anos de amor e carinho e por me apoiarem na realização e concretização dos
meus sonhos.
Ao meu irmão, que sempre esteve ao meu lado me apoiado quando eu
mais precisava.
Ao meu namorado, pelo carinho e amor, e pelas vezes em que eu
precisava estudar e ele me compreendia e me apoiava.
Aos meus avós, Almerindo, Albina e Neuza, que sempre, desde pequena,
estiveram ao meu lado, torcendo por mim, com todo seu amor.
As minhas eternas amigas, Paula Fulco, Vivianne Pereira, Thaís Netto e
Ana Claudia Deodorio, que me acompanharam durante o curso de Tecnologia em
Produção de Fármacos e por cada momento vivido, seja na UEZO ou fora dela.
Aos amigos do Laboratório de Pesquisa de Ciências Farmacêuticas, que
tive o imenso prazer em conhecê-los durante a minha Iniciação Científica.
Aos meus professores do curso de Tecnologia em produção de Fármacos
pela dedicação e aprendizado ao longo do curso.
Aos Doutores Plínio Berardo e Maurício Abrão que acreditaram e
permitiram que este projeto se desenvolvesse.
As colaboradoras Maria Luiza Marin e Marta Privato pela dedicação e
paciência para a coleta das amostras.
Um agradecimento especial a minha orientadora professora Jamila Perini,
por quem tenho muita admiração e carinho, por toda sua paciência, dedicação e
seus ensinamentos. E por ter me dado a oportunidade de conhecer e desenvolver
v
este projeto maravilhoso e importante, me fornecendo orientações seguras com
toda sua experiência.
E a todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a
realização desse trabalho.
Obrigado a todos. Vocês fazem parte de um momento muito especial da
minha vida.
vi
"O ensino do sábio é fonte de Vida..."
Provérbios 13:14
vii
SUMÁRIO
Lista de Figuras.....................................................................................................viii
Lista de Tabelas......................................................................................................ix
Lista de Siglas e abreviaturas..................................................................................x
Resumo..................................................................................................................12
Abstract..................................................................................................................14
1. Introdução .........................................................................................................15
1.1. Endometriose e Angiogênese..............................................................18
1.2. Fator de Crescimento Endotelial Vascular - VEGF..............................19
2. Objetivos............................................................................................................25
2.1. Objetivo geral.......................................................................................25
2.2. Objetivos específicos............................................................................25
3. Materiais e Métodos...........................................................................................26
3.1. População estudada.............................................................................26
3.2. Extração de DNA e genotipagem.........................................................27
3.3. Análise estatística.................................................................................28
4. Resultados.........................................................................................................30
4.1. Frequências alélicas dos polimorfismos do VEGF...........................35
4.2. Frequências genotípicas dos polimorfismos do VEGF....................36
4.3. Frequências haplotíplicas dos polimorfismos do VEGF.......................41
5. Discussão...........................................................................................................43
6. Conclusão..........................................................................................................48
7. Referências Bibliográficas..................................................................................49
8. Anexos...............................................................................................................60
viii
ANEXO: 1....................................................................................................60
ANEXO: 2....................................................................................................61
ANEXO: 3....................................................................................................62
ANEXO: 4....................................................................................................67
ANEXO: 5....................................................................................................72
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura
1-
Pontos
prováveis
para
a
instalação
/
presença
da
endometriose.........................................................................................................15
Figura 2- A teoria da menstruação retrógrada......................................................16
Figura 3- Representação do processo angiogênico..............................................18
Figura 4- Estrutura do gene VEGF e a localização dos SNPs -2578C>A
(rs699947), -2489C>T (rs1005230), -460C>T (rs833061), -1154G>A (rs1570360),
+405G>C (rs2010963), -7C>T (rs25648), +936C>T (rs3025039) e +1612G>A
(rs10434)................................................................................................................22
Figura 5- Resultado da determinação dos genótipos de VEGF por PCR em tempo
real dos SNPs (a) 2578C>A, (b) -460T>C, (c) -1154G>A, (d) 405G>C e (e)
936C>T..................................................................................................................30
Figura 6- Frequências alélicas dos polimorfismos do VEGF em casos e
controles.................................................................................................................36
Figura 7- Desequilíbrio de ligação dos polimorfismos (-2578C>A, -460T>C, 1154G>A,
405G>C
e
936C>T)
de
VEGF
nos
grupos
casos
e
controles.................................................................................................................41
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Dados de frequência genotípica de SNPs de VEGF em pacientes com e
sem endometriose..................................................................................................23
Tabela 2- Características do ensaio PCR em tempo real para os polimorfismos
2578C>A, -460T>C, -1154G>A, 405G>C e 936C>T do VEGF.............................28
Tabela
3-
Características
demográficas
e
clínicas
das
pacientes
com
endometriose (casos) e das mulheres saudáveis (controle)..................................34
Tabela 4- Frequência dos genótipos de VEGF em pacientes com endometriose e
em mulheres do grupo controle.............................................................................37
Tabela
5-
Equilíbrio
de
Hardy-Weinberg
dos
polimorfismos
do
VEGF.....................................................................................................................38
Tabela 6- Frequência dos alelos de VEGF em uma amostra da população
brasileira e em outras populações étnicas.............................................................39
Tabela 7- Genótipos de VEGF e a magnitude de associação com a
endometriose.........................................................................................................40
Tabela 8- Frequência dos haplótipos de VEGF em uma amostra da população
brasileira (pacientes com endometriose e em mulheres controle) e a magnitude de
associação com a endometriose............................................................................42
Tabela 9- Resumo de dados da literatura e do presente estudo avaliando a
magnitude de associação dos SNPs de VEGF com a endometriose....................44
xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ASRM = Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva
GnRH = Hormônio liberador de gonadotrofina
VEGF = Fator de crescimento do endotélio vascular
PlGF = Fator de Crescimento Placentário
VEGFR-1, -2 e -3 = Receptor do Fator de Crescimento Endotelial Vascular 1, -2 e
-3.
UTR = Região não traduzida
SNP = Polimorfismos de um único nucleotídeo
mRNA = Acido Ribonucleico mensageiro
CDS = Região Codificante
PCR = Reação em cadeia de polimerase
FMUSP = Faculdade de Medicina Universitária de São Paulo
HFSE = Hospital Federal dos Servidores do Estado
Kg = Quilograma
Cm = Centímetro
OR = Razão de Chance
H2O q. s. p. = Água quantidade suficiente para
12
RESUMO
A endometriose é uma doença ginecológica que afeta cerca de 5 -15% das
mulheres na idade reprodutiva e é caracterizada pela presença de tecido
endometrial estromal e/ou glandular em localizações extra-uterinas. O fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF) tem um papel importante na angiogênese
e polimorfismos no gene VEGF podem influenciar no desenvolvimento da
endometriose. O presente estudo tem como objetivo determinar a frequência de
cinco
polimorfismos
do
gene
VEGF:
-2578C>A
(rs699947),
-1154G>A
(rs1570360), -460T>C (rs833061), 405G>C (rs2010963) e 936C>T (rs3025039), e
avaliar se existe associação entre tais polimorfismos e o desenvolvimento da
endometriose. Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
Humana da FMUSP (N° 09010/11) e do HFSE-RJ (N° 000.414). A amostra do
estudo
foi
composta
por
150
mulheres
brasileiras
com
endometriose
histopatologicamente confirmadas (casos) e 35 mulheres brasileiras sem a
evidência laparoscópica da doença (controles). O DNA genômico foi extraído de
amostras de sangue e a genotipagem dos polimorfismos estudados foi realizada
por PCR em Tempo Real. As variáveis nominais foram avaliados pelo teste Quiquadrado de Pearson ou Teste Exato de Fisher e foi calculada a razão de chance
(OR), com intervalo de confiança de 95% (IC 95%). As frequências dos cinco
polimorfismos de VEGF estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg na população
estudada. Não foram observadas diferenças significativas entre as frequências
alélicas e genotípicas dos polimorfismos -2578A>C, -1154G>A, -460T>C e
936C>T entre os dois grupos. A frequência dos genótipos GG, GC e CC do
polimorfismo 405 de VEGF foi 45%, 42% e 13%, respectivamente, nos casos e,
26%, 68% e 6%, respectivamente, nos controles (P = 0.0249). Considerando o
polimorfismo 405G>C a razão de chance entre os genótipos [GG /(GC+CC)],
comparando casos e controles, foi de 0,434 (OR) com um intervalo de confiança
de 95% (0,189 – 0,992). Concluímos que o polimorfismo 405G>C do gene VEGF
foi significativamente associado com a susceptibilidade à endometriose com um
aparente efeito protetor na presença de pelo menos um alelo variante.
13
Palavras-chaves: endometriose, VEGF, polimorfismos.
14
ABSTRACT
Endometriosis is a gynecological disease that affects approximately 5 -15%
of women of reproductive age and is characterized by the presence of endometrial
stromal tissue and / or glandular in extra-uterine locations. The vascular
endothelial growth factor (VEGF) plays an important role in angiogenesis and
VEGF polymorphisms might influence endometriosis development. The present
study aims to determine the frequency of five VEGF gene polymorphisms: 2578C>A (rs699947), -460T>C (rs833061), -1154 G>A, +405G>C (rs2010963)
and +936C>T (rs3025039) and evaluating whether there is an association
between these polymorphisms and the development of endometriosis. This project
was approved by the Human Research Ethics Committee of the FMUSP (N°
09010/11) and HFSE-RJ (N° 000.414). The study sample consisted of 150
Brazilian women with histologically confirmed endometriosis (cases) and 35
women with no laparoscopic evidence of disease (controls). Genomic DNA was
extracted from blood samples, and genotyping was performed by real time PCR.
The nominal variables were evaluated by Pearson Chi-square test or Fisher's
Exact test, with calculation of the odds ratios (OR) with 95% confidence intervals
(95%CI). The frequencies of the five polymorphisms of VEGF are in HardyWeinberg equilibrium in the study population. No significant differences were
observed between the allele and genotype frequencies of polymorphisms 2578A>C, -1154G>A, -460T>C e 936C>T among the two groups. The frequencies
of the VEGF 405 genotypes GG, GC and CC were 45%, 42%, 13%, respectively,
among cases and, 25%, 67%, and 8%, respectively, among controls (P = 0.0249).
Considering the polymorphism 405G>C odds ratio between genotypes [GG / (GC
+ CC)], comparing cases and controls, was 0.434 (OR) with a confidence interval
of 95% (0.189 to 0.992). We conclude that the polymorphism 405G>C in the
VEGF gene was significantly associated with susceptibility to endometriosis with
an apparent protective effect in the presence of at least one variant allele.
Key-words: endometriosis, VEGF, polymorphism.
15
1- INTRODUÇÃO
O endométrio é um tecido especializado que está localizado na camada
interna do útero, que sofre modificações cíclicas sequenciais, pela ação dos
hormônios produzidos pelos folículos ovarianos e pelo corpo lúteo (estrogênio e
progesterona), sendo eliminado, em pequenos fragmentos, mensalmente na
menstruação. (KEITH, 2004).
A endometriose é uma doença ginecológica caracterizada pelo crescimento
do endométrio em locais ectópicos, tais como a cavidade abdominal, o ovário,
peritônio pélvico, fundo-de-saco, ligamentos uterossacros, face posterior do útero,
cólon sigmóide e bexiga (GIUDICE e KAO, 2004) (Figura 1). É uma doença
comum, que afeta cerca de 5 - 15% das mulheres em idade reprodutiva (JIA e
cols., 2012).
Figura 1- Pontos prováveis para a instalação / presença da endometriose
Alguns pesquisadores têm proposto teorias para o desenvolvimento da
endometriose. Porém a teoria mais aceita foi a de SAMPSON (1927), o qual
sugeriu que tecidos endometriais são derramados pela tuba uterina dentro da
16
cavidade peritoneal durante a menstruação retrógrada, sofrendo proliferação e
crescimento em sítios ectópicos (Figura 2).
Essa teoria é suportada pela
presença de fragmentos de endométrio, que quando transplantados para meios
de cultura ou em animais, levam à formação de focos de endometriose (KOKS e
cols., 1997). Embora a teoria da menstruação retrógrada seja uma das
explicações mais aceita para o desenvolvimento da doença, os reais mecanismos
celulares e moleculares ainda não são claros. Muitas mulheres podem ter fluxo
menstrual retrógrado, porém normalmente seu sistema imune é capaz de retirar
os restos de fragmentos endometriais e prevenir implantações e crescimento de
células. Entretanto, em algumas pacientes o tecido endometrial transplantado
pela menstruação retrógrada se prolifera e cresce desenvolvendo a endometriose
(SIMPSON, 2000).
Figura 2- A teoria da menstruação retrógrada.
Durante a menstruação, fragmentos do endométrio sofrem refluxos (1) através das tubas
uterinas para dentro da cavidade abdominal (2) os fragmentos aderem à superfície
peritoneal (3), invadem (4), e adquire um suprimento de sangue (5) (GROOTHUIS e
cols.,2005).
17
Diversas classificações têm sido propostas para a endometriose e a mais
recente foi a da American Fertility Society, que propôs uma classificação em
sistema de escores reunidos em estádios, analogamente ao que se faz para
neoplasias malignas, considerando o tamanho da lesão e o grau de acometimento
(superficial ou profundo); tanto no peritônio quanto nos ovários direito e esquerdo;
a obliteração do fundo-de-saco posterior (parcial ou completa); e o tipo de
aderências (velamentosa ou densa) nos ovários e nas trompas, ressaltando o
envolvimento total das fímbrias tubárias por aderências, dividindo os pacientes em
quatro estágios: I (mínima), II (leve), III (moderado) e IV (severo). (AMERICAN
SOCIETY FOR REPRODUCTIVE MEDICINE, 1997).
O
diagnóstico
definitivo
da
doença
é
eminentemente
cirúrgico,
caracterizado por hemorragia e fibrose de padrão cicatricial associada a
elementos
epiteliais
e/ou
estromais
mullerianos.
No
entanto,
algumas
características clínicas, como o próprio exame físico, exames laboratoriais e
evidências de exames de imagem podem sugerir o diagnóstico da endometriose.
Clinicamente, a paciente pode apresentar sintomas como dismenorréia, em vários
graus, dor pélvica, dispareunia, infertilidade e alterações intestinais cíclicas
(NEME e cols., 2000). Porém, em alguns casos, a mulher portadora da
endometriose pode ser assintomática, dificultando o diagnóstico da doença
(GIUDICE e cols., 2004).
O tratamento clínico da endometriose é ainda assunto controverso e existe
na literatura um consenso de que o tratamento deve ser cirúrgico (FEDELE e
cols., 2000). A via de acesso pode ser por laparotomia ou laparoscopia,
dependendo da extensão e acometimento da doença (ROSEAU, e cols., 2000).
A endometriose não é uma doença maligna, mas tem semelhanças com
um tumor em desenvolvimento, pois estas células podem se conectar, invadir e
danificar outros tecidos (COLLETTE e cols., 2006). Estudos demonstram que a
vascularização dos implantes de endometriose é provavelmente um dos fatores
mais importantes para a invasão de outros tecidos por células endometriais
(TAYLOR e cols., 2002). Em pacientes com endometriose, o processo de
angiogênese é alterado em favor da sobrevivência e do reabastecimento do
tecido endometrial (MAY e cols., 2008).
18
1.1. Endometriose e Angiogênese
A manifestação clínica da endometriose é acompanhada por angiogênese
e formação de adesão celular (LI e cols., 2009), possivelmente devido ao
ambiente peritoneal alterado e o sistema imunitário (CHRISTODOULAKOS,
2007). A angiogênese é definida como a formação de novos vasos sanguíneos a
partir de vasos pré-existentes em um processo envolvendo quebra da membrana
basal e destruição do tecido conjuntivo pelas metaloproteináses de matriz
(MMPs), migração e proliferação de células endoteliais, maturação de células
endoteliais e tubulização, como ilustrado na figura 3. Uma vez que estes vasos
sanguíneos foram estabelecidos, as células endoteliais sofrem alterações
teciduais específicas para gerar funcionalmente vasos distintos (FIGG e
FOLKMAN, 2008).
Figura 3- Representação do processo angiogênico
19
O crescimento de tecido normal, tal como no desenvolvimento embrionário,
na cicatrização de feridas, na função ovariana e do ciclo menstrual, depende da
formação de novos vasos (angiogênese) para o fornecimento de oxigênio e
nutrientes. (FOLKMAN, 1971). Além disso, o processo de angiogênese envolve
vários processos patológicos, tais como, o crescimento tumoral, a artrite
reumatoide, a retinopatia diabética, a psoríase (HOEBEN, e cols., 2004) e a
endometriose (LASCHKE e cols., 2012).
A angiogênse é um processo complexo e que requer um delicado balanço
entre indutores e inibidores (SCHAMS e cols., 2004). Várias moléculas são
identificadas como indutoras da angiogênese, pois esse processo é dependente
de fatores liberados pelas células. Dentre os fatores que estão envolvidos no
crescimento de vasos sanguíneos, o fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF) é o mais importante (MCLAREN, 2000).
1.2. Fator de Crescimento Endotelial Vascular - VEGF
O VEGF foi uma dos primeiros fatores angiogênicos a serem identificados.
Em 1983, Harold Dvorak e colaboradores identificaram esta glicoproteína, por
meio da purificação de células tumorais, percebendo que esta melhorava a
permeabilidade celular, sendo chamada de fator de permeabilidade vascular
(VPF). Posteriormente, em 1989 FERRARA e HENZEL identificaram a mesma
proteína, em meio condicionado, em células pituitárias bovinas e verificaram que
promovia a proliferação de células endoteliais vasculares. E em 1990, ficou claro
que as duas proteínas eram a mesma, passando a ser denominado fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF) sendo um potente regulador positivo da
angiogênese (RUHRBERG, 2008).
O VEGF é uma glicoproteína homodimérica com peso molecular de 30 – 46
kilodaltons (kDa) caracterizada como um dos membros da superfamília de fatores
de crescimento que possuem um nó de cistina, formado por oito resíduos de
cisteínas ligados por pontes dissulfeto (HOLMES e cols., 2005).
20
Atualmente, a família do VEGF em humanos inclui cinco membros: VEGFA (ou VEGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e o PlGF (Fator de Crescimento
Placentário),
ligados
denominados receptor
a
três
do
receptores
fator
de
transmembrana
crescimento
tirosina
endotelial
quinase
vascular - 1
(VEGFR-1), receptor do fator de crescimento endotelial vascular - 2 (VEGFR2) e receptor do fator de crescimento endotelial vascular - 3 (VEGFR-3). Os
dois primeiros receptores são expressos predominantemente em células
endoteliais vasculares e suas progenitoras e o VEGFR-3 é expresso
principalmente em células endoteliais linfáticas (FERRARA e cols., 2005; ROY e
cols., 2006). O VEGF apresentam também alguns co-receptores como
neuropilinas, heparam-sulfato, caderinas e integrinas, que se liga a alguns
elementos da família VEGF (NEUFELD e cols., 1999).
O VEGF apresenta várias funções biológicas como proliferação, migração,
e permeabilidade das células endoteliais pela ligação com VEGFR-2 (FERRARA,
2001). Além disso, pode ter um papel importante no desenvolvimento e na
progressão da endometriose, por ser expresso em células epiteliais e estromais
no útero humano e em células reguladas por estrogênio (HYDER e cols., 1996;.
MUELLER e cols., 2000). Além disso, está localizado no epitélio dos implantes de
endometriose, particularmente em lesões vermelhas (DONNEZ e cols., 1998; TAN
e cols., 2002).
Um dado importante é que os níveis de VEGF encontram-se elevados no
fluído peritoneal e no soro de pacientes com endometriose. Diversos estudos têm
investigado
e
observado
que
o
mRNA
e
proteínas
do
VEGF
são
significativamente maiores em mulheres com endometriose (SHIFREN e cols.,
1996; KUPKER e cols.,1998; FASCIANI e cols., 2000; TAN e cols., 2002; KHAN e
cols., 2003; MATALLIOTAKIS e cols., 2003; GILABERT-ESTELLES e cols.,
2007). Cosín e colaboradores, em 2009, observaram um aumento dos níveis de
VEGF no endométrio e no fluído peritoneal de mulheres com endometriose
sugerindo um aumento da atividade angiogênica, o que pode contribuir para a
capacidade de implantação de células endometriais em locais ectópicos.
(MCLAREN e cols., 1996, COSÍN e cols., 2009). Recentemente, tem sido
demonstrado que o uso de anti-VEGF humano interfere com a manutenção e
21
crescimento da endometriose por inibição da angiogênese num modelo animal
(NAP e cols., 2004). Além disso, uma família simples em duas gerações com
quarto membros que têm endometriose mostrou que os níveis circulantes de
VEGF foram altos em relação ao grupo controle indicando um papel importante do
VEGF na susceptibilidade da doença. (MATALLIOTAKIS e cols., 2003; SIMPSON
e cols., 2003).
O fator de crescimento endotelial vascular é codificado pelo gene VEGF
que está localizado no cromossomo 6p21.3 (VINCENTI e cols., 1996) e é
composto por oito éxons e sete íntrons exibindo splicing alternativo para formar
uma família de proteínas (FUKUMURA e cols., 1998; LAMBRECHTS e cols.,
2003). O splicing alternativo do gene VEGF gera nove isoformas que apresentam
em comum a região do éxon 1 a 5, sendo elas: VEGF-A121, VEGF-A145, VEGFA148, VEGF-A162, VEGF-A165, VEGF-A165b, VEGF-A183, VEGF-A189, VEGFA 206 (SHIBUYA, 2011). As isoformas do VEGF diferem entre si devido a
presença ou ausência dos éxons 6a, 7b, 7a e 7b do gene VEGF-A e exibem
diferentes padrões de expressão o que sugere diferentes funções fisiológicas
(ROBINSON e STRINGER, 2001).
Um crescente número de trabalhos vem mostrando o interesse em se
estudar a influência de fatores genéticos em VEGF e o desenvolvimento da
endometriose (ATTAR e cols, 2010; COSÍN e cols., 2009; EMAMIFAR e cols.,
2012; ZHAO e cols., 2008; LIU e cols., 2009; ALTINKAYA e cols., 2011;
BHANOORI e cols., 2005; GENTILINI e cols., 2008; IKUHASHI e cols., 2007; KIM
e cols., 2005). Até o momento já foram descritos diversos polimorfismos de um
único nucleotídeo (SNPs) na região promotora, 5’UTR e 3’UTR do gene VEGF,
conforme ilustrado na figura 4 (JAIN, e cols., 2009).
22
Figura 4.- Estrutura do gene VEGF e a localização dos SNPs -2578C>A
(rs699947), -2489C>T (rs1005230), -460C>T (rs833061), -1154G>A
(rs1570360), +405G>C (rs2010963), -7C>T (rs25648), +936C>T (rs3025039) e
+1612G>A (rs10434).
A linha tracejada indica a região codificante (CDS) com a presença de sete íntrons. UTR
refere-se a região não codificante (Adaptado de LOKESH JAIN, e cols., 2009).
Associações entre polimorfismos do gene VEGF e outras doenças têm sido
relatadas em estudos caso-controle, tal como câncer de mama (JAIN, 2009),
diabetes, retinopatias (RAY e cols., 2004) e câncer de próstata (LIN e cols., 2003).
Em relação à endometriose, já foram estudados os SNPs rs699947, rs833061,
rs1570360, rs2010963 e rs3025039 do VEGF em diversas populações,
entretanto, os resultados das análises são controversos (HSIEH e cols., 2004;
IKUHASHI e cols., 2007; KIM e cols., 2005; KIM e cols., 2008; GENTILINI e cols.,
2008 e BHANOORI, e cols., 2005). Na tabela 1 estão resumidos dados de
frequência dos SNPs rs833061, rs2010963 e rs3025039 estudados por diferentes
grupos em populações chinesas, japonesas, indianas, italianas, coreanas e
australianas (ZHAO e cols., 2008).
23
Tabela 1- Dados de frequência genotípica de SNPs de VEGF em pacientes
com endometriose e em mulheres sem a presença de endometriose incluída
como grupo controle.
Adaptado de ZHAO e cols., 2008.
24
Com relação aos SNPs que ocorrem em regiões regulatórias 5´UTR e
promotor (-2578C>A, -460T>C e 405G>C) foi observada uma associação entre o
SNP -460T>C e a endometriose em mulheres chinesas (HSIEH e cols., 2004 e
LIU e cols., 2009) e japonesas considerando os estágios III e IV da endometriose
(IKUHASHI e cols., 2007). Para o SNP -2578C>A foi observada uma associação
com a endometriose em mulheres chinesas (LIU e cols., 2009), enquanto que o
SNP 405G>C foi associado com o risco do estágio avançado da endometriose na
população coreana e na população caucasiana (KIM e cols., 2005; GENTILINI e
cols., 2008).
Em contraste, na população australiana não houve associação significativa
entre os SNPs localizados na região 5'UTR (-2578C>A, -460T>C e 405G>C) e o
desenvolvimento da endometriose (ZHEN e cols, 2008), bem como em mulheres
estonianas e caucasianas quando analisada a associação entre os SNPs -1154
G>A e 405G>C com a endometriose (LAMP e cols., 2010; COSÍN e cols., 2009).
Considerando o SNP localizado na região 3´UTR (936C>T) foi observada
uma associação positiva entre os estágios III e IV da endometriose em mulheres
japonesas (IKUHASHI e cols., 2007), e em mulheres caucasianas (COSÍN e cols.,
2009).
Entretanto, não foi observada associação entre o SNP 936C>T do VEGF e
a endometriose tanto na população coreana (KIM e cols., 2008) quanto em
mulheres Chinesas (LIU e cols., 2009), australianas (ZHEN e cols., 2008) e
estonianas (LAMP e cols., 2010).
Em virtude dos dados controversos dos estudos de associação entre SNPs
do VEGF e endometriose (BHANOORI e cols., 2005), e em virtude do possível
papel fundamental do VEGF na patogênese da endometriose (HSIEH e cols.,
2004 e RAMÓN e cols., 2011), torna-se necessário investigar a real associação
dos SNPs do VEGF e o desenvolvimento da endometriose, especialmente em
mulheres brasileiras, já que não existem dados nesta população.
Foram estudados cinco tipos de SNPs do VEGF, -2578C>A, -460T>C, 1154 G>A, 405G>C e 936C>T, todos localizados em regiões regulatória do gene,
pois estas regiões influenciam na expressão da proteína VEGF.j
25
2- OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral:
Caracterizar a frequência de polimorfismos no gene VEGF e avaliar se
existe associação com o desenvolvimento da endometriose.
2.2. Objetivos específicos:
Determinar a frequência alélica, genotípica e haplotípica dos polimorfismos
VEGF -2578C>A (rs699947), -460T>C (rs833061), -1154 G>A (rs1570360),
405G>C (rs2010963) e 936C>T (rs3025039) em mulheres diagnosticadas com
endometriose e em mulheres com diagnóstico negativo da doença;
Avaliar se existe associação entre os polimorfismos de VEGF (-2578C>A, 460T>C, -1154G>A, 405G>C e 936C>T) e a endometriose em mulheres
brasileiras.
26
3. MATERIAIS E MÉTODOS:
3.1. População estudada
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres
Humanos da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP) (N°
09010/11) (Anexo 1) e pelo Hospital Federal dos Servidores do Estado do Rio de
Janeiro - HFSE-RJ (N° 000.414) (Anexo 2).
Este projeto trata-se de um estudo caso - controle, onde todas as mulheres
convidadas a participar receberam o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(TCLE), e foram orientados a lê-lo cuidadosamente e a inquirir a respeito de
qualquer dúvida quanto ao projeto. As pacientes que concordaram com as
condições estipuladas no TCLE (Anexo 3 e 4), após assinarem, foram incluídas
no projeto. As participantes do estudo receberam o Questionário Demográfico
(Anexo 5) que visa à obtenção de dados pessoais de identificação e informações
demográficas. Tais informações destinam-se a assegurar a abrangência e
restringir eventuais tendências da amostra populacional. Todas as informações
pessoais estão mantidas em sigilo e são utilizadas apenas pelos investigadores
envolvidos no presente estudo.
Critérios de inclusão:
Mulheres com idade entre 18 e 48 anos;
Diagnóstico cirúrgico de endometriose;
Ausência de neoplasia maligna de qualquer natureza.
Critérios de exclusão:
Não preencher os critérios de inclusão;
Gravidez confirmada ou suspeita.
27
3.2. Extração de DNA e genotipagem
Após a assinatura do TCLE e preenchimento do Questionário Demográfico,
foi feita a coleta de sangue para posterior extração do DNA.
O DNA genômico foi extraído do sangue periférico das voluntárias
participantes do estudo utilizando o kit de extração de DNA genômico (Real
Biotech Corporation, Taiwan, China), conforme procedimentos recomendados
pelo fabricante. Em resumo, foram adicionados 300 µl de sangue, em um tubo
eppendorf contendo uma solução RBC Lysis Buffer para lise do RBC. Em
seguida, foi centrifugado e descartado o sobrenadante. Depois, foram adicionados
200 µl de GB Buffer no tubo eppendorf para a lise das células, incubando-o por 10
minutos, após mistura no vórtex. O processo de extração foi realizado com etanol
(96-100%), seguido da retenção do DNA em coluna específica (Real Biotech
Corporation). O DNA foi recuperado com o tampão de lavagem Wash Buffer e
centrifugação. E para finalizar, foi adicionado ao DNA extraído o tampão de
eluição Evolution Buffer. As amostras de cada participante foram colocadas em
tubos eppendorf de 1500 µl, devidamente etiquetados com o código interno do
voluntário, a data de extração, e em seguida, foram armazenadas em geladeira (4
a 8ºC) para posterior análise de genotipagem.
A análise dos polimorfismos do gene em estudo (VEGF) foi realizada pela
técnica de PCR em tempo real no Laboratório de Pesquisa de Ciências
Farmacêuticas (LaPesF) do Centro Universitário Estadual da Zona Oeste (UEZO).
O DNA genômico para os cinco polimorfismos do gene VEGF foi amplificado
utilizando primers e sondas específicas do Sistema TaqMan (Tabela 2).
28
Tabela 2- Características do ensaio PCR em tempo real para os
polimorfismos -2578C>A, -460T>C, -1154G>A, 405G>C e 936C>T do VEGF.
SNPs
Primer
Sondas
-2578A>C
(rs699947)
5’-GGATGGGGCTGACT AGGTAAGC-3’
5’-AGCCCCCTTTTCCT CCAAC-3’
GCCAGCTGTAGGCCAGACCCTGGCA[A/C]GATCTGGGTGGATAATCAGACTGAC
- 460T>C
(rs833061)
5′-TGTGCGTGTGGGGTTGAGAG-3′
5′-TACGTGCGGACAGGGCCTGA-3′
GAGTGTGTGCGTGTGGGGTTGAGGG[C/T]GTTGGAGCGGGGAGAAGGCCAGGGG
-1154G>A
(rs1570360)
5’-TCCTGCTCCCTCCT CGCCAATG-3’
5’-GGCGGGGACAGGC GAGCATC-3’
AGCCCGGGCCCGAGCCGCGTGTGGA[A/G]GGGCTGAGGCTCGCCTGTCCCCGCC
+405G>C
(rs2010963)
5′-TTGCTTGCCATTCCCCACTTGA-3′
5′-CCGAAGCGAGAACAGCCCAGAA-3′
CGCGCGGGCGTGCGAGCAGCGAAAG[C/G]GACAGGGGCAAAGTGAGTGACCTGC
+936C>T
(rs3025039)
5’-AAGGAAGAGGAGAC TCTGCGC-3’
5’-TATGTGGGTGGGT GTGTCTACAG-3’
GCATTCCCGGGCGGGTGACCCAGCA[C/T]GGTCCCTCTTGGAATTGGATTCGCC
Para todos os ensaios, as reações de PCR em tempo real foram realizadas
em um volume final de 8 µl, com 30 ng de DNA, 1x Taqman Universal Master Mix
(Applied Biosystems), 1x de cada ensaio específico de oligonucleotídeo e sonda,
e H2O q.s.p. As condições da PCR foram: 95ºC por 10 minutos, acompanhados
de 40 ciclos de desnaturação a 92ºC por 15 segundos e anelamento a 60ºC por 1
minuto. A detecção dos alelos foi realizada após 1 minuto a 60ºC no aparelho
7500 Real-Time System (Applied Biosystems) e, em seguida, os genótipos foram
determinados diretamente.
3.3. Análise estatística
A frequência alélica e genotípica do gene VEGF foi determinada por
contagem direta dos alelos, e em seguida foi calculado o equilíbrio de HardyWeinberg (HWE). O teste Qui-quadrado de Pearson (X2) ou quando se aplicava o
teste exato de Fisher foram usados para fazer a comparação da distribuição da
29
freqüência dos alelos e dos genótipos de VEGF nos subgrupos da população
estudada (casos e controles).
As frequências haplotípicas, o coeficiente de ligação (D’) e o coeficiente de
correlação
(r2)
foram
determinados
utilizando
o
programa
Haploview
(http://www.broad.mi-t.edu/mgp/haploview/tutorial.php). O D’ indica o grau de
desequilíbrio de ligação em uma população e o r2 é a correlação ao quadrado
entre a presença e ausência de alelos em diferentes locus.
A diferença entre as variáveis demográficas e clínicas do grupo caso e
controle foi avaliada pelo Teste T no programa Excel.
A razão de chance (OR) foi utilizada para avaliar a magnitude da associação
entre as frequências genotípicas e haplotípicas e o desenvolvimento da
endometriose. Além disso, foi determinado o intervalo de confiança de 95% (IC
95%) para estas comparações.
Os programas utilizados para a realização de todas as análises estatísticas
foram
o
Vassar
(http://vassarstats.net/odds2x2.html?),
o
Epi
Info
(http://epiinfo.com.br/ead/course/category.php?id=4) e o Excel, e o nível de
significância foi fixado em P menor ou igual 0,05.
30
4. RESULTADOS
Foram recrutadas para o grupo caso 150 mulheres, sendo 20 pacientes do
Hospital HFSE-RJ e 130 do Hospital da FMUSP. Todas as pacientes foram
diagnosticadas com endometriose através de cirurgia e com comprovação
histopatológica. Um total de 35 mulheres brasileiras, sem evidência laparoscópica
da doença, também recrutadas no Hospital da FMUSP foi incluído no grupo
controle.
A identificação dos genótipos de VEGF (-2578C>A, -460T>C, -1154G>A,
405G>C e 936C>T) por PCR em tempo real está ilustrada na figura 5, a qual
mostra o perfil de cada genótipo específico.
Figura 5- Resultado da determinação dos genótipos de VEGF por PCR em
tempo real dos SNPs (a) -2578C>A, (b) -460T>C, (c) -1154G>A, (d) 405G>C e
(e) 936C>T.
a) -2578C>A
31
b) -460T>C
c) -1154G>A
32
d) 405G>C
e) 936C>T
33
Em azul estão os indivíduos com genótipo homozigoto variante; em verde, os heterozigotos
e, em vermelho, os homozigotos selvagens. Em preto é mostrado o controle negativo.
Os dados demográficos e clínicos das mulheres participantes do estudo
estão apresentados na tabela 3.
A amostra populacional deste estudo foi
composta por 150 mulheres com endometriose (casos) e 35 mulheres saudáveis
(controles).
A idade média dos casos foi de 35 anos semelhante ao grupo controle, 31
anos (P=0,456). Em relação ao peso médio dos casos foi de 60 kg (40-103)
diferentemente ao grupo controle, 70 kg (49-104) (P=0,037), corroborando com o
que foi descrito em 2005 e 2012 por Ferrero e colaboradores e Hsu e
colaboradores, respectivamente. A altura média das mulheres no grupo caso foi
de 1,64 cm (1,47-1,82) equivalente ao grupo controle, 1,67 cm (P=0,102).
O tabagismo também foi avaliado e comparando casos e controles não
houve diferença entre os sub-grupos analisados.
Em relação aos sintomas descritos na tabela 3, houve uma diferença entre
as mulheres do grupo caso e do grupo controle, sendo a disparêunia o sintoma
com maior frequência (66%) no grupo caso e a dismenorréia (30%) no grupo
controle. Além disso, o grupo caso apresentou infertilidade (41%), ao passo que o
grupo controle não apresentou esse sintoma.
Considerando o grupo caso, o local mais acometido com focos de
endometriose foi a região retro-cervical (85 mulheres). Além do ovário, peritônio,
bexiga, reto e septo retrovaginal também foram encontrados focos de
endometriose no ureter, íleo, apêndice e intestino, discriminados como “outros” na
tabela 3. Em relação a agressividade da doença, 112 pacientes (75%)
apresentaram endometriose profunda, que é caracterizada pelos implantes
alcançarem uma profundidade superior a 0,5 cm e por envolverem outros órgãos
como os ligamentos útero-sacros, bexiga, ureteres, septo reto-vaginal e intestino,
podendo formar nódulos que atingem o reto, sigmóide, órgãos genitais, vagina e
algumas vezes o intestino grosso e íleo.
34
Tabela 3- Características demográficas e clínicas das pacientes com
endometriose (casos) e das mulheres saudáveis (controle).
Dados demográficos
Média
(mínimo e máximo)
Idade em anos *
Peso em quilos *
Altura em centímetros *
35
31
(22-46)
(22-37)
60
70
(40-103)
(49-104)
158
166
(147-182)
(155-177)
Tabagismo
N (%)
Fumante
10 (7%)
4 (11%)
Ex-fumante
13 (9%)
3 (9%)
Nunca fumou
116 (77%)
14 (40%)
Não informou
11 (7%)
14 (40%)
Dor pélivica crônica
64 (43%)
5 (14%)
Dismenorréia
87 (59%)
11 (30%)
Dispareunia
98 (66%)
4 (11%)
Infertilidade
61 (41%)
0
Ovário
51 (34%)
-
Peritônio
53 (35%)
-
Bexiga
20 (13%)
-
Reto
56 (37%)
-
Retro-cervical
85 (57%)
-
Sintomas
Órgão ou local dos focus de
Endometriose
35
Septo Retovaginal
32 (21%)
Outros
25 (17%)
-
112 (75%)
-
Gravidade da Endometriose
Profunda
* Teste T com p<0,05
4.1. Frequências alélicas dos polimorfismos do VEGF
Considerando a população geral estudada, as frequências dos alelos
variantes -2578A, -460C, -1154A, 405C e 936T foram 41%, 44%, 25%, 35% e
14%, respectivamente. Fazendo uma comparação entre os casos e controles,
conforme as frequências ilustradas na figura 6, não foram encontradas
diferenças significativas para nenhum dos SNPs analisados.
36
Figura 6- Frequências alélicas dos polimorfismos do VEGF em casos e
controles.
4.2. Frequências genotípicas dos polimorfismos do VEGF
A distribuição dos genótipos de VEGF envolvendo os SNPs -2578C>A, -460T>C, -1154G>A, 405G>C e 936C>T está mostrada na tabela 4. A
frequência observada para a população geral de mulheres brasileiras está de
acordo
com
o
equilíbrio
de
Hardy-Weinberg
(tabela
5).
Entretanto,
considerando o SNP 405G>C, foi encontrada uma divergência com o HWE
para o grupo controle.
Comparando a frequência dos genótipos, entre os casos e controles,
identificou-se uma diferença significativa na distribuição dos genótipos apenas
do SNP 405G>C (P = 0,0249). A frequência do 405 GG e CC foi
37
aproximadamente duas vezes maior no grupo casos (45% e 13%,
respectivamente) do que no grupo controle (26% e 6%, respectivamente).
Tabela 4- Frequência dos genótipos de VEGF em pacientes com
endometriose e em mulheres do grupo controle.
Genótipos
N (%)
-2578
CC
AC
-460
AA
CC
(N = 148)
CT
-1154
TT
GG
(N = 150)
GA
405
AA
GG
(N = 82)
GC
936
CC
CC
(N = 150)
CT
TT
(N = 133)
Casos
49(33) 75(51) 24(16)
26(17)
(N = 35)
78(52) 46(31)
48(59)
(N = 33)
27(33)
7(8)
68(45) 63(42) 19(13)
(N = 15)
3(75)
(N = 34)
30(23) 100(2)
(N = 23)
Controles
14(40) 16(46) 5(14)
P
0.740
7(20)
16(49) 10(31)
0.865
10(67)
3(20) 2(13)
0.577
Teste Qui-Quadrado de Person ou teste exato de Fisher
9(26)
23(68)
0.024
2(6)
0(65)
8(35)
0.432
15(0)
38
Tabela 5- Equilíbrio de Hardy-Weinberg dos polimorfismos do VEGF.
SNPs
População
Total
P
Casos
P
Controles
P
-2578C>A
63
91
29
CC
AC
AA
0,683
49
75
24
0,598
14
16
5
0,901
-460T>C
56
94
33
TT
TC
CC
0,553
46
78
26
0,471
10
16
7
0,898
-1154G>A
58
30
9
GG
GA
AA
0,095
48
27
7
0,269
10
3
2
0,087
405G>C
77
86
21
GG
GC
CC
0,681
68
63
19
0,465
9
23
2
0,016
936C>T
CC
CT
TT
115
38
3
0,945
100
30
3
0,676
15
8
0
0,312
Na tabela 6 é apresentada a frequência descrita na literatura para
diversas populações dos SNPs de VEGF (-2578C>A, -460T>C, -1154G>A,
405G>C e 936C>T), comparando com os resultados do presente estudo.
39
Tabela 6- Frequência dos alelos de VEGF em uma amostra da população
brasileira e em outras populações étnicas.
SNPs
N
1.625
-2578C>A
115
61
102
60
-460T>C
959
180
1.625
61
102
-1154G>A
959
180
140
102
959
405G>C
180
140
253
353
199
936C>T
959
180
427
Referências
Freathy e cols.,
2006
Maltese e cols.,
2008
Calderón e
cols., 2009
Summers e
cols., 2005
Attar e cols.,
2010
Zhao e cols.,
2008
Cosın e cols.,
2009
Freathy e cols.,
2006
Calderón e
cols., 2009
Summers e
cols., 2005
Zhao e cols.,
2008
Cosın e cols.,
2009
Gentilini e cols.,
2008
Summers e
cols., 2005
Zhao e cols.,
2008
Cosın e cols.,
2009
Gentilini e cols.,
2008
Fang e cols.,
2009
Guan e cols.,
2009
Lamp e cols.,
2010
Zhao e cols.,
2008
Cosın e cols.,
2009
Hofmann e
cols., 2008
Caucasiano %
Afro-americanos %
População
Estudada %
37
41
50
47
51
41
44
51
49
33
24
31
25
30
31
31
31
30
35
31
31
13
12
17
14
15
10
15
40
Para avaliar a magnitude de associação entre os genótipos de VEGF e a
endometriose, os genótipos selvagens de todos os SNPs (-2578C>A, -460T>C, 1154G>A, 405G>C e 936C>T) foram padronizados como referência em
comparação aos genótipos heterozigostos e homozigotos variantes, conforme a
tabela 7.
Nesta
análise
o
polimorfismo
405G>C
apresentou
associação
estatisticamente significativa com a endometriose com um aparente efeito protetor
pela presença de pelo menos um alelo variante (OR: 0,434, 95% IC: 0,189 –
0,992), já que a frequência dos genótipos variantes (GC + CC) foi
significativamente maior no grupo controle (n = 25, 74%) quando comparado aos
casos (n = 82, 55%).
Tabela 7- Genótipos de VEGF e a magnitude de associação com a
endometriose.
SNPs
-2578C>A
-460T>C
-1154G>A
405G>C
936C>T
Genótipos
Casos N (%)
Controles N (%)
OR (95%IC)
CC
49 (33)
14 (40)
1
(AC + AA)
99 (67)
21 (60)
1.346 (0.631 -2.874)
TT
46 (31)
10 (30)
1
(TC + CC)
104 (69)
23 (70)
0.983 (0.433 - 2.230)
GG
48 (59)
10 (67)
1
(GA + AA)
34 (41)
5 (33)
1.416 (0.444 -4.518)
GG
68 (45)
9 (26)
1
(GC + CC)
82 (55)
25 (74)
0.434 (0.189 - 0.992)
CC
100 (77)
15 (65)
1
(CT + TT)
33 (25)
8 (35)
0.618 (0.240 - 1.590)
41
4.3. Frequências haplotíplicas dos polimorfismos do VEGF
Com base nos cinco polimorfismos (-2578C>A, -460T>C, -1154G>A,
405G>C e 936C>T) genotipados neste trabalho foi possível inferir os haplótipos
de VEGF (figura 5) que se encontram listados na tabela 8.
No grupo caso foi observado que os SNPs da região 5´-UTR (-2578C>A, 460T>C, -1154G>A e 405G>C) encontram-se em desequilíbrio de ligação com um
valor de D´ próximo a 1 nas comparações par a par (figura 7) e um valor de r2
entre 0.017 a 0.893. Considerando o grupo de mulheres brasileiras “saudáveis”
(controle) observou-se um desequilíbrio de ligação entre os 4 SNPs da região 5´UTR e também entre os SNPs -1154G>A e 936C>T, todos com um valor de D´
igual a 1 nas comparações par a par (figura 7) e um valor de r2 entre 0.035 a
0.774.
Não foi encontrada associação dos haplótipos de VEGF envolvendo os
SNPs (-2578C>A, -460T>C, -1154G>A, 405G>C e 936C>T), com a endometriose
(tabela 8).
Figura 7- Desequilíbrio de ligação dos polimorfismos (-2578C>A, -460T>C, 1154G>A, 405G>C e 936C>T) de VEGF nos grupos casos e
controles
Os números nos boxes indicam valores decimais de D’.
42
Tabela 8- Frequência dos haplótipos de VEGF em uma amostra da
população brasileira (pacientes com endometriose e em mulheres controle)
e a magnitude de associação com a endometriose.
Haplótipos
(-2578C>A, -460T>C, -1154G>A, 405G>C, 936C>T)
Casos
(%)
Controles
(%)
OR
(95% IC)
CTGCC
27,5
33,9
1
CTGGC
22,6
12,0
2,18
(0,98 - 5,46)
ACAGC
19,6
21,8
1,07
(0,49 - 2,32)
ACGGC
14,2
10,6
1,55
(0,60 - 4,13)
CTGCT
6,2
6,2
ACAGT
5,2
1,6
CCGGC
2,4
2,9
ACGGT
1,9
5,4
1,10
(0,34 - 3,77)
2,31
(0,46 - 15,68)
1,16
(0,20 - 8,48)
0,43
(0,10 - 2,02)
43
5. DISCUSSÃO
Este é o primeiro trabalho a descrever a frequência alélica, genotípica e
haplotípica de polimorfismos no gene VEGF (2578C>A, -460T>C, -1154G>A,
405G>C e 936C>T) em mulheres brasileiras com endometriose e em mulheres
“saudáveis”. Diversos estudos tem apontado a influência do VEGF na
fisiopatologia da endometriose (MACHADO e cols., 2008; DUN e cols., 2010;
TAYLOR, e cols., 2002; DONNEZ, e cols., 1998;), e nesse contexto, estudos
caso-controle
estão
sendo
realizados
para
avaliar
a
associação
entre
polimorfismos em VEGF e o desenvolvimento da endomtriose, entretanto, os
dados ainda são contraditórios (ALTINKAYA, e cols., 2011; ATTAR, e cols., 2010;
COSÍN, e cols., 2009; EMAMIFAR, e cols., 2012; LAMP, e cols., 2010; LIU, e
cols., 2009; ZHAO, e cols., 2009; HSIEH e cols., 2004; IKUHASHI e cols., 2007;
KIM e cols., 2005; KIM e cols., 2008; GENTILINI e cols., 2008; BHANOORI, e
cols., 2005; ROTMAN e cols., 2012), conforme discussão apresentada na tabela
9.
O VEGF é um importante fator pró-angiogênico que apresenta um papel
fundamental
como
regulador
da
proliferação
celular
endotelial
e
da
permeabilidade vascular (TROVÓ DE MARQUI, 2012). O processo de
angiogênese é de extrema importância na fisiopatologia da endometriose, pois o
tecido endometrial ectópico necessita de uma nova rede vascular para seu
desenvolvimento (ROBERT, e cols., 2009). Já foi observado que os níveis de
mRNA e da proteína do VEGF é significativamente maior em mulheres com
endometriose quando comparado com o grupo controle (FASCIANI, e cols., 2000;
MATALLIOTAKIS
e
cols.,
2003;
GILABERT-ESTELLES
e
cols.,
2007;
EMAMIFAR, e cols., 2012). E uma hipótese para explicar essa diferença se dá
pelo fato do gene VEGF ser altamente polimórfico (JAIN, e cols., 2009).
44
Tabela 9- Resumo de dados da literatura e do presente estudo avaliando a
magnitude de associação dos SNPs de VEGF com a endometriose.
SNPs
-2578A>C
-1154G>A
- 460T>C
+405G>C
Referências
População
N
Associação com a
endometriose
Zhao e cols., 2008
Australiana
958
Não
Liu e cols., 2009
Chinesa
344
A
Lamp e cols., 2010
Estônia
150
C
Liu e cols., 2009
Chinesa
344
A
Lamp e cols., 2010
Estônia
150
Não
Ratman e cols., 2012
USA
24
Não
Hsieh e cols., 2004
Chinesa
122
T
Bhanoori e cols., 2005
Sul da Índia
215
Não
Kim e cols., 2005
Coreana
215
Não
Ikuhashi e cols., 2007
Japonesa
147
Não
Zhao e cols., 2008
Australiana
958
Não
Cosín e cols., 2009
Espanha
186
Não
Liu e cols., 2009
Chinesa
344
Não
Attar e cols., 2010
Turquia
51
Não
Altinkaya e cols., 2011
Turquia
98
Não
Emamifar e cols., 2011
Norte do Irã
480
Não
Bhanoori e cols., 2005
Sul da Índia
215
C
Kim e cols., 2005
Coreana
215
C
Ikuhashi e cols., 2007
Japonesa
147
Não
Gentilini e cols., 2008
Italiana
203
C
Zhao e cols., 2008
Australiana
958
Não
Cosín e cols., 2009
Espanha
186
Não
Attar e cols., 2010
Turquia
51
C
Altinkaya e cols., 2011
Turquia
98
C
Emamifar e cols., 2011
Norte do Irã
480
C
Ikuhashi e cols., 2007
Japonesa
147
T
Zhao e cols., 2008
Australiana
958
Não
+936C>T
Presente
Estudo
Não
Não
Não
C
Não
45
Cosín e cols., 2009
Espanha
186
T
Liu e cols., 2009
Chinesa
344
Não
Lamp e cols., 2010
Estônia
150
Não
 - aumento do risco no desenvolvimento da endometriose.
 - diminuição do risco no desenvolvimento da endometriose.
Considerando o SNP VEGF -2578C>A, localizado na região promotora, três
trabalhos distintos mostraram resultados completamente diferentes (ZHAO, e
cols., 2008, LIU e cols., 2009 e LAMP e cols., 2010), conforme consta na tabela 9.
Os nossos resultados corroboram com Zhao e colaboradores, que em 2008, após
analisarem 958 pacientes não observaram associação do SNP -2578C>A com a
endometriose.
Três trabalhos, com resultados controversos, estudaram a associação do
SNP VEGF -1154G>A com a endometriose (LIU e cols., 2009; LAMP e cols.,
a2010; ROTMAN e cols., 2012), e semelhante ao nosso estudo, LAMP e
colaboradores, em 2010, e ROTMAN e colaboradores, em 2012, também não
encontraram associação deste SNP com a doença.
Dos dez estudos já publicados na literatura, em relação a associação do
SNP VEGF -460T>C com a endometriose, apenas um observou associação
positiva quando analisaram 122 mulheres chinesas (Hsieh e cols., 2004). Em
2009, Liu e colaboradores estudaram 344 chinesas e não observaram associação
desse SNP com a endometriose, corroborando com nosso estudo.
Para o SNP VEGF +936 C>T, localizado na região 3’UTR, o presente estudo
não observou associação com a endometriose de acordo com o que já foi descrito
para população australiana, chinesa e da Estônia (ZHAO e cols., 2008; LIU e
cols., 2009; LAMP e cols., 2010), entretanto, dois estudos diferentes observaram
uma
associação
quando
analisaram
mulheres
(IKUHASHI e cols., 2007; COSÍN e cols., 2009).
japonesas e
espanholas
46
E finalmente para o SNP VEGF +405 G>C, localizado na região 5’UTR, a
associação observada pelo nosso grupo, em que a presença do alelo 405C
diminui o risco do desenvolvimento da endometriose, também foi descrita por
Bhanoori e cols. (2005) e Altinkaya e cols. (2011), quando estudaram mulheres do
sul da Índia e da Turquia, respectivamente. Contrariamente, três trabalhos não
encontraram associação (IKUHASHI e cols., 2007; ZHAO e cols., 2008; COSÍN e
cols., 2009) e quatro observaram um efeito oposto, em que a presença do alelo
405C aumenta o risco do desenvolvimento da endometriose (KIM e cols., 2005;
GENTILINI e cols., 2008; ATTAR e cols., 2010; EMAMIFAR e cols., 2011).
Um dado importante que justifica o resultado encontrado pelo nosso grupo
em relação a diminuição do risco do desenvolvimento da endometriose, na
presença do alelo 405C, já foi discutida por WATSON e colaboradores, em 2000,
que mostrou que o SNP VEGF +405 G>C encontra-se dentro de um sitio de
ligação do fator de transcrição MZF1. Sendo assim, na presença do alelo C ocorre
redução da especificidade de ligação sugerindo que a menor produção de VEGF,
observada na presença do alelo C, é devido ao rompimento do sítio de ligação
MZF1, consequentemente diminuindo o processo de angiogênese, já que o VEGF
é um dos principais indutores angiogênicos. Em conclusão, não ocorrendo o
processo angiogênico, que é fundamental para a sobrevivência dos focos de
endometriose, possivelmente, a mulher não irá desenvolver endometriose
(WATSON e cols., 2000).
As análises realizadas no presente estudo, envolvendo polimorfismos do
VEGF e a associação com a endometriose, são extremamente importantes, pois
além dos resultados serem controversos, não existem estudos na população
brasileira. Algumas limitações deste estudo foram: (i) o número reduzido de
participantes do grupo controle em função da dificuldade de se encontrar
mulheres com os critérios de inclusão (ver metodologia); (ii) os possíveis vieses
na seleção dos participantes; (iii) o desconhecimento da influencia de cada SNP
na função do VEGF e (iv) o SNP 405G>C, no grupo controle, não estar em
equilíbrio de Hardy – Weinberg, o qual pode ser justificado pelo número reduzido
de participantes do grupo controle. Mesmo assim, resultados negativos devem ser
47
considerados, bem como a realização de metanálises para validação dos
achados.
A contínua investigação para o melhor conhecimento da funcionalidade de
diversos polimorfismos localizados no gene VEGF e sua associação com o
desenvolvimento da endometriose deve prosseguir, pois levará a uma melhor
compreensão do comportamento e da fisiopatologia da doença podendo
influenciar nos aspectos terapêuticos, bem como nos estudos clínicos.
48
6. CONCLUSÃO
As frequências dos genótipos VEGF (incluindo os SNPs -2578C>A, 460T>C, -1154G>A, 405G>C e 936C>T) em mulheres brasileiras estão de
acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg e são similares às frequências
relatadas para outros grupos populacionais.
Os SNPs -2578C>A, -460T>C, -1154G>A e 405G>C de VEGF em
brasileiros ocorrem em forte desequilíbrio de ligação, conforme relatado para
outros grupos populacionais, e o haplótipo de VEGF CTGCC é o mais
frequente tanto em pacientes brasileiras com endometriose quanto em
mulheres brasileiras saudáveis.
A frequência genotípica do SNP 405G>C é significativamente diferente entre
casos e controle, sendo que foi observado um aparente efeito protetor na
presença de pelo menos um alelo variante.
49
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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60
8. ANEXOS
ANEXO 1: Aprovação do Comitê de Ética do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina Universitária de São Paulo.
61
ANEXO 2: Aprovação do Comitê de Ética do Hospital Federal dos Servidores
do Estado.
62
ANEXO 3: Termo de Consentimento Paciente.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Caracterização de polimorfismos em genes envolvidos com a predisposição
do desenvolvimento da endometriose
Pesquisador Responsável: Dr. Plinio Tostes Berardo
Você está sendo convidada para participar, como voluntária, em uma
pesquisa. Após ser esclarecida sobre as informações a seguir, no caso de aceitar
fazer parte do estudo, assine ao final deste documento, que está impresso em
duas vias. Uma delas é sua e a outra é do pesquisador responsável. Em caso de
recusa você não será penalizada de forma alguma. Em caso de dúvida você pode
procurar o Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Federal dos Servidores do
Estado - RJ.
Introdução:
Esta pesquisa visa estudar melhor uma doença chamada endometriose
que significa a presença de um tumor benigno feito de tecido endometrial (o
mesmo que existe dentro do útero) que pode causar dor e dificuldade para
engravidar, e desta maneira muitas vezes deve ser retirado através de cirurgia. O
objetivo desta pesquisa é tentar entender por que algumas mulheres
desenvolvem endometriose e outras não. Para isso, nós iremos estudar o perfil
genético de mulheres com endometriose.
Desenho do estudo e objetivo(s):
Essas informações estão sendo fornecidas para sua participação voluntária
neste estudo. Durante o acompanhamento clínico no HFSE, após o diagnóstico
da endometriose, você deverá ter visitas ambulatoriais trimestrais, depois de um
ano sem sintomas as visitas serão semestrais por mais um ano quando deverá
estar apta para alta do HFSE para acompanhamento de rotina ginecológica em
unidade primária ou secundária de saúde com encaminhamento detalhado feito
em guia de contra-referência segundo as normas de funcionamento do Serviço de
63
Ginecologia do HFSE. No caso de falha do tratamento inicial ou retorno dos
sintomas a frequência de visitas e procedimentos adicionais será individualizada
de acordo com o seu caso, sendo assegurado todas as medidas necessárias para
o tratamento de sua doença.
Se você concordar em participar deste estudo, uma pequena e única
quantidade de sangue (3ml) será coletada para se obter o seu DNA (material
genético de características únicas de cada pessoa) e identificar as características
dos genes relacionados com o desenvolvimento da endometriose. Desta maneira,
os objetivos deste projeto incluem: (a) Determinar se existem alterações genéticas
que podem estar relacionadas ao desenvolvimento da endometriose em mulheres
diagnosticadas com a doença, tendo o benefício de saber se você ou sua família
tem maior risco de desenvolver a doença e com isso poder definir condutas de
prevenção e diagnóstico precoce; (b) Avaliar se estas alterações têm relações
com a idade, tipo dos sintomas ou agressividade da doença.
Descrição dos procedimentos:
A sua participação no estudo é VOLUNTÁRIA, e caso você concorde em
participar do estudo você deverá passar pelas seguintes etapas: (a) entrevista
com um profissional da saúde da equipe de pesquisa que lhe explicará as etapas
e procedimentos do estudo e poderá esclarecer as suas dúvidas em relação a
este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e ao Questionário ClínicoDemográfico; (b) assinatura deste Termo de Consentimento; (c) preenchimento
do Questionário Clínico-Demográfico, que visa a obtenção de informações
clínicas e demográficas das pacientes envolvidas no estudo (Anexo II), tais
informações destinam-se a assegurar a abrangência e restringir eventuais
tendências da amostra populacional; (d) coleta de uma única amostra de sangue
que será utilizada para a análise de alterações genéticas relacionadas ao
desenvolvimento da endometriose as quais serão realizadas no Laboratório de
Tecnologia em Produção de Fármacos (LTF) da Universidade Estadual da Zona
Oeste (UEZO).
64
Segurança do voluntário e Benefícios do estudo
O Comitê de Ética em Pesquisa do HFSE aprovou este estudo,
considerando-o ético e seguro. A sua participação no estudo é voluntária e
mesmo que concorde em participar, você tem o direito de desistir e interromper a
sua participação a qualquer momento, sem necessidade de justificar esta decisão
e neste caso você não terá nenhum prejuízo quanto à continuidade de seu
tratamento na Instituição. No caso de desistência o seu material biológico
(sangue) armazenado assim como os seus dados pessoais será prontamente
descartado de forma definitiva. Este estudo não trará nenhum benefício imediato
para você assim como não receberá qualquer tipo de recompensa pela sua
participação.
Confidencialidade:
É garantida a confidencialidade das informações obtidas, não sendo
divulgados seus dados pessoais em momento algum. Seus dados pessoais
somente serão conhecidos pelos médicos e demais profissionais que participam
deste estudo. Os resultados de suas análises serão do seu conhecimento caso
manifeste esta vontade. Qualquer publicação que seja feita com os resultados
desta pesquisa não incluirá nome ou outros identificadores dos participantes da
pesquisa. O pesquisador se compromete a utilizar os dados e o material coletado
somente para pesquisas relacionadas à endometriose, assim o material que não
for utilizado ficará estocado para estudos futuros por um período de cinco anos no
Laboratório de Tecnologia em Produção de Fármacos (LTF) da Universidade
Estadual da Zona Oeste (UEZO) o qual tem todas as condições adequadas para
estocagem de material biológico. Caso manifeste desejo de desistência em
participar do estudo, em qualquer momento poderá retirar seu consentimento para
armazenamento de amostra biológica (sangue) bem como de seus dados
pessoais.
65
Despesas e compensações:
Não haverá despesas pessoais para você em qualquer fase do estudo.
Não há compensação financeira relacionada à sua participação. Você não está
abrindo mão de qualquer direito legal ao participar deste estudo.
Com quem devo entrar em contato em caso de dúvidas?
Em qualquer etapa do estudo, você terá acesso aos profissionais
responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de eventuais dúvidas. O
investigador principal é o Dr. Plinio Tostes Berardo que pode ser encontrado no
Serviço de Ginecologia no 7º andar do prédio principal do HFSE ou pelos
telefones: 22913131 ramal: 3767; 22031408 ou 96615884. Se você tiver alguma
consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o
Comitê de Ética em Pesquisa do HSE, situado no 5º andar do prédio dos
ambulatórios do mesmo hospital, que é o órgão responsável em avaliar a parte
ética das pesquisas com seres humanos além de assegurar o bem estar e os
direitos dos sujeitos da pesquisa durante o desenvolvimento da mesma.
Rio de Janeiro, ___ de _______________ de 201__.
_________________________________________________________________
Dr. Plinio Tostes Berardo - Pesquisador responsável
66
CONSENTIMENTO DA PARTICIPAÇÃO DA PESSOA COMO SUJEITO
Eu,______________________________________________,RG_____________
_____
CPF_______________________,
_____________________________,
Prontuário
nº
Matrícula
nº
______________________________, abaixo assinado, concordo em participar do
estudo
Caracterização
predisposição
do
de
polimorfismos
desenvolvimento
da
em
genes
endometriose,
envolvidos
como
com
sujeito.
a
Fui
devidamente informado e esclarecido pelo pesquisador Plinio Tostes Berardo
sobre a pesquisa e os procedimentos nela envolvidos. Foi-me garantido que
posso retirar meu consentimento a qualquer momento, sem que isto leve a
qualquer
penalidade
ou
interrupção
de
meu
acompanhamento/
assistência/tratamento.
Rio de Janeiro ____ de __________________ de 201__.
Nome e Assinatura do sujeito:
_________________________________________________________
Presenciamos a solicitação de consentimento, esclarecimentos sobre a pesquisa
e aceite do sujeito em participar.
Testemunhas (não ligadas à equipe de pesquisadores):
Nome:__________________________________________________
Assinatura: _____________________________________________
Nome:__________________________________________________
Assinatura: _____________________________________________
67
ANEXO 4. Termo de Consentimento Controle.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Caracterização de polimorfismos em genes envolvidos com a predisposição
do desenvolvimento da endometriose
Pesquisador Responsável: Dr. Plinio Tostes Berardo
Você está sendo convidada para participar, como voluntária, em uma pesquisa.
Após ser esclarecida sobre as informações a seguir, no caso de aceitar fazer
parte do estudo, assine ao final deste documento, que está impresso em duas
vias. Uma delas é sua e a outra é do pesquisador responsável. Em caso de
recusa você não será penalizada de forma alguma. Em caso de dúvida você pode
procurar o Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Federal dos Servidores do
Estado - RJ.
Introdução:
Esta pesquisa visa estudar melhor uma doença chamada endometriose
que significa a presença de um tumor benigno feito de tecido endometrial (o
mesmo que existe dentro do útero) que pode causar dor e dificuldade para
engravidar, e desta maneira muitas vezes deve ser retirado através de cirurgia. O
objetivo desta pesquisa é tentar entender por que algumas mulheres
desenvolvem endometriose e outras não. Para isso, nós iremos estudar o perfil
genético de mulheres com endometriose e de mulheres saudáveis como você.
Desenho do estudo e objetivo(s):
Essas informações estão sendo fornecidas para sua participação voluntária
neste estudo. Durante o acompanhamento clínico no HFSE, se você concordar
em participar deste estudo, uma pequena e única quantidade de sangue (3ml)
será coletada para se obter o seu DNA (material genético de características
únicas de cada pessoa) e identificar as características dos genes que podem
estar relacionados com o desenvolvimento da endometriose. Dessa maneira, os
objetivos deste projeto incluem: (a) Determinar se existem alterações genéticas
68
que podem estar relacionadas ao desenvolvimento da endometriose em mulheres
diagnosticadas com a doença e em mulheres saudáveis como você, tendo o
benefício de saber se você ou sua família tem maior risco de desenvolver a
doença e com isso poder definir condutas de prevenção e diagnóstico precoce.
Descrição dos procedimentos:
A sua participação no estudo é VOLUNTÁRIA, e caso você concorde em
participar do estudo você deverá passar pelas seguintes etapas: (a) entrevista
com um profissional da saúde da equipe de pesquisa que lhe explicará as etapas
e procedimentos do estudo e poderá esclarecer as suas dúvidas em relação a
este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e ao Questionário ClínicoDemográfico; (b) assinatura deste Termo de Consentimento; (c) preenchimento
do Questionário Clínico-Demográfico, que visa a obtenção de informações
clínicas e demográficas das voluntárias saudáveis envolvidas no estudo (Anexo
II), tais informações destinam-se a assegurar a abrangência e restringir eventuais
tendências da amostra populacional; (d) coleta de uma única amostra de sangue
que será utilizada para a análise de alterações genéticas relacionadas ao
desenvolvimento da endometriose as quais serão realizadas no Laboratório de
Tecnologia em Produção de Fármacos (LTF) da Universidade Estadual da Zona
Oeste (UEZO).
Segurança do voluntário e Benefícios do estudo
O Comitê de Ética em Pesquisa do HFSE aprovou este estudo,
considerando-o ético e seguro. A sua participação no estudo é voluntária e
mesmo que concorde em participar, você tem o direito de desistir e interromper a
sua participação a qualquer momento, sem necessidade de justificar esta decisão
e neste caso você não terá nenhum prejuízo quanto à continuidade de seu
tratamento na Instituição. No caso de desistência o seu material biológico
(sangue) armazenado assim como os seus dados pessoais será prontamente
descartado de forma definitiva. Este estudo não trará nenhum benefício imediato
para você assim como não receberá qualquer tipo de recompensa pela sua
participação.
69
Confidencialidade:
É garantida a confidencialidade das informações obtidas, não sendo
divulgados seus dados pessoais em momento algum. Seus dados pessoais
somente serão conhecidos pelos médicos e demais profissionais que participam
deste estudo. Os resultados de suas análises serão do seu conhecimento caso
manifeste esta vontade. Qualquer publicação que seja feita com os resultados
desta pesquisa não incluirá nome ou outros identificadores dos participantes da
pesquisa. O pesquisador se compromete a utilizar os dados e o material coletado
somente para pesquisas relacionadas à endometriose, assim o material que não
for utilizado ficará estocado para estudos futuros por um período de cinco anos no
Laboratório de Tecnologia em Produção de Fármacos (LTF) da Universidade
Estadual da Zona Oeste (UEZO) o qual tem todas as condições adequadas para
estocagem de material biológico. Caso manifeste desejo de desistência em
participar do estudo, em qualquer momento poderá retirar seu consentimento para
armazenamento de amostra biológica (sangue) bem como de seus dados
pessoais.
Despesas e compensações:
Não haverá despesas pessoais para você em qualquer fase do estudo.
Não há compensação financeira relacionada à sua participação. Você não está
abrindo mão de qualquer direito legal ao participar deste estudo.
Com quem devo entrar em contato em caso de dúvidas?
Em qualquer etapa do estudo, você terá acesso aos profissionais
responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de eventuais dúvidas. O
investigador principal é o Dr. Plinio Tostes Berardo que pode ser encontrado no
Serviço de Ginecologia no 7º andar do prédio principal do HFSE ou pelos
telefones: 2291-3131 ramal: 3767; 220-31408 ou 9661-5884. Se você tiver
alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com
o Comitê de Ética em Pesquisa do HSE, situado no 5º andar do prédio dos
ambulatórios do mesmo hospital, que é o órgão responsável em avaliar a parte
70
ética das pesquisas com seres humanos além de assegurar o bem estar e os
direitos dos sujeitos da pesquisa durante o desenvolvimento da mesma.
Rio de Janeiro, ___ de _______________ de 201__.
_________________________________________________________________
Dr. Plinio Tostes Berardo - Pesquisador responsável
71
CONSENTIMENTO DA PARTICIPAÇÃO DA PESSOA COMO SUJEITO
Eu,______________________________________________,RG_____________
_____
CPF_______________________,
_____________________________,
Prontuário
nº
Matrícula
nº
______________________________, abaixo assinado, concordo em participar do
estudo
Caracterização
predisposição
do
de
polimorfismos
desenvolvimento
da
em
genes
endometriose,
envolvidos
como
com
sujeito.
a
Fui
devidamente informado e esclarecido pelo pesquisador Plinio Tostes Berardo
sobre a pesquisa e os procedimentos nela envolvidos. Foi-me garantido que
posso retirar meu consentimento a qualquer momento, sem que isto leve a
qualquer
penalidade
ou
interrupção
de
meu
acompanhamento/
assistência/tratamento.
Rio de Janeiro ____ de __________________ de 201__.
Nome e Assinatura do sujeito:
_________________________________________________________
Presenciamos a solicitação de consentimento, esclarecimentos sobre a pesquisa
e aceite do sujeito em participar.
Testemunhas (não ligadas à equipe de pesquisadores):
Nome:_________________________________________________
Assinatura: _____________________________________________
Nome:_________________________________________________
Assinatura: _____________________________________________
72
ANEXO 5: Questionário Clínico – Demográfico Pacientes e Controles.
CARACTERIZAÇÃO DE POLIMORFISMOS EM GENES ENVOLVIDOS COM A
PREDISPOSIÇÃO DO DESENVOLVIMENTO DA ENDOMETRIOSE
QUESTIONÁRIO CLÍNICO-DEMOGRÁFICO
Data da Entrevista: _____/______/________
Origem :
Nº do prontuário:
Cirurgia: _____________________
Nome:
Peso: _________
Altura: ___________
Possui endometriose? ( ) Não
apresenta ou apresentou?
1. Infiltrativa intestino
2. Ovários
3. Peritônio █
4. Parede
(
Data de Nascimento: _____________
) Sim. Qual o tipo de endometriose que
5. Infiltrativa bexiga █
6. Outros. Especifique _____________
7. Infiltrativa retrocervical
Já realizou procedimentos cirúrgicos para remoção dos focos de endometriose?
1. Não
vezes _____________
2. Sim. Número de vezes _____________
vezes _____________
2a. Laparoscopia
█ 2b. Laparotomia
Número de
Número de
Fez algum tipo de tratamento antes do procedimento cirúrgico para remoção dos
focos de endometriose?
.
1. Não
█
2. Sim. Qual tratamento _____________________________________________
_________________________________________________________________
Fez dosagem do CA125 ANTES de remover os focos de endometriose?
.
1. Não
73
2. Sim. Valor _____________________
Fez dosagem do CA125 APÓS remover os focos de endometriose?
1. Não
2. Sim. Valor _____________________
Já teve dificuldades de engravidar?
.
1. Sim
2. Não
Precisou usar técnica de reprodução assistida?
1. Sim
2. Não
Possui filhos? █ 1. Não
█ 2. Sim, quantos? ______
PC:________ Aborto:________
PN:_______
Possui ou já possuiu ciclo menstrual irregular?
1. Sim
2. Não
Quantos dias em média dura o fluxo menstrual? ________
Qual o intervalo médio entre as menstruações (do início de uma menstruação ao
início da próxima)? ________
Você sente ou sentia dor durante a menstruação (dismenorréia)?
1. Não
2. Pouca
█ 3. Moderada
█ 4. Intensa
Já precisou ir ao hospital devido a dores durante o período menstrual?
█ 1. Sim
74
█ 2. Não
Você sente ou sentia dor durante o ato sexual (dispareunia)?
1. Não
2. Pouca
█ 3. Moderada
█ 4. Intensa
Você sente ou sentia dor pélvica crônica (> 6 meses)?
.
1. Não
█ 3. Moderada
2. Pouca
█ 4. Intensa
Possui algum familiar que tem ou já teve endometriose?
1. Não
2. Sim. Especifique o grau de parentesco ___________________________
Possui alguma doença?
1. Diabetes
2. Pressão Alta
3. Insuficiência Cardíaca
█ 4. Gastrite/úlcera
█ 5. Hipertireoidismo
█ 6. Hipotireoidismo
█
7. Asma/Bronquite
8. Câncer – especifique _______________
9. Outras – especifique _______________
Já fez uso de contraceptivos orais ou hormônios?
Medicamento
Tempo de uso
1)__________________
_________________
Dose
Frequência
______________
_________________
2)__________________
_________________
______________
_________________
3)__________________
_________________
______________
_________________
75
Faz uso de algum medicamento atualmente:
Medicamento
Dose
Tempo de uso
1)__________________
______________
____________
Frequência
_________________
2)__________________
____________
______________
_________________
3)__________________
____________
______________
_________________
Histórico de tabagismo?
1. Fumante
Responsável pelo preenchimento:
2. Nunca fumou
█ 3. Ex-fumante