INFLUÊNCIA DO RECICLO DE FERMENTO NA
CAPACIDADE FERMENTESCÍVEL DE MELAÇO
Lima, M. C. S.(1); Silva, F.L.A.(1): Leite, A.L.(1); Santos, F. J. A. L.(1); Silva,
A.C.P.(1); Barbosa-Neto, A. G.(2,3); Brasileiro, B. T. R. V.(1,3)
[email protected]
(1)
Universidade Católica de Pernambuco – UNICAP, Recife - PE; (2)Universidade
Federal de Pernambuco – UFPE, Recife – PE; (3)Genetech Bioprodutividade, Recife PE
RESUMO
O bioetanol é obtido através da fermentação alcoólica, que é a ação das leveduras de
gênero Saccharomyces sobre açúcares fermentescíveis. Dentre os substratos
utilizados, o melaço, que é um subproduto da produção do açúcar, é muito utilizado
usinas para a produção de etanol em países tropicais como o Brasil, devido a
quantidade substancial de sacarose. Assim o presente trabalho objetivou avaliar a
eficiência alcoólica da fermentação com melaço de cana-de-açúcar após reciclo de
células, tomando a fermentação de caldo de cana (mosto) como referência
independente. Para qual foram realizados ensaios fermentativos sequenciais com o
fermento reciclado a partir do ensaio anterior. Embora os resultados tenham
demonstrado alta correlação entre os substratos, o melaço surpreendentemente
apresentou capacidade fermentescível superior ao caldo de cana.
Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae, Eficiência Alcoólica, Cana-de-açúcar.
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INTRODUÇÃO
O bioetanol é obtido através da fermentação alcoólica, que é a ação das
leveduras de gênero Saccharomyces sobre açúcares fermentescíveis. No
Brasil, utiliza-se como substrato para a fermentação alcoólica o melaço
de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.), a própria cana-deaçúcar, ou a mistura destes. A sacarose presente nesses substratos pode
ser transformada em etanol, ATP e CO2, num processo que envolve 12
reações em sequência ordenada, cada qual catalisada por uma enzima
específica (PACHECO, 2010; AMORIM, 2008).
O Melaço é um subproduto da produção do açúcar e é aproveitado por
usinas para a produção de etanol (RODRIGUES, 2011), devido à
quantidade substancial de sacarose, sendo utilizado para a produção
industrial de etanol em países tropicais como o Brasil (MAITI et. al.,
2011). Além de possuir vitaminas e minerais, tais como, nitrogênio,
fosfatos, cálcio e magnésio, zinco, manganês, carbono, cobre e ferro
essenciais para a fermentação alcoólica e o melaço é considerado um
substrato de baixo custo (TOKASHIKI et al., 2011).
Durante o processo de fabricação de açúcar, são gerados subprodutos e
resíduos da produção, sendo que praticamente todos estes podem ser
aproveitados de maneira a aumenta os lucros da própria indústria e
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diminuir os custos de produção e impactos ambientais (MEZAROBA et
al., 2010).
O melaço ou mel final se constitui no principal subproduto da indústria
do açúcar, sendo produzido na proporção de 40 a 60 quilos por tonelada
de cana processada. No Brasil devido ao elevado teor de açúcares totais
e demais componentes, o melaço é utilizado, principalmente, na
fabricação do álcool etílico (ALCARDE, 2007)
A composição química tanto do caldo de cana quanto a do melaço,
dependem muito da cana utilizada, portanto, são extremamente
variáveis (MARQUES, 2008). A quantidade de nutrientes do melaço é
maior que a do caldo de cana. Isso pode ocasionar segundo Souza
(2009), o estresse induzido pelo aumento da osmolaridade externa,
levando a redução em crescimento e perda da viabilidade das células
das leveduras, devido às perturbações no gradiente osmótico através da
membrana plasmática.
O sulfito presente no melaço causa queda da viabilidade, números de
células, brotamento celular e queda na eficiência alcoólica via
reprodução de mais fermento para a reposição das perdas, aumento da
atividade tamponante do meio, maior consumo de ácidos e bases no
processo, e em casos mais graves, aumento exagerado na acidez do
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álcool produzido, além de aumentar a acidez do meio. Para evitar esses
problemas há a clarificação do melaço na indústria (NETO, 2012).
No processo industrial é feito o reciclo de células, ou seja, quando a
fermentação alcoólica termina, as leveduras são separadas do vinho
através de centrifugação, e são reutilizadas com o objetivo de reduzir
custos na reposição do fermento e melhores condições de operação,
devido que os micro-organismos não precisam do consumo de substrato
na fase de crescimento e já estão adaptados ao meio fermentativo
(LIMA, 2004).
Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo de avaliar a
eficiência alcoólica da fermentação com melaço de cana-de-açúcar após
reciclo de células, tomando a fermentação de caldo de cana (mosto)
como referência independente.
MATERIAL E MÉTODOS
Como substratos da fermentação foram utilizados: o melaço de cana-deaçúcar, o qual cedido por uma unidade industrial produtora de açúcar e
etanol do Estado da Paraíba, Brasil; caldo de cana de açúcar, adquirido
em comercio local, Recife-PE.
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Ensaio fermentativo
O ensaio fermentativo segue a metodologia proposta por de Silva Filho
et al. (2005), Vila Nova et al. (2009) e Barbosa-Neto et al. (2010). Para
avaliar a capacidade fermentescível do mosto de melaço, foi utilizado o
fermento liofilizado JP1, o qual foi ativado em solução salina durante
1h em estufa microbiológica. As fermentações tiveram duração de 6h
sendo mantida na temperatura de 33ºC. Os parâmetros físico-químicos
industriais e microbiológicos foram medidos antes e após a
fermentação.
Para determinar a viabilidade celular foi utilizada a
câmara de Neübauer. O teor de fermento foi padronizado a 10% em
todos os ensaios. Para o cálculo de rendimento e eficiência da
fermentação foi considerado a seguinte fórmula:
Rendimento = X/Y Eficiência = (rendimento/0,511)*100
X = gramas de etanol produzido
Y = gramas de glicose consumido
Determinação dos Açúcares Redutores Totais (ART) e Açúcar
Residual (AR), Potencial Hidrogeniônico (pH), °Brix e Teor
Alcoólico (Silva Filho et al., 2005; Barbosa et al., 2010)
Para determinação da quantidade de açúcar inicial (ART) e final (AR)
foi medida através do método do ácido denitrosalisílico (ADNS). Para o
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qual foi preparada uma curva de calibração com uma solução aquosa de
glicose na concentração de 2g/L com diluições de 0,5g/L, 1,0g/L,
1,5g/L e 2,0g/L. Para determinação do açúcar inicial foi utilizado um
alíquota do sobrenadante mosto, no qual foi adicionado 100µL de HCL
1M. Em seguida, adicionou-se 100µL de NaOH 1M e 1mL de reativo
ADNS. O volume foi completado para 10mL com água destilada e foi
procedida a leitura D.O. em comprimento de onda de 540nm. Quanto a
medida do açúcar residual, após 6h de fermentação, 40mL da
fermentação foi centrifugada durante 5 minutos para separar o vinho do
mosto fermentado, da biomassa. Em seguida 10µL do vinho foi diluído
em 990 µL de água destilada e adicionada 1mL de ADNS sem
aquecimento.
Posteriormente, foi feita a leitura da D.O em comprimento de onda de
540nm e a partir da curva de calibração da glicose e da respectiva
absorbância, efetuou-se a regressão linear e a correlação (R2). O cálculo
da quantidade de açúcares redutores totais foi realizado da seguinte
forma:
A540nmxdiluição da amostra =0,9465x ART (g/l) + 0,0164
O pH e o Brix foram medidos através de um pHmetro portátil e do
refratômetro respectivamente. O teor alcoólico foi determinado pela
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técnica de ebuliômetria, através do ebuliômetro modelo 3300. A partir
de uma curva de calibração com solução alcoólica nos tratamento de
0,0%, 2,5%, 5,0%, 10,0%, 15,0% e 20% foi possível determinar a
quantidade de álcool diluído (gEtOH/100mL) na amostra. Onde foi
obtida através da curva de calibração a seguinte equação, para medida
de etanol após a fermentação:
TºC = 1,0337x(ETOH(g/L)+102,81
Análises estatísticas
Os dados obtidos foram tratados estatisticamente independentemente
pela comparação das médias através da análise de variância (ANOVA)
e o teste-t pareado, considerando 95% de intervalo de confiança. A
eficiência fermentativa do caldo de cana e do melaço foram
corelacionadas por regressão linear.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
De forma global, pode-se representar a fermentação alcoólica pela
equação de Gay-Lussac. Na qual se observa que 1 mol de glicose
(180g) produz 2 moles de etanol (92g), 2 moles de dióxido de carbono
(CO2) (88g) e 57 kcal de energia (LEHNINGER et al., 2006). A Figura
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1 agrega estes dados que de modo geral apresentou correlação dos
valores observados com os valores esperados (teórico estequiométrico).
Entretanto no segundo reciclo celular do Melaço (Figura 1B) este
padrão estequiométrico não foi observado, que possivelmente mascarou
a análise de ANOVA e o teste-t pareado, não sendo observada diferença
significativa (p-value=0,168) entre o primeiro e segundo reciclo.
Quanto ao caldo de cana o reciclo demonstrou significativa influencia
na capacidade fermentescível do substrato (Figura 1A).
Figura 1. Monitoramento do consumo do substrato e formação de produtos de
fermentação (Etanol e CO2) durante os ensaios de reciclos. A) Fermentação do caldo
de cana-de-açúcar; B) Fermentação do Melaço.
A capacidade fermentescível dos substratos, surpreendentemente,
demonstrou que o melaço propiciou ao fermento condições ideal para
fermentação em relação ao caldo de cana, no qual não foram observadas
diferenças significativas entre os ensaios de reciclo (Figura 2A). O
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melaço deu suporte ao fermento até o segundo reciclo observando
diferença significativa entre o primeiro e segundo reciclo (p-value:
0,002) (Figura 2B). De modo geral, o melaço apresentou capacidade
fermentescível superior a observada nos ensaios de caldo de cana,
entretanto é observado em ambos os ensaios uma queda no segundo
reciclo, voltando a se recuperar no terceiro reciclo (Figura 2). Que
possivelmente pode estar relacionado a aclimatação do fermento.
Segundo Souza (2009), a quantidade de nutrientes do melaço é maior
que a quantidade de nutrientes da cana, podendo assim aumentar o
estresse induzido pelo desequilíbrio osmótico, ocasionado redução do
crescimento e perda da viabilidade, e como consequência tem-se uma
redução da eficiência fermentativa. Os resultados acima discutidos nos
mostra uma possível contrariedade a essa questão, pois o melaço teve
sua eficiência fermentativa relativamente boa nos reciclos e quanto o
caldo de cana não se pôde esperar o mesmo. Nesse caso o melaço foi o
melhor substrato para a fermentação.
A análise de regressão permitiu a significativamente a extração do
coeficiente de regressão linear, permitindo inferir modelos de estudo,
demonstrando alta correlação entre os ensaios. No entanto, este modelo
de regressão possuiu poucos dados de inferência não sendo aplicável
para análises de modelagem.
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Figura 2. Capacidade fermentescível dos substratos durante os ensaios de reciclo de
fermento. A) Cana de açúcar; B) Melaço.
Figura 3. Regressão linear simples da eficiência fermentescível do melaço contra do
caldo de cana.
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CONCLUSÃO
O presente trabalho permite concluir que, ambos os substratos não
influenciam a capacidade fermentativa da levedura, embora o primeiro
reciclo exerce pressão sobre o fermento, período de aclimatação. Os
ensaios de reciclo pouco influenciaram a eficiência e o rendimento da
fermentação. O melaço apresentou maior capacidade fermentescível,
comparada ao caldo de cana. O modelo estatístico proposto dá suporte
ao delineamento mais robusto com a mesma abordagem.
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