Universidade Federal do Ceará
Rede Nordeste de Biotecnologia
Analise Proteômica
MÉTODOS DE REVELAÇÃO
EM GÉIS E DETECÇÃO DE
IMAGENS NA ABORDAGEM
PROTEÔMICA
Erika B. de Menezes
Prof. Arlindo de Alencar A. Moura
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MÉTODOS DE REVELAÇÃO
EM GÉIS NA ABORDAGEM
PROTEÔMICA
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
 Propriedades desejáveis
 Faixa dinâmica de detecção;
 Sensibilidade;
 Linearidade;
 Reprodutibilidade;
 Compatível com espectro de massa;
 Baixa toxicidade;
 Baixo custo.
(Lópes, 2007)
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
 1 µg de Proteína
Revelação por Coomassie
Revelação pela Prata
(Lópes, 2007)
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
 Revelação por Azul Brilhante de Coomassie -
Coomassie Blue
 Revelação fluorescente (Sondas Moleculares)
 Sypro Ruby
 Eletroforese em gel diferencial – DIGE
 Revelação pela Prata
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REVELAÇÃO POR AZUL
BRILHANTE DE COOMASSIE
(COOMASSIE BLUE)
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REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE
COOMASSIE
 Azul Brilhante de Coomassie
 Composto aromático de caráter ácido
 Tingir lã
 “Tintura de Coomassie”
 1963
 Revelação de proteínas
(Fazekas de St. Groth et al., 1963)
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REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE
COOMASSIE
 CBB-R 250
 Aromático sulfatado, não polar
 Ácido acético e metanol
 Interações iônicas
 Interações secundárias
 Pontes de hidrogênio
 Interação de Van der Waals
 Interações hidrofóbicas (amônia sulfatada)
(Fazekas de St. Groth et al., 1963)
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REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE
COOMASSIE
 Ácido tricloroacético (TCA a 12,5%)
 Alta acidez e propriedade corrosiva
(Fazekas de St. Groth et al., 1963)
 Coomassie Blue (CBB-R 250)
  sensibilidade
(Merril, 1990)
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REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE
COOMASSIE
 CBB-G 250 (Coomassie Blue colloidal)
 Dimetilado  CCB-R
 20% de metanol
  [sulfato de amônio]
(Neuhoff et al., 1988)
 Pnt/CCB-G
 Não penetra na matriz apenas interage com
a pnts.
(Fazekas de St. Groth et al., 1963)
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REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE
COOMASSIE
  sensibilidade
 10 ng ptn/banda
(Brush, 1998)
 Formação do colóide
 Prolongou o tempo de coloração
 Metanol  etanol
 Tempo recomendado foi de pelo menos 24h
(Neuhoff et al. 1985)
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REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE
COOMASSIE
 Sulfato de alumínio
(Al2(SO4)3)
  a ligação do
corante as
(Kang et al. 2002)
proteínas
  Sensibilidade
A – Coomassie Blue
B- Coomassie Coloidal
*Sulfato de amônio + etanol
C- Prata
(Kang et al. 2002)
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REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE
COOMASSIE
 Coloração Azul
 Sulfona do Coomassie
 Amina das proteínas
(Reisner et al., 1975)
 Especificidade
 Proteínas
 Não requer separação prévia das Pnt e Aa.
(Fazekas de St. Groth et al., 1963)
(Chrambach et al., 1963)
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REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE
COOMASSIE
 Vantagens
 Intensa capacidade de coloração;
 Elevada solubilidade em géis de poliacrilamida e
agarose;
 Capacidade de distinção entre pnt e Aa.;
 Compatível com Espectro de Massa;
 Estável na forma sólida;
 Fácil manuseio;
 Baixo custo.
(Fazekas de St. Groth et al., 1963)
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REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE
COOMASSIE
 Limitações
 Fraca revelação das bandas;
 Pouco contraste com o gel levemente corado de
azul;
  Sensibilidade;
 50 a 100 x menos sensível que a prata;
  Faixa dinâmica de detecção.
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REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE
COOMASSIE
 Coomassie Blue G-250
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REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE
COOMASSIE
 Coomassie Blue G-250
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REVELAÇÃO FLUORESCENTE
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REVELAÇÃO FLUORESCENTES
 Revelações Sypro – Sondas moleculres
 Sypro Orange;
 Sypro Red;
1D SDS PAGE
 Sypro Tangerine;
 Sypro Ruby.
2D SDS PAGE
(Pathon et al., 2002)
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REVELAÇÃO FLUORESCENTES
 Sypro Ruby
 Coloração baseado em um quelato;
Cultura de Fibroblastos
(Berggren et al., 2000)
(Pathon et al., 2002)
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REVELAÇÃO FLUORESCENTES
 Sypro Ruby
 Protocolo simples;
 Glicoproteínas, lipoproteínas;
(Steinberg et al., 1996)
(Berggren et al., 2000)
 Compatível com EM;
 Marcador durante a FIE
(Steinberg et al., 2000)
 ½ vida longa – não foi alcançado aos 19’
 Mais resistente a foto clareador
(Berggren et al., 1999)
(Smejkal et al., 2004)
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REVELAÇÃO FLUORESCENTES
 Sypro Ruby
 Transiluminador UV
 300 nm
 Scanner a laser
 Typhoon
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REVELAÇÃO REVELAÇÃO POR
CORANTE FLUORESCENTES
 Vantagens
 Compatível com Espectro de massa (MALDI-TOF
MS);
 Identifica pequenas quantidade de ptn. ;
(Lopez, 2000)
  Limite dinâmico linear
  variabilidade entre géis;
 quando comparada com a prata
 Permite visualizar + 20% de spots
(Patton, 2000)
(Patton, 2002)
 Melhor reprodutibilidade;
 Reutilização para vários géis.
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REVELAÇÃO REVELAÇÃO POR
CORANTE FLUORESCENTES
 Limitações
 Elevado custo;
 Uso de equipamento sofisticado
 Scanner (Typhoon)
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REVELAÇÃO FLUORESCENTES
 Eletroforese em gel diferencial – DIGE
 Disponível em 1997
(Unlu et al., 1997)
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REVELAÇÃO FLUORESCENTE
26
REVELAÇÃO FLUORESCENTE
Cy3
controle
Cy5
Tratamento
(Unlu et al., (1997) (Issaq & Veenstra (2008)
27
27
REVELAÇÃO FLUORESCENTE
 Vantagem
 Menor tempo de analise;
 Elimina o problema de reprodutibilidade;
 Melhor comparação do perfil protéico entre
indivíduos;
 Maior acurácia nas comparações de proteínas de
diferentes amostras (95% de confiança)
 Alta sensibilidade.
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REVELAÇÃO FLUORESCENTE
 Limitações
 Dificuldade de cortar spots para analise posterior;
 Spots são visíveis por scanner específicos;
 Elevado custo.
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REVELAÇÃO PELA PRATA
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REVELAÇÃO PELA PRATA
 Laboratórios de histologia
 Géis de Poliacrilamida – Switzer et al., 1976
 Proteínas
(Merryl et al., 1976)
 Protocolos utilizados em 2D
 Nitrato de Prata
 Diamino de prata ou prata amoniacal [Ag(NH3)2]
(Haines et al., 1990)
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REVELAÇÃO PELA PRATA
 Depende da redução do íon prata  prata metálica (Ag0)
 (Ag  + elevado potencial de oxidação)
 Íons Ag interagem com grupos
 ácidos carboxílicos ( Asp e Glu), sulfidrilicos
(Cys), e aminas (Lys).
 Formando a prata metálica
(Haines et al., 1990)
 2 Ag(NH3)2+ + 2 HS-R  2 Ag0 + 4 NH3 + R-S-S-R + 2 H+
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REVELAÇÃO PELA PRATA
 Etapas
 1º fixação – insolubilização das proteínas no gel
e remover componentes de interferência (Glicina,
TRIS, SDS);
 2º Sensibilização
 3º Impregnação pela prata;
 4º Revelação
 Nitrato de Prata – Formaldeído, Carbonato e
tiosulfato
(Haines et al., 1990)
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REVELAÇÃO PELA PRATA
 Etapas
 4º Revelação
 Prata amoniacal – Formaldeído (agente
redutor) e ácido cítrico ( íons Ag livre)
 5º Lavagens
 Processo semelhante a revelação fotográfica.
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REVELAÇÃO PELA PRATA
 Prata amoniacal
 + contraste
 + sensibilidade
 + demorada
 Bandas ou spots
 Marrom ou preta
 Lipoproteínas
 Azul
 Glicoproteínas
 Vermelho
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REVELAÇÃO PELA PRATA
 Vantagens
 Sensibilidade
 100 x maior que o Coomassie
 Abordagem proteômica
 Pureza de uma ptn.
 Detectar pequena quantidade de ptn.
(Switzer et al., 1979)
(Haines et al., 1990)
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REVELAÇÃO PELA PRATA
 Limitações
 Necessita de muitas etapas
(Quadroni e James, 1999)
  Reprodutibilidade (~20% na intensidade de spots)
 Alguns íons de prata pode interferir na identificação
da ptn;
(Oses-Prieto et al., 2007)
 Não apresentar ponto de saturação.
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
Métodos
Sensibilidade
Características
Coomassie Blue R 250
50-100 ng
Compatível EM
Baixo custo
Coomassie Blue G 250
10 ng
Compatível EM
Fácil manuseio
Prata
1 ng
Alta sensibilidade
1 ng
Alta sensibilidade
Compatível EM
Necessita de
instrumento sofisticado
para aquisição de
imagens
Sypro Ruby
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DETECÇÃO DE IMAGENS
NA ABORDAGEM
PROTEÔMICA
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MÉTODOS DE DETECÇÃO DE IMAGENS
NA ABORDAGEM PROTEÔMICA
 Detecção das imagens
 Impossibilidade de se determinar visualmente a
intensidade de spots ou bandas individualmente;
 Interpretação de vários spots na 2D ser muito
laboriosa  computador;
 O grande volume de dados em laboratórios de
pesquisa  Avaliar, processar e salvar são
requeridos;

40
MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
 Detecção das imagens
 Impossibilidade de se determinar visualmente a
intensidade de spots ou bandas individualmente;
 Interpretação de vários spots na 2D ser muito
laboriosa  computador;
 O grande volume de dados em laboratórios de
pesquisa  Avaliar, processar e salvar são
requeridos. ;
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
 Detecção das imagens
 Impossibilidade de se determinar visualmente a
intensidade de spots ou bandas individualmente;
 Interpretação de vários spots na 2D ser muito
laboriosa  computador;
 O grande volume de dados em laboratórios de
pesquisa  Avaliar, processar e salvar são
requeridos;
 Criação banco de dados.
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
 Detecção das imagens
 Impossibilidade de se determinar visualmente a
intensidade de spots ou bandas individualmente;
 Interpretação de vários spots na 2D ser muito
laboriosa  computador;
 O grande volume de dados em laboratórios de
pesquisa  Avaliar, processar e salvar são
requeridos;
 Criação banco de dados.
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
 Eletroferograma
 Câmeras acoplada a um computador;
 Densicitometro;
 Scanners.
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
 Scanner de Mesa
 Alta performance;
 Fácil uso – rápido;
 Boa resolução;
 Baixo custo.
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
 Imagem Scanner III
 Alta resolução;
 Densidade Ótica ( 3.4);
 Resolução 100 e 600 dpi
 Géis - 150 e 300 dpi
 Revelações
 Coomassie Blue
 Prata
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
 Scanner de Mesa
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
 Scanner de tela de fósforo de armazenamento
 Técnica de autoradiografia
 > sensibilidade;
 Rapidez;
  limite linear dinâmico;
 Laser de HeNe
 633 nm
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
 Scanner fluorescentes
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
 Scanner de Múltiplo propósito
 Detecção fluorescente;
 Tela de fósforo de armazenamento;
 Quimiluminescência;
 ≠ comprimentos de ondas associados a ≠ filtros;
 Detectores são mais sensíveis
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
 Scanner de Múltiplo propósito
 Laser com ≠ comprimentos de ondas
 ≠ filtros
Westermeier, 2005
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
 Scanner de Múltiplo propósito
 Typhoon 9410
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
 Scanner de Múltiplo propósito
 ImageQuant LAS 4000
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MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA
ABORDAGEM PROTEÔMICA
Característica
Scanners
Máquina digital
Sensibilidade
Alta
Alta *
Resolução
Definido pelo software
que está lendo
Definido pelo tamanho da
amostra e pixel da
máquina
Analise quantitativa
A intensidade de luz
abrange toda superfície
Necessita de correções
Plano escuro e superfície
plana
* Mecanismo de resfriamento
54
Obrigada pela atenção...
[email protected]
55