When gaining is loosing: insights into the function of ataxin-3 and its perturbation
in the context of Machado-Joseph disease
Abstract
Ataxin-3 (ATXN3) is the protein involved in Machado-Joseph Disease (MJD), one of the nine
neurodegenerative disorders known to be caused by a polyglutamine (polyQ) expansion. This polyQ
tract causes the appearance of misfolded protein species, protein aggregates, neuronal dysfunction
and cell death. ATXN3 is known to interact with polyubiquitin chains and to have deubiquitylating
(DUB) activity in vitro, but its substrates and its cellular and physiological role(s) remain unknown,
specially in neurons. Since the leading hypothesis concerning the pathogenesis of MJD is that the
expanded polyQ tract confers a toxic gain of function of ATXN3, not much attention has been
dedicated to its normal function. However, it is believed that a partial loss of the normal function of
ATXN3 may also contribute to and modulate disease progression. This study was based on the idea
that understanding the normal physiological role of ATXN3 will be of relevance for our understanding
of the pathogenesis of MJD.
In this work, we explored the function of ATXN3 in neuronal cells and its perturbation in the context
of MJD. We found that ATXN3 is required for neuronal differentiation and for normal cellular
morphology, cytoskeleton organization, proliferation and survival. This phenotype is associated with
increased proteasomal degradation of alpha5-integrin subunit (ITGA5) and reduced activation of
integrin signaling. Interestingly, we show that silencing of ATXN3, overexpression of a catalytically inert
version of the protein or a mutant protein bearing an expanded polyQ tract led to partially overlapping
phenotypes, suggesting that a loss of the neuronal function of ATXN3 may be contributing to
neurodegeneration.
Consistent with a wider role of ATXN3 in the regulation of the cytoskeleton network, we found that
loss of function of ATXN3 also leads to a deregulation of tau expression, namely a deregulation of tau
exon 10 splicing. This event has a negative impact in neuronal morphology and differentiation.
Additionally, we found that ATXN3 interacts with SFRS7, a regulator of tau splicing, and regulates its
ubiquitylation levels. As similar alterations were found in the brain of a mouse model of MJD, it is likely
that this mechanism is contributing to pathogenesis of this disorder. Hence, this work establishes for
the first time a functional link between two key proteins involved in different neurodegenerative
diseases.
Lastly, we characterized the ubiquitome of neuronal cells lacking ATXN3 in an attempt to identify
potential substrates of its DUB activity. We found that a large proportion of these proteins were
involved in RNA posttranscriptional modification. Considering this, we analyzed by transcriptomic
analysis and using reporter minigenes the global splicing pattern in neuronal cells upon silencing of
ATXN3 and found that splicing was globally altered in these cells. These findings lead us to propose for
the first time that ATXN3 plays a role in splicing regulation in neurons, a novel function for this protein.
In summary, this work adds new knowledge about the relevance for neurons of one specific DUB,
ataxin- 3, and provides new clues about its biological functions and the pathways in which it is involved.
It reinforces ATXN3’s involvement with the UPP and it also raises new hypotheses for its role in
cytoskeleton organization and in splicing regulation. Additionally, it provides evidence for perturbation
of the normal function of ATXN3 in the context of disease, through a dominant negative effect, which
may have relevance for the development of future therapeutical strategies.
Candidate: Andreia Alexandra Neves de Carvalho
Supervisor: Patrícia Espinheira de Sá Maciel
Date: 1st December 2014
Locality: ECS/ICVS
Quando ganhar é perder: estudo da função da ataxina-3 e da sua perturbação no
contexto da Doença de Machado-Joseph
Resumo
A Ataxina-3 (ATXN3) é a proteína envolvida na Doença de Machado-Joseph (DMJ), uma das nove
doenças neurodegenerativas que se sabe serem causadas por uma expansão de poliglutaminas
(poliQ). Este trato de poliQ causa o aparecimento de espécies proteicas com uma conformação
anormal, agregados proteicos, disfunção neuronal e morte celular. A ATXN3 interage com cadeias de
poliubiquitina e tem atividade de ubiquitina hidrolase (DUB) in vitro, mas os seus substratos e a(s)
sua(s) função(ões) fisiológica(s) permanecem desconhecidos, especialmente em neurónios. Dado que
a hipótese actualmente mais aceite relativa ao mecanismo patogénico da DMJ considera que o trato
de poliQ expandido confere um ganho tóxico de função à ATXN3, não tem sido dedicada muita atenção
à sua função normal. Contudo, acredita-se que a perda parcial da função normal da ATXN3 também
pode contribuir e modular a progressão da doença. Este estudo baseou-se na ideia de que conhecer a
função fisiológica normal da ATXN3 será relevante para conseguirmos compreender a patogénese da
doença. Neste estudo, explorámos a função da ATXN3 em neurónios e a sua perturbação pela
expansão poliQ em DMJ. Descobrimos que a ATXN3 é necessária para a diferenciação neuronal e para
a normal morfologia celular, organização do citosqueleto, proliferação e sobrevivência. Este fenótipo
está associado a um aumento da degradação da subunidade 5-alpha da integrina (ITGA5) pelo
proteossoma e uma ativação diminuída da sinalização pela via das integrinas. Curiosamente,
demonstrámos que o silenciamento da ATXN3, a sobreexpressão de uma versão cataliticamente inerte
da proteína ou de uma proteína mutante contendo um trato de poliQ expandido conduzem a fenótipos
parcialmente sobreponíveis, sugerindo que a perda da função neuronal da ATXN3 pode contribuir para
a neurodegeneração. De forma consistente com um papel mais abrangente da ATXN3 na regulação da
organização do citosqueleto, descobrimos que a perda de função da ATXN3 também origina uma
desregulação da expressão da tau, nomeadamente uma desregulação do splicing do exão 10 da tau
em células neuronais. Este evento tem um impacto negativo na sua morfologia e diferenciação. Além
disso, descobrimos que a ATXN3 interage com o SFRS7, um factor regulador do splicing da tau, e regula
os seus níveis de ubiquitilação. Considerando que alterações semelhantes foram encontradas no
cérebro do modelo de DMJ em ratinho, este mecanismo parece contribuir para a patogénese. Este
trabalho estabelece assim, pela primeira vez, uma ligação funcional entre duas proteínas chave
envolvidas em diferentes doenças neurodegenerativas. Por fim, caracterizámos o ubiquitoma de
células neuronais silenciadas para a ATXN3, com o objectivo de identificar potenciais candidatos para
a sua atividade DUB. Concluímos que uma grande proporção destas proteínas estão envolvidas na
modificação pós-transcripcional do RNA. Tendo este dado em consideração, analisámos o padrão
global do splicing por análises de transcriptómica e usando minigenes repórteres, e descobrimos que
o splicing estava globalmente afetado nestas células. Estes achados levaram-nos a propor pela
primeira vez que a ATXN3 desempenha um papel na regulação do splicing em neurónios, uma nova
função para esta proteína.
Em sumário, este trabalho amplia o conhecimento acerca da relevância para os neurónios de uma
DUB específica, a ataxina-3, e fornece indicativos sobre as suas funções biológicas e as vias celulares
onde está envolvida. Além disso, reforça o envolvimento da ATXN3 com a UPP, levantando também
novas hipóteses para o seu papel na regulação do citosqueleto e na regulação do splicing.
Adicionalmente, são apresentadas evidências para a perturbação da função normal da ATXN3 no
contexto da doença através de um efeito dominante negativo, facto que poderá ser relevante para o
desenvolvimento de futuras estratégias terapêuticas.
Candidata: Andreia Alexandra Neves de Carvalho
Orientadora: Patrícia Espinheira de Sá Maciel
Data: 1 Dezembro 2014
Local: ECS/ICVS