DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Cap. 15 Karp
Rodopsina
proteína sensível
à luz
1
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2
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Os sinais chegam vindos de…
3
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“Nenhum homem é uma ilha” - John Donne
Ligando extracelular
Local de contacto
célula-célula
1. Reconhecimento do sinal
2. Transferência do sinal
Tradução/conversão do sinal
Citoesqueleto
3. Resposta ao sinal
4. Fim do processo de resposta
(mecanismos de controlo)
Matriz extracelular
4
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1. Transmissão do sinal
. Nem toda a informação é transmitida do espaço extracelular
via receptor na superfície da célula
Por exemplo: Hormonas esteróides actuam por difusão através
da
membrana
plasmática
e
ligam-se
a
um
receptor
no
citoplasma
Alguns agentes induzem uma resposta directa sem terem de
iniciar um sinal no interior da célula - acetilcolina
5
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3. Resposta ao sinal
. Activação enzimática
. Alteração da organização do citoesqueleto
. Alteração da permeabilidade aos iões
. Activação da síntese de DNA
. Activação da síntese de RNA
. Morte celular
6
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3. Resposta ao sinal
A comunicação (sinalização) celular
afecta todos os aspectos da
Estrutura e Função Celular
Regulação do crescimento
e divisão celular
Como a célula perde o controlo do crescimento
e se converte numa célula tumoral?
7
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4. Fim da resposta
. Destruição ou inactivação das
moléculas-sinal
A comunicação (sinalização) celular
afecta todos os aspectos da
. Diminuição do nível do estímulo
extracelular
(concentração
Estrutura e Função Celular
da
molécula - sinal)
8
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2. Tradução/conversão do sinal
Sinal recebido na superfície celular é diferente do sinal transmitido
ao interior da célula
Vias de sinalização compostas por diferentes proteínas e que
funcionam por:
• Alteração da conformação da proteína substrato, activando
ou inactivando essa proteína substrato
• Substratos: enzimas, canais iónicos, factores de transcrição
ou vários tipos de unidades de regulação
9
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Via G proteínas
cinases
fosfatases
Receptores de
cinases
de Tyr
cinases
fosfatases
10
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Tradução/conversão do sinal
Activação ou inactivação ocorre através da adição ou remoção de
grupos fosfato
Cinases (adição de fosfato)
Fosfatases (remoção de fosfato)
solúveis ou membranares
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Via de sinalização
Cinases e Fosfatases
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Via de sinalização -
Proteínas G
Proteína
substrato
inactiva
Pi
GDP
GTP
GTP
Proteína
Substrato
activa
Proteína G
activa
Proteína G
inactiva
Transmissão
de sinal
Pi
As
alterações
induzidas
conformacionais
permitem
ligação
específica a determinado substrato
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Proteína G
inactiva
Proteína
substrato
inactiva
GDP
13
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Proteínas G
– ligam o nucleótido guanina (ON/OFF)
Proteínas que ligam GTP
Estado activo, GTP ligado
Estado inactivo, GDP ligado
Especificidade de ligação a proteínas alvo
Proteína-GTP
activa uma proteína alvo
Proteína-GDP
(por hidrólise de GTP em GDP)
separa-se da proteína alvo
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Via de sinalização -
Proteínas G
O ciclo de proteínas G activas e inactivas é
auxiliado por proteínas acessórias que
regulam a sua actividade:
- GEFs, factores trocadores do nucleótido
guanina
- GAPs, proteinas activadoras – GTPase
- GDIs, inibidores da dissociação do
nucleótido guanina
15
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Receptor
Efector
Estímulo
(ligando)
Efector
activado
Tradução/conversão
do sinal
Proteína G
Via receptores acoplados a G proteínas
Sinal
1.
A ligação de um ligando ao receptor,
activa uma G-proteína. O sinal é
produzido por uma proteína efectora
activada
Via receptores de cinases de Tyr
1.
Sinal
Efectores
Estímulo
(ligando)
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activação directa da actividade
enzimática associada ao próprio receptor
Efector
activado
Receptor
cinase
activo
A ligação de um ligando cria o sinal por
(cinase)
Receptor
inactivo
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Receptores acoplados a
G-proteínas
e
Segundos Mensageiros
17
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18
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Segundos Mensageiros
Substância
libertada
no
citoplasma
após
ligação
do
primeiro
mensageiro (hormona) a um receptor específico na superfície da
célula
Ligam-se a diferentes moléculas, induzindo diferentes tipos de
respostas
Efeito de cascata (amplificação do sinal)
Ligação de uma hormona gera diversos segundos mensageiros
gerando respostas múltiplas
19
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Segundos Mensageiros
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Segundos Mensageiros
AMPc sintetizado por:
Proteína integral com local
activo
no
interior
da
membrana
21
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sinalização
sinalização
sinalização
sinalização
sinalização
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Via de sinalização -
Proteínas G
Segundos Mensageiros
Glucagon
Proteína com 29 aas
Adenilciclase
Epinefrina
Amina hidrofílica
2 receptores
diferentes, mas da
mesma família
(GPCRs)
Receptores acoplados
a G-proteínas
GTP
Mensageiros
secundários
intracelulares
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Via de sinalização -
Proteínas G
Segundos Mensageiros
Um
receptor
activado
pode
activar várias G-proteínas – 1º
passo activação
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Via de sinalização -
Proteínas G
Segundos Mensageiros
Também as sub-unidades Gβ podem
ligar-se a várias proteínas efectoras
como canais iónicos
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Via de sinalização -
Proteínas G
Segundos Mensageiros
adenilciclase
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Via de sinalização -
Proteínas G
Segundos Mensageiros
27
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Via de sinalização -
Proteínas G
Segundos Mensageiros
28
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Via de sinalização -
Proteínas G
Segundos Mensageiros
29
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Via de sinalização -
Proteínas G
Terminar a resposta
de sinalização
Fosforilação
Por uma cinase específica do receptor
acoplado a G-proteína
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Via de sinalização -
Proteínas G
Segundos Mensageiros
Terminar a resposta
de sinalização
Receptores - Arrestina
Ligam-se à clatrina
(vesículas de transporte)
e sofrem endocitose
“Paragem” da activação
Inactivação do receptor, por
remoção da sensibilização
Desfosforilados
Destruídos
e
Voltam à membrana
31
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Via de sinalização -
Proteínas G
Terminar a resposta
de sinalização
A -subunidade
Velocidade
de
hidrólise
de
GTP
e
correspondente inactivação
Este
processo
é
regulado
por
uma
proteína GAP que aumenta a eficiência
da hidrólise
Reassociar-se às outras subunidades
32
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Terminar a resposta
de sinalização
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Inibição da activação
1-
Remoção
pelas cinases:
de
fosfatos
adicionados
fosfatase 1
2- Remoção enzimática do AMPc do
citoplasma
(Fosfodiesterase
AMPc)
33
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do
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Via de sinalização -
Proteínas G
Segundos Mensageiros
A
toxina
-subunidade,
GTPase
assim
no
a
da
cólera
inibindo
epitelio
a
actua
actividade
intestinal
adenilciclase
sempre
na
de
mantendo
activada,
levando à perda de grandes volumes de água
para o lúmen do intestino.
AMPc
AMPc
AMPc
AMPc
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The Actions of Cholera Toxin
When cholera toxin is released from the
bacteria in the infected intestine, it binds to the intestinal cells known as
enterocytes (epithelial cell in above diagram) through the interaction of the
pentameric B subunit of the toxin with the GM1 ganglioside receptor on the
intestinal cell, triggering endocytosis of the toxin. Next, the A/B cholera toxin
must undergo cleavage of the A1 domain from the A2 domain in order for A1 to
become an active enzyme. Once inside the enterocyte, the enzymatic A1
fragment of the toxin A subunit enters the cytosol, where it activates the G
protein Gsa through an ADP-ribosylation reaction that acts to lock the G
protein in its GTP-bound form, thereby continually stimulating adenylate
cyclase to produce cAMP. The high cAMP levels activate the cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator (CFTR), causing a dramatic efflux
of ions and water from infected enterocytes, leading to watery diarrhoea.
One area of anti-diarrhoea treatment
lies in the stimulation of enkephalins, which regulate intestinal secretion by
acting directly on enterocytes. Enkephalins bind to the opioid receptors on
enterocytes, which act through G proteins to inhibit the stimulation of
cAMP synthesis induced by cholera toxin, thereby directly controlling ion
transport.
35
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Concentração das hormonas no sangue
- baixa (10-8 M)
- amplificação torna o sistema de comunicação muito eficaz
AMPc
AMPc
AMPc
AMPc
AMPc
AMPc
AMPc
AMPc
AMPc
AMPc
AMPc
Activa
Activa
Activa
Activa
P
Activa
P
Activa
P
Activa
P
Activa
P
Activa
P
Activa
P
Activa
P
P Activa
Activa P
P
AMPc
P
36
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P
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38
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39
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Respostas mediadas
por AMPc
Membrana plasmática
(Transporte)
Microtúbulos
Cinase
Formação
de lipidos
Sintetase
do glicogénio
RE (Síntese
Cinase
Cinase da
Fosforilase
de proteínas)
Cinase
Fosforilase
(degradação
de glicogénio)
Núcleo (síntese de
DNA, síntese de RNA)
40
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Respostas mediadas por
AMPc
Proteína Cinase A
41
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Respostas mediadas por
AMPc
Cinase A
42
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43
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46
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Segundos mensageiros derivados de lipidos
Os fosfolipidos são convertidos numa grande variedade
de segundos mensageiros, por acção de fosfolipases
Envolvidas em sinalização
47
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Segundos mensageiros derivados de lipidos
Respostas mediadas por inositolfosfato
(derivado do fosfatidilinositol - PI).
A activação também é feita via G-proteína
Acetilcolina
ligação ao músculo esquelético induz a sua contracção
Antigénio
ligação ao mastócito estimula secreção de histamina
48
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Segundos mensageiros derivados de lipidos
PI – fosfatidilinositol
PI(4)P- PI-4-fosfato
PI(4,5)P2 – PI-4,5-bifosfato
PI-PLC – fosfolipase C especifica
de PI
IP3- inositol 1,4,5-trifosfato
DAG- diacilglicerol
PKC – proteína cinase C
49
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Diacilglicerol (DAG)
• Permanece na membrana
• Activa proteína cinase C (PKC) que fosforila resíduos
treonina e serina em proteínas alvo
PKC
Crescimento e diferenciação celular
Metabolismo celular
Activação da transcrição
50
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Inositolfosfato (IP3)
O receptor (tetramérico) do IP3
é um canal de cálcio (também um
mensageiro secundário)
• Difunde para o citoplasma
• Liga-se ao receptor específico no REL
(armazenados iões Ca2+)
• Canal de cálcio tetramérico
• Abertura do canal de Ca2+
• Libertação de Ca2+ para o citoplasma
51
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Inositolfosfato (IP3)
O receptor (tetramérico) do IP3
é um canal de cálcio (também um
mensageiro secundário)
• Células musculares lisas (vasos sanguíneos)
• Células musculares lisas (estômago)
• Músculo esquelético
52
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53
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54
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Cálcio
Segundos Mensageiros
•
•
•
•
•
•
•
Divisão celular
Secreção
Endocitose
Fertilização
Transmissão sináptica
Metabolismo
Movimento celular
Níveis citoplasmáticos de cálcio
• são mantidos baixos
• membrana impermeável
• sistemas de transporte removem cálcio do
citoplasma
• canais iónicos ou transportadores de Ca2+
(Exemplo: Receptores de IP3)
55
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Cálcio
Fura-2, liga Ca2+
56
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Cálcio
A concentração
regulada:
de
Ca2+
é
- por transportadores de Ca2+
- por canais de Ca2+
Em
células
musculares
esqueléticas
aumentam
os
níveis de cálcio após potencial
de acção
Não respondem a IP3
Respondem quando
Ca2+ passam no canal
Receptores
Rianodine
(RyRs), pois ligam o alcalóide
vegetal.
Cálcio induz libertação de
cálcio - CICR
57
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alguns
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Cálcio
Respondem quando alguns Ca2+ passam
no canal
Cálcio induz libertação de cálcio (CICR)
A
cafeína
diminuí
a
sensibilidade destes receptores
ao cálcio
Aumenta no entanto a resposta
à abertura via CICR tornando as
células mais excitáveis
Receptores Rianodine (RyRs), pois
ligam o alcalóide vegetal.
58
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Segundos Mensageiros
Cálcio
pode afectar
Proteínas cinase dependentes de cálcio
Outras proteínas efectoras
Activar ou inibir sistemas de transporte
Alterar a permeabilidade da membrana
Induzir fusão de membranas
Alterar a estrutura e função do citoesqueleto
Não tem efeito sozinho
Acoplado a proteínas
calmodulina
ligadoras
de
cálcio,
59
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ex:
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Cálcio
Calmodulina
Baixa afinidade por cálcio
Quando o cálcio aumenta após estímulo, liga
cálcio e aumenta a sua afinidade (pois sofre
alteração
conformacional)
para
vários
efectores
Dependendo da célula pode ligar-se a:
- proteína cinase
- fosfodiesterase do cAMP
- canais iónicos
- transportadores de cálcio
(para regular a concentração de cálcio)
60
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Receptores com actividade
intrínseca de cinase de Tyr
61
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Receptores de cinase
de tirosina
(receptores com
actividade intrínseca)
Domínio ligador de
fosfotirosina
62
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Receptores de cinase de tirosina
(receptores com actividade intrínseca)
63
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Receptores de cinase de tirosina
(receptores com actividade intrínseca)
Mecanismo de acção de receptores dependentes da insulina
Controlo do crescimento celular e diferenciação
Transfere grupos fosfato para:
- a β-subunidade (autofosforilação)
- família de proteínas solúveis (substratos do receptor de insulina – IRSs)
64
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Receptores de cinase de tirosina
(receptores com actividade intrínseca)
Receptores dependentes da insulina (RTKs)
Apenas fosforilam substratos cujas
tirosinas estejam incluídas numa
determinada sequências de resíduos
- motivos
tirosinas (MFT)
de
fosforilação
de
Esta actividade depende ainda de
proteínas (domínios SH2) com grande
afinidade por ligar proteínas com MFT
O IRS depois de fosforilado actua como
estação de ancoragem e liga outras
proteínas com SH2
cinase
65
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Receptores dependentes da insulina (RTKs)
Receptores de cinase de tirosina
(receptores com actividade intrínseca)
66
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Receptores dependentes da insulina (RTKs)
Receptores de cinase de tirosina
(receptores com actividade intrínseca)
Proteína cinase B
67
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Receptores de cinase de tirosina
(receptores com actividade intrínseca)
Estimulador do crescimento
celular e proliferação
Ras -
Oncogene viral
Vírus que induzem células normais a tornarem-se
malignas
Faz parte do genoma humano normal
30% de tumores humanos apresentam uma forma
alterada do gene ras
O gene ras dá origem à proteína Ras (uma G
proteína monomérica)
Com o gene ras alterado a proteína não hidrolisa
o GTP e portanto a célula está sempre activa,
sempre em proliferação.
68
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Receptores de cinase de tirosina
(receptores com actividade intrínseca)
Receptores dependentes da insulina (RTKs)
A diabetes de tipo 2
Resistência das células à insulina
Terapêutica baseada em inibidores da fosfatase
dos receptores
69
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Receptores de cinase de tirosina
Receptores dependentes da insulina (RTKs)
(receptores com actividade intrínseca)
Trocador de nucleotido
70
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Receptores de cinase de tirosina
(receptores com actividade intrínseca)
Factor Transcrição
Proliferação celular
e
regulação do ciclo celular
MAP – mitogen-activated protein kinase. Activa factores estimuladores/reguladores da mitose
71
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Convergência
divergência e
cruzamento
GrB2
É uma molécula adaptadora que liga
outras proteínas no complexo
Liga a Sos
É um trocador do nucleótido de
guanina (Ras-GEF)
O complexo vai activar
converte-se em cinase)
72
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Raf
(e
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73
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Convergência, divergência e cruzamento
Factores de crescimento:
- (EGF) factor epidérmico de crescimento
- (PDGF) factor do crescimento derivado das plaquetas
- (FGF) factor do crescimento de fibroblastos
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MAP – cinase activada por factores de
crescimento estimuladores da mitose
74
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Proteína Cinase A
(PKA)
e AKAPs
(proteínas de ancoragem a PKA)
Como células diferentes respondem a PKA?
75
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76
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Ligação ao substrato
77 in vitro
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 Estruturas dinâmicas que podem alterar-se rapidamente se
a célula receber sinalização para se mover ou entrar em
mitose.
 Resultam da interacção da INTEGRINA com o material
extracelular da placa de cultura e o seu citoesqueleto FILAMENTOS de ACTINA.
78
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Comunicação via contacto célula substrato
INTEGRINAS
Envolvidas na comunicação entre o meio
extracelular e regulação de actividades nas
células
Sinalização:
- Libertação de Ca2+
-Síntese de mensageiros 2ºs derivados de
lípidos
- Fosforilação de tirosinas
Crescimento, migração,
diferenciação
e
sobrevivência
79
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Comunicação via contacto célula substrato
INTEGRINA
Paxilin
- Uma cinase da tirosina
- Activa uma outra cinase
Cinase das adesões focais-(FAK)
Resíduos de fosfotirosina
(a vermelho)
+
Microfilamentos de actina
(a verde)
80
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Comunicação via contacto célula substrato
Células não estimuladas
Via integrinas e
G-proteína (Rho)
Células estimuladas e
formação de
adesões focais
81
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Comunicação via contacto célula substrato
Convergência,
divergência e
cruzamento
Genes promotores do
crescimento
82
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Também S-nitrosilações de proteínas
Sildenafil
VIAGRA
Inibidor da Fosfodiesterase (PDE5)
do cGMP
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- Também
presentes
entre
as
células
endoteliais que delimitam as paredes dos
capilares.
- Presentes no cérebro formando a barreira
hemato-encefálica.
- As células do sistema imunitário usam
esta barreira para passar, pois possuem
sinalização adequada para abrir estas
oclusões.
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- Especializadas na comunicação intercelular.
- Disseminadas em tecidos epiteliais, células do
músculo cardíaco, liso e neurónios.
- Compostas por uma proteína integral –
CONEXINA.
- Estas uniões põem em contacto estreito o
citoplasma de várias células. Permite a passagem
de AMPc e inositol fosfato, envolvidos na
sinalização celular.
- A sinalização recebida por uma célula passa
rapidamente para todas as células. 85
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