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• As vias biossintéticas das células eucarióticas são constituídas
por estruturas membranares que realizam as funções de:
- Síntese, modificação
- libertação/transporte de proteínas solúveis e proteínas
membranares, para o seu destino
•Vesículas
• 50 a 75 nm
• Origem: individualização das saliências
de membranas dadoras
• Fim: fusão com membranas receptoras
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Vesículas
Apresentam na sua superfície proteínas que:
- funcionam como um mecanismo molecular que leva
ao encurvar da membrana e formar a vesícula
são
um
mecanismo
para
componentes a ser transportados
selecção
dos
- intervêm no mecanismo molecular para direccionar
a vesícula e para a ancorar à membrana alvo
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COP II –(RER)
Golgi
COP I –(Golgi)
RER
Vesículas com clatrina –(TGN)
destino final
(endossomas, lisossomas)
COP – “coat protein”
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COP II – RER
Golgi
As vesículas COP II contém
proteína com 5 subunidades
Anticorpos
contra
estas
proteínas
impedem
a
formação das vesículas mas
não têm efeito no transporte
das vesículas
Estas vesículas são capazes
de
seleccionar
adequado
o
para
material
ser
transportado
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As proteínas de cobertura ligam-se a
sequências
domínios
sinal,
citosólicos
localizadas
nos
de
proteínas
das
proteínas
integrais do RE
O
terminal
integrais
A proteína Sar
proteínas
luminal
(transmembranares)
solúveis
(proteínas
ligam
de
secreção) no lúmen do RE
- Liga GTP (guanosina trifosfato)
- Apresenta função reguladora (formação e desorganização das vesículas)
A forma inactiva contém GDP ligada. A troca de GDP por GTP, activa Sar e promove a sua
ligação à membrana do RE
A ligação de Sar permite a ligação das outras proteínas de “cobertura” e posteriormente a
formação da vesícula com “cobertura” COP II
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A proteína Sar
- Liga GTP (guanosina tri-fosfato)
- Apresenta função reguladora (formação e desorganização das
vesículas)
Antes da fusão das vesículas COP II com a membrana alvo, é necessário a
desorganização dos componentes membranares de cobertura da vesícula e
libertação destes no citoplasma
Pensa-se que a desorganização é desencadeada pela hidrólise da molécula de
GTP e consequente produção da subunidade Sar-GDP, que possui menor
afinidade pela membrana da vesícula
Após a dissociação da Sar-GDP da membrana, ocorre a libertação das outras
proteínas de cobertura das COP II.
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Estas vesículas foram descobertas em
células tratadas com moléculas análogas
à
Golgi
RER
GTP,
mas
que
não
podem
ser
hidrolisadas.
Nestas condições as vesículas COP I
acumulam-se nestas células tratadas e
podem ser isoladas por centrifugação em
gradiente de densidade
Evidenciando que também estas vesículas
contém proteína capaz de ligar GTP
(ARF1) e que é necessário hidrolisar
GTP para promover a desorganização das
proteínas de cobertura
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Retenção e Retorno de Proteínas Residentes
Se as vesículas se formarem continuamente a partir dos compartimentos membranares
então como será possível manter a composição desse compartimento?
O que determina que uma determinada proteína permaneça no RE ou prossiga para o
complexo de Golgi?
As proteínas permanecem num determinado compartimento por:
- retenção das moléculas residentes que são excluídas das vesículas
de transporte (integrando grandes complexos de difícil incorporação
em vesículas)
- retorno das moléculas “que escaparam”, para o compartimento onde
normalmente residem
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Retenção e Retorno de Proteínas Residentes
Proteínas residentes no RER (lúmen e membranares) possuem
sequências sinal no C-terminal que servem como - Sinais de
Retorno, que asseguram o seu regresso ao lúmen do RE
A dissulfeto isomerase e chaperones (proteínas solúveis no RE)
possuem a sequência Lys-Asp-Glu-Leu ou KDEL no C-terminal.
O receptor da PRS (proteína de reconhecimento de sinal, proteína
membranar) possuí no C-terminal uma sequência sinal de retorno –
KKXX, (K=Lys e X=qualquer aminoácido)
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O retorno das proteínas é realizado
quando as proteínas solúveis do RE
se ligam ao receptor da sequência
KDEL
(inserido
na
membrana
do
compartimento cis-Golgi)
(ARF1)
O receptor de KDEL vai ligar-se às
proteínas de cobertura das COP I, e
todo o complexo volta para o RE.
O receptor possui a sequência KKXX,
pois é uma proteína integral
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Como uma determinada proteína, sintetizada no
RE
é
dirigida
para
um
destino
celular
específico?
A escolha das proteínas sintetizadas e modificadas ocorre no
TGN (Trans Golgi Network) e é também este compartimento
o responsável pela produção das vesículas de clatrina
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Estas vesículas possuem:
- uma estrutura externa constituída
pela proteína clatrina
- uma estrutura interna composta por
um complexo de proteínas designadas por –
adaptador.
O complexo clatrina-adaptador liga-se a
um receptor membranar específico para o
composto a ser transportado
Estas interacções permitem que
materiais específicos do lúmen do
TGN
fiquem
concentrados
nas
vesículas de clatrina
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Papel das vesículas de clatrina
Funciona como
sequência sinal
(manose-6-fosfato)
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• Síntese em ribossomas no RER
• Fosforiladas no complexo de Golgi : adição de Pi à manose
da cadeia de açucares da N-glicosilação
• Fosforilação (sinal de reconhecimento)
• receptores de manose-6-fosfato (MPRs) são proteínas
membranares concentradas nas projecções de clatrina
do TGN. Interagem com as proteínas lisossomais (lúmen) e
com os adaptadores (citoplasma)
• Receptores
desligam-se
das
proteínas
próximo
dos
lisossomas
• Receptores retornam ao TGN para nova carga
• Existem MPRs na membrana plasmática que ligam proteínas
lisossomais do espaço extracelular
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Endereçamento das vesículas para
compartimentos específicos
Fusão Membranar
1. As vesículas deslocam-se
ligadas a microtubulos
2.
Proteínas
fibrosas
que
estabelecem o 1º contacto
entre a vesícula e a
membrana
alvo,
via
proteínas Rab que ligam
GTP e que contribuem para
a especificidade da ligação
3.
A ancoragem por uma
grande família de proteínas
integrais – SNARE.
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Endereçamento das vesículas
para compartimentos específicos
Fusão Membranar
A fusão
selectiva
garante
endereçamento correcto
o
Proteínas SNARE
(envolvidas no transporte vesicular)
v-SNARE
(sinaptobrevina)
(localizadas nas membranas das
vesículas)
• t-SNARE
(Syntaxin e SNAP-25)
(localizadas
em
receptoras
de
compartimentos)
membranas
diferentes
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Endereçamento das vesículas para compartimentos específicos
Fusão Membranar
Uma v-SNARE numa vesícula
do RE apenas deve interagir
com
uma
t-SNARE
das
cisternas cis Golgi, e não com
uma t-SNARE na membrana
lisossomal
Recentemente foi verificado
que
as
proteínas-GTP
Proteínas Rab- possuem um
efeito de regulação no processo
de fusão membranar
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Mecanismo de fusão membranar
Vesículas de neurotransmissores
A ligação da vesícula à membrana alvo é iniciada
pela ligação do domínio citosólico da v-SNARE ao
domínio citosólico do complexo t-SNARE/SNAP25
Formando um complexo enrolamento dos domínios
em hélice alfa das proteínas intervenientes
Uma proteina Rab (ligadora
de
GTP)
presente
na
membrana da vesícula pode
SNAP 25
funcionar como reguladora
ajudando
o
processo
de
fusão membranar
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Mecanismo de fusão membranar
Vesículas de neurotransmissores
A formação do complexo de fusão necessita da
interacção das proteínas t-SNARE e v-SNARE e
hidrólise de ATP
No entanto o processo da fusão das duas membranas ainda
não se encontra complemente esclarecido
No passo 4 e após fusão os complexos t-SNARE/vSNARE/SNAP25 devem dissociar-se para que estas
proteínas possam catalisar passos posteriores de
fusão
Em 5) novas vesículas contendo v-SNARE são
formadas e retornam às membranas dadoras
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Mecanismo de fusão membranar
Vesículas de neurotransmissores
T-SNARE
(Syntaxin e SNAP-25)
V-SNARE
(sinaptobrevina)
Hipotético
domínio
membranar
Modelo de interacção
entre v e t-SNARE
conduzindo à fusão
membranar
NSF promove o
desenrolamento das SNAREs
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Mecanismo de fusão membranar
Vesículas de neurotransmissores
A toxina do tétano e do botulismo
actuam como proteases das
SNAREs
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HA1 (3)
Fusão membranar
Fusão do vírus influenza
com células animais
HA1 (3)
A membrana de uma partícula viral, funde-se com a membrana do endossoma (que a envolve)
No caso do vírus da influenza, o pH acídico do endossoma causa alterações conformacionais
na glicoproteína de cobertura do vírus (HA-hemaglutinina), expondo péptidos de fusão muito
hidrofóbicos, os quais são inseridos no interior da membrana das vesículas endocíticas
A inserção de várias HA activadas, conduz à fusão do vírus com as membranas do
endossoma, num processo conduzido por vários outros intermediários.
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Fusão membranar
Fusão do vírus influenza
com células animais
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Fusão membranar
Fusão do vírus influenza
com células animais
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Fusão membranar
Fusão do vírus influenza
com células animais
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Fusão membranar
Fusão do vírus influenza
com células animais
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Um
percursos
dos
finais
do
transporte celular
A libertação dos produtos de secreção
(grânulos
de
membranar
secreção)
(entre
a
requer
fusão
membrana
do
grânulo e a membrana plasmática)
A
fusão
das
membranas
cria
uma
abertura (poro de fusão) permitindo a
libertação do conteúdo do grânulo para
o espaço extracelular – exocitose.
Este processo é desencadeado por um
aumento local de Ca2+.
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A face luminal da membrana da
vesícula integra-se na superfície
externa da membrana plasmática
A face citosólica
da
vesícula
da membrana
integra-se
na
superfície interna da membrana
plasmática
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Modelo de fusão de membranas
As proteínas de cada uma das membranas
em fusão entram em contacto
E formam um poro que pode dilatar-se
As
bicamadas
membranas
de
lípido
fundem-se
das
assim
que
duas
as
moléculas de lípido se difundem ao longo
das superfícies hidrofóbicas criadas entre
as proteínas (de fusão) que delimitam o
poro de fusão
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Organitos Digestivos
Possuem
50
ou
mais
enzimas
hidrolíticas: fosfatases, nucleases,
proteases,
(colagenases),
polissacaridases, enzimas lipolíticas,...
Os produtos de baixo MW, resultantes da
digestão podem ser transportados através
da membrana lisossomal, para o citoplasma
Todas as enzimas lisossomais são activas a
pH acídico (4.6) -hidrolases acídicas.
Este pH é mantido
presente nas membranas
por
H+-ATPase
A membrana é protegida do ataque
proteolítico pois possui proteínas
integrais acídicas e muito glicosiladas
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A função principal relaciona-se com a
digestão de compostos vindos do meio
extracelular – fagossomas.
São
os
lisossomas
das
células
fagocíticas os responsáveis pela inibição
(baixo pH e espécies de oxigénio
reactivas), de microrganismos ingeridos
e sua posterior digestão
Função na fertilização
O acrossoma do espermatozóide contém
enzimas lisossomais que vão digerir a
superfície do óvulo e permitir a entrada
do espermatozóide
Remodelação dos organitos celulares,
autofagia - autofagolisossomas
Corpo residual
digestão
–
sem actividade de
Grânulos de lipofucsina – permanecem no
citoplasma
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Entrada de material extracelular de dimensões e características que
não
permite
a
sua
passagem
através
da
membrana
ou
de
transportadores membranares
Vesículas formadas por dobras ou invaginação da membrana
• Fagocitose – partículas
• Endocitose - fluidos, solutos dissolvidos ou macromoléculas
em suspensão
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Fagocitose
Vesículas
1-2 mm de diâmetro
Células específicas (células fagocíticas)
•Entrada e posterior degradação das partículas
num lisossoma
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Fagocitose
Protecção
Células fagocíticas - macrófagos, neutrófilos
• Organismos invasores, células danificadas, glóbulos vermelhos
velhos
• As partículas a serem fagocitadas são reconhecidas
receptores na superfície das células fagocíticas (macrófagos)
por
• A fagocitose é facilitada pela cobertura da superfície da
partícula a ingerir por opsoninas
• Vesícula fagocítica funde posteriormente com um lisossoma
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Neutrófilo
Levedura
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Endocitose
Vesículas
0,1 a 0,2 mm de diâmetro
1) Entrada não específica de fluidos extracelulares
- Qualquer molécula pequena ou grande, presente no
fluído entra na célula
- Em certos tipos de células pode servir para a
conversão de membrana plasmática (celular) em
membrana citoplasmática (RE)
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Endocitose
2)
Entrada
específica
de
macromoléculas
extracelulares e que se encontram em baixa concentração
no fluído extracelular – mediada por receptores
- hormonas
- factores de crescimento
- enzimas
- proteínas do plasma
• receptores localizados em “coated pits” de clatrina
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Via endocítica
A via endocítica começa com a organização de uma rede
de microtúbulos e vesículas – endossomas:
- endossomas primários na periferia da célula
- endossomas tardios , próximos do núcleo
Distinguem-se de acordo com a sua densidade, pH e
composição em proteínas (podem ser separados por
centrifugação)
. O material que entra por endocitose é transportado em
vesículas endocíticas até aos endossomas primários,
onde são redistribuídos.
MPR-receptor da manose-6-fosfato
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Via endocítica
.
Material
dissolvido
e
ligandos,
são
transferidos para os endossomas tardios, em
vesículas transportadoras específicas
. Proteínas integrais das membranas das
vesículas,
ficam
concentradas
em
compartimentos tubulares dos endossomas
primários – centros de reciclagem.
. As moléculas que atingem os endossomas
tardios
fundem-se
posteriormente
com
lisossomas.
a- maturação dos endossomas tardios em
lisossomas
b- fusão dos endossomas com lisossomas
já existentes
c- transporte por vesículas
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43
Estrutura da
Clatrina
Organização estrutural da
clatrina e adptador, das
vesículas de endocitose
Nas
TGN
vesículas
o
composição
originadas
no
adaptador
tem
diferente
mas
muito semelhante
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•Receptors that use
clathrin-coated vesicle
endocytosis have unique
peptide signal
•Signal is: Phe-Arg-X-Tyr
•This signal mediates
adaptin binding
•Adaptin in turn binds to
individual clathrin molecules
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Endocitose mediada por receptores
Cobertura de
Clatrina
a
c
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b
d
Vesículas Cobertas
De Clatrina
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•Coat seen on inner side of cell membrane
•This is EM evidence for the occurrence of RME
•Similar for LDL, yolk protein uptake
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Estrutura da Clatrina
Composta por 3 cadeias leves e
3 cadeias pesadas
Dispõem-se numa estrutura de
3 braços – Triskelion
Esta
estrutura
construir
organizações
permite
diferentes
poligonais
(hexágonos/pentágonos)
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Papel das
“coated pits”
As
vesículas
endocíticas
de
clatrina necessitam para a sua
formação
de
uma
proteína
adicional, uma proteina que liga
Análogo não
hidrolisável
GTP – Dinamina
Esta proteína organiza-se em
pequenas
hélices
que
se
dispõem em colar em torno da
vesícula.
Esta
proteína
capaz
de
estrutural
gerar
é
forças
mecânicas
50
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Papel das “coated pits”
Invaginações
membranares
cobertas facilitam a entrada de
proteínas membranares integrais
e
respectivos
ligandos
associados
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LDLs e Metabolismo do Colesterol
Implicação fisiológica de endocitose mediada por receptores
Prémio Nobel - Brown e Goldstein
Esta doença é caracterizada por níveis elevados de colesterol no sangue,
levando à formação de placas de aterosclerose e ataques cardíacos
prematuros
O colesterol é usado pelas células animais como constituinte das suas
membranas biológicas e como percursor das hormonas esteróides
É uma molécula hidrofóbica que é transportada no sangue integrando um
complexo de lipoproteína – LDL “Low-Density Lipoproteín”, Lipoproteína de
Baixa Densidade.
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LDLs e Metabolismo do Colesterol
Implicação fisiológica de endocitose
mediada por receptores
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•Familial Hypercholesterolemia (FH): high levels of blood cholesterol and other characteristics
•Leads to an increase in blood LDL (cholesterol)
•Risk of Atherosclerosis & Heart Disease
•Atherosclerosis: buildup of cholesterol deposits lead to plaques & clog arteries
•Contributes to heart attacks at early age
•One human mutation is due to a defect in LDL receptor (e.g., in adapter binding site; can't form coated pit for LDL
uptake) which causes the buildup of LDL particles at the cell surface leading to plaque formation
The following diagram shows how a single amino acid change in the receptor results in the inability of the
receptor-ligand complex for form a clathrin coat. This prevents uptake of the complex leaving it at the cell
surface. Continual build-up of the complexes leads to plaque formation.
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ribonucleoproteínas
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