AVALIAÇÃO DOS FATORES DE CRESCIMENTO DERIVADOS DO
SOBRENADANTE DE CULTURA CELULAR DE MIELOMA MÚLTIPLO
(RPMI 8226) SOBRE CÉLULAS MUSCULARES LISAS (A7R5)
Bruno Ribeiro (PROVIC/UEPG), Giovani Marino Fávero (orientador), e-mail:
[email protected].
Universidade Estadual de Ponta Grossa / Departamento de Biologia Geral –
SEBISA / Ponta Grossa, PR.
Ciências Biológicas - Citologia e Biologia Celular
Palavras-chave: microambiente tumoral, angiogênese, neoplasia.
Resumo: Este projeto objetiva o estudo da interação através da estimulação
in vitro de células musculares lisas (A7R5) com o sobrenadante de cultura
de células de Mieloma Múltiplo (MM). Para o estudo quantitativo e qualitativo
os principais fatores de proliferação foram quantificados. As células de
Mieloma Múltiplo e as células de músculo liso vascular de aorta torácica de
embrião de rato foram mantidas em incubadora úmida de CO2 (5%) a 37oC.
A quantificação dos fatores de crescimento VEGF (Fator de crescimento do
endotélio vascular), Interleucina-6 (IL-6), fator transformador de crescimento
do tipo beta (TGF-beta) e fator de crescimento de fibroblasto (FGF) foram
quantificadas pela técnica de ELISA seguindo as recomendações do kit da
RayBiotech. Os resultados da quantificação dos fatores de crescimento
apresentaram como média e desvio padrão: 0,2473 ± 0,03296pg/mL de
VEGF, 0,0775 ± 0,008963 pg/mL de IL-6, 11,98118 ± 5,80917 pg/mL de
TGF-beta e 0,098333 ± 0,003512 pg/mL de FGF. A proliferação e viabilidade
celular foram avaliadas pelo método MTT, mas ainda não obtiveram
resultados satisfatórios. Como esses primeiros ensaios de viabilidade e
proliferação ainda não foram significativos, não há como fazer uma
correlação entre os fatores de crescimento secretados pelas células sob
influência do sobrenadante de MM com o numero de células viáveis.
Introdução
O tecido neoplásico esta envolto por inúmeras células normais, que
caracterizam o microambiente tumoral, dentre estas células encontram-se
células associadas a formação de novos vasos. O aumento da massa
tumoral é diretamente proporcional a atividade de formação de novos vasos,
conhecido como angiogênese, esta, acompanha o crescimento e a
malignidade da maioria das neoplasias e é essencial para o crescimento do
tumor(5). Existe uma série de fatores que estimulam a angiogênese, dentre
eles o mais importante é o fator de crescimento do endotélio vascular
(VEGF), que é secretado por inúmeras células normais e neoplásicas, e é o
principal alvo nas terapias antiangiogênicas de tumores (1). A interação
presente no microambiente tumoral é um fator importante para a proliferação
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.
angiogênica, sendo o estudo deste estimulo imprescindível para melhor
compreensão da relação parênquima-estroma em ambientes tumorais.
Desordem maligna de células do plasma O mieloma múltiplo (MM) é um
distúrbio de células malignas do plasma que representa cerca de 10% de
todos os cânceres hematológicos.
O mieloma múltiplo é uma doença maligna das células plasmáticas
caracterizada pelo acúmulo dessas células na medula óssea (MO) e
representa cerca de 10% de todos os cânceres hematológicos (2). As células
do MM interagem com o microambiente e induzem modificações patológicas
que, por seu turno, propiciam o crescimento e a sobrevida das células do
MM(4).
As células do mieloma podem crescer na forma de tumores localizados
ou plasmocitomas. Esses plasmocitomas podem ficar restritos à medula
óssea e ao osso (medular) ou se desenvolver fora do osso em tecidos moles
(extramedulares). Quando existem vários plasmocitomas dentro e fora do
osso, a condição também é conhecida como mieloma múltiplo(3).
Materiais e métodos
Linhagem de Mieloma Múltiplo - RPMI 8226: Células de MM (RPMI
8226) foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% Soro Fetal Bovino
(SFB), 100 U/ml penicilina, 100 µg/mL estreptomicina, 24 mM NaHCO3 até
confluência para a realização dos experimentos. Estas células foram
mantidas em incubadora úmida de CO2 (5%) a 37oC.
Linhagem de Célula muscular lisa derivada de aorta torácia de embrião
de rato: Foi utilizada linhagem celular de músculo liso vascular de aorta
torácica de embrião de rato, A7r5, obtida do Banco de Células da UFRJ. As
células foram mantidas em garrafas plásticas para cultura contendo DMEM
(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, suplementado com soro fetal bovino
10%, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 μg/mL, glutamina 2 mM e
HEPES 10 mM; pH 7,4) a temperatura de 37°C em atmosfera úmida
contendo 5% de CO2.
Quantificação do Fator de Crescimento do Endotélio Vascular (VEGF),
da Interleucina-6 (IL-6), do fator de crescimento de fibroblasto (FGF) e do
fator transformador de crescimento do tipo beta (TGF-β): A quantidade de
VEGF, IL-6, FGF e TGF-β secretada foi determinada com a separação do
sobrenadante das culturas e seguiu as recomendações do kit de ELISA da
RayBiotech, Inc Cat#:ELH-VEGF-001.
Proliferação e Viabilidade Celular pelo Método MTT: Foram plaqueadas
4x104 células A7R5 em cada poço, mantidas sob condições de cultura, em
placas de 96 poços, em triplicata, e diferentes quantidades de sobrenadante
de MM serão adicionados em ordem crescente de fatores de crescimento
(VEGF e IL-6). As células serão incubadas por 24, 48 e 72 horas
consecutivas. Diariamente foi feita a quantificação de células viáveis.
Incubou-se 0,5 mg/mL de reativo MTT, que é um sal de tetrazolium amarelo
que após incubação de 4 horas (37ºC) é metabolizado formando cristais de
formazam com coloração azul escura, que foram então solubilizados com
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100 µL tampão 10% de SDS, 0,01N HCl. Esta reação ocorre apenas em
células metabolicamente ativas, através da enzima mitocondrial succinato
desidrogenase. Foi realizada, imediatamente, a leitura em 595nm com filtro
de referência em 655nm, em espectrofotômetro. Para a quantificação das
células viáveis, foi feita uma curva de calibração, convertendo-se a
absorbância da solução em número de células.
Resultados e Discussão
As células do MM interagem com o microambiente e induzem
modificações patológicas que, por sua vez, propiciam o crescimento e a
sobrevida das células do MM. O microambiente da medula óssea consiste
de várias proteínas da matriz extracelular e de componentes
hematopoiéticos. Possuem também osteoclastos e osteoblastos capazes de
secreção de fatores de crescimento das células do MM. A direta interação
das células mielomatosas com o microambiente e a secreção de citocinas
ativa cascatas sinalizadoras que medeiam o crescimento, sobrevida,
resistência a drogas e a migração destas células assim como a
osteoclastogênese e a angiogênese(4).
As células do microambiente tumoral secretam vários fatores de
crescimento incluindo a interleucina 6 (IL-6), o fator de crescimento do
endotélio vascular (VEGF) e fator de crescimento de fibroblasto (FGF),
principalmente(4).
Como a interação presente no microambiente tumoral é fator importante
para a proliferação angiogênica, o estudo destes estímulos é imprescindível
para melhor compreensão do ambiente tumoral. Sendo assim, o estudo
resolveu quantificar fatores de crescimento e os resultados dessa
quantificação pela técnica de ELISA apresentaram os seguintes dados:
Figura 1 – Gráficos representando curvas de variância da concentração dos fatores de
crescimento (em pg/mL).
Desses dados obtidos podemos calcular a média e o desvio padrão de
cada fator de crescimento, estes números estão expostos na tabela 1
abaixo. E notamos ainda que, de um modo geral, todos tiveram um aumento
significativo, o que confirma o conceito de que as células mielomatosas em
contato com as células musculares lisas secretam todas estas citocinas para
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o desenvolvimento cada vez mais facilitado do tumor, principalmente pela
angiogênese.
Tabela 1
Fatores de crescimento
VEGF
IL-6
TFG- β
FGF
Média
0,2473 pg/mL
0,080333 pg/mL
1,98118 pg/mL
0,098333 pg/mL
Desvio Padrão
± 0,03296 pg/mL
± 0,008963 pg/mL
± 5,80917 pg/mL
± 0,003512 pg/mL
Os primeiros ensaios de viabilidade e proliferação celular não foram
significativos devendo ser novamente realizados.
Conclusões
A avaliação dos estímulos secretados pelo parênquima tumoral sobre as
demais células presente no microambiente do tumor auxilia na aprimoração
do conhecimento sobre as neoplasias e permite que através destas
informações novas estratégias terapêuticas possam ser desenvolvidas.
Como os primeiros ensaios de viabilidade e proliferação ainda não foram
significativos, não há como fazer uma correlação entre os fatores de
crescimento secretados pelas células sob influência do sobrenadante de MM
com o numero de células viáveis. Sendo assim, o projeto ainda necessita de
mais alguns ensaios de proliferação para que se obtenha o resultado
esperado.
Agradecimentos
Ao professor Giovani Marino Fávero, Paula Dayana Matkovski e Milton
Sérgio Bohatch Júnior
Referências
1. Stefanini, M. O.; Wu F. T.; Mac Gabhann, F.; Popel, A. S. A
compartment model of VEGF distribution in blood, healthy and
diseased tissues. BMC Syst Biol. 2008, 19;2:77.
2. Kyle, R. A. e Rajkumar, S. V. Multiple myeloma. Journal Article. 2008,
111, 6: 2962-2972.
3. DURIE, B. G. M. Mieloma Múltiplo - Câncer da Medula Óssea.
International Myeloma Foundation Latin America. 2009, 4-6.
4. Giuliani, N.; Rizzoli, V. New acquisitions in the physiopathology of
multiple myeloma: role of the bone microenvironment. Rev. Bras.
Hematol. Hemoter. 2008, 30, 3-5 .
5. Abounader, R.; Laterra, J. Scatter factor/hepatocyte growth factor in
brain tumor growth and angiogenesis. Neuro Oncol. 2005, 7 (4): 436.
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.