UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA UFPB
DANILO BATISTA MARTINS BARBOSA
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DA ASSOCIAÇÃO DO ÓLEO
ESSENCIAL DE Cymbopogon winterianus Jowitt (CITRONELA)
COM ANTIFÚNGICOS SINTÉTICOS SOBRE
ESPÉCIES DE Aspergillus
JOÃO PESSOA-PB
2011
1
DANILO BATISTA MARTINS BARBOSA
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DA ASSOCIAÇÃO DO ÓLEO
ESSENCIAL DE Cymbopogon winterianus Jowitt (CITRONELA)
COM ANTIFÚNGICOS SINTÉTICOS SOBRE
ESPÉCIES DE Aspergillus
Tese apresentada, como parte dos requisitos
necessários para conclusão do Doutorado em
Odontologia
(UFPB/UFBA),
área
de
concentração em Estomatologia com linha de
pesquisa
em
Fitoterapia
Aplicada
à
Odontologia.
Orientadora: Profª. Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima
JOÃO PESSOA-PB
2011
2
DANILO BATISTA MARTINS BARBOSA
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DA ASSOCIAÇÃO DO ÓLEO
ESSENCIAL DE Cymbopogon winterianus Jowitt (CITRONELA)
COM ANTIFÚNGICOS SINTÉTICOS SOBRE
ESPÉCIES DE Aspergillus
Aprovada em: ______/______/_______
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________
Profa. Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima
Orientadora (CCS - UFPB)
______________________________________________________
Profa. Dra. Cláudia Roberta Leite Vieira de Figueiredo
(Examinadora - CCS - UFPB)
_______________________________________________________
Prof. Dr. Fabiano Gonzaga Rodrigues
(Examinador – CCS - UFPB)
_____________________________________________________
Prof. Dr. Sérgio Bartolomeu de Farias Martorelli
(Examinador – Faculdade de Odontologia do Recife)
___________________________________________________
Prof. Dr. Thúlio Antunes de Arruda
(Examinador - UEPB)
3
"A excelência pode ser obtida se você se
importa mais do que os outros julgam ser
necessário; se arrisca mais do que os outros
julgam ser seguro, sonha mais do que os
outros julgam ser prático, e espera mais do
que os outros julgam ser possível."
Vince Lombardi
4
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tão me ofertar tantas graças, tantas bênçãos, muito mais do que
preciso para ser feliz.
À minha esposa e melhor amiga Iolanda, por me entender, mesmo quando
não falo, me suster quando caio, me conduzir, quando paro e por fazer de minha
vida algo muito melhor do que poderia ser.
A Danton, por saber suportar, às vezes sem entender, as horas em que o pai
esteve distante, mesmo quando presente, mostrando-me como se forma um
verdadeiro homem.
A Henrique, pela alegria que nos trouxe na esteira de sua vinda, unindo mais
o que já era um só, tornando maravilhoso o que já era bom.
A meu pai, Genival, por mostrar que um homem pode ser feito de aço,
caminhar desertos, nadar oceanos e, passados séculos, continuar achando que
nada é impossível.
À minha amada mãe, Irany, pelo amor transbordante, inesgotável, por ter
sempre o colo, o carinho, fazendo-nos sempre querer continuar crianças.
Aos meus queridíssimos irmãos Danúsio, Michele e Daniele, com meus
cunhados Andréia, Jefferson e Jonathan e meus sobrinhos Guilherme, Laís e
Camila, pelo amor e suporte de todas as horas, apostando sempre em mim.
Aos meus sogros Mac Arthur e Socorro, que me deram meu presente tão
precioso.
Aos meus cunhados Luizinho, Gizeuda, Janine e Bruno e ao meu sobrinho
Davi, que formam minha segunda família, tão amada quanto a primeira.
À minha avó Iolanda, por todos esses anos de dedicação e carinho
constantes.
Aos meus tios e primos, pela convivência querida, menos freqüente do que
seria de nossa vontade.
Aos meus amigos-irmãos de toda uma vida: George Bezerra, Odilon Aquino,
Napoleão Carvalho, Agamenon Cunha Lima, Eduardo Franca, Genésio Rocha, José
de Atenágoras, amizades que transcendem a barreira do sangue, companheiros
para todo o sempre.
Aos amigos-irmãos de agora para toda a vida: João Frank, essencial em um
momento decisivo, soube fazer o que um amigo de toda uma vida faria, e Sérgio
Carvalho, grande surpresa, mais querido a cada dia.
5
À minha orientadora Edeltrudes Lima, que rege a vida feito uma maestrina,
como quem conduz a mais bela canção.
Ao professor Thúlio Antunes, pela disponibilidade em dividir com desapego
com quem chega à sua procura.
A Fabiano Gonzaga e Tânia Lemos: só Deus pode mostrar como um evento
fortuito pode definir nossa vida para sempre. Minha gratidão por todo o amor,
encorajamento e acolhimento de todos os dias, todas as horas.
A Sérgio Martorelli, o primeiro exemplo, o exemplo de sempre, o amigo
fidelíssimo presente ao primeiro apelo.
A Jean-Paul Meningaud, pai e amigo em uma terra estranha: o cirurgião que é
parâmetro mundial para a Ciência é pequeno diante do homem de carne-e-osso; e a
Caroline Meningaud, pelo carinho, sensibilidade e compreensão.
A Jacques-Charles Bertrand, aquele que me mostrou como um mestre pode
ser grande, pela proteção e apoio em todos os momentos.
A meus amigos no exílio francês, Sílvio de Barros, Yuri Catunda, Marcelo e
Paula Varella, Rafael Spinelli, Hassan Aboushadi, Francisco Guerra Ferraz, Xerxes
Gusmão, Cássio Nery, Rafael Correia, Ismene Serra, Carlos Augusto de Souza,
Michele Ribeiro, Marina Peregrino e Rommel Amorim (in memoriam), por provarem
que o inverno mais frio e mais cinzento pode ser também quente e alegre.
A Giliara Carol e Ricardo Castro, que, de meus alunos, passaram a meus
professores com a serenidade e segurança que se espera dos grandes.
Aos companheiros da pós-graduação Gustavo Agripino, Fabiano Pacheco,
Ana Carolina Albuquerque, Betânia Fachetti, Keila Barroso, Maria Oliveira, Rosalya
Coura, pelos alegres momentos vividos.
Aos amigos de plantão Jocemir Paulino, André Ribeiro, Sávio Bruno e
Eucimar Guimarães, pelas demonstrações de amizade e companheirismo.
Aos coordenadores do Programa de Pós-graduação Lino João e Ricardo
Duarte, pelo esforço e desvelo mostrado durante o curso.
Aos professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação pelo apoio e
dedicação.
Aos colegas do Laboratório de Micologia Wylly Oliveira, Igara Lima, Fillipe
Pereira, Katiana Lima e Egberto Carmo, por todo o carinho e a paciência com que
me receberam.
6
RESUMO
Esta pesquisa se propôs a estudar as propriedades antifúngicas do óleo essencial
de Cymbopogon winterianus Jowitt associado a antifúngicos sintéticos contra cepas
de Aspergillus. Os parâmetros utilizados para esse fim se basearam na
determinação da Concentração Inibitória Mínima, Índice de Concentração Inibitória
Fracionada (método de associação – Checkerboard), bem como na curva de morte
microbiana. A anfotericina B e o fluconazol, antifúngicos sintéticos de uso
consagrado, foram empregados como controles positivos, sendo também utilizados
nos testes de combinação com o produto natural. Todos os ensaios foram realizados
em triplicata. A realização desse estudo possibilitou aprofundar os conhecimentos
acerca dos efeitos terapêuticos do óleo essencial de C. winterianus, quando usado
de forma isolada ou se relacionado às drogas aludidas anteriormente. Além disso,
buscou-se encontrar alternativas viáveis ao tratamento das infecções por
Aspergillus, atualmente baseados no uso prolongado de drogas alopáticas, onde os
efeitos colaterais observados representam um fator limitante para seu pleno
sucesso.
Palavras-Chaves: Aspergillus, Cymbopogon, Fitoterapia, Óleo essencial, Agentes
Antifúngicos.
7
ABSTRACT
This research aimed to study the antifungal properties of essential oil of Cymbopogon
winterianus Jowitt associated with synthetic antifungals against strains of Aspergillus.
The parameters used for this purpose were based on the determination of Minimum
Inhibitory Concentration, Fractional Inhibitory Concentration Index (method of
association - Checkerboard) as well as in microbial death curve. Amphotericin B and
fluconazole antifungal synthetic were used as positive controls, and is also used in
combination with tests of the natural product. All tests were performed in triplicate.
The present study allowed further our understanding about the therapeutic effects of
essential oil of C. winterianus, when used in isolation or drug related alluded to
earlier. In addition, we attempted to find viable alternatives to the treatment of
Aspergillus infections, currently based on the prolonged use of allopathic drugs,
where the observed side effects are a limiting factor to its full success.
Keywords: Aspergillus, Cymbopogon, Phytotherapy, Volatile Oils, Antifungal Agents.
8
LISTA DE ABREVIATURAS
ASD
-
Agar Sabouraud Dextrose
ATCC
-
American Type Culture Collection
CC S
-
Centro de Ciências da Saúde
CF M
-
Concentração Fungicida Mínima
CIF
-
C o n c en t ra çã o In ib it ó ria Fr ac io ná r ia
CI M
-
Concentração Inibitória Mínima
DMSO
-
Dimetilsufóxido
L TF
-
Laboratório de Tecnologia Farmacêutica
NCCLS -
National Committee for Clinical Laboratory Standards
O. E.
-
Óleo Essencial
OMS
-
Organização Mundial de Saúde
PCR
-
Reação em Cadeia de Polimerase
UFPB
-
Universidade Federal da Paraíba
9
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Cymbopogon winterianus............................................................. 25
FIGURA 2 - Fluxograma do ensaio da cinética da morte microbiana.............. 48
10
LISTA DE QUADRO, ESQUEMAS E TABELAS
QUADRO1 - Componentes do óleo essencial das folhas de C. winterianus ........... 41
ESQUEMA 1 - Representação da associação entre os antifúngicos sintéticos e o
óleo essencial pelo método de Checkerboard. .................................. 46
ESQUEMA 2 - Associação entre o óleo essencial de C. winterianus e a
anfotericina B sobre A. fumigatus (ATCC 16913) ............................... 51
ESQUEMA 3 - Associação entre o óleo essencial de C. winterianus e anfotericina
B sobre A. flavus (ATCC 16013)......................................................... 52
ESQUEMA 4 - Associação entre o óleo essencial de C. winterianus e o fluconazol
sobre A. fumigatus (ATCC 16913) ...................................................... 53
ESQUEMA 5 - Associação entre o óleo essencial de C. winterianus e o fluconazol
sobre A. flavus (ATCC 16013) ............................................................ 54
TABELA 1 - Concentração inibitória mínima de anfotericina B sobre cepas de
Aspergillus .......................................................................................... 49
TABELA 2 - Concentração inibitória mínima do fluconazol sobre cepas de
Aspergillus .......................................................................................... 50
TABELA 3 - Determinação da concentração inibitória fracionária da associação
entre o óleo essencial de C. winterianus e a anfotericina B sobre
cepas de Aspergillus ........................................................................... 55
TABELA 4 - Determinação da concentração inibitória fracionária da associação
entre o óleo essencial de C. winterianus e o fluconazol sobre cepas
de Aspergillus .................................................................................... 55
TABELA 5 -
Crescimento radial fúngico de A. fumigatus na presença
da associação entre o óleo essencial de C. winterianus e a
anfotericina B (em mm)....................................................................... 56
11
TABELA 6 - Grau de inibição de A. fumigatus pela associação do óleo essencial
de C. winterianus com a anfotericina B em relação ao controle
(em %) ................................................................................................ 56
TABELA 7 - Crescimento radial fúngico de A. fumigatus na presença da
associação entre o óleo essencial de C. winterianus e fluconazol
(em mm).............................................................................................. 57
TABELA 8 - Grau de inibição de A. fumigatus pela associação do óleo essencial
de C. winterianus com fluconazol em relação ao controle (em %)...... 58
TABELA 9 - Crescimento radial fúngico de A. flavus na presença da associação
entre o óleo essencial de C. winterianus e fluconazol (em mm) ......... 59
TABELA 10 - Grau de inibição de A. flavus pela associação do óleo essencial de
C. winterianus com o fluconazol em relação ao controle (em %)........ 59
12
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 - Crescimento radial fúngico de A. fumigatus na presença da
associação entre o óleo essencial de C. winterianus e
anfotericina B .................................................................................... 57
GRÁFICO 2 - Crescimento radial fúngico de A. fumigatus na presença da
associação entre o óleo essencial de C. winterianus e o
fluconazol .......................................................................................... 58
GRÁFICO 3 - Crescimento radial fúngico de A. flavus na presença da
associação entre o óleo essencial de C. winterianus e o
fluconazol .......................................................................................... 60
13
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................15
2 OBJETIVOS...........................................................................................................17
2.1 Geral ...................................................................................................................17
2.2 Específicos ........................................................................................................17
3 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................18
3.1 Fitoterapia ..........................................................................................................18
3.2 Óleos Essenciais ..............................................................................................20
3.3 Cymbopogon winteriaunus Jowitt ..................................................................24
3.4 Fungos ..............................................................................................................27
3.5 Aspergillus ........................................................................................................29
3.5.1 Forma alérgica..................................................................................................31
3.5.2 Forma não invasiva ..........................................................................................32
3.5.3 Forma invasiva .................................................................................................33
3.6 Antifúngicos ......................................................................................................35
3.7 Estudo de associação – Checkerboard..........................................................37
4 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................39
4.1 Local do Estudo.................................................................................................39
4.2 Produto Natural Testado...................................................................................39
4.3 Óleo Essencial...................................................................................................40
4.3.1 Análise do óleo essencial .................................................................................40
4.4 Fármacos Antifúngicos.....................................................................................41
4.5 Microrganismos.................................................................................................42
4.6 Meio de cultura ..................................................................................................42
4.7 Inóculo das Espécies Fúngicas .......................................................................43
14
5 METODOLOGIA......................................................................................................44
5.1 Determinação da CIM – Técnica da Microdiluição..........................................44
5.2 Ensaio do Sinergismo – Método do Checkerboard........................................44
5.3 Interferência da Associação do Óleo Essencial com os Antifúngicos
Padrão sobre o Crescimento Micelial Radial ..................................................47
5.4 Tratamento Estatístico......................................................................................48
6 RESULTADOS.......................................................................................................49
6.1 Determinação da CIM dos Antifúngicos Padrão.............................................49
6.2 Determinação da CIF da associação dos antifúngicos sintéticos
e o óleo essencial pelo método Checkerboard..............................................50
6.3 Interferência da Associação do Óleo Essencial com os
Antifúngicos Padrão sobre o Crescimento Micelial Radial Fúngico ............55
7 DISCUSSÃO ..........................................................................................................61
8 CONCLUSÃO ........................................................................................................79
REFERÊNCIAS.........................................................................................................80
15
1 INTRODUÇÃO
Aspergilose é um espectro de doenças que pode ser causado por várias
espécies de Aspergillus (GUS et al., 2005). Esses microorganismos pertencem à
classe dos ascomicetos, bastante comum na natureza. Apesar de cerca de 900
espécies terem sido descritas, apenas algumas se constituem em patógenos
fúngicos sobre humanos (KHONGKHUNTHIAN; REICHART, 2001).
A. fumigatus é o agente mais frequente, mas A. flavus, A. niger e A. terreus
também podem provocar a infecção (GUS et al., 2005). A inalação de esporos é a
causa primária da doença, que pode apresentar três apresentações principais: a
forma pulmonar, a invasiva e a alérgica broncopulmonar (MERCK, 1999). A
contaminação também pode ocorrer pela colonização de ferimentos ou de cirurgias
(SIDRIM; MOREIRA, 1999; CHAMILOS; KONTOYIANNIS, 2005; PASQUIER, et al.,
2006). Eles também são os principais responsáveis pelas infecções fúngicas dos
seios paranasais. Essas afecções podem ser iniciadas por duas vias: a via
“aerogênica” ocorre quando os esporos são inalados, depositando-se diretamente
nas cavidades sinusais, onde haverá proliferação, desde que se encontre condições
anaeróbicas; a outra é aquela onde os esporos são introduzidos na cavidade por
meio de uma comunicação buco-sinusal. Uma vez depositados nos seios, terão um
comportamento oportunista, havendo multiplicação, desde que ocorra diminuição da
ventilação
sinusal,
como
ocorre
em
sinusites
bacterianas
pré-existentes
(FALWORTH; HEROLD, 1996).
O tratamento das aspergiloses se baseia, principalmente, em protocolos
medicamentosos, associados, quando necessário, a complementação por cirurgia.
Devido ao caráter destrutivo desses microorganismos, a necessidade de um
tratamento prolongado e disciplinado e os efeitos colaterais resultantes das drogas
adotadas, notadamente a anfotericina B, conhecida por seu potencial nefrotóxico
(KEELE et al., 2001), observa-se um grande número de fracassos terapêuticos.
Esses insucessos podem resultar em mutilações extensas, incapacitação funcional e
óbito, principalmente quando há invasão da cavidade craniana, através dos seios
16
paranasais ou da órbita (NOTANI et al., 2000). As dificuldades expostas motivam a
adoção de estratégias de tratamento mais eficazes.
A utilização de produtos naturais para esse fim vem despertando um interesse
freqüente,
apresentando
resultados
animadores.
Cymbopogon
winterianus
(citronela) é uma planta de notáveis propriedades terapêuticas, com uso consagrado
pela literatura. Seu óleo essencial vem sendo indicado para diversos fins (CASSEL;
VARGAS, 2006; QUINTANS-JÚNIOR et al., 2007; THANABORIPAT, 2007).
Entretanto, sua estrutura complexa evidencia um potencial ainda inexplorado,
suscitando a realização de estudos mais aprofundados, de modo a se optimizar suas
possibilidades de uso.
Assim, este trabalho se propôs a observar o comportamento antifúngico da
associação entre drogas alopáticas de uso mais freqüente contra infecções por
Aspergillus associados ao óleo essencial de C. winterianus.
17
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Avaliar a atividade antifúngica da associação do óleo essencial obtido a partir
de C. winterianus com drogas sintéticas sobre espécies de Aspergillus.
2.2 Específicos

Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) da anfotericina B e do
fluconazol, drogas alopáticas de uso consagrado para o tratamento de
infecções por Aspergillus.

Determinar o padrão de atividade antifúngica da associação do óleo essencial
de C. winterianus com a anfotericina B e o fluconazol, através do método de
Checkerboard.

Determinar a curva de morte microbiana a partir das associações entre o óleo
essencial com a anfotericina B e com o fluconazol (ensaio de cinética).
18
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Fitoterapia
A utilização de plantas com objetivos medicinais é bastante difundida em todo
o mundo. Os vegetais têm sido, desde a Antiguidade, um importante recurso ao
alcance do ser humano para esse fim. O homem encontrou nas chamadas plantas
medicinais, virtudes que foram transmitidas de geração a geração. Elas representam
um marco na história do desenvolvimento de nações. Nos
países
em
desenvolvimento, entre 65 e 80% da população depende exclusivamente de plantas
medicinais para seus cuidados básicos de saúde. (AGRA et al., 2007; BRASILEIRO
et al., 2008; VEIGA-JÚNIOR, 2008).
Todavia, até nas sociedades mais industrializadas, o uso de vegetais in
natura pela população vem se intensificando (BRASILEIRO et al., 2008). Nesses
locais, apesar do acesso fácil à medicina moderna, o uso de ervas medicinais
mantém sua popularidade, amparada por fatores históricos e culturais (AGRA et al.,
2007). É nesse contexto que o uso de plantas visando à cura de doenças ganha um
interesse crescente em escala mundial.
A Fitoterapia é uma terapêutica caracterizada pelo uso de plantas medicinais
em suas diferentes formas farmacêuticas, sem a utilização de substâncias ativas
isoladas, ainda que de origem vegetal. Tal abordagem incentiva o desenvolvimento
comunitário, a solidariedade e a participação social (BRASIL, 2006). Para reforçar
esta idéia, a possibilidade de introduzir a Fitoterapia no sistema público de saúde
vem sendo considerada desde 1988, através da resolução n.8/88 da Comissão
Interministerial de Planejamento e Coordenação (CIPLAN) e faz parte das diretrizes
da I Conferência Nacional de Assistência Farmacêutica – CNMAF - em 2003
(VENDRUSCOLO et al., 2005).
Percebe-se, assim, o interesse governamental e profissional em associar o
avanço tecnológico ao conhecimento popular e ao desenvolvimento sustentável,
19
visando uma política de assistência à saúde eficaz, abrangente, humanizada e
independente da tecnologia farmacêutica (FRANÇA et al., 2008).
O homem moderno pode ser compreendido e diferenciado dos demais por
seu consumo elevado de medicamentos (VEIGA-JÚNIOR, 2008). O advento da
medicina científica contribuiu para o aumento da sobrevida humana. E, no cotidiano
das práticas de saúde, a aplicação de princípios científicos desencadeou a
descoberta de terapêuticas que melhoraram a qualidade de vida das pessoas
(FRANÇA et al., 2008). As pesquisas químicas e farmacêuticas ao longo do Século
XX possibilitaram o alívio para males que assolaram a humanidade por séculos,
como a tuberculose, a sífilis, o câncer e a hanseníase, assim como para as
endemias do mundo atual, a exemplo da depressão, das cardiopatias e da AIDS. A
grande oferta de medicamentos alopáticos, entretanto, não resolveu os problemas
de saúde da maior parte da população (VEIGA-JÚNIOR, 2008).
É nessa esteira que se pode notar o ressurgimento da Fitoterapia. Observa-se
um interesse crescente em torno dos fitomedicamentos, e isso se justifica pelo fato
de que estes apresentam diversas vantagens, quando comparados à terapêutica
convencional, no que tange a menor incidência de efeitos colaterais, toxicidade
relativa diminuída, baixo custo e no fato do Brasil apresentar uma enorme população
de plantas medicinais em sua flora nativa. Considera-se também que o uso de
destas pode representar uma alternativa de substituição aos anti-sépticos e
desinfetantes sintéticos convencionais, visando evitar o desenvolvimento de
resistência bacteriana a esses compostos (SANTOS et al., 2006; SOUZA et al.,
2007). Os fatores citados podem ter influenciado a redescoberta da medicina natural,
e nesse ressurgimento, a Fitoterapia deixa de lado seu empirismo inicial, ganhando
o respaldo de um crescente número de pesquisas e estudos, traduzindo-se como
uma síntese da relação direta entre a medicina popular e o conhecimento científico
(FRANÇA et al., 2008).
Não obstante esse aporte de trabalhos científicos, atualmente a utilização
majoritária dos fitoterápicos se dá de maneira informal. É importante lembrar que o
uso desses medicamentos não está isento de riscos: a crença na “naturalidade
inócua” dos fitomedicamentos e plantas medicinais não é facilmente contradita, pois
as evidências científicas sobre a ocorrência de intoxicações e efeitos colaterais
20
relacionados a seu uso dificilmente chegam ao conhecimento dos usuários
(SILVEIRA et al., 2006). Há estudos que alertam para o risco de toxicidade de
fitoterápicos e de seu uso indiscriminado pela população leiga (AGRA et al., 2007).
Além disso, ainda se observam lacunas no que concerne a indicação correta dos
fitoterápicos para o tratamento de alguma doença (FRANÇA et al., 2008).
Há uma tendência à generalização do uso de plantas medicinais por se
entender que tudo que é natural não é tóxico nem faz mal a saúde. Este conceito é
errôneo, porque existe uma imensa variedade de plantas medicinais que podem ser
providas de toxicidade considerável. Observa-se que cada vegetal, em sua essência,
pode ser alimento, veneno ou medicamento, e essa distinção entre as substâncias
alimentícias, tóxicas e medicamentosas se faz apenas com relação à dose, a via de
administração e a finalidade com que são empregadas. Em muitos casos, as
pessoas subestimam as propriedades medicinais das plantas e fazem uso delas de
forma desregrada. A preocupação mostra-se pertinente, uma vez que não há
critérios rígidos no tocante à posologia e às doses tóxicas ou letais, permitindo que o
uso aleatório desses princípios possa ser realizado sem qualquer controle. Não se
pode descartar a possibilidade de efeitos colaterais dos fitoterápicos quando se
associam duzentas ou trezentas substâncias ao princípio ativo desejado (FRANÇA
et al., 2008).
Observando-se os dados encontrados na literatura, constatou-se uma grande
carência de estudos in vitro e in vivo, enquanto que o maior contingente de
pesquisas disponíveis é composto de análises pré-clínicas (VENDRUSCOLO et al.,
2005). Esses fatos corroboram a necessidade de trabalhos sérios na área,
reafirmando, assim, a credibilidade do emprego de plantas medicinais no meio
médico-odontológico e evidenciando sua essência científica.
3.2 Óleos Essenciais
A Natureza pode ser um meio inóspito, oferecendo condições desfavoráveis e
insalubres para a viabilidade dos organismos vivos. Estes têm sua sobrevivência
21
constantemente ameaçada por agressores animados e inanimados. Para assegurar
sua sobrevivência, os vegetais necessitam de meios de defesa próprios contra
organismos externos. Já é bem aceito que algumas plantas contêm compostos aptos
a inibir o crescimento microbiano (SOUZA et al., 2005).
As propriedades antimicrobianas dos vegetais foram relatadas devido à sua
habilidade para sintetizar, por meio do metabolismo secundário, vários compostos
químicos complexos dotados de atividade antimicrobiana, incluindo nesse rol os
alcalóides, os flavonóides, os taninos, as cumarinas, os glicosídeos, os fenilpropanos
e os ácidos orgânicos (SOUZA et al., 2005).
Na pesquisa de produtos naturais, atualmente se observa uma tendência à
busca pela obtenção de fitoconstituintes a partir de extratos, frações, óleos fixos ou
essenciais, obtidas de espécies vegetais para uma possível aplicação no combate a
processos infecciosos causados por fungos, bactérias, parasitas e vírus (ARRUDA,
2006). Dentre esses compostos, os óleos essenciais assumem uma posição de
destaque, dadas suas propriedades singulares.
Óleos essenciais são compostos líquidos, complexos, orgânicos, lipofílicos,
voláteis, aromáticos, também sendo conhecidos, como óleos voláteis, óleos etéreos
ou essências. São extraídos de diversas partes das plantas, como folhas, flores,
sementes, brotos, galhos, cascas de caule, frutos e raízes (ARAÚJO, 2005).
Recebem essa denominação por terem aparência oleosa à temperatura ambiente.
Entretanto, sua principal característica é a volatilidade, diferindo, assim, dos óleos
fixos, mistura de substâncias lipídicas, obtidos, geralmente, de sementes. Outra
característica importante se dá pelo aroma agradável e intenso que a maioria de
seus representantes apresenta (PEREIRA, 2006).
As propriedades físicas, químicas e sensitórias desses compostos serão
determinantes para seu aproveitamento prático (RANGAHAU, 2001). Algumas
características dos óleos vegetais conferem às plantas que os produzem o papel de
poderosas fontes de agentes biocidas, sendo largamente estudadas na agricultura
por apresentarem atividades bactericidas, inseticidas e fungicidas (PEREIRA, 2006).
Esses compostos vegetais podem apresentar diferentes estruturas e mecanismos de
ação, quando comparados com substâncias antimicrobianas convencionalmente
22
empregadas para controle do crescimento e sobrevivência dos microorganismos
(SOUZA, 2004).
Historicamente, os óleos essenciais e os extratos de plantas têm servido de
base para diversas aplicações na medicina popular (NASCIMENTO et al., 2007). Na
Idade Antiga, estes eram usados regularmente em Roma, na Grécia, Egito e em
todo o Oriente como temperos, desodorantes, medicações e antissépticos para
embalsamamento. Seus extratos eram aproveitados para a fabricação óleos ou
cremes (RANGAHAU, 2001).
Sem que houvesse maior progresso sobre o conhecimento de suas
propriedades, os óleos foram introduzidos na Europa. Só nos anos 1300, na
Espanha e na França, sua destilação foi desenvolvida, visando produzir maiores
concentrações de essências de Rosmarinus officinalis (alecrim) e Salvia officinalis
(sálvia). As exigências da farmácia medieval obrigaram a uma incrementação de seu
processo de destilação (RANGAHAU, 2001).
Em 1550, alguns aspectos marcantes se observavam: o óleo de lavanda era
produzido na França para fins de exportação; essências e aromas eram
desenvolvidos a partir de uma variedade cada vez maior de plantas; por fim,
químicos, farmacêuticos e físicos pesquisavam as propriedades químicas, físicas e
terapêuticas dessas substâncias (RANGAHAU, 2001).
A primeira medida experimental de suas propriedades bacterianas foi
empreendida por De la Croix, em 1881. Entretanto, no decorrer dos séculos XIX e
XX, seu interesse terapêutico perdeu importância, diante de sua aplicação como
aromatizante e como perfume. Como resultado da evolução da tecnologia de
destilação no último século, os óleos essenciais foram alçados à categoria de
matérias primas industriais (RANGAHAU, 2001; BURT, 2004).
Nos dias atuais, seu principal aproveitamento na Comunidade Européia é
baseado nas indústrias alimentícias (aromatizantes), de perfumes e farmacêuticas
(BURT, 2004).
Quando se analisa os óleos essenciais, fica patente sua complexidade
estrutural, uma vez que podem ser compostos por mais de 60 constituintes
individuais, o que influenciará, sobremaneira, sua atividade biológica (LIMA et al.,
23
2006). A avaliação das propriedades dos óleos extraídos de certas plantas revelou
que alguns destes exibiam atividades antibacterianas, inseticidas e antifúngicas
(SILVA et al., 2008).
Sua composição química mostra-se extremamente intrincada, onde prevalece
a presença de terpenos e fenilpropanóides, representando os elementos voláteis
contidos em muitos órgãos vegetais e que se relacionam a várias funções
imprescindíveis à sobrevivência vegetal. Exercem, assim, papel fundamental em sua
interação química com outras plantas e na defesa contra o reino animal. Os óleos
essenciais possuem conhecidas propriedades antifúngicas e um potencial para
aplicação como agentes antimicrobianos (FARIAS; LIMA, 2000). Tem sido
estabelecido cientificamente que cerca de 60% desses compostos possuem
propriedades antifúngicas e 35%, propriedades antibacterianas (LIMA et al., 2006;
PEREIRA, 2006; TRAJANO, 2008).
Os
pelas
componentes
propriedades
fenólicos
antibacterianas,
são
os
possuindo,
principais
também,
responsáveis
alguma
atividade
antifúngica (OLIVEIRA et al., 2007). Seu caráter antisséptico é normalmente
atribuído à presença, além dos compostos fenólicos, de aldeídos, e álcoois, tais
como o citral, geraniol, linalol e timol, que têm alta atividade, superior ao próprio
fenol (FENNER et al., 2006). Já se atribuiu que essas ações se deviam a suas
propriedades lipofílicas e hidrofóbicas, permitindo o trânsito através das membranas
e sua entrada no citoplasma (CHRISTIAN; GOGGI, 2008).
Apesar de as características antimicrobianas dos óleos essenciais e de seus
componentes terem sido estudadas no passado, seu mecanismo de ação ainda não
foi elucidado completamente. Considerando o vasto número de compostos químicos
presentes nos óleos essenciais, parece ser mais razoável supor que sua atividade
antibacteriana não se ampare em um mecanismo de ação único, mas, sim, que ele
atue em diferentes sítios celulares: degradando a parede celular; causando danos
na membrana citoplasmática; alterando as proteínas da membrana celular;
promovendo o escape do conteúdo celular; induzindo a coagulação do citoplasma.
(BURT, 2004).
Seu caráter hidrofóbico é um fator importante nesse mecanismo de ação,
permitindo a separação dos lipídios da membrana celular e das mitocôndrias,
24
comprometendo sua integridade e tornando-os mais permeáveis. A despeito desses
microorganismos tolerarem a saída de certo volume celular sem que sua vitalidade
seja comprometida, a perda extensa desse conteúdo, de moléculas ou de íons vitais
pode ser fatal. Vem sendo demonstrado que os óleos essenciais de maior atividade
antimicrobiana dispõem de uma percentagem importante de compostos fenólicos,
como o carvacrol, o eugenol e o timol em sua composição. Sua atuação se dá,
principalmente pelo comprometimento da membrana plasmática, alterando a força
motora dos prótons, o fluxo de elétrons, o transporte ativo por essa barreira e pela
coagulação do meio celular. (BURT, 2004).
As peculiaridades encontradas nos mecanismos de ação antimicrobiana dos
óleos essenciais parecem incrementar seu modus operandi, justificando o crescente
interesse científico sobre suas possibilidades de uso: vários antibióticos sintéticos
tendem a apresentar diversos efeitos colaterais e espectro de ação limitada
(MITSCHER et al., 1972). Além disso, é um fato preocupante o aparecimento de
microorganismos multirresistentes em ambientes hospitalares e na comunidade,
sugerindo-se a aplicação desses componentes naturais para tal fim (FARIAS; LIMA,
2000; EDRIS, 2007).
Dada a importância de alguns desses óleos e o escasso estudo sobre suas
possibilidades de uso, mostra-se interessante aumentar o conhecimento sobre suas
concentrações inibitórias, buscando-se o equilíbrio entre aceitabilidade clínica e
eficácia antimicrobiana (NASCIMENTO et al., 2007). Com o aprofundamento das
pesquisas em questão, pode-se explorar o uso terapêutico das substâncias
mencionadas de uma maneira mais eficaz, vencendo-se os inconvenientes inerentes
aos
antibióticos
convencionais
em
melhores
condições
para
controlar
microorganismos refratários aos protocolos medicamentosos atuais.
3.3 Cymbopogon winteriaunus Jowitt
Considerando os resultados terapêuticos promissores apresentados pelas
espécies vegetais, nossa atenção recairá sobre uma espécie em particular:
25
Cymbopogon winteriaunus. Esse exemplar pertence à família Poaceae, também
denominada Gramineae, que contém cerca de 668 gêneros, abrangendo em torno
de 9500 espécies com ampla distribuição. Suas propriedades lhe conferiram notável
importância econômica. Está representada por plantas herbáceas dotadas de raízes
fibrosas, enquanto que a participação de arbustos ou árvores nesse contingente é
bastante reduzida (FIGURA 1). As espécies vegetais dessa família detêm uma vasta
gama de constituintes químicos, ao passo que vários desses compostos são
aproveitados na indústria de alimentos, amido açúcar e óleos essenciais. Nota-se
também a presença de alcalóides, saponinas, substâncias cianogênicas, ácidos
fenólicos, flavonóides e terpenóides (EVANS, 1996).
O cultivo das espécies da família Poaceae é feito em larga escala,
notadamente em regiões tropicais e subtropicais, sua presença sendo percebida
desde em regiões montanhosas de planícies até em climas áridos. Pode-se creditar
essa ampla disseminação global a suas reconhecidas propriedades aromáticas
(MARCO et al., 2007).
FIGURA 1 - Cymbopogon winterianus.
FONTE: Pereira, 2009.
O gênero Cymbopogon constitui-se em um representante de grande
importância da família Poaceae, estando composto por cerca de 120 espécies.
Justifica-se boa parte do interesse despertado por esse grupo amparado por seu
26
aproveitamento econômico na produção de óleo essencial (LORENZI; MATOS,
2003).
Também denominada citronela, é uma planta perene, largamente cultivada
nas regiões tropicais do planeta por suas propriedades aromáticas. Há,
basicamente, dois tipos conhecidos: Cymbopogon nardus var. lenabatu (L.) Rendle,
também conhecido como lenabatu ou citronela do Ceilão, e Cymbopogon
winterianus Jowitt, também denominado maha pengiri ou citronela de Java. Acreditase que ambas se originaram no Ceilão, sendo que a primeira é mais cultivada nessa
ilha, enquanto que a segunda está mais presente em Java, Haiti, Honduras, Taywan,
Guatemala e China. Provavelmente, todos os tipos de citronela se originam de
Cymbopogon congertiflorus, conhecido como mara-grass, de fácil ocorrência no SriLanka (LORENZO et al., 2000; ROCHA et al., 2000). Observa-se um grande
interesse por espécimes de Cymbopogon, amparado pela produção de seu óleo
essencial (ROCHA et al., 2000). Até a primeira parte do século XX, C. nardus era
mais exporado para a produção de óleo. Gradativamente, C. winterianus foi
ocupando uma posição de maior relevância nesse quesito, dominando a preferência
do mercado, por conta do maior rendimento encontrado em seu óleo. Assim, ele
passou a ser cultivado em locais como Haiti, América Central, Pacífico Sul e África
tropical. Mais recentemente, países como o Brasil passaram a contribuir com a
produção do óleo de citronela (LORENZO et al., 2000).
O cultivo de C. winterianus neste país toma importante espaço no mercado de
produtos naturais, devido à grande procura por seu óleo essencial, tanto no mercado
interno quanto para exportação (ROCHA et al.,2000). Nesse lugar, é possível sua
cultura em diferentes regiões geográficas, uma vez que se mostra extremamente
resistente a variações climáticas e a pragas (CASSEL; VARGAS, 2006).
C. winterianus possui entre 0,6% e 1% de óleo essencial em suas folhas
(AZEREDO et al.,2007). A presença desse composto tem influência marcante sobre
as características farmacológicas da espécie vegetal em questão. Quintans-Júnior et
al. (2008) analisaram a composição do óleo essencial de C. winterianus. Seu
trabalho encontrou, como componentes majoritários, o geraniol (40%), citronelal
(27,44%), citronelol (10,45%) e o geranial (8,05%), respondendo por 86% dos
elementos formadores. A distribuição dos constituintes do óleo essencial de C.
27
winterianus irá variar, sob a dependência de inúmeras variáveis, tais como o local da
coleta do produto vegetal, época da colheita, tipo de solo a origem da espécie
vegetal, exposição à luz solar, processamento e temperatura de secagem, dentre
outros (ROCHA et al., 2000).
Esses compostos químicos maiores podem ser isolados, possibilitando uma
melhor exploração comercial de suas propriedades (SHASANY et al., 2000). Os
componentes voláteis do óleo essencial são usados na indústria de perfumaria, de
cosméticos e na fabricação de medicamentos (GUENTHER, 1948; SHASANY et al.,
2000). Suas propriedades farmacológicas permitem utilizá-lo como depressor do
sistema nervoso central e anticonvulsivante (QUNTANS-JÚNIOR, 2008). O citronelol
é excelente aromatizante de ambientes e repelente de insetos, além de apresentar
ação anti-microbiana local e acaricida (MARCO et al., 2007). Outrossim, já se relatou
ser dotado de ação ansiolítica (QUNTANS-JÚNIOR, 2008).
Além das possibilidades de uso já descritas, já é patente o aproveitamento do
óleo essencial de C. winterianus dando combate a patologias resultantes da ação de
fungos. Atualmente, as infecções micóticas estão em expansão, representando uma
questão desafiadora para a Ciência. O óleo essencial da espécie vegetal representa
um eficiente inibidor fúngico, mas as doses necessárias são elevadas em demasiado
para possibilitar seu uso clínico (THANABORIPAT, 2004). Esse aspecto estimula o
aprofundamento de pesquisas para explorar tal possibilidade terapêutica de maneira
viável, trazendo benefícios para a Humanidade.
3.4 Fungos
Os fungos são microrganismos eucarióticos mais complexos, quando
comparados às bactérias e aos vírus. Possuem espessa parede constituída por
quitina e polissacarídeos, além de uma membrana celular, cujo principal componente
é o ergosterol. Essas características peculiares tornam-nos naturalmente mais
resistentes aos antimicrobianos utilizados no combate às infecções causadas por
bactérias (FARIAS; LIMA, 2000; SOUZA, 2004).
28
Esses seres estão dispersos no meio ambiente, em vegetais, ar atmosférico,
solo e água. Embora sejam estimados em 250 mil espécies, menos de 150 foram
descritos como patógenos aos seres humanos (BRASIL, 2009). Estes organismos
são comumente saprófitas do solo e da vegetação, sendo a transmissão de pessoa
para pessoa bastante rara (ALMEIDA; SCULLY, 2002).
Qualquer infecção de origem fúngica é chamada de micose. Esse tipo de
evento tem, geralmente, caráter crônico, de longa duração, uma vez que os fungos
crescem lentamente (TORTORA et al., 2001). No organismo do hospedeiro, em
condições normais, não são danosos à saúde. No entanto, em situações de
imunossupressão ou alterações sistêmicas, alguns assumem o comportamento de
patógenos, causando manifestações infecciosas, que vão desde lesões mucosas
superficiais até disseminações sistêmicas graves e invasivas. Por esse motivo, são
denominados oportunistas (BUDTZ-JORGENSEN, 1990). O comportamento dos
fungos no ambiente tem variado, conforme a época. O uso de regimes
medicamentosos que debilitam o sistema imune, tal como a quimioterapia utilizada
no tratamento do câncer assim como o crescente surgimento de pacientes com
AIDS têm propiciado, recentemente, um aumento significativo de indivíduos
imunossuprimidos, os quais estão altamente sujeitos a infecções fúngicas
generalizadas. Esses microorganismos podem ser classificados em leveduriformes e
filamentosos (FUNGARO, 2000).
Leveduras são fungos capazes de colonizar o homem e outros animais,
estando presentes sobre a pele, trato gastrointestinal e mucosas, vivendo
comensalmente. São seres unicelulares e, frente à perda do equilíbrio parasitahospedeiro, podem causar diversos quadros infecciosos com formas clínicas
localizadas ou disseminadas. O exemplo mais representativo são os organismos do
gênero Candida (BRASIL, 2009).
De modo contrário, fungos filamentosos ou bolores são organismos
multicelulares, portanto, mais desenvolvidos. Possuem como elemento constituinte
básico a hifa, que pode ser septda ou não septada (cenocítica). A partir da hifa,
formam-se esporos para propagação das espécies. Na grande maioria dos fungos,
os esporos podem ser chamados de conídios. Normalmente, não fazem parte da
microbiota animal, e, desse modo, o homem não é um reservatório importante para
29
esse grupo de seres. As portas de entrada no hospedeiro são as vias aéreas
superiores ou soluções de continuidade na barreira epidérmica após traumatismos
com objetos perfuro-cortantes (BRASIL, 2009).
Dependendo da progressão, as micoses podem causar prejuízos em graus
variados para a saúde humana, desde discretos processos localizados até quadros
patológicos generalizados com envolvimento sistêmico, resultando em grandes
mutilações, atingindo até um curso fatal. Diferentemente da maioria das afecções
virais e bacterianas, as doenças causadas por fungos apresentam características
histopatológicas identificáveis, facilitando seu diagnóstico e possibilitando um
tratamento mais precoce (ALMEIRA; SCULLY, 2002). Métodos moleculares,
principalmente aqueles baseados em PCR (Reação em Cadeia de Polimerase) têm
sido adotados na tentativa de melhorar a sensibilidade e especificidade, propiciando
um diagnóstico mais acurado das patologias fúngicas (FUNGARO, 2000).
Os fungos leveduriformes são mais resistentes do que aqueles do tipo
filamentoso (FARIAS; LIMA, 2000; LACAZ et al., 2002). Deste último grupo,
participam representantes de grande relevância tanto do ponto de vista
microbiológico quanto no que tange os aspectos clínicos decorrentes das suas
infecções: Aspergillus.
3.5 Aspergillus
Esse fungo da classe dos Ascomicetos é um tipo de organismo extremamente
comum no ambiente (KRENNMAIR; LENGLINGER, 1995; KHONGKHUNTHIAN;
REICHART, 2001). Sua freqüência sofre influência sazonal, aumentando no outono
e inverno. Tem distribuição universal no ambiente, particularmente no solo, na água,
em cereais e na matéria vegetal em decomposição (FALWORTH; HEROLD, 1996;
DIMITRAKOPOULOS et al., 2005). Microscopicamente, pode ser identificado como
uma estrutura filamentosa com diâmetro de 2 a 4µm. Sua unidade básica é a hifa, e,
a partir desta, formam-se esporos para propagação das espécies. Na grande maioria
dos fungos, os esporos podem ser chamados de conídios (KRENNMAIR;
LENGLINGER, 1995; BRASIL, 2009).
30
Cerca
de 900 espécies
foram identificadas,
mas
apenas
algumas
desempenham o papel de patógenos em humanos. Dentre estas, destacam-se A.
fumigatus, A. flavus, A. niger e A. terreus (KRENNMAIR; LENGLINGER, 1995;
KHONGKHUNTHIAN; REICHART, 2001). Aspergillus é o maior implicado nas
infecções fúngicas do seio maxilar, sendo que A. fumigatus é o tipo mais comum
nesses eventos. Nota-se, porém, que A. flavus está associado às infecções mais
agressivas (FALWORTH; HEROLD, 1996).
Aspergilose se refere a um espectro de doenças que podem ser causadas por
várias espécies de Aspergillus (GUS et al.2005). Sua principal via de inoculação é a
aerogência, dando-se pela inspiração, penetrando no trato respiratório, que é o sítio
primário mais comum. Nesse momento, observa-se um crescimento de caráter
saprofítico, devendo assumir um curso patogênico, desde que haja condições
anaeróbicas predisponentes. Assim, pessoas expostas continuamente ao ambiente
apresentam maior possibilidade de desenvolver tal patologia (DIMITRAKOPOULOS
et al. 2005; RODRÍGUEZ et al. 2008). Meios alternativos de contaminação se dão
através de ferimentos, ou na ocasião da realização de uma cirurgia, quando esse
processo será denominado iatrogênico (NOTANI et al., 2000). No meio hospitalar,
espécies de Aspergillus podem ser isoladas do ar, da poeira acumulada e da
superfície dos ambientes, facilitando a inoculação (MUZYKA; GLICK, 1995).
Exemplos comuns na rotina odontológica se dão pela penetração de materiais
obturadores endodônticos no interior do seio maxilar, ou quando da formação de
uma comunicação buco-sinusal durante a realização de uma extração dentária
(FALWORTH; HEROLD, 1996).
Já foi demonstrado que materiais usados para tratamento de canais
radiculares, notadamente a base de zinco, entrando em contato com a mucosa
sinusal, podem estimular o desenvolvimento de aspergilose. Foi proposto que as
substâncias que continham esse metal em sua formulação induziam o metabolismo
de crescimento para o Aspergillus (KHONGKHUNTHIAN; REICHART, 2001;
YALTIRIK et al., 2003; GIARDINO et al., 2006).
Fatores de risco associados à aspergilose incluem exposição ao patógeno em
pacientes sujeitos a imunocomprometimento por diabetes, antibioticoterapia ou
corticoterapia prolongadas, rádio ou quimioterapia, desnutrição, transplantados em
31
uso de imunossupressores e portadores de patologias imunossupressoras. Em se
havendo imunocompetência, ocorre em pessoas relacionadas a condições
ocupacionais predisponentes, a exemplo de fazendeiros, ou no caso de internações
hospitalares por razões diversas. Sugeriu-se que o aumento da freqüência de suas
notificações pode estar ligado ao aperfeiçoamento das técnicas diagnósticas e ao
melhor
conhecimento
da
doença
por
parte
dos
profissionais
da
saúde
(DIMITRAKOPOULOS et al. 2005; COSTA et al., 2007; RODRIGUEZ et al.,2008).
Assinalou-se também que a instituição de drogas mais eficazes em uso pelos
pacientes infectados pelo vírus HIV e a melhor resposta aos novos protocolos
quimioterápicos para o câncer possibilitaram uma maior expectativa de vida.
Entretanto, essa maior taxa de sobrevida veio acompanhada de um incremento dos
casos de micoses sistêmicas (HELMERHORST et al., 1999).
De acordo com a interação do fungo com as defesas do hospedeiro, há dois
cursos possíveis: o primeiro é o não invasivo, incluindo as formas saprofíticas e
alérgicas em pacientes imunocompetentes, caracterizado por baixas morbidade e
mortalidade; o segundo é o invasivo, onde há penetração tecidual, resultando em
necrose
severa,
preferencialmente
em
pacientes
imunocomprometidos.
(DIMITRAKOPOULOS et al., 2005) A aspergilose invasiva representa uma ameaça
maior à vida em indivíduos debilitados, sendo uma das causas mais comuns de
infecções nesse grupo (WARN et al., 2003).
Os achados variam, segundo a modalidade estudada (MYOKEN et al.2006).
Estabeleceu-se 3 formas clínicas possíveis (KHONGKHUNTHIAN; REICHART,
2001).
3.5.1 Forma alérgica
Essa apresentação tem sintomatologia similar à bronquite alérgica. Acomete
usualmente pessoas jovens, com histórico de asma ou pólipos paranasais.
Clinicamente, resulta em obstruções nasais e sinusite, não respondendo aos
tratamentos usuais. Esse processo se deve a uma reação de hipersensibilidade
mediada por Ig-E (WILLARD et al., 2003).
32
É característico encontrar um paciente com pouca resistência orgânica, com
obstruções sinusal e nasal e, secreção persistente, havendo cefaléia associada.
Exames hematológicos são de grande valia: uma vez que esse processo se deve a
uma reação mediada por Ig-E, o aumento em seus níveis séricos é bastante
elucidativo.
Quadros
de
eosinofilia
também
são
comuns
(KRENNMAIR;
LENGLINGER, 1995; WILLARD et al., 2003).
A terapêutica deve englobar debridamento da mucosa sinusal comprometida
com aumento da ventilação a esse nível, controle da alergia por corticoterapia e
monitoramento dos níveis séricos de Ig-E. Drogas antifúngicas não serão
importantes na obtenção da cura (FALWORTH; HEROLD, 1996; WILLARD et al.,
2003).
3.5.2 Forma não invasiva
Também conhecida como micetoma, aspergiloma ou bola fúngica, é tipo
clínico mais comum, ocorrendo em pessoas saudáveis. Envolve, geralmente, o seio
maxilar, principalmente de modo unilateral, sintomática ou assintomaticamente
(PAGELLA et al., 2007).
Quando há sintomatologia, ela inclui os sintomas clássicos da sinusite
crônica, com secreção nasal, dor e, eventualmente, aumento de volume facial. Nos
quadros assintomáticos, a descoberta é feita de maneira fortuita, em exames
radiográficos de rotina (COSTA et al., 2007). Estes evidenciam uma imagem densa
com aspecto de reação a corpo estranho, também conhecida como antrólito,
localizado no interior da cavidade sinusal. O mesmo decorre da permanência de
sulfato de cálcio ou fosfato de cálcio, que são depositados nas partes necróticas do
micélio, em decorrência do metabolismo micótico (KRENNMAIR; LENGLINGER,
1995; FALWORTH; HEROLD, 1996; KHONGKHUNTHIAN; REICHART, 2001).
Para sua cura, está indicado o debridamento das massas fúngicas, sem que
haja indicação de antimicrobianos sistêmicos (PAGELLA et al., 2007). Advoga-se a
realização de gestos para melhora da drenagem muco-ciliar e da ventilação sinusal,
33
além da eliminação das condições predisponentes. Seu prognóstico é excelente, e
não são esperadas recorrências após a realização do tratamento adequado
(FALWORTH; HEROLD, 1996; WILLARD et al., 2003; COSTA et al., 2007).
A abordagem cirúrgica pode ser realizada de duas maneiras:
- A primeira usa o método de Caldwell-Luc, onde o acesso ao seio maxilar é
dado por trepanação da fossa canina, conferindo um amplo acesso à região de
interesse cirúrgico. É uma técnica mutilante, de uso mais restrito nos dias atuais,
estando reservada para os casos em que a remoção do tecido comprometido não
possa ser conduzida por outras vias (COSTA et al., 2007).
- A outra modalidade é feita por via endoscópica, minimamente invasiva e
com taxas de complicação mais baixas. É considerada a técnica mais adequada
para tratar essas afecções. (PAGELLA et al., 2007) O acesso trans-operatório e a
via para drenagem e ventilação se fazem pelo óstio maxilar, constante da anatomia
natural do seio. Seu único senão se refere à limitação de acesso ao ângulo entre o
suporte ósseo do ducto lacrimal e a parede anterior do seio, onde a permanência de
remanescentes micóticos pode predispor a recorrências (COSTA et al., 2007).
3.5.3 Forma invasiva
É também denominada aspergilose fulminante (XAVIER et al.,2009). A forma
invasiva de infecção por Aspergillus atinge pacientes imunocomprometidos podendo
acometê-los de diferentes maneiras: se envolve o tecido pulmonar, cujo acesso se
dá via vasos sangüíneos, resultará em broncopneumonia. Se presente nos seios
paranasais encontramos congestão nasal, edema facial, dores e febre alta
(MYOKEN et al.2006). Essa patologia pode invadir a parede dos vasos sangüíneos,
provocando sua ruptura ou mesmo a ocorrência de fenômenos trombóticos (NOTANI
et al., 2000).
Exames complementares, como radiografias convencionais, tomografia
computadorizada e ressonância magnética, evidenciam um processo em evolução,
34
cuja agressividade leva à destruição óssea, com possível invasão das estruturas
vitais adjacentes (OGATA et al., 1997; DIMITRAKOPOULOS et al., 2005;
RODRÍGUEZ et al. 2008).
A evolução esfenoidal isolada é pouco comum, dada a pouca aeração dessa
estrutura, e, em ocorrendo, terá caráter ameaçador. Clinicamente, pode-se relatar
cefaléia, dor retroocular, diplopia, exoftalmia e cegueira. Tais achados oftalmológicos
devem-se ao envolvimento do nervo óptico, sendo característicos do tipo de
extensão mencionada.
A partir desse ponto, a invasão craniana pode ocorrer
rapidamente (RODRÍGUEZ et al., 2008).
A aspergilose orbitária é mais comum em pacientes com baixa resistência
orgânica. Tem curso rápido, podendo ser confundido com outros processos locais,
como fenômenos inflamatórios e neoplásicos (GUS et al., 2005).
Em casos avançados, com penetração na cavidade craniana, o processo é
geralmente desfavorável, incorrendo, facilmente, na morte do paciente, a despeito
da realização de debridamentos extensos e de terapia antifúngica maciça
(DIMITRAKOPOULOS et al. 2005, MARINOVIC, et al., 2007). Um dos fatores
desfavoráveis é a baixa difusão de drogas antifúngicas nos tecidos do sistema
nervoso central. Um novo antifúngico, o voriconazol parece ser mais efetivo nesse
quesito, prometendo uma melhor penetração na região mencionada (MARINOVIC, et
al., 2007).
O envolvimento da cavidade craniana se dá por 3 vias distintas: na primeira
delas, há a propagação a partir de focos primários distantes, notadamente
pulmonares, através da corrente sangüínea, sendo essa modalidade também
denominada hematogênica; no segundo caso, tem-se uma extensão direta a partir
de áreas primariamente contaminadas pelos microorganismos, tendo-se como
exemplo mais comum a dispersão de Aspergillus presentes nos seios paranasais em
direção a estruturas nobres adjacentes, tais como os globos oculares ou a base do
crânio, configurando uma situação clínica de extrema gravidade; na terceira
possibilidade, temos uma infecção direta no momento de um procedimento
neurocirúrgico, sendo esta também denominada via iatrogênica (NOTANI et al.,
2000).
35
Para que haja uma evolução benigna, a constatação precoce da doença é
essencial, permitindo abordagens cirúrgicas e medicamentosas maciças (MYOKEN
et al., 2006; XAVIER et al., 2009). Seu diagnóstico diferencial deve incluir
mucormicoses, infecções por pseudomonas e doença de Weneger (FALWORTH;
HEROLD, 1996).
O tratamento de escolha preconiza a curetagem total dos tecidos necróticos e
a terapêutica antifúngica tópica e sistêmica. A despeito da realização de protocolos
vigorosos, o curso fatal é comum, principalmente pela demora entre o início do
processo e a instituição dos primeiros cuidados (KHONGKHUNTHIAN; REICHART,
2001; DIMITRAKOPOULOS et al. 2005; XAVIER et al., 2009).
A despeito das evidências clínicas bem estabelecidas, em qualquer das
apresentações, a certeza só poderá ser dada pela coleta de material e posterior
análise histológica (KRENNMAIR; LENGLINGER, 1995; NOTANI et al., 2000;
RODRÍGUEZ et al. 2008).
3.6 Antifúngicos
Uma vez estabelecida a infecção, sempre há a possibilidade de agravamento
do processo por disseminação para regiões nobres, como a cavidade craniana, quer
seja por via hematogênica, quando a apresentação de origem é a forma pulmonar,
ou por extensão direta pela contigüidade anatômica, nas infecções sinusais. Isto
posto, a abordagem invasiva necessita de valiosa terapêutica adjuvante,
representada pela administração de antifúngicos.
A maioria das micoses responde bem à terapia tópica ou sistêmica com
polienos ou azóis. Em geral, a administração oral de drogas em infecções fúngicas
foi revolucionada pelo grupo dos triazóis, fluconazol e itraconazol (SAMARANAYAKE
et al., 2009), particularmente em pacientes portadores de HIV (GREENBERG et al.,
2008).
A
eficácia
limitada
das
drogas
antifúngicas
disponíveis
contra
os
microorganismos causadores de micoses severas, principalmente em pacientes
36
imunodeprimidos, está ligada ao desenvolvimento rápido de seres resistentes,
diminuindo a capacidade terapêutica dessas substâncias (SVETAZ et al., 2007).
Apesar do aumento do número de antimicóticos comercialmente disponíveis
nos últimos
anos, esses ainda se encontram sub-representados, quando
comparados ao contingente de drogas antibacterianas. Ao mesmo tempo, a
resistência aos antifúngicos tradicionais tem representado um grande desafio para a
clínica (BATISTA et al., 1999). O tratamento convencional para as doenças fúngicas
é muito restrito, particularmente devido ao espectro diminuído dos antifúngicos
atuais e por conta do alto custo do tratamento, ainda mais quando se necessita de
um uso mais prolongado. Esses fatores vêm encorajar a adoção de novas
terapêuticas, dentre elas, o emprego mais extenso de produtos naturais (SILVA et
al., 2008).
Os antifúngicos mais conhecidos pertencem às classes dos compostos
poliênicos, azólicos e ecocardinas (MUZYKA; GLICK, 1995; PATTERSON, 2006):
a) Poliênicos: principalmente representados pela nistatina e anfotericina-B;
b) Azólicos: esse grupo se divide em imidiazólicos (clotrimazol, miconazol e
cetoconazol) e triazólicos (fluconazol, itraconazol e voriconazol)
c) Ecocardinas: os mais citados são a caspofungina, micafungina e a
anidulafungina.
O tratamento farmacológico das aspergiloses invasivas está ricamente
documentado, e a primeira escolha recai sobre anfotericina-B, fluconazol e
itraconazol (ALMEIDA; SCULLY, 2002; RAMIREZ et al., 2004).
A anfotericina-B foi, por mais de quatro décadas, primeira escolha para o
combate à aspergilose, mas as altas doses necessárias, juntamente com a com
nefrotoxicidade associada e o aparecimento de microorganismos resistentes vêm
desestimulando seu uso (MYOKEN et al., 2006; PATTERSON, 2006).
37
O uso do fluconazol tem sido desencorajado devido à emergência de
organismos
resistentes
à
substância,
(SAMARANAYAKE
et
al.,
2009),
particularmente em pacientes portadores de HIV (GREENBERG et al., 2008).
Apesar da eficácia do itraconazol sobre Aspergillus, seu uso clínico sobre
pacientes severamente acometidos fica bastante comprometido, devido à presença
de interações medicamentosas, toxicidade e pela biodisponibilidade inadequada da
suspensão oral (PATTERSON, 2006).
Novas drogas, a exemplo do Voriconazol prometem resultados alentadores no
tratamento de leveduras e de fungos filamentosos, mas essa afirmação ainda carece
de fundamentação científica (SERRANO et al., 2004; RODRIGUEZ et al., 2008).
Sendo assim, tem aumentado o número de pesquisas que apontam para o
surgimento de cepas resistentes aos antifúngicos convencionais (JORGE, 1998), e,
considerando a grande importância clínica dada às micoses, faz-se mister estudar
de forma mais aprofundada o potencial antifúngico existente em compostos oriundos
de espécies vegetais, ditas medicinais. Importa que sejam antifúngicos potentes e
que possam ser usados para a produção de fármacos eficientes, seguros, estáveis e
com pouca ou nenhuma toxicidade (ARRUDA, 2006).
3.7 Estudo de Associação - Checkerboard
O tratamento das infecções por Aspergillus se mostra um fator de impacto
para a ciência atual, tanto em se baseando na agressividade demonstrada por esse
microorganismo como em se tomando em nota o surgimento de espécies resistentes
às
drogas
tradicionalmente
usadas
para
esse
fim
(KHONGKHUNTHIAN;
REICHART, 2001; WARN et al., 2003; DIMITRAKOPOULOS et al., 2005;
MARINOVIC et al., 2007; SVETAZ et al., 2007; XAVIER et al., 2009;).
O combate a organismos patógenos refratários é um problema emergente nos
dias atuais e se baseia em duas possibilidades: o desenvolvimento de novas drogas
antimicrobianas ou a combinação de substâncias já existentes (DRAGO et al., 2007).
38
Outra indicação muito precisa para a adoção da terapia combinada ocorre naqueles
casos onde o caráter etólógico é polimicribiano, dificultando a obtenção da cura pela
monoterapia (MITSUGUI et al., 2008).
O uso combinado de agentes antimicrobianos é uma prática comum na rotina
clínica. Esse recurso buscará sempre um incremento no papel terapêutico das
drogas (NIGHTINGALE et al., 2007). A associação de antibióticos é realizada com
base na susceptibilidade microbiana, pois a potencialização do efeito antimicrobiano
é usualmente obtida quando o microrganismo é susceptível a cada uma das drogas
adotadas. Porém, diferentes estudos têm demonstrado o aumento deste efeito,
quando combinações de antibióticos são adicionadas, tanto em culturas de amostras
bacterianas sensíveis quanto em amostras resistentes aos agentes testados
(MITSUGUI et al., 2008).
A maior vantagem dessa estratégia reside em uma esperada ampliação dos
espectros de ação dos dois antibióticos e na prevenção da emergência de
organismos resistentes (DRAGO et al., 2007). Entretanto, se em alguns casos a
combinação de drogas tem resultado benéfico e em outras situações tal fato não
ocorre, seria de grande valia conhecer o mecanismo que determina o sinergismo
entre drogas, de modo a predizer quando uma associação será útil ou não
(NIGHTINGALE et al., 2007).
A realização dessa combinação racional de drogas antimicrobianas pode-se
mostrar uma decisão grandemente benéfica para se traçar estratégias de combate a
infecções causadas por organismos pouco sensíveis às terapêuticas convencionais.
39
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local do Estudo
As análises referentes ao estudo da atividade antifúngica dos produtos
naturais
selecionados
foram
realizadas
no
Laboratório
de
Micologia
do
Departamento de Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal da Paraíba, que disponibilizou as cepas de A. fumigatus e de
A. flavus. Os ensaios tiveram início em novembro de 2009, sendo concluídos em março
de 2010.
4.2 Produto Natural Testado
A espécie vegetal de Cymbopogon winteriaunus foi selecionada para a
obtenção e utilização do óleo essencial de suas folhas com base em informações
registradas na literatura quanto às suas conhecidas atividades farmacológicas e ao
seu
uso
na
medicina
popular
como
acaricida,
repelente
e
antimicótico
(THANABORIPAT et al., 2004; MARCO et al., 2007; QUINTANS-JÚNIOR et al.,
2008).
As folhas da planta foram coletadas em fevereiro de 2007, no setor de agricultura
do CFT na cidade de Bananeiras, uma região localizada na microrregião do Brejo,
incluída na mesorregião Agreste do estado da Paraíba. Esta espécie foi identificada
pela Dra. Rita Baltazar de Lima, do Laboratório de Botânica do Departamento
de Sistemática e Ecologia do Centro de Ciências Exatas e registrada no Herbário
Prof. Lauro Pires Xavier, onde uma exsicata da mesma foi depositada com o registro
JPB 41387.
40
4.3 Óleo Essencial
O óleo essencial de C. winteriaunus utilizado nos ensaios biológicos foi
disponibilizado pelo Dr. Paulo Alves Wanderley, do CFT, Campus III de Bananeiras-PB.
As folhas frescas de C. winterianus (100g) foram cortadas em pequenas unidades e
submetidas a hidrodestilação utilizando um aparelho de Clevenger ®. O óleo
essencial apresentou isenção de resíduos, densidade de 0,8790g/mL, odor
característico e coloração verde clara. O óleo foi conservado em um frasco âmbar e
mantido sob refrigeração, a uma temperatura inferior a 4ºC.
As emulsões do óleo essencial nas diferentes concentrações foram
preparadas no momento de execução dos ensaios. Em um tubo de ensaio
esterilizado, foi adicionado 30µL do óleo essencial, 0,04mL de Tween 80 como
agente emulsificante e quantidade suficiente para 3mL de água destilada estéril. A
mistura foi agitada por 5 minutos utilizando o aparelho Vortex ®, obtendo uma
emulsão de concentração final de 10000 µg/mL. A partir desta, obtiveram-se as
concentrações inferiores realizando diluições seriadas em razão de dois (ALLEGRINI
et al.,1973).
4.3.1 Análise do óleo essencial
A análise do óleo essencial de C. winterianus foi realizada no Laboratório de
Química Fundamental da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), por
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG - EM), utilizando o
instrumento QP-5050 ® equipado com um GC-17A - Shimadzu ® – Japão
(MCLAFFERTY; STAUFFER, 1989; ADAMS, 1995). A composição do óleo será
descrita a seguir (QUADRO 1):
41
_____________________________________________________________________________________________________
Picos
Composto
Percentual (%)
Peso molecular
Tempo de retenção(min)
1
2-metil-2-hepten-6-ona
0,13
126
6,99
2
β-mirceno
0,07
136
7,18
3
limoneno
3,39
136
8,58
4
linalol
1,34
136
11,13
5
citronelal
23,59
154
13,81
6
citronelol
11,74
156
17,00
7
geraniol
18,81
139
18,65
8
acetato de citronelil
5,29
138
22,30
9
β-elemeno
6,40
189
22,50
10
eugenol
10,34
164
23,96
11
germacreno
2,63
204
27,69
12
∆-cadineno
2,63
204
27,69
13
elemol
6,73
204
30,67
14
endo-bourbonanol
1,01
222
31,52
15
farnesol
0,60
204
33,01
16
y-eudesmol
1,00
222
33,66
17
torreyol
1,65
204
34,08
18
trans-farnesol
3,01
222
34,69
QUADRO 1. Componentes do óleo essencial das folhas de C. winterianus.
FONTE: Pereira, 2009.
4.4 Fármacos Antifúngicos
Nesta pesquisa, foram utilizados como controle positivo ou drogas padrão a
anfotericina B e o fluconazol, adquiridas sob forma de pó. As soluções foram
preparadas no momento da execução dos testes para o alcance da concentração
desejada nos testes de sensibilidade.
42
4.5 Microrganismos
Para os ensaios de atividade antifúngica do óleo essencial, foram
selecionadas cepas de fungos do gênero Aspergillus de meio ambiente, isoladas no
Laboratório de Micologia do Centro de Ciências da Saúde – UFPB e cepas-padrão
da American Type Culture Collection – ATCC, incluindo:

A. fumigatus:
- ATCC 16913
- ATCC 46913
- ATCC 40640
- IPP 210

A. flavus:
- ATCC 16013
- LM 907
4.6 Meio de cultura
O meio de cultura usado nos ensaios para determinação da atividade
antifúngica foi ágar Sabouraud e caldo Sabouraud dextrose a 2% ASD
(Difco Laboratories Ltda - Detroit / USA), preparado conforme as instruções do
fabricante. O mesmo foi solubilizado e distribuído em balões de fundo chato com
capacidade para 250mL e autoclavados a 121ºC por 15 minutos.
43
4.7 Inóculo das Espécies Fúngicas
Para o inóculo, as cepas fúngicas foram selecionadas e mantidas em ágar
Sabouraud inclinado durante 7-14 dias a temperatura ambiente. Inicialmente, foram
preparadas suspensões das cepas em tubos de ensaio contendo 10mL de solução
contendo salina (NaCl a 0,9%) estéril. Em seguida, tais suspensões foram agitadas
durante 2 minutos com auxílio do aparelho Vortex ®. Após esse momento, cada
suspensão foi comparada e ajustada à turbidez apresentada pela solução de sulfato
de bário do tubo 0,5 da escala Mcfarland, que corresponde a um inóculo de
aproximadamente 106UFC/mL (FROMTLING et al., 1983; DRUTZ, 1987; ODDS,
1989; CLEELAND; SQUIRES, 1991). Ensaios preliminares mostraram que tais
concentrações celulares, determinadas através do uso da câmara de Newbaeuer,
equivalem à leitura de 90% de transmitância em espectrofotômetro a 530nm (LIMA,
1996; NCCLS, 2000; BELÉM, 2001).
44
5 METODOLOGIA
5.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) - Técnica da
Microdiluição
A determinação das CIMs dos produtos estudados frente às espécies
fúngicas testadas foram realizadas através da técnica da Microdiluição em placa de
96 orifícios e fundo em “U” com tampa, esterilizadas (INLAB/Indústria Brasileira). A
CIM do óleo essencial de C. winterianus já fora estabelecida por estudo realizado no
mesmo laboratório anteriormente, correspondendo a 312µg/mL (OLIVEIRA, 2011).
Para os produtos sintéticos, distribuiu-se, inicialmente, 100 µL de caldo Sabouraud
Dextrose, duplamente concentrado, a partir da primeira coluna (A) até a sexta (F).
Cada placa se prestou ao cálculo da CIM de uma substância sintética em estudo –
anfotericina B e fluconazol. Em seguida, foram distribuídos 100 µL das drogas
antifúngicas sintéticas (anfotericina B e fluconazol), na concentração inicial
estabelecida de 5.000 µg/mL, duplamente concentrada, na primeira linha das
cavidades - A1 até F1.
A linha 12 serviu de controle de crescimento, onde foi adicionado o meio com
o inóculo, sem a adição dos antifúngicos. A partir da concentração inicial, foram
feitas as diluições seriadas à razão de 2 nas cavidades das linhas de 1 a 11,
obtendo-se as concentrações de 5.000 até 4,25µg/mL.
O ensaio foi realizado em duplicata e incubado a temperatura ambiente
durante 4 dias. Após o tempo de incubação adequado dos ensaios, foi realizada a
primeira leitura dos resultados (BANSOD; RAI, 2008).
45
5.2 Ensaio de Sinergismo – Método de Checkerboard
O efeito combinado das substâncias sintéticas com o óleo essencial de
C. winterianus foi determinado a partir da técnica de diluição Checkerboard para
derivação do Índice de Concentração Inibitória Fracionada (Índice CIF).
As suspensões de A. fumigatus e A. flavus foram padronizadas pela escala
6
10 McFarland. Foram utilizadas soluções dos produtos testados em concentrações
determinadas a partir de suas respectivas CIMs. Inicialmente, adicionamos 100 µL
do meio de cultura Saboraud dextrose nos poços da microplaca estéril. Em seguida,
50 µL de cada produto testado, em diluições seriadas, foram dispostos de maneira
ordenada: no sentido horizontal, da direita para a esquerda, há decréscimo da
CIM do óleo essencial, e, no vertical, de cima para baixo, das drogas sintéticas.
(ESQUEMA 1). O resultado mostra que, em cada poço, teremos uma combinação
única de concentrações entre as duas substâncias (óleo e droga). (NIGHTINGALE et
al., 2007).
A Concentração Inibitória Fracionária (CIF) vai ser calculada através da soma
do CIFA + CIFB. O CIFA, por sua vez, é calculado através da relação CIMA
combinado/ CIMA sozinho, enquanto que o CIFB = CIMB combinado/CIMB sozinho.
Este índice é interpretado da seguinte forma: sinergismo (<1), aditividade (=1),
indiferença (>1 ou antagonismo (>1) (SINGH, 2000).
Finalmente, o meio de cultura foi inoculado com 10 µL da suspensão fúngica.
O crescimento fúngico se evidenciou através do método visual. O ensaio foi
realizado em triplicata, e as placas foram incubadas para posterior análise
(ELIOPOULOS; MOELLERING, 1991; DUTTA et al., 2004; NIGHTINGALE et al.,
2007).
46
ESQUEMA 1 Representação da associação entre os antifúngicos sintéticos e
o óleo essencial pelo método de Checkerboard.
CIM x 8
CIM x 8 O.E.
+
CIM / 8 Drg
CIM x 8 O.E.
+
CIM / 4 Drg
CIM x 8 O.E.
+
CIM / 2 Drg
CIM x 8 O.E.
+
CIM Drg
CIM x 8 O.E.
+
CIM x 2 Drg
CIM x 8 O.E.
+
CIM x 4 Drg
CIM x 8 O.E.
+
CIM x 8 Drg
CIM x 4
CIM x 4 O.E.
+
CIM / 8 Drg
CIM x 4 O.E.
+
CIM / 4 Drg
CIM x 4 O.E.
+
CIM / 2 Drg
CIM x 4 O.E.
+
CIM Drg
CIM x 4 O.E.
+
CIM x 2 Drg
CIM x 4 O.E.
+
CIM x 4 Drg
CIM x 4 O.E.
+
CIM x 8 Drg
CIM x 2
CIM x 2 O.E.
+
CIM / 8 Drg
CIM x 2 O.E.
+
CIM / 4 Drg
CIM x 2 O.E.
+
CIM / 2 Drg
CIM x 2 O.E.
+
CIM Drg
CIM x 2 O.E.
+
CIM x 2 Drg
CIM x 2 O.E.
+
CIM x 4 Drg
CIM x 2 O.E.
+
CIM x 8 Drg
CIM O.E.
+
CIM / 8 Drg
CIM O.E.
+
CIM / 4 Drg
CIM O.E.
+
CIM / 2 Drg
CIM O.E.
+
CIM Drg
CIM O.E.
+
CIM x 2 Drg
CIM O.E.
+
CIM x 4 Drg
CIM O.E.
+
CIM x 8 Drg
CIM / 2
CIM / 2 O.E.
+
CIM / 8 Drg
CIM / 2 O.E.
+
CIM / 4 Drg
CIM / 2 O.E.
+
CIM / 2 Drg
CIM / 2 O.E.
+
CIM Drg
]
CIM / 2 O.E.
+
CIM x 2 Drg
CIM / 2 O.E.
+
CIM x 4 Drg
CIM / 2 O.E.
+
CIM x 8 Drg
CIM / 4
CIM / 4 O.E.
+
CIM / 8 Drg
CIM / 4 O.E.
+
CIM / 4 Drg
CIM / 4 O.E.
+
CIM / 2 Drg
CIM / 4 O.E.
+
CIM Drg
CIM / 4 O.E.
+
CIM x 2 Drg
CIM / 4 O.E.
+
CIM x 4 Drg
CIM / 4 O.E.
+
CIM x 8 Drg
CIM / 8
CIM / 8 O.E.
+
CIM / 8 Drg
CIM / 8 O.E.
+
CIM / 4 Drg
CIM / 8 O.E.
+
CIM / 2 Drg
CIM / 8 O.E.
+
CIM Drg
CIM / 8 O.E.
+
CIM x 2 Drg
CIM / 8 O.E.
+
CIM x 4 Drg
CIM / 8 O.E.
+
CIM x 8 Drg
CIM / 8
CIM / 4
CIM / 2
CIM
DROGA
CIM x 2
CIM x 4
CIM x 8
CIM
ÓLEO
47
5.3 Interferência da Associação do Óleo essencial com os Antifúngicos Padrão
sobre o Crescimento Micelial Radial Fúngico
A inibição do crescimento micelial das cepas dos fungos filamentosos foi
determinada pela diluição em meio sólido através da medida diária do crescimento
radial do micélio em ágar Sabouraud adicionado da associação do óleo essencial
e com cada antifúngico padrão separadamente. Desse modo, a quantidade de cada
produto adicionada foi ajustada para apresentar uma concentração final similar ao
valor das CIM, CIM x 2 e CIM x 4 previamente determinadas. Para a execução
da técnica, inicialmente, foram preparadas placas de Petri estéreis, contendo o meio
de cultura (ASD) fundido e resfriado a 45 - 50ºC, adicionado das diferentes
associações. Após solidificação do meio de cultura, partindo-se de culturas recentes,
foi retirado um fragmento da colônia de cada fungo selecionado para estudo
de, aproximadamente, 2mm de diâmetro. Escolheu-se apenas as associações que,
no ensaio de associação checkerboard apresentaram resultados satisfatórios
(aditividade ou sinergismo).
As combinações onde se encontrou indiferença ou
antagonismo foram excluídas dessa etapa do estudo. O sistema foi incubado a
temperatura ambiente (28 – 30ºC) por 7 dias. Em intervalos temporais diários
(0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 dias após a incubação), o crescimento micelial radial da colônia
fúngica foi medido, e o resultado expresso em milímetros (ADAM et al., 1998;
HADACEK; GREGER, 2000; DAFERERA et al., 2003). O controle incluído neste
ensaio consistiu na observação do crescimento micelial radial da cepa fúngica em
ágar Sabouraud sem adição do óleo essencial ou das drogas estudadas anfotericina B e fluconazol (FIGURA 2).
48
INÓCULO
(2mm)
MEIO
+
ASSOCIAÇÃO
INÓCULO
(2mm)
INÓCULO
(>2mm)
FIGURA 2: Fluxograma do ensaio da cinética da morte microbiana.
5.4 Tratamento Estatístico
A técnica estatística empregada na análise dos dados foi uma estatística
descritiva e os resultados obtidos foram organizados em tabelas e gráficos.
49
6 RESULTADOS
6.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos Antifúngicos
Padrão
Foram determinadas as concentrações inibitórias mínimas das substâncias
antifúngicas padrão (anfotericina B e fluconazol), de acordo com sua interação com
as cepas estudadas.
Os resultados mostram que a anfotericina B apresentou
inibição de 100% das cepas à concentração de 625µg/mL, ao passo que a
312µg/mL, apenas 66,6% dos microorganismos foram inibidos. Em relação ao
fluconazol, a 2500µg/mL, 100% das cepas foram inibidas, sem que qualquer inibição
parcial fosse observada em menores concentrações (TABELAS 2 e 3).
TABELA 1 - Concentração inibitória mínima de anfotericina B sobre cepas de
Aspergillus
A. fumigatus
A. fumigatus
A. fumigatus
A. fumigatus
A.Flavus
A.flavus
ATCC 16913
ATCC 46913
IPP 210
ATCC 40640
ATCC 16013
LM907
5000 µg/Ml
-
-
-
-
-
-
2500 µg/Ml
-
-
-
-
-
-
1250 µg/mL
-
-
-
-
-
-
625 µg/mL
-
-
-
-
-
-
312 µg/mL
-
-
+
-
-
+
156 µg/mL
+
+
+
-
-
+
78 µg/mL
+
+
+
+
-
+
39 µg/mL
+
+
+
+
-
+
19 µg/mL
+
+
+
+
+
+
9,5 µg/mL
+
+
+
+
+
+
4,25 µg/mL
+
+
+
+
+
+
Controle
+
+
+
+
+
+
(meio + inóculo)
- : inibição do crescimento do microorganismo
+ : crescimento do microorganismo
50
TABELA 2 - Concentração inibitória mínima do fluconazol sobre cepas de
Aspergillus:
A. fumigatus
A. fumigatus
A. fumigatus
A. fumigatus
A.Flavus
A.flavus
ATCC 16913
ATCC 46913
IPP 210
ATCC 40640
ATCC 16013
LM907
5000 µg/mL
-
-
-
-
-
-
2500 µg/mL
-
-
-
-
-
-
1250 µg/mL
+
+
+
+
+
+
625 µg/mL
+
+
+
+
+
+
312 µg/mL
+
+
+
+
+
+
156 µg/mL
+
+
+
+
+
+
78 µg/mL
+
+
+
+
+
+
39 µg/mL
+
+
+
+
+
+
19 µg/mL
+
+
+
+
+
+
9,5 µg/mL
+
+
+
+
+
+
4,25
+
+
+
+
+
+
Controle
+
+
+
+
+
+
(meio + inóculo)
- : inibição do crescimento do microorganismo
+ : crescimento do microorganismo
6.2 Determinação da Concentração Inibitória Fracionária (CIF) da Associação
entre os Antifúngicos Sintéticos e o Óleo Essencial pelo Método
Checkerboard
Os ensaios mostraram que a associação entre o óleo essencial de
C. winterianus e as substâncias antifúngicas no combate a cepas de A. fumigatus
(ATCC 16913) e de A. flavus (ATCC 16013) mostraram interações bem
51
contrastantes. A associação do óleo essencial com a anfotericina B sobre A.
fumigatus apresentou duas situações equivalentes onde houve uma maior redução
da concentração das drogas, sempre com uma relação de sinergismo entre as
substâncias (ESQUEMA 2). Já A. flavus se mostrou mais refratária à ação da
mesma combinação, registrando-se uma resposta antagonista entre os compostos
(ESQUEMA 3). Por seu turno, o fluconazol exibiu sinergismo sobre os dois
microrganismos analisados. O comportamento para cada combinação efetuada está
demonstrado a seguir (ESQUEMAS 4 e 5):
ESQUEMA 2 - Associação entre o óleo essencial de C. winterianus e a
anfotericina B sobre A. fumigatus (ATCC 16913).
2500
µg/mL
+
-
-
-
-
-
-
-
1250
µg/mL
+
-
-
-
-
-
-
+
+
+
-
-
-
-
-
+
+
+
-
-
+
-
-
+
+
+
-
-
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
78
µg/mL
156
µg/mL
312
µg/mL
625
µg/mL
312
µg/mL
156
µg/mL
78µg/mL
39
µg/mL
Óleo ↑
Anfotericina B →
- : inibição do crescimento do microorganismo
+ : crescimento do microorganismo
625
µg/mL
1250
µg/mL
2500
µg/mL
5000
µg/mL
52
ESQUEMA 3 - Associação entre o óleo essencial de C. winterianus
e anfotericina B sobre A. flavus (ATCC 16013).
2500
µg/mL
-
-
-
-
-
-
-
-
1250
µg/mL
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
156
µg/mL
312
µg/mL
625
µg/mL
1250
µg/mL
625
µg/mL
312
µg/mL
156
µg/mL
78
µg/mL
39
µg/mL
Óleo ↑
Anfotericina B →
78
µg/mL
- : inibição do crescimento do microorganismo
+ : crescimento do microorganismo
2500
µg/mL
5000
µg/mL
53
ESQUEMA 4 - Associação entre o óleo essencial de C. winterianus e o
fluconazol sobre A. fumigatus (ATCC 16913).
2500
µg/mL
1250
µg/mL
625
µg/mL
312
µg/mL
156
µg/mL
78
µg/mL
39
µg/mL
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
312
µg/mL
625
µg/mL
1250
µg/mL
Óleo ↑
Fluconazol →
-
-
-
-
2500
µg/mL
5000
µg/mL
10000
µg/mL
20000
µg/mL
- : inibição do crescimento do microorganismo
+ : crescimento do microorganismo
54
ESQUEMA 5: Associação entre o óleo essencial de C. winterianus e
o fluconazol sobre A. flavus (ATCC 16013).
2560
µg/mL
1250
µg/mL
625
µg/mL
312
µg/mL
156
µg/mL
78
µg/mL
39
µg/mL
Óleo ↑
-
+
+
+
-
-
-
-
-
+
+
+
-
-
-
-
-
+
+
+
-
-
-
-
-
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
625
µg/mL
1250
µg/mL
2500
µg/mL
5000
µg/mL
10000
µg/mL
20000
µg/mL
312
Fluconazol → µg/mL
- : inibição do crescimento do microorganismo
+ : crescimento do microorganismo
55
A interpretação dos achados das associações pelo método de Checkerboard
está descrito a seguir (TABELAS 3 e 4):
TABELA 3 - Determinação da concentração inibitória fracionária da associação entre
o óleo essencial de C. winterianus e a anfotericina B sobre cepas de
Aspergillus
CIF O.E.
C. winterianus
CIF
Anfotericina B
CIF
associação
Tipo de
interação
A. fumigatus
(ATCC 16913)
0,25
0,5
0,75
SINERGISMO
A. fumigatus
(ATCC 16913)
0,5
0,25
0,75
SINERGISMO
A. flavus
(ATCC16013)
1
0,5
1,5
ANTAGONISMO
CEPA
TABELA 4 - Determinação da concentração inibitória fracionária da associação entre
o óleo essencial de C. winterianus e o fluconazol sobre cepas de
Aspergillus
CIF O.E.
C. winterianus
CIF
Fluconazol
CIF
associação
Tipo de
interação
A. fumigatus
(ATCC 16913)
0,125
0,5
0,625
SINERGISMO
A. flavus
(ATCC16013)
0,125
0,5
0,625
SINERGISMO
CEPA
6.3 Interferência da Associação do Óleo Essencial com os Antifúngicos
Padrão sobre o Crescimento Micelial Radial Fúngico
Para esta etapa do trabalho, considerou-se selecionar apenas as associações
que apresentaram resultados positivos (sinergismo ou aditividade), descartando-se
aquelas onde os achados não eram relevantes (antagonismo).
56
A interação entre A. fumigatus com a associação entre o óleo essencial
de C. winterianus com a anfotericina B é descrita a seguir (TABELAS 5, 6)
(GRÁFICO 1):
TABELA 5 - Crescimento radial fúngico de A. fumigatus na presença da associação
entre o óleo essencial de C. winterianus e a anfotericina B (em mm):
TEMPO/CONCENTRAÇÃO
CIM
CIM x 2
CIM x 4
Controle
Dia 0
2
2
2
2
Dia 1
7
7
7
16
Dia 2
18
15
10
40
Dia 3
30
24
17
55
Dia 4
33
29
20
65
Dia 5
35
31
23
70
Dia 6
35
34
23
80
Dia 7
37
35
26
85
TABELA 6 – Grau de inibição de A. fumigatus pela associação entre o óleo essencial
de C. winterianus e a anfotericina B em relação ao controle (em %):
TEMPO/CONCENTRAÇÃO
CIM
CIM x 2
CIM x 4
Dia 1
64%
64%
64%
Dia 2
58%
66%
79%
Dia 3
47%
58,4%
72%
Dia 4
51%
57%
71,4%
Dia 5
51,4%
57,3%
69%
Dia 6
58%
59%
73%
Dia 7
60%
60%
71%
Diâm etro do crescim ento radial
57
90
80
70
60
50
CIM
40
CIM X 2
30
CIM X 4
20
Controle
10
0
10
21
32
43
54
6 5
7 6
8 7
Dias
GRÁFICO 1 - Crescimento radial fúngico de A. fumigatus na presença da associação entre o óleo
essencial de C. winterianus e anfotericina B.
O comportamento de A. fumigatus na presença do óleo essencial de
C. winterianus combinado com o fluconazol pode ser evidenciado a seguir
(TABELAS 7, 8) (GRÁFICO 2):
TABELA 7 - Crescimento radial fúngico de A. fumigatus na presença da associação
entre o óleo essencial de C. winterianus e fluconazol (em mm):
TEMPO/CONCENTRAÇÃO
CIM
CIM x 2
CIM x 4
Controle
Dia 0
2
2
2
2
Dia 1
5
4
2
16
Dia 2
7
4
2
40
Dia 3
10
4
2
55
Dia 4
11
5
2
65
Dia 5
12
8
2
70
Dia 6
13
10
2
80
Dia 7
15
13
2
85
58
TABELA 8 – Grau de inibição de A. fumigatus pela associação do óleo essencial de
C. winterianus com fluconazol em relação ao controle (em %):
TEMPO/CONCENTRAÇÃO
CIM
CIM x 2
CIM x 4
Dia 1
79%
86%
100%
Dia 2
87%
95%
100%
Dia 3
85%
96%
100%
Dia 4
86%
95%
100%
Dia 5
85%
91%
100%
Dia 6
86%
90%
100%
Dia 7
84%
87%
100%
Diâmetro do crescimento radial
90
80
70
60
CIM
50
CIM X 2
40
CIM X 4
30
Controle
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Dias
GRÁFICO 2 - Crescimento radial fúngico de A. fumigatus na presença da associação entre o óleo
essencial de C. winterianus e o fluconazol
59
Os achados para a interação entre a ação combinada do óleo essencial de C.
winterianus com o fluconazol no combate a A. flavus serão expostos abaixo
(TABELAS 9, 10) (GRÁFICO 3):
TABELA 9 -
Crescimento radial fúngico de A. flavus na presença da associação
entre o óleo essencial de C. winterianus e fluconazol (em mm):
TEMPO/CONCENTRAÇÃO
CIM
CIM x 2
CIM x 4
Controle
Dia 0
2
2
2
2
Dia 1
2
2
2
20
Dia 2
3
2
2
36
Dia 3
3
2
2
50
Dia 4
4
2
2
55
Dia 5
5
2
2
67
Dia 6
10
5
2
75
Dia 7
14
7
2
80
TABELA 10 - Grau de inibição de A. flavus pela associação do óleo essencial do C.
winterianus com o fluconazol em relação ao controle (em %):
TEMPO/CONCENTRAÇÃO
CIM
CIM x 2
CIM x 4
Dia 1
100%
100%
100%
Dia 2
97%
100%
100%
Dia 3
98%
100%
100%
Dia 4
96%
100%
100%
Dia 5
95%
100%
100%
Dia 6
89%
96%
100%
Dia 7
85%
94%
100%
Diâmetro do crescimento radial
60
90
80
70
60
50
CIM
40
CIM X 2
30
CIM X 4
20
Controle
10
0
10
12
23
34
45
56
67
78
Dias
GRÁFICO 3 - Crescimento radial fúngico de A. flavus na presença da associação entre o óleo
essencial de C. winterianus e o fluconazol.
Os resultados do teste do crescimento micelial radial fúngico se mostraram
discrepantes, principalmente quando se toma como parâmetro o comportamento de
A. fumigatus sob a ação da associação entre a anfotericina B e o óleo essencial. As
três concentrações tiveram um crescimento linear frente ao tempo, mas CIM e CIM x
2 provocaram um grau de inibição bem mais discreto em se comparando a CIM x 4.
Se comparamos o comportamento de A. fumigatus submetido à associação
entre fluconazol e o óleo essencial, é notável que as concentrações CIM e CIM x 2
controlam o crescimento das cepas de maneira mais eficiente do que no caso
anterior, mas igualmente de modo uniforme. Já a concentração de CIM x 4
promoveu inibição completa do cresicmento da cepa em questão, mostrando maior
eficácia nesse quesito.
Na última associação testada, com o fluconazol e o óleo combatendo o
desenvolvimento de A. flavus, houve um maior gradiente de inibição nas três
concentrações. Os microorganismos submetidos à ação de CIM tiveram um
crescimento muito discreto, porém uniforme. CIM x 2 ofereceu uma inibição
completa até o dia 6, havendo pequeno crescimento a partir desse momento. Já a
concentração de CIM x 4 mostrou inibição completa do crescimento. Esses
resultados conferem a essa associação um comportamento inibitório mais efetivo
nas três concentrações testadas.
61
7 DISCUSSÃO
As infecções são eventos potencialmente ameaçadores para a vida. Desde
que se reúnam as condições necessárias – virulência aumentada, resistência
imunológica comprometida, tratamento inadequado ou ausente – o processo pode
alcançar
uma
evolução
agressiva,
acarretando
sérias
repercussões
para
o organismo acometido. Aliado a isso, temos como fator agravante o surgimento de
microorganismos
MYOKEN
et
refratários
al.,
2006;
aos
tratamentos convencionais (JORGE, 1998;
PATTERSON,
2006;
GREENBERG
et
al.,
2008;
SAMARANAYAKE et al., 2009).
Certas características estruturais dos fungos tornam-lhes mais resistentes aos
antimicrobianos
convencionais.
(FARIAS;
LIMA,
2000;
SOUZA,
2004)
As
aspergiloses são infecções fúngicas com elevados índices de morbidade e
mortalidade, estando A. fumigatus e A. flavus mais amiúde implicados (ZAMAN;
SARMA, 2007).
Dimitrakopoulos et al. (2005) afirmam que ,normalmente, a via de contágio é
aerogênica, com inspiração dos conídios para o trato respiratório, ocorrendo um
crescimento de caráter saprofítico. Um curso insidioso com freqüência estará ligado
a condições orgânicas debilitantes.
Ogata et al. (1997) afirmam que, nos últimos anos, as aspergiloses dos seios
paranasais se tornaram eventos de ocorrência mais intensa. Apesar de terem
grande associação com pacientes diabéticos, sob terapias antineoplásicas ou
imunossupressivas, podem acometer, igualmente, indivíduos saudáveis.
Segundo Beck-Mannagetta et al.,(1983), os cimentos de obturação de canais
endodônticos contendo zinco em sua formulação podem servir como meio de
crescimento para Aspergillus, desde que projetados iatrogenicamente no interior do
seio maxilar.
Opinião semelhante tem Giardino et al., (2006), que frisam a necessidade de
se prevenir a introdução desse material a nível sinusal, evitando-se, assim, a
multiplicação de Aspergillus e a indicação de tratamento cirúrgico adicional.
62
Em contraposição a essas afirmações, Odell e Pertl (1995) citaram a
possibilidade de haver uma contaminação prévia das pastas de obturação por
esporos de Aspergillus provenientes do ambiente, que, a nível intra-sinusal,
encontrarão condições propícias para sua reprodução.
Os mesmos autores lembram que um quadro de aspergilose em hospedeiros
com déficit imunológico estará apto a desenvolver curso invasivo.
Entretanto, Mylona et al. (2006) relatam o caso de uma aspergilose sinusal
invasiva causada por Aspergillus fumigatus em paciente imunocompetente, com
extensões para a cavidade nasal, seios esfenoidal e etimoidal.
Rowe-Jones e Friedman (1994) frisam que a extensão intracraniana é um
quadro de considerável morbidade, podendo ter início pela propagação direta a
partir da cavidade sinusal adjacente ou mesmo por via venosa, a despeito da
existência de paredes sinusais íntegras ou de um não acometimento mucoso.
Notani et al. (2000) acrescentam uma terceira via de penetração na cavidade
craniana, através de um gesto neurocirúrgico, sendo, por conseguinte, chamada de
iatrogênica.
Okamoto et al.(2006) enfatizam a importância da terapêutica cirúrgica
vigorosa nesses casos, na ausência da qual o processo terá progressão rápida,
possivelmente com resultados funestos.
Já na opinião de Dimitrakopoulos et al.(2005) e Marinovic, et al.(2007),
mesmo que se tenham sido consumadas medidas terapêuticas que incluam
debridamento extenso e terapia antifúngica maciça, o curso fatal é freqüente.
A aspergilose de localização facial tem prognóstico variado. Independente da
extensão das infecções por Aspergillus, merecer, com freqüência, uma atenção
multidisciplinar,
com
participação
otorrinolaringologista, cirurgião
simultânea
bucomaxilofacial e
do
pneumologista,
neurocirurgião,
a grande
ocorrência de aspergiloses sinusais e a etiologia endodôntica conferem a essas
enfermidades um maior envolvimento com a rotina odontológica, impondo a
realização de mais estudos explorando a aspergilose sob esse prisma específico, a
exemplo do trabalho presente.
63
Segundo diversos autores, o tratamento convencionalmente proposto para as
micoses invasivas se baseia no uso de drogas antifúngicas, como anfotericina B,
fluconazol e itraconazol. Entretanto, esses regimes quimioterápicos são permeados
de inconvenientes (SERRANO et al., 2004; RODRIGUEZ et al., 2008; KLAASSEN et
al., 2010).
Vários estudos advogam ainda ser a anfotericina B a droga de eleição contra
infecções por Aspergillus. A despeito da reconhecida eficácia da droga sintética
nesse campo, frequentemente, a dose de referência precisa ser reduzida, de modo a
se minimizar os efeitos colaterais, mesmo sob o risco de comprometimento do
regime
antifúngico.
Os
reflexos
adversos
incluem
febre,
hipocalcemia,
hipomagnesemia, anemia e, sobretudo, nefrotoxicidade (MUZYKA; GLICK, 1995;
KANG et al., 2003; MYOKEN et al., 2006; PATTERSON, 2006).
Ramos et al. (2003) corroboram essas afirmações, lembrando que se trata de
uma droga onde a administração endovenosa e um protocolo de tratamento
ultrapassando 90 dias de regime contínuo não raro se impõem (RAMOS et al.,
2003).
Patterson (2006) afirma que a terapêutica pela anfotericina B é pouco
indicada hoje, uma vez que tem eficácia limitada, toxicidade substancial, associação
a grande mortalidade. Além disso, por requerer infusão endovenosa, gera altos
custos hospitalares. Ele cita o desenvolvimento da anfotericina lipossomal como uma
promessa menos tóxica para o tratamento das aspergiloses. Entretanto, observou-se
que as desvantagens representadas pelo preço proibitivo e pela intolerância a uma
dose clinicamente eficaz desestimularam seu uso.
Em contraste, Dimitrakopoulos et al. (2005) advogam que em aspergiloses
intra-cranianas diagnosticadas precocemente, a adoção de debridamento cirúrgico
extenso associado ao uso de anfotericina B é um recurso válido, podendo
incrementar a expectativa de vida e as condições de tratamento.
O fluconazol surgiu como uma solução auspiciosa no combate às micoses
insidiosas, prometendo eficácia contra os organismos envolvidos, boa tolerância por
parte dos pacientes e uma menor gama de efeitos colaterais, não estando,
entretanto, isenta de sua ocorrência. Ao seu uso, foram atribuídos dor abdominal,
64
vômitos, diarréria, cefaléia e, mais raramente, dermatite esfoliativa, anafilaxia,
plaquetopenia e leucopenia (SANTOS-JÚNIOR et al., 2005).
De acordo com Helmerhorst et al (1999), a maior sobrevida de pacientes com
HIV e câncer
pelo aperfeiçoamento dos regimes
quimioterápicos
trouxe,
paradoxalmente, um aumento dos índices de micoses sistêmicas. O grande
consumo de antimicóticos com fins de profilaxia e tratamento nessas situações
induziu ao aparecimento de mais casos provocados por microorganismos resistentes
às drogas de uso mais rotineiro. Santos-Júnior et al. (2005) citam que essa situação
se faz presente de maneira mais emblemática em relação ao fluconazol.
Marinovic et al. (2007) frisam que um fator agravante para as micoses
severas se dá pela baixa difusão da maioria dos antifúngicos no sistema nervoso
central, dificultando o tratamento das patologias com envolvimento craniano. Em
contrapartida, Santos-Júnior et al. (2005) lembram que o fluconazol apresenta uma
boa penetração nesse meio, promovendo um aumento da resposta orgânica ao
patógeno.
Natarajan et al. (2005) ressaltam a importância do desenvolvimento novas
drogas para esse fim, a exemplo da caspofungina, eficaz em casos invasivos e
indicada para pacientes adultos refratários ou intolerantes à anfotericina B e ao
voriconazol.
Patterson (2006) defende o voriconazol como protocolo de primeira escolha
para o tratamento dessa patologia, baseando-se na melhor evolução e maior
sobrevida apresentada pelos pacientes.
Porém, Serrano et al.(2004) afirmam que vários estudos já foram realizados
demonstrando a efetividade do voriconazol sobre cepas de Cândida, mas poucas
pesquisas foram empreendidas para avaliar sua ação sobre fungos filamentosos.
Alertam, por fim, que há necessidade de estudos mais aprofundados que permitam
conhecer melhor o potencial das substâncias de vanguarda usadas para o
tratamento das aspergiloses.
Drago et al. (2007) frisam que tão importante quanto a adoção de novos
arsenais terapêuticos no combate às aspergiloses é a combinação racional entre
65
medicamentos já existentes, de modo a se suprir as deficiências encontradas nos
regimes ora empregados.
Corroborando tal afirmação, Warn et al.(2003) lembram que, ultimamente, tem
sido notado um aumento dos insucessos terapêuticos envolvendo a aspergilose,
sugerindo que esse fato se deva à emergência de organismos resistentes, que vêm
a limitar a eficácia das drogas de uso corrente
Tal situação tem obrigado os pesquisadores a buscar novos medicamentos
que sejam eficazes, inclusive a partir de fontes vegetais. Souza et al. (2007)
defendem
que
os
fitoterápicos
são
menos
sujeitos
à
resistência
dos
microorganismos, uma vez que atuam por mecanismos de ação distintos daqueles
apresentados pelas drogas convencionais.
Segundo Souza et al. (2005), corroboram essa informação, afirmando que os
compostos naturais dispõem de estruturas e métodos de funcionamento diferentes,
quando comparados com substâncias antimicrobianas usualmente empregadas para
controle de crescimento dos microorganismos
Bansod e Rai (2008) defendem que uma grande vantagem inerente aos
fitoterápicos se explica por estes serem produtos naturais, logo representando meios
terapêuticos seguros e isentos de efeitos colaterais.
Já França et al. (2008) alertam que esse pode ser um raciocínio equivocado,
uma vez que há uma tendência universal a se subestimar as propriedades
medicinais das plantas, usando-as de forma indiscriminada. Lembram que se faz
mister o estabelecimento de parâmetros atinentes à posologia e às doses tóxicas ou
letais.
A adoção de um óleo essencial para a realização deste experimento encontra
respaldo nos trabalhos de Pereira (2006) e Souza et al. (2005), que enumeram a
importância do composto na fisiologia da sobrevivência vegetal, atuando na defesa
das plantas.
A escolha do óleo de C. winterianus foi amparado pelos trabalhos de Duarte
et al. (2005) e Mendonça et al. (2005), segundo os quais ele já vem sendo
extensamente usado como repelente de insetos, larvicida, antisséptico e antifúngico.
O mesmo tem demonstrada eficácia no combate às micoses. Essa particularidade
66
justifica a busca da viabilidade clínica para o esgotamento da capacidade curativa do
óleo, requisito básico para o sucesso deste estudo de associação.
Diante de tais afirmações, justifica-se o interesse de se realizar uma pesquisa
procurando definir as propriedades das substâncias envolvidas neste trabalho, tais
como a concentração inibitória mínima (CIM) pela técnica da microdiluição. O intuito
principal é conhecer detalhadamente as possibilidades de uso das drogas
interessadas, estabelecendo-se critérios rígidos no tocante a segurança e
confiabilidade.
Dever et al. (1992) afirmam que o cálculo da CIM pela técnica de
microdiluição é uma técnica de execução e interpretação simples. Nix et al. (1995)
consideram esse método ponto de partida imprescindível para a maioria dos estudos
de susceptibilidade a drogas.
Ostrosky et al. (2008) lembram que essa técnica vem acompanhada de
algumas particularidades: como desvantagens, citam a possibilidade de células de
microorganismos aderirem ao fundo do poço, ou de permanecerem em suspensão,
prejudicando a interpretação dos resultados; como características positivas,
consideram-no um método proveitoso, por ser barato, reprodutível, sensível,
requerer uma pequena quantidade de amostras e deixar um registro permanente.
A determinação da CIM, primeira etapa deste trabalho, forneceu dados
imprescindíveis para as fases subseqüentes. Analisando-se o comportamento dos
microorganismos frente à ação da anfotericina B, observou-se que 100% das cepas
de A. fumigatus e A. flavus foram inibidas à concentração de 625µg/mL, ao passo
que, para a inibição de 66,6% destas, a concentração foi de 312µg/mL. No último
caso, apenas as cepas IPP 210 de A. fumigatus e LM 907 de A. flavus não foram
sensíveis a essa concentração. Em contrapartida, a cepa mais sensível foi A. flavus
ATCC 16013, inibida pela concentração de 39µg/mL.
Avaliando-se a ação do fluconazol, a concentração de 2500 µg/mL foi
responsável por inibir 100% das cepas estudadas, não havendo inibição parcial em
concentrações intermediárias da droga. Há que se observar que a dose foi bem mais
elevada do que aquela encontrada para a anfotericina B. Constatou-se, assim, que
não existiam cepas mais ou menos sensíveis aos efeitos dessa droga, informação
67
também contrastante em relação àquela encontrada para o antimicrobiano
anteriormente testado.
Tais resultados parecem mais pobres do que aqueles obtidos por Sutton et al.
(2006), que, ao estudarem a eficácia da anfotericina B contra espécies de
Aspergillus, obtiveram a CIM sobre A. fumigatus e A. flavus sempre com resultados
próximos a 2µg/mL.
Dever et al. (1992) lembram que, em vários estudos consultados, há grande
discordância entre as CIMs de cada tipo de droga sobre os microorganismos
analisados.
Sugerem ser a solução para tal problema
estabelecer
uma
uniformização da densidade do inóculo, da temperatura e do tempo de incubação.
Ostrosky et al. (2008) acrescentam que para evitar tais transtornos é
inevitável se ter um conhecimento profundo das condições experimentais e uma
padronização rigorosa na execução do teste.
De posse das CIMs das substâncias consideradas, outro problema se
observou: cada uma delas apresentava incovenientes em seu uso clínico no
combate às aspergiloses.
Diversos autores, a exemplo de Kang et al. (2003), Keele et al. (2001),
Muzyka e Glick (1995), Myoken et al. (2006) e Patterson (2006) alertam que a
anfotericina B tem reconhecidos efeitos deletérios associados ao seu uso
prolongado, inviabilizando, comumente, o sucesso clínico.
Outros artigos, tais como aqueles de Greenberg et al. (2008) e de
Samaranayake et al. (2009) lembram que a efetividade do fluconazol está
comprometida para esse fim, dado o número crescente de microorganismos
refratários à sua ação, particularmente em pacientes portadores de HIV.
Por fim, para Thaboripat (2004), a ação fungicida do óleo essencial de C.
winterianus já foi comprovada, mas sua utilização é freqüentemente contestada por
requerer a instituição de altas doses, inviabilizando um emprego clínico seguro.
Segundo Drago et al. (2007), o combate a organismos refratários passa por
duas estratégias possíveis: a primeira consiste no desenvolvimento de novas drogas
capazes de oferecer um tratamento mais eficaz; a segunda preconiza a combinação
68
de substâncias antimicrobianas já existentes, certamente um método mais
simples e barato.
Já para Mitsugui et al. (2008), um emprego útil da combinação de
antimicrobianos seria naquelas infecções de caráter polimicrobiano, onde a
monoterapia tem alcance, não raro, insuficiente.
Para Nightingale et al. (2007), o método mais usado para a compreensão da
associação de drogas antibióticas é aquele representado pela técnica de
Checkerboard, de fácil execução e entendimento. Através desta, obteremos o
cálculo da concentração inibitória fracionária (CIF) da associação de drogas. De
acordo com o valor numérico obtido, será conceituado o comportamento da
associação. Os parâmetros para essa designação variam entre os autores:
Nightingale et al. (2007), atentam para a dificuldade de interpretação da
técnica, onde os limites variam, segundo as fontes pesquisadas. Consideram a
ocorrência de sinergismo (CIF ≤ 0,5), aditividade ou indiferença (0,5 < CIF ≤ 4) e
antagonismo (CIF ≥ 4).
Para Mitsugui et al. (2008), a interação pode apresentar as seguintes
possibilidades: sinergismo (CIF ≤ 0,5), sinergismo parcial (0,5 < CIF < 1), aditividade
(CIF = 1), indiferença (1 ≤ CIF < 4) e antagonismo (CIF >4). Entretanto, nenhum
outro trabalho consultado apresentou o termo “sinergismo parcial”, nem esse estudo
conceituou tal termo.
A classificação considerada por Drago et al. (2007), propõe que a combinação
pode apresentar sinergismo (CIF ≤ 0,5), aditividade ( 0,5 < CIF ≤ 4) e antagonismo
(CIF > 4).
Dada a ausência de um consenso para definir os limites precisos para
classificar a interação entre as drogas pelo método de Checkerboard, tomamos
como padrão o trabalho de Singh et al. (2000), segundo o qual a associação poderá
ser sinérgica
(CIF
< 1), aditiva
(CIF
= 1) ou antagônica
(CIF
>1), pela
simplicidade de conceituação e aplicabilidade mais lógica. Também, adotaremos a
afirmação de Nightingale et al. (2007), que consideram que as situações de
aditividade e indirefença correspondem a um mesmo tipo de interação.
69
De posse das CIMs do óleo essencial de C. winterianus – partindo de estudo
previamente realizado no mesmo laboratório (OLIVEIRA, 2011), com valor igual a
312µg/mL – e das drogas sintéticas, pôde-se calcular a titulação pelo método de
Checkerboard. Tomou-se, como parâmetro, uma cepa de referência de A. fumigatus
(ATCC 16913) e outra de A. flavus (ATCC 16013). Cada uma delas foi exposta à
ação combinada do óleo essencial com a anfotericina B e com o fluconazol. Desse
modo, quatro ensaios foram realizados:
Na combinação do óleo essencial com a anfotericina sobre A. fumigatus,
encontramos duas situações possíveis: na primeira delas, temos que a concentração
inibitória fracionária (CIF) da droga sintética foi igual a 0,5, e que a do óleo essencial
foi igual a 0,25. No segundo contexto, a CIF do óleo foi igual a 0,5, e a da droga foi
de 0,25. Ocorre assim que temos duas possibilidades onde há uma maior redução
dos componentes: na primeira delas, a concentração da droga cai à metade, e a do
óleo, à quarta parte; no segundo cenário encontrado, a CIF do óleo cai à metade, e
a da droga cai a um quarto. Em ambos os contextos, a CIF da associação foi igual a
0,75, indicando sinergismo entre as substâncias testadas. Esse resultado mostra
uma interação plenamente favorável, com a chance de se reduzir a concentração de
ambos os componentes, sempre um deles em maior intensidade. Assim, pode-se
optar por se fazer a escolha pela combinação melhor tolerada clinicamente.
No segundo teste, foi observado o comportamento da associação entre o óleo
essencial com a anfotericina B procurando a inibição de cepas de A. flavus. A CIF da
droga sintética foi igual a 0,5, e a do óleo, a 1, sendo que a CIF da associação foi de
1,5, que denota haver antagonismo entre as duas substâncias testadas. Esse
resultado mostra uma combinação desfavorável para os propósitos defendidos pelo
estudo.
No terceiro teste, opôs-se o conjunto do óleo essencial com o fluconazol a
cepas de A. fumigatus. A CIF do óleo foi de 0,125, e o da droga foi de 0,5. O CIF da
associação foi igual a 0,625, denotando também haver sinergismo entre os
compostos. Assim, encontrou-se um grande decréscimo da concentração do óleo,
ao passo que a modificação em relação ao fluconazol foi mais discreta.
O quarto teste combinou o óleo essencial ao fluconazol para tentar a inibição
de A. flavus. Os resultados foram semelhantes ao experimento anterior, com o CIF
70
do óleo igual a 0,125 enquanto que o da droga foi de 0,5, traduzindo, também, uma
situação de sinergismo.
Os resultados obtidos exibiram uma combinação eminentemente favorável na
maior parte dos casos estudados. Excetuando a combinação entre o óleo com a
anfotericina sobre A. flavus, onde o resultado constou como antagonismo, nas
demais, os resultados sinérgicos se configuram em respostas desejáveis para o
combate a cepas de Aspergillus..
A associação entre óleo e fluconazol sobre A. fumigatus teve um resultado
sinérgico, onde a CIM do primeiro pôde ser reduzida à oitava parte, o mesmo
ocorrendo na associação entre óleo e fluconazol sobre A. flavus. Tais
comportamentos permitiram observar uma resposta terapêutica da associação a
partir de uma fração nitidamente menor do óleo essencial, além de se reduzir o
aporte da droga sintética à metade. Deduz-se terem sido obtidos achados
plenamente favoráveis, uma vez que já foi relatada a necessidade de doses
elevadas, inviáveis para a prática clínica, do óleo essencial de C. winterianus para
que se alcançassem resultados fungicidas sobre Aspergillus (THANABORIPAT,
2004).
A
associação
estudada
capacita
uma
melhor
aplicabilidade
das
possibilidades terapêuticas das associações, visando resultados superiores contra
infecções invasivas por esses microorganismos filamentosos.
Essa assertiva se torna ainda mais válida quando consideramos o trabalho de
Singh et al. (2000), que, frisa que, quanto menor o cálculo da CIF da associação,
maior o grau de sinergismo encontrado.
Inúmeros estudos têm sido dedicados comprovar a eficácia do estudo de
Checkerboard para a compreensão do comportamento de antimicrobianos em
associação.
Singh et al. (2006) compararam a resposta de pacientes transplantados,
portadores de aspergilose invasiva, à combinação entre voriconazol e caspofungina,
usando como controle uma população que havia feito uso apenas da formulação
lipídica de anfotericina B. Os resultados, obtidos pelo método de Checkerboard
evidenciaram que o uso da associação descrita estava ligado a uma maior
sobrevida.
71
Cuenca-Estrella
et
al.
(2006)
pesquisaram
o
comportamento
de
Scopulariopsis brevicularis, patógeno emergente envolvido tanto em infecções
superficiais, como as onicomicoses, como em casos mais graves, como em micoses
profundas, meningites em pacientes com AIDS, endocardites, bolas fúngicas intrasinusais e pneumonias. Esse organismo tem-se mostrado resistente in vitro a
anfotericina B, agentes azólicos, caspofungina e terbinafina. Para o estudo,
observou-se sua interação com dez associações envolvendo os seguintes
antifúngicos: anfotericina B, terbinafina, itraconazol, voriconazol, posaconazol e
caspofungina. A associação entre as drogas foi realizada pelo método de
Checkerboard. Encontrou-se ação sinérgica em algumas combinações, notadamente
em posaconazol com terbinafina (68% das cepas). Outras combinações –
anfotericina B com caspofungina, posaconazol com caspofungina e voriconazol com
caspofungina – também exibiram sinergismo em algumas cepas.
O exposto evidencia a importância do método Checkerboard para buscar
alternativas viáveis para o combate a S. brevicularis, organismo que guarda
inúmeras semelhanças com o Aspergillus, tais como as apresentações clínicas, o
aparecimento de patógenos resistentes e a elevada morbidade, por meio de
combinação eficaz entre drogas em uso.
Se considerarmos o volume de trabalhos que demonstram confiabilidade do
método de Checkerboard, é fácil aceitar a legitimidade de seu uso como recurso
válido no desenvolvimento das terapias antimicrobianas combinadas. Entretanto, tal
técnica merece ressalvas:
Nightingale et al. (2007) lembram que não há consenso entre os autores
quanto aos parâmetros válidos para cada resultado encontrado. Porém, para esse
autor, a principal limitação reside no fato de que, para seu cálculo, as CIFs são
determinadas a partir de concentrações fixas das drogas, ao passo que, in vivo, elas
variam ao longo do tempo, com a metabolização das substâncias.
Steinbach et al. (2003) ressaltam que, apesar de o método de Checkerboard
decifrar a natureza da interação entre as drogas, ela não provê uma descrição mais
detalhada da taxa de atividade antifúngica ao longo do tempo. Para Keele et al.
(2001), ele não consegue detectar mudanças na tolerância bacteriana adquiridas
durante o experimento.
72
Diante de tais justificativas, na etapa seguinte do trabalho, realizou-se o
estudo da cinética da morte microbiana, também conhecido como cinética do
crescimento radial. Segundo Singh et al. (2000), essa técnica, apesar de ter caráter
diverso, é complementar ao método de Checkerboard.
Para Lewis et al. (2000), o estudo da cinética da morte bacteriana fornece um
entendimento importante da farmacodinâmica de drogas antimicrobianas, permitindo
a elaboração de regimes terapêuticos que optimizem a atividade antifúngica, ao
mesmo tempo em que minimizem o grau de exposição do paciente ao fármaco,
reduzindo sua toxicidade resultante.
White et al. (1996) defendem que a técnica de Checkerboard e o estudo da
cinética se baseiam em fenômenos diferentes: no primeiro, a partir do conhecimento
das concentrações inibitórias mínimas, pode-se observar a inibição do crescimento
microbiano; no segundo caso, porém, o que se avalia é a intensidade da morte dos
microorganismos.
Aiyegoro et al. (2008) consideram-no um dos métodos mais confiáveis para
determinar a resistência microbiana, consistindo na observação da taxa de morte
dos microorganismos pela ação de uma concentração fixa de agentes antibióticos.
Entretanto, alguns estudiosos são reticentes a essa técnica. Keele et al.
(2001) afirmam que, no estudo da cinética, a concentração das drogas é estática e
não sofre absorção, como ocorreria em um sistema vivo. Além disso, nesse modelo,
não há interação das drogas ou fungos com proteínas. Por fim, o tipo de meio de
cultura, as espécies de fungos selecionadas e as variações de metodologia entre os
laboratórios podem ter efeito nos resultados. Assim, sugerem que esse ensaio deva
ser considerado apenas como indicativo dos efeitos potenciais das drogas em um
organismo vivo.
White et al. (1996) apontam algumas limitações do estudo da cinética, tais
como a influência do tamanho do inoculo escolhido, as dificuldades de interpretação
dos resultados, dada a pequena variação de concentrações estudadas, e o trabalho
dispendido para sua execução.
73
Em contraposição, para Dever et al. (1992), já foi demonstrado que essa
técnica, mesmo sendo realizada in vitro, permite uma boa correlação com o estado
de cura, quando relacionado com modelos animais ou ensaios clínicos.
O estudo da cinética do crescimento radial arrematou a análise das
propriedades antifúngicas das associações estudadas neste trabalho, possibilitandose conhecer dinamicamente a ação antimicrobiana destas frente às cepas
observadas.
Nesta fase, o ensaio da cinética de morte microbiana nos mostra ter havido, já
a partir do segundo dia, inibição em todos os eventos analisados, sempre com
resultados acima de 47%, tomando-se como parâmetro a placa controle (TABELAS
6, 8, 10).
A efetividade sobre cepas de A. fumigatus se deu de maneira mais discreta a
partir da associação com a anfotericina B. Considerando os testes relativos a essa
droga com o óleo, ao fim do dia 7, CIM permitiu um crescimento radial de 37mm,
CIM x 2 de 35mm, e CIM x 4 de 26mm. Mesmo em se pesando a diferença exígua
entre as duas concentrações menores, a inibição, em seu momento de menor
efetividade, ainda se manteve próxima a 50%, mostrando ter havido uma ação
perceptível no controle do crescimento das cepas (GRÁFICO 1; TABELAS 5, 6).
Tais resultados se alinham ao que defendem diversos autores: essa droga
assume um papel fungicida em doses elevadas, ao passo que, em concentrações
normais, há efeito apenas fungistático. Além disso, a mesma oferece a possibilidade
de desenvolvimento de resistência fúngica (MUZYKA; GLICK, 1995; MYOKEN et al.,
2006; PATTERSON, 2006).
O caráter dose-dependente da anfotericina B está plenamente demonstrado
pelo fato de sua ação inibitória aumentar de modo diretamente proporcional à sua
concentração na associação, fornecendo um combate considerável ao crescimento
fúngico. Não se pôde, entretanto, alcançar uma ação fungicida até a concentração
CIM x 4 das substâncias associadas.
Bansod e Rai (2008) lembram que um fato complicador que envolve o
tratamento de várias doenças consiste na necessidade freqüente da utilização de
altas doses de antimicrobianos, levando à ocorrência de efeitos colaterais
74
acentuados, com possibilidade de desenvolvimento de resistência microbiana e
retardo a cura do processo infeccioso.
Assim, se torna desejável a obtenção de estratégias que proporcionem um
aperfeiçoamento da atividade terapêutica da anfotericina, principalmente em se
reduzindo as concentrações necessárias a uma resposta antifúngica. Os ensaios
provaram haver susceptibilidade dos microorganismos às associações empregadas.
Pautando-se por tal filosofia, depreende-se que esta pesquisa logrou resultados
animadores no tocante a se possibilitar um uso mais eficaz e seguro da anfotericina.
Mata et al.(2009) procuraram determinar a incidência de patógenos e detectar
o controle dos mesmos sobre as sementes de Jereus jamacaru (mandacaru), a partir
da exposição a diferentes concentrações dos óleos de C. winterianus e de
Pimpinella anisum. No tratamento controle, incidiram os fungos Aspergillus sp.,
Penicillium sp., Cladosporium sp., Curvalaria sp., Nigrospora sp. e Rhizophus sp. Os
resultados mostraram que os óleos apresentaram efeito inibitório sobre a incidência
de fungos sobre as sementes tratadas. Além disso, constatou-se que, quando nas
maiores concentrações, reduziram a incidência de fungos e aumentaram a
germinação das sementes de mandacaru. Os dados encontrados por estes autores
corroboram os resultados do estudo presente, onde o aumento da concentração da
anfotericina B e do óleo incrementaram a inibição das cepas estudadas.
A combinação do óleo com o fluconazol sobre A. fumigatus, detentora de
melhores resultados, sempre suprimiu o desenvolvimento das cepas acima de 79%,
em todas as concentrações. Tomando-se CIM x 4, não houve registro de aumento
no diâmetro radial durante o transcorrer do trabalho. Mesmo na menor concentração,
a associação impediu o desenvolvimento fúngico em 87% já no dia 2, mostrando
uma notável ação contra esse organismo. Os graus de inibição ao fim do dia 7 foram
de 84% para CIM, 87% para CIM x 2 e 100% para CIM x 4 (GRÁFICO 2; TABELAS
7, 8).
As informações contidas nesta etapa do trabalho confirmam a efetividade das
associações testadas sobre A. fumigatus, sobretudo em se utilizando o fluconazol
como composto sintético.
Essa droga, cuja indicação para o tratamento das aspergiloses é contestada,
dada a possibilidade de resistência fúngica, foi grandemente beneficiada pela
75
associação com o óleo essencial de C.winterianus. Esse achado se mostra em
concordância com o trabalho de Singh et al .(2000), que defende que nos casos de
aditividade ou sinergismo das associações, o incremento terapêutico pode ser
explicado pela aceleração do seu
tempo de ação, impossibilitando aos
microorganismos de desenvolverem um fenótipo mais agressivo.
Estudando isoladamente o comportamento da associação do óleo essencial
com o fluconazol sobre as duas cepas, percebeu-se um elevado potencial inibitório
em todos os momentos observados. Repetindo a tendência documentada na
associação do óleo com a anfotericina, no ensaio com o fluconazol, A. fumigatus
teve melhor resistência contra as concentrações CIM e CIM x 2. Ao fim do estudo, os
crescimentos
radiais
foram de 15 e 13mm, contra
85mm do controle,
correspondendo a inibições de 84 e 87%, lembrando que houve ausência de
crescimento radial, quando submetido a CIM x 4, ação nitidamente fungicida.
Já no último ensaio, A. flavus se mostrou bastante susceptível à ação da
associação. As inibições no dia 7 sob a ação de CIM (85%) e de CIM x 2 (94%),
mesmo estando aquém daquela encontrada em CIM x 4 (100%), já mostram um
resultado ainda mais alentador no tocante às propriedades antifúngicas dessa
associação contra a cepa. Deve-se frisar que, na concentração mais alta, também
não houve aumento algum no diâmetro do inoculo, até o dia 7, repetindo o
comportamento de A. fumigatus (GRÁFICO 3; TABELAS 9, 10)
Santos-Júnior et al. (2005) fizeram um estudo avaliando as características da
ação, do tratamento e da resistência fúngica ao fluconazol, afirmando que o mesmo
não tem boa ação contra aspergilose, podendo ser usado como terapia alternativa
em meningites por Aspergillus dada sua tolerabilidade e sua indução mínima de
efeitos colaterais.
Muzyka e Glick (1995), em trabalho de revisão sobre as infecções fúngicas
orais e suas opções terapêuticas, atribuem à droga um caráter efetivo contra uma
grande variedade de micoses em pacientes imunocompetentes e imunodeprimidos,
induzindo menores reações indesejáveis. Suas indicações incluem candidíase oral,
profilaxia da meningite criptocócica em pacientes com AIDS e histoplasmose.
Entretanto, as aspergiloses estão ausentes no rol mencionado.
76
Contrapondo as afirmações anteriores, há obras que a defendem como uma
das drogas de primeira escolha contra esses patógenos (ALMEIDA; SCULLY, 2002;
SERRANO et al., 2004). Trata-se de um fármaco com ação fungistática em doses
moderadas, podendo assumir comportamento fungicida em maiores concentrações,
ou desde que usada sobre organismos susceptíveis (MUZYKA, GLICK, 1995). As
informações acima confirmam os resultados dessa última etapa do trabalho, onde,
na associação do óleo com o fluconazol contra A. fumigatus sob as concentrações
de CIM e CIM x 2, houve uma ação fungistática bem demarcada, com diminuição do
grau de crescimento radial das cepas em relação ao controle. Na concentração CIM
x 4, evidenciou-se um comportamento fungicida bem definido, sem que houvesse
qualquer crescimento do das cepas a partir do momento da inoculação.
Quando esta associação foi testada sobre A. flavus, obteve-se resultados
ainda mais animadores, com uma ação fungistática bem marcante à concentração
igual a CIM. Com CIM x 2, viu-se uma inibição total do crescimento radial até o dia 5.
Depois desse momento, notou-se um desenvolvimento micelial apenas discreto.
Um comportamento similar se observou no estudo conduzido por Okungbowa
e Usifo (2010), que testaram o crescimento radial fúngico de Aspergillus fumigatus e
Penicillum sp. quando submetidos ao efeito antifúngico de três desinfetantes:
metanol a 70 e a 90%, etanol a 90% e hipoclorito de sódio a 4%. Notou-se que o
hipoclorito apresentou a melhor ação antimicrobiana, seguido pelo metanol a 90%.
Entretanto, pelo estudo, pôde-se perceber que, após alguns dias, houve crescimento
fúngico em todas as séries estudadas, evidenciando um comprometimento do efeito
das drogas.
Essa situação observada na interação entre o óleo essencial de C.
winterianus com o fluconazol sobre A. flavus pode-se amparar no fato deste
composto natural apresentar caráter volátil. Sendo assim, é plausível crer que,
devido a um fenômeno de evaporação, a concentração do óleo pode ter diminuído,
comprometendo o padrão fungicida da associação observado até então.
Essas observações validam ainda mais os resultados alcançados por esse
estudo, onde o fluconazol é grandemente beneficiado por seu uso em conjunto com
o óleo essencial de C. winterianus.
77
Todos os dados obtidos nessa fase da pesquisa evidenciaram um
comportamento bastante animador para os propósitos buscados pelo trabalho.
Quando estudos semelhantes são tomados como parâmetro, nota-se que a
interação entre o óleo essencial de C. winterianus e os fármacos adotados se
configura em um recurso bastante válido contra as infecções por Aspergillus.
Moreira (2009) procurou observar a atividade antifúngica do óleo essencial do
Hyptis suaveolens sobre espécies patogênicas de Aspergillus. Obteve que a
concentração inibitória mínima (CIM) foi igual a 40µL/mL. Empreendeu o teste da
cinética da inibição do crescimento radial em meio sólido, sobre cepas de
A.parasiticus (ATCC-15517) e de A. fumigatus (ATCC-40640), com incubação
durante 14 dias e observações a cada 48 horas, sob a ação de CIM/2, CIM e CIM x
2. Encontrou resultados discretamente melhores do que aqueles obtidos nesse
trabalho, onde, no primeiro dia, CIM/2 promoveu uma inibição de 78% das cepas, no
dia 8, de 76%, e, no dia 14, igual a 94%. As concentrações CIM e CIM x 2
promoveram inibição total das cepas (igual a 100%) em todos os momentos
estudados.
Bankole e Somorin (2010) testaram a atividade antifúngica dos extratos de
Ocimum gratissimum e Aframomum danielli sobre cepas isoladas a partir de arroz
estocado. Acompanhou-se a inibição do crescimento radial fúngico sob a ação dos
extratos dos produtos naturais em meio sólido a cada 24 horas durante 7 dias. Ao
fim do experimento, notou-se que a inibição ocorreu de modo diverso: Aspergillus
niger foi o organismo mais sensível a A. danielli, sofrendo um grau de inibição igual a
56,7%, em relação ao controle de crescimento, enquanto que Cladosporium
sphaerospermum foi o mais resistente, com inibição de 46,4%. Já nas cepas
submetidas ao extrato de O. gratissimum, Penicillium citrinum foi o organismo mais
sensível, com inibição igual a 59,7%, ao passo que Cladosporium sphaerospermum
foi o mais refratário, com inibição igual a 46,4%.
Os achados obtidos no estudo citado foram mais modestos do que aqueles
encontrados pela pesquisa presente, onde se puderam aferir inibições finais
compreendidas entre 60 e 100%, configurando-se em um grau de efetividade mais
importante sobre cepas de fungos filamentosos.
78
A associação de anfotericina e do fluconazol ao óleo essencial de C.
winterianus se mostrou uma estratégia muito sagaz para que se possa explorar a
ação antimicrobiana das três substâncias, sobretudo do composto natural, que exibe
propriedades extensamente inexploradas.
Ao se observar que, na maior parte dos experimentos, foram encontradas
associações com sinergismo acentuado, pode-se compreender a importância desses
ensaios para a elaboração de estratégias eficientes de combate às aspergiloses. Tal
fato se ampara na possibilidade de emprego de doses sub-toxicas dos componentes
envolvidos, de eficácia das associações contra cepas resistentes, ou mesmo de
instituição de protocolos de tratamento mais curtos.
Espera-se que essa pesquisa sirva de mote para o desenvolvimento de
estudos in vivo, visando uma melhor interpretação da resposta dos microorganismos
às associações adotadas e permitindo o aperfeiçoamento das capacidades
terapêuticas interessadas.
Assim sendo, a combinação racional do óleo essencial de C. winterianus com
a anfotericina B e com o fluconazol terá grande destaque no combate às infecções
fúngicas por Aspergillus, viabilizando um tratamento mais seguro e eficaz,
minimizando os efeitos deletérios das drogas e esgotando seu potencial curativo.
79
8 CONCLUSÃO
De acordo com os resultados obtidos nos ensaios de associação do óleo
essencial de C. winterianus com a anfotericina B e o fluconazol, concluiu-se que:
o A associação entre o óleo essencial de C. winterianus com as drogas
sintéticas estudadas - anfotericina B e fluconazol - demonstrou haver
propriedades antifúngicas marcantes sobre cepas de Aspergillus;
o O cálculo da concentração inibitória mínima da anfotericina B e do
fluconazol evidenciou a possibilidade de um uso antifúngico clinicamente
viável;
o A associação entre o óleo essencial de C. winterianus com a anfotericina
B e com o fluconazol promoveu resultados favoráveis, exibindo um
incremento positivo sobre a ação dos três compostos envolvidos, em
relação às cepas testadas;
o O estudo da cinética da morte microbiana confirmou a efetividade das
associações avaliadas pelo método de Checkerboard.
80
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