26 a 30 de Julho
Estudo dos supercomplexos da cadeia respiratória de Bacillus subtilis
Responsável: Ana Melo
Monitores: Pedro Sousa
Filipe Santos
Participantes:
Carolina Camelo
Inês Santos
Magda Paiva
Sara Silva
Cadeia respiratória de B. subtilis
Amplificação do gene codificante da subunidade A da citocromo c oxidase (qoxA) de B. subtilis.
Colónia
Wt (2x)
H2O Milipore
Ferver 5 min. ΔqoxA (1x)
Δ qoxB (1x)
Lise celular
Desnaturação DNAses
1 min. a 12000 RPM
WT
Marcador gap (>100 bp)
qoxA
(100 bp)
qoxB
(100 bp)
PCR de Colónias
DNA
Gel de agarose
H2O estéril
Tampão
dNTP
Primer
Fw
Primer
Rev
Taq Polimerase
Ligação do gene ao vector plasmídico (pSKEcoRV)
qoxA
GTGATCCTCTTGTTCAGAGCATTTAAACCACTGATTAT
GCTGACTCTGCTTTCCTCCGTTTTTTTATTGGGCGGCT
GCAGTCAAATCGCGGTATTGGAT
Ligação
H2O estéril
Tampão da ligase
pSKEcoRV (desfosforilado)
Produto de PCR (qoxA ou qoxB)
T4 DNA ligase
22ºC
Transformação do produto da ligação nas células de E. coli.
Produto da ligação:
pSK_qoxA
Transformação
37ºC
Ecoli XL1Blue
Incubar overnight
Colónias de bactérias com plasmídeo sem produto de ligação
Colónias de bactérias com plasmídeo com produto de ligação
Espectros de UV/Visível de B. subtilis
cyt
c
Cadeia respiratória de B. subtilis
bc1
NDH‐
2
caa3
aa3
Q
SDH
bd
Grupo prostético Comprimento de onda
Hemo a
441 Hemo a
601
Hemo b
429
Hemo b
550
Hemo c
560
Hemo d
631
Podemos concluir que as oxidases terminais caa3 e bd da cadeia respiratória de B. subtilis estão presentes neste crescimento.
Actividades enzimáticas
Actividade NADH:oxigénio oxidoredutase
Após NADH
28,9 nmol min‐1 mg‐1
Após KCN
15,7 nmol min‐1 mg‐1
% (inibição)
45,7
Actividade NADH:K3[Fe(CN)6] oxidorredutase= 110 nmol NADH min‐1 mg‐1
Actividade succinato:oxigénio oxidoredutase
Após succinato
14,32 nmol min‐1 mg‐1
Após KCN
10,58 nmol min‐1 mg‐1
% (inibição)
26,12
Actividade succinato:DCPIP oxidorredutase = 151,7 nmol DCPIP min‐1 mg‐1
BN‐PAGE
Massa Molecular dos complexos isolados
NDH‐2 Æ 45 kDa
caa3 Æ 145 kDa
aa3 Æ 147 kDa
bc1 Æ 73 kDa
SDH Æ 116 kDa
bd Æ 218 kDa ou 90 kDa
Supercomplexos identificados:
Banda 7
‐(SDH)3 Bandas 2 e 6
‐ NDH‐2:(SDH)3
Nota: É necessário confirmar os resultados obtidos por Espectrometria de Massa