Cardosina A
Estrutura terciária
1
Pro
31 KDa
PSI
15 KDa
Precursor
RGTVRDSGSA
HAIGANGVMNQQ
Intermediário
Cardosina A
madura
EHLSTSSEE
Modelo proposto para o processamento proteolítico da Cardosina A. Os locais de
clivagem Pro/cadeia de 31 KDa, cadeia de 31 KDa/PSI e PSI/cadeia de 15 KDa estão
assinalados com setas.
2
Cardosina A
Estrutura secundária
Cadeia de 31 KDa
Cadeia de 15 KDa
3
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos
de Cynara cardunculus L.
1 Passo. Extracção Acídica
Tampão citrato de sódio
100 mM, pH 3,5
4
Exclusão Molecular
Solvente
Direcção do fluxo
Separação baseada em
propriedades dos
compostos
Detector UV
Proteínas fraccionadas
MBarros
5
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L.
2 Passo. Cromatografia de Exclusão Molecular
Coluna: Superdex G75
Eluente: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6
1600
Absorvância a 280 nm (mAU)
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
-200 0
50
100
150
200
Tempo de retenção (min)
6
Cromatografia de Troca Iónica
Separação baseada em
propriedades dos compostos
Bombas
AeB
Aplicação
da amostra
Detector UV
Mistura
Mistura
de
proteína
de
Coluna
proteína
s
de DEAE
s
Proteínas
carregadas + são
eluídas primeiro
Tampão
A
+
Resina
+
Proteína
+
+
-
Tampão
B
Proteína
-
Gradiente linear de
sal
MBarros
7
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L.
3 Passo. Cromatografia de troca iónica
Coluna: Q Sepharose
forte DEAE)
(trocador
aniónico
Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6
Gradiente crescente de 1M NaCl
Absorvância a 280 nm (mAU)
700
600
500
400
300
200
100
0
-100
0
20
40
60
80
100
120
Tempo de retenção (min)
8
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L.
5. Controlo de Pureza das Cardosinas
Para
o
controlo
de
A0
pureza das amostras de
cardosinas recorre-se a
electroforese vertical em
gel de poliacrilamida, em
condições
desnaturantes
31 KDa
15 KDa
34 KDa
14 KDa
(SDS-PAGE).
Após Q Sepharose (trocador aniónico
forte DEAE)
9
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L.
4 Passo. Desalting – eliminar o sal das amostras da
cromatografia anterior
Eluente: Água Mili_Q (água ultra pura)
90
80
Absorvância a 280 nm (mAU)
As amostras de cardosinas
A0, A e B recolhidas na
cromatografia
de
troca
iónica são sujeitas a uma
nova
cromatografia
de
exclusão molecular numa
coluna Desalting G25, com
o objectivo de remover o
sal.
Coluna: Sephadex G25
70
60
50
40
30
20
10
0
-10 0
2
4
6
8
10
Tempo de retenção (min)
10
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L.
6 Passo. Recromatografia de troca iónica da
amostra de cardosina B
Coluna: Mono Q (trocador aniónico)
Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6
Gradiente crescente de 1 M NaCl
800
700
Absorvância a 280 nm (mAU)
A amostra de cardosina B
necessita de ser submetida
a uma nova cromatografia de
troca iónica numa coluna de
maior resolução, a fim de
remover a maior parte da
cardosina A que contamina
a amostra obtida na primeira
troca iónica.
600
500
400
300
200
100
0
-100 0
5
10
15
20
25
30
35
Tempo de retenção (min)
11
Resumo
• A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos e outras
moléculas de acordo com a sua massa, carga ou afinidade por
determinados ligandos
• Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa solução
podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma superfície sólida.
• A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém um gel
constituído por esferas.
• A natureza das esferas determina o tipo de separação realizado. De
acordo com:
•
- a massa, cromatografia de exclusão molecular
•
- a carga, cromatografia de troca iónica
•
- a afinidade, cromatografia de afinidade
MBarros
12