BMP5748 – 2011
Exame
Nome:_____________________________________________
1. Desenhe oligonucleotideos complementares para inserir direto (sem PCR) a
seguinte sequência no sítio BamH1 do gene mostrado, resultando numa versão
híbrida e funcional do gene ( mantendo a fase de leitura, os codons estão
indicados em tripletts).
Sequência a inserir (HA tag): 5' TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT3‘
Sequência gene alvo (clonado em vetor pGEM T easy):
5’ ATG CCA TCA ACT GGG TGT TCT AAC TCA TCC CCG ACT TTT AAA CAT GAG CTG
CAG ATC ATG GCG GAT CCG CTA CAG TTC GGT GGG CTA TCA AGG CTC CAG CTT GTT
ACG ATT CTT ATA CCA TAG 3’
2. O organismo Trypomodium cansativum é um parasita intracelular que invade,
se multiplica e assim destroi linfócitos da onça parda, levando assim à sindrome de
imunodeficiencia e morte precoce deste animal. No parasita foi descoberta uma
familia multigenica (Tc_var) de 100 membros que codifica antígenos importantes
na invasão. Devido ao seu tamanho, estes antigenos podem ser classificados em
10 classes (A-J) que diferem em 3-4 kDa de uma classe para a outra. Você estuda
estes antigenos/genes (modelo do gene am A). Tendo em mãos todos os genes
clonados e um anticorpo contra a porção conservada das proteinas (A), você faz
primeiramente uma análise da regulação de transcrição (B) e expressão dos
antígenos (C) de parasitas recolhidos e recebe o seguinte resultado:
*
N-termino conservado
B
Ectodomínio polimórfico
Microarray with polymorphic
domains amplified with oligos *
each class with 10 members
classes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
TM
epitopo do anticorpo
antiTC_var
dominio conservado
Western blot using antiTC_var
C
Size range of TC-var proteins
A
120 kDa
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
110 kDa
100 kDa
90 kDa
80 kDa
70 kDa
Continuação 2: Interprete os resultados relativos a transcrição e tradução de
proteínas Tc_var.
3. Você faz um nuclear run-on assay com o mesmo material de parasitas de pergunta
2 e recebe o resultado abaixo. A) Descreva brevemente como o ensaio funciona
tecnicamente. B) O que você conclui para a transcrição dos genes TC_var?
Microarray polymorphic domains
each class with 10 members
classes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
4. Tentando descobrir mecanismos que influem neste modo de expressão de genes
TC_var, consegue knockouts em 2 genes potencialmente envolvidos na regulação da
transcrição de TC_var. A partir de material de parasitas knockouts você mede
transcrição por microrarray e expressão de proteinas como feito em 2 B e C.
Parasita knockout no gene MLE (multiple ligands expressed)
A
Microarray polymorphic domains
each class with 10 members
classes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
Western blot using antiTC_var
B
120 kDa
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
110 kDa
100 kDa
90 kDa
80 kDa
70 kDa
Parasita knockout no gene CAP1 (chromatin associated protein 1)
Microarray polymorphic domains
each class with 10 members
C
Western blot using antiTC_var
D
classes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
120 kDa
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
110 kDa
100 kDa
90 kDa
80 kDa
70 kDa
A partir dos resultados 4 A-D, sugira uma função para MLE e CAP1.
Respostas corretas
1. O desenho dos oligos deve considerar a sequência e fase de leitura no
5’ (para ficar na fase com o gene onde será inserido o HA tag) e 3’ do
sitio BamH1 (para continuar na fase de leitura no gene onde será
inserido o HA tag). Sendo assim, a sequência com HA tag inserida deve
ser (três letras juntas um codon) 5’-GCG GAT CCG TAC CCA GAT GTT CCA
GAT TAC GCT GCG GAT CCG C-3’ . Note que os nts sublinhados servem para
manter a fase de leitura. Como temos pouca BamH1 no lab, vou
desenhar 2 oligos que hibridados já formam um sitio BamH1 clivado
(assim os oligos tb são mais curtos! Tem a desvantagem que vou ter que
fosforilar os oligos no 5’ antes de usar , tudo bem):
5’- GAT CCG TAC CCA GAT GTT CCA GAT TAC GCT GCG (fita sense)
5’- GATCCGC AGC GTA ATC TGG AAC ATC TGG GTA CG -3’ (fita antisense)
2. Nos rersultados do microarray que revela a presença de transcritos (e
se for ainda possivel uma densitometria dos spots que não enxergo aqui
poderia ver até a quantidade de cada transcrito) podemos ver que vários
genes Tc_var apresentam transcritos, especificamente das classes B, D, F,
H, I. Em outras palavras, se todos os genes Tc_var forem representados no
array, o organismo possui naquele momento 7 transcritos Tc_var
diferentes (B3, B9, D6, F3, H7, H9, I2). No Western blot onde uso um
anticorpo contra a parte conservada das proteinas (assumo que a
performance deste ac é igual para todas as proteinas TC_VAR), vejo
apenas uma banda na altura das proteinas da classe D, ou seja, é muito
provavel que apenas a proteina TC_VAR D6 esteja presente no parasita – já
que dessa classe apenas um gene apresentou transcrito. Temos aqui
algum controle póstranscripcional na expressão de genes Tc_var que
suprime a tradução dos transcritos.
3. No nuclear run-on é testada a presença de transcrição ativa e não de
transcritos prontos como no Northern blot ou num microarray onde
utiliza –se cDNA marcado como sonda.
O procedimento inclui o isolamento de núcleos intactos, que são
incubados com NTPs radioativamente marcados no alfa-32P. Assim, o
RNA que estava sendo transcrito neste momento no nucleo é
radioativamente marcado e após purificação com métodos adequados
(extração com fenol/trizol e precipitação) pode ser utilizado como sonda
num “microarray radioativo”, neste caso usaria um dot-array com
representantes Tc_var espotados como mostrado já em tarefa 2. Assim
cada transcrito nascente hibridaria com um spot do referente Tc_var do
array (previamente desnaturado para estar em “single strand”).
Já o resultado deste ensaio me mostra que os mesmos genes dos quais vi
transcritos num microarray comum também vejo transcritos nascentes.
Ou seja, transcritos que estão presentes de fato são produzidos naquele
momento (e não anteriormente), e há de fato 7 loci dos quais nascem
estes transcritos.
4. No knockout do gene MLE vejo uma derepressão de tradução, ou seja:
todos os transcritos presentes parecem ser traduzidos (tem sinal no
Western!) com a ressalva que o Western não me resolve se os dois genes
Tc_var classe H de fato são traduzidos. Me parece que o MLE pode ser uma
RNAs/DEAD box Helicase, semelhante a DHH1 de T cruzi ou DOZI de P.
berghei, ela recrutaria os mRNAs de Tc_var. Mas por que ela não reprime
a tradução de um único RNA no wildtype (que é traduzido), eu não sei.
Já o CAP1 parece exercer uma função de repressor de transcrição, mas
não de todos os genes Tc_var, já que não reprime alguns genes transcritos
no wildtype. No knockout, todos os genes são transcritos e com a presença
de MLE, que provavelmente recrutou os transcritos evitando tradução.
Entretanto, como antes, apenas um único transcrito é traduzido (uma
banda no Western).
A transcrição de Tc_var me parece muito complexo e faltam vários
componentes a serem identificados para montarmos um modelo
consistente. Por exemplo, quem licencia loci para serem transcritos na
presença de CAP1? Ou ainda, quem licencia transcritos feitos para serem
traduzidos na presença de MLE?
Classificação final curso 2011
As notas finais foram atribuidas da seguinte maneira: Todo mundo que
participou todos os dias e estava presente na avaliação automaticamente
alcança conceito C. Pontuação no exame entre 0 e 1,33 pontos resulta em
conceito C, entre 1,34 e 2,66 fica com conceito B, e acima 2,66 é conceito A.
Em nenhum caso foram descontados pontos por faltas.
Aluno/a
Conceito
Pontos no
exame (max 4)
Eduardo Alves dos
Santos
A
3
Wesley Luzetti
Fotoran
A
3,9
Natalia Lopez Orozco
C
0,4
Marcell Crispim
C
1,1
Nahiara Esteves Zorgi
A
3
Jaqueline Rodrigues
A
3,25
Andrea Costa
B
1,5
Bianca Cechetto
Carlos
A
3,25
Lucas Borges Pereira
A
3,5
Heloisa Berti Gabriel
A
3,25