UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC
CURSO DE FISIOTERAPIA
BRUNA REMOR BAPTISTA
ANÁLISE DA ATIVIDADE DA CADEIA RESPIRATÓRIA
MITOCONDRIAL E CREATINA QUINASE NO CÉREBRO DE
CAMUNDONGOS MDX
CRICIÚMA, JUNHO DE 2009
1
BRUNA REMOR BAPTISTA
ANÁLISE DA ATIVIDADE DA CADEIA RESPIRATÓRIA
MITOCONDRIAL E CREATINA QUINASE NO CÉREBRO DE
CAMUNDONGOS MDX
Trabalho de conclusão de curso - TCC, do Curso
de Fisioterapia da Universidade do Extremo Sul
Catarinense UNESC.
Orientador Técnico: Prof. Dr.Emilio Luiz Streck
Co-orientadora: Profª Drª. Lisiane Tuon
CRICIÚMA, JUNHO DE 2009
2
BRUNA REMOR BAPTISTA
ANÁLISE DA ATIVIDADE DA CADEIA RESPIRATÓRIA MITOCONDRIAL E
CREATINA QUINASE NO CÉREBRO DE CAMUNDONGOS MDX
Trabalho de Conclusão de Curso
aprovado pela Banca Examinadora para
obtenção do Grau de Fisioterapeuta, no
Curso de Fisioterapia da Universidade do
Extremo Sul Catarinense, UNESC, com
Linha de Pesquisa em Fisiopatologia
Experimental. Criciúma, 29 de Junho de
2008.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Emílio Luiz Streck - Doutor - UNESC- Orientador
Prof. Eduardo Ghisi Victor - Mestre - UNESC
Prof. Tiago Petrucci Freitas - Mestre - UNESC
3
Dedico este trabalho a todos que direta ou
indiretamente contribuíram para concretização de
um sonho, de me tornar Fisioterapeuta, no decorrer
destes últimos cinco anos de conquistas e aos meus
incansáveis esforços durante esta jornada que me
fizeram seguir em frente sempre confiante.
4
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADP - Adenosina difosfato
ATP – Adenosina trifosfato
AVD´s – Atividade de vida diária
CEP – Comitê de ética em pesquisa
CK – Creatina quinase
DMB – Distrofia Muscular de Becker
DMD - Distrofia Muscular de Duchenne
EMG – Eletromiográfico
EEG- Eletroencéfalograma
FADH – Flavina adenina dinucleotídeo
FISIOPAT – Laboratório de Fisiopatologia Experimental
GABA – Ácido gama-aminobutírico
MDX – Modelo animal de distrofia muscular de Duchenne
NAD- Nicotinamida adenina dinucleotídeo
FAD - Dinucleótido de flavina e adenina
NADH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo
GTP- Guanosina trifosfato
FADH2 - flavina adenina dinucleotideo
CO2 – Gás carbônico
O2- Oxigênio
H2O- Água
PK – Piruvato quinase
FMN- Flavina mononucleotideo
Fe-S – Ferro enxofre
CoQ – Coenzima Q
QH2- Ubiquinol
SDH – Succinato desidrogenase
5
QI – Quociente de inteligência
SNC – Sistema Nervoso Central
Cu+2 - Cobre
6
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura A – Ciclo de Krebs...............................................................................21
Figura B – Cadeia respiratória mitocôndrial....................................................26
Figura 1 – Gráficos da análise dos Complexos Respiratórios I,II,III e IV........33
Figura 2 – Análise da Creatina Quinase..........................................................35
7
RESUMO
A ausência de distrofina está envolvida com alterações cognitivas e doenças
psiquiátricas, associada com comprometimento cognitivo e diminuição da
obtenção de energia. Assim, o presente estudo investigou a atividade da
cadeia respiratória mitocondrial e da creatina quinase (CK) em cérebros de
camundongos mdx. Camundongos machos (mdx) e normais C57BL10 foram
utilizados. Os animais com três meses de idade foram mortos por decapitação,
o córtex pré-frontal, cerebelo, hipocampo, estriado e córtex cerebral foram
dissecados para a análise da atividade da cadeia respiratória mitocondrial e
CK. Observou-se em todas as estruturas cerebrais, uma diminuição no
complexo I, não se observando alteração na atividade do complexo II. Houve
também um aumento da atividade do complexo III no córtex e na atividade do
complexo IV no pré-frontal e estriado. A atividade da CK está aumentada em
hipocampo, prefrontal, córtex e estriado. Nossos resultados mostraram uma
disfunção da cadeia respiratória mitocondrial e um aumento na atividade da CK
no cérebro de camundongo mdx. Este aumento na atividade CK pode ser um
efeito protetor contra o dano celular.
Palavras-chave: camundongo
creatinofosfoquinase; cérebro.
mdx;
cadeia
respiratória
mitocondrial;
8
ABSTRACT
Lack of dystrophin has been involved with cognitive impaired and psychiatric
diseases, associated with cognitive impairment, present impairment of energy
production. Thus, the present study investigated mitochondrial respiratory chain
and creatine kinase (CK) activities in mdx mouse brain. Male dystrophic (mdx)
and normal C57BL10 mice were used. The mice were killed after three months
by decapitation when prefrontal, cerebellum, hippocampus, striatum and cortex
were dissected for analyses of mitochondrial respiratory chain and CK activities.
We observed, in all brain structures, a decrease in complex I but not in complex
II activities, increases in complex III activity in cortex, in complex IV activity in
prefrontal and striatum. CK activity was increased in hippocampus, prefrontal,
cortex and striatum. Our results showed a dysfunction in mitochondrial
respiratory chain activity and an increase in CK activity in the brain of mdx
mouse. This increase in CK activity can be a protector effect against cellular
damage.
Key Words: mdx mouse; mitochondrial respiratory chain; creatine kinase;
brain.
9
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 10
2 REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................ 15
2.1 Distrofias musculares ................................................................................. 15
2.2 Distrofia muscular de Duchenne ................................................................ 16
2.3 Distrofina .................................................................................................... 17
2.4 Camundongos mdx X a distrofia muscular de Duchenne........................... 18
2.5 Metabolismo energético ............................................................................. 20
2.6 Cadeia respiratória ..................................................................................... 25
2.7 Creatina Quinase ....................................................................................... 30
3 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................. 32
3.1 Caracterização da pesquisa ....................................................................... 32
3.2 Local e Caracterização da amostra............................................................ 32
3.3 Instrumentos para coleta de dados ............................................................ 32
3.4 Procedimentos para coleta de dados ......................................................... 33
3.5 Procedimentos para análise ....................................................................... 34
4 APRESENTAÇÃO E ANÁLISE DOS DADOS .............................................. 35
5 CONCLUSÃO................................................................................................ 39
REFERÊNCIAS................................................................................................ 40
ANEXOS .......................................................................................................... 46
10
1 INTRODUÇÃO
As distrofias musculares são grupos de distúrbios determinados
geneticamente e associados à degeneração progressiva dos músculos
esqueléticos e em muitos casos, da musculatura cardíaca. São caracterizadas
por fraqueza muscular progressiva, deterioração, degeneração e regeneração
das fibras musculares (UMPHRED, 2004). Onde, a Distrofia muscular de
Duchenne (DMD) é a segunda doença genética mais comum nos seres
humanos e é a forma mais grave das distrofias. É uma condição ligada ao
cromossomo X que afeta aproximadamente 3300 nascidos masculinos vivos,
causada pela ausência ou pelo rompimento da distrofina da proteína, que é
encontrado em uma variedade de tecidos, como nos músculos esqueléticos e
nos neurônios em regiões particulares do sistema nervoso central (SNC)
(ANDERSON et al., 2002; BOGLIOLO, 2000).
A DMD tem início na região podálica começando com fraqueza da
cintura pélvica e manifesta-se por dificuldade de deambular, subir escadas e
elevar-se do solo evoluindo no sentido cefálico comprometendo a cintura
escapular, resultando em transtornos para alimentar-se, envolvimento da
musculatura cardíaca e frequentemente alguns pacientes desenvolvem
alteração da cognição (BOGLIOLO, 2000).
Trinta por cento dos meninos com distrofia muscular de Duchenne
(DMD) sofrem dos vários graus de alteração cognitiva (KUMAGAI et al., 2001;
GILIBERTO et al., 2004). Após a localização do gene da Distrofia Muscular de
Duchenne, descobriu-se que o produto deste, é uma proteína do citoesqueleto
da membrana celular encontrada na superfície interna do sarcolema de fibras
musculares normais, denominada distrofina. A precisa função da distrofina
ainda não está totalmente esclarecida, no entanto sabe-se que ela exerce uma
importante função de manutenção da arquitetura de célula muscular e equilíbrio
no processo de contração (RUBIN, 2002; BOGLIOLO, 2000).
A distrofina, proteína ausente nos músculos dos meninos com DMD é
produzida também no cérebro, e a sua deficiência no SNC pode esclarecer o
retardo mental encontrado em meninos com DMD (KUMAGAI et al., 2001;
GILIBERTO et al., 2004; BOGLIOLO, 2000). Estudo recente mostrou que
déficits cognitivos são associados freqüentemente com a distrofia muscular de
11
Duchenne (DMD). Podem ser devido a um déficit nas isoformas no cérebro da
distrofina. O diagnóstico da DMD engloba exame físico, dosagem sérica de
creatina quinase (CK) onde os níveis séricos estão elevados e piruvato quinase
(PK), eletroneuromiografia, eletrocardiograma e biópsia muscular que auxilia no
diagnóstico final da doença. Pode-se ainda verificar a presença da proteína
distrofina pela imunofluorecência, cuja ausência é patognomônima da DMD
(BOGLIOLO, 2000; RUBIN, 2002).
Os camundongos mdx apresentam ausência na distrofina no músculo e
no cérebro, causando déficits moderados de aprendizagem e memória, além
de comportamentais, ansiedade e a locomoção reduzida em comparação aos
ratos do controle (VAILLEND and UNGERER, 1999). Dados recentes reforçam
a hipótese que a deficiência da distrofina do cérebro está correlacionada com a
disfunção cognitiva e indicam que os camundongos mdx podem ser um modelo
de alteração cognitiva encontrado em meninos com DMD (MUNTONI et
al.,1991; VAILLEND et al., 1995;).
O modelo animal de DMD, não produz a distrofina no músculo e no
cérebro sendo relevante para pesquisas em nível de SNC por que expressa o
genótipo da doença e não o fenótipo, podendo ser utilizado para avaliação das
possíveis alterações cognitivas e danos mitocôndriais. O animal de DMD é
considerado um modelo valioso de DMD humano (VAILLEND, et al., 1995).
Um aspecto importante de DMD que recebe menos atenção é a
ausência ou pelo rompimento da distrofina na função do SNC. Os estudos
comportamentais comparativos entre meninos com DMD e ratos mdx,
mostraram que os meninos com DMD têm um déficit cognitivo e um quociente
de inteligência (QI) mais baixo (média 85), enquanto os ratos mdx indicam um
déficit na aprendizagem passiva de latência e na memória em curto prazo. Em
meninos com DMD, há uma evidência de desordem na arquitetura do SNC,
anormalidades nos dendritos e perda neural. No rato mdx, relatórios recentes
descrevem uma diminuição de 50% no número de neurônios e perdas neurais
nas regiões do córtex cerebral (ANDERSON et al., 2002).
No estudo realizado por Navarro et al (2004), afirmou-se que a atividade
enzimática dos complexos I (NADH desidrogenase) e IV (citocromo oxidase)
são marcadores de função mitocondrial. Os aumentos da atividade dessas
12
enzimas são diretamente relacionados com os produtos oxidativos e a função
neurológica em ratos mdx.
Baseado na contextualização do problema elaborou-se a seguinte
questão: A atividade da cadeia respiratória mitocondrial e creatina quinase
podem estar relacionadas com as alterações comportamentais no modelo
animal de distrofia muscular de Duchenne?
Tendo como referência a questão problema acima citada, formularam-se
as seguintes questões a investigar e suas respectivas hipóteses:
I) Existe disfunção metabólica no cérebro de camundongos mdx?
Acredita-se que a alteração do metabolismo leva a um aumento da
sensibilidade das áreas cognitivas, principalmente hipocampo e córtex
pré-frontal.
II) A partir disto, qual parte do metabolismo está afetada: creatina
quinase, cadeia respiratória ou ambos?
Acredita-se que ambas estarão afetadas. A creatina quinase em estudos
apresenta-se com os níveis séricos elevados em camundongos com
distrofia muscular de Duchenne; já com relação à cadeia respiratória
acredita-se que ela esteja diminuída devido ao fato de ela estar presente
em todas as células cerebrais sendo necessário o O2 para a produção
de ATP e uma membrana mitocondrial intacta; uma alteração na
capacidade de produção de ATP leva a uma alteração do metabolismo.
Este estudo visou correlacionar a importância da atividade da cadeia
respiratória e creatina quinase no cérebro do modelo animal de camundongos
com distrofia muscular de Duchenne (mdx).
Como objetivos específicos:
I) Analisar a relação dos complexos respiratórios I, II, III e IV, nas
alterações comportamentais de camundongos mdx, nas estruturas cerebrais
dissecadas: hipocampo, estriado, cerebelo, córtex pré-frontal e córtex;
II) Analisar os níveis séricos de creatina quinase nas estruturas
cerebrais no cérebro de camundongos mdx: hipocampo, estriado, cerebelo,
córtex pré-frontal e córtex como parâmetro diagnóstico;
13
III) Analisar os níveis séricos de creatina quinase no sangue como
parâmetro diagnóstico no cérebro de camundongos mdx.
A Distrofia Muscular de Duchennne (DMD) é caracterizada por
uma desordem recessiva, ligadas ao cromossomo X, causando distúrbios de
caráter genético na região Xp21, acometendo músculos cardíaco, esquelético e
cerebral.
Esta alteração provoca uma deleção no gene responsável pela
produção de uma proteína citoesquelética denominada distrofina, que tem a
função de manter as propriedades mecânicas da célula, a flexibilidade e a
integridade. A DMD acomete exclusivamente meninos com uma taxa de
incidência de 1 a cada 3.300 meninos nascidos vivos (CARAKUSHANSKY.
2001, THOMPSON, 2002). Trinta por cento dos meninos com distrofia
muscular de Duchenne (DMD) sofrem dos vários graus de alteração cognitiva
(KUMAGAI et al., 2001; GILIBERTO et al., 2004).
Uma análise de vinte e oito estudos relativos à avaliação das
funções cognitivas em pacientes com DMD, mostrou que as funções verbais
como processamento fonológico, memória verbal, aritmética, compreensão e
leitura apresentam maior impacto no desempenho intelectual global destes
pacientes,
se
comparadas
às
habilidades
viso-espaciais.
Algumas
especificidades foram encontradas em relação à idade dos pacientes: aqueles
mais jovens apresentaram maior comprometimento intelectual verbal. Em
contrapartida, os pacientes mais velhos mostraram maior dificuldade motora.
Estudos sugerem que a maior disfunção verbal nos jovens esteja associada à
deleções nas partes distais do gene distrofina, mais freqüentemente a deleções
downstream no exon 44, comprometendo, principalmente, a transcrição das
proteínas Dp140 e Dp71. Tais proteínas estão presentes em estruturas
corticais responsáveis por grande parte das funções cognitivas como
hipocampo, giro denteado e córtex pré-frontal (ZACH et al., 2006).
Por meio dos estudos realizados com os camundongos mdx, que é o
modelo ideal para estudar a doença, e é o modelo que mais se assemelha com
humanos com essa distrofia, poder-se-á encontrar respostas até então não
conhecidas a respeito da DMD, para desenvolver possíveis tratamentos
14
fisioterapêuticos que melhorem a atividade respiratória dos portadores da
distrofia e contribuir com comunidade científica e social.
Tornam-se
importantes
investigações
mais
aprofundadas
desta
distrofinopatia que a cada ano vem aumentando o número de casos. O objetivo
de melhorar a qualidade de vida destes pacientes e minimizar ao máximo os
efeitos físicos e psicológicos que estes meninos apresentam com a progressão
da doença, esta deve ser a principal meta dos profissionais da saúde.
Este trabalho pretende mostrar o quão importante é a Fisioterapia nesta
doença degenerativa e progressiva, que leva a uma deformidade e
incapacidade desses pacientes que lutam pela vida mesmo sabendo que sua
expectativa de vida não ultrapassará a segunda década de vida, com
exercícios
que
ofertam
melhora
da
capacidade
respiratória,
diminui
significantemente a evolução das deformidades, a fadiga apresentada pelos
portadores de DMD que dificulta na realização de suas atividades de vida diária
(AVD´s), o tratamento com Fisioterapia auxilia esses pacientes a terem uma
maior independência para realizarem suas atividades de forma que não
precisem em tempo integral de um cuidador ou de um familiar para auxiliá-lo.
Poder contribuir com uma parcela significativa para o entendimento das
alterações do metabolismo desses pacientes e de que forma essa alteração se
manifesta, visando esclarecer dúvidas que são pouco mencionadas, devido à
escassez de estudos relacionados com essas alterações metabólicas dessa
doença.
Como são pouco conhecidos os efeitos das distrofinopatias no Sistema
Nervoso Central, através da análise metabólica e da determinação em tecido
cerebral, poderemos identificar e melhor compreender os mecanismos
neurobiológicos que levam ao dano cognitivo em pacientes portadores de
distrofia muscular de Duchenne e assim promover novas estratégias
terapêuticas para esta doença.
15
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Distrofias musculares
As distrofinopatias compreendem a Distrofia Muscular de Duchene
(DMD) e a Distrofia Muscular de Becker (DMB), caracterizadas por uma
desordem recessiva, ligadas ao cromossomo X, causando distúrbios de caráter
genético na região Xp21, acometendo músculos cardíaco e esquelético. Esta
alteração provoca uma deleção no gene responsável pela produção de uma
proteína citoesquelética denominada distrofina, que tem a função de manter as
propriedades mecânicas da célula muscular, a flexibilidade e a integridade que
é necessária durante a contração e relaxamento das fibras musculares. Esta
proteína encontra-se ausente na DMD e de forma parcial na DMB,
caracterizando as formas mais severas e mais leves, respectivamente, onde
ambas apresentam sinais e sintomas semelhantes, porém, com um tempo de
evolução diferenciado (REED, 2002; BEHRMAN, 2002)
A DMD e a DMB acometem exclusivamente meninos, sendo que a
mãe é a portadora do gene e responsável pela transmissão genética do
mesmo. A DMD apresenta uma taxa de incidência de 1 a cada 3.500 meninos
nascidos vivos, e a DMB de 1,7 a 5,5 a cada 100.000 (CARAKUSHANSKY,
2001). A proteína distrofina, está presente no sarcolema da membrana celular
dos músculos esqueléticos (REED, 2002), no entanto, se sabe que esta
proteína possui três isoformas: a do tipo muscular, a do tipo cerebral e a do tipo
Purkinje, As isoformas cerebrais, ainda que em pequenas concentrações, são
encontradas em neurônios corticais e células cerebelares de Purking (KUDOH,
2005). Em doenças crônicas como as Distrofias Musculares, têm sido utilizadas
indiretamente mensurações das atividades metabólicas e enzimáticas como a
análise da cadeia respiratória mitocôndrial e CK (creatina quinase) para teor
metodológico, pois em estudos já realizados com camundongos mdx, a
degeneração celular ocasionada pela patologia pode ser correlacionada
secundariamente à alteração do metabolismo energético.
16
2.2 Distrofia muscular de Duchenne
Como definição a distrofia muscular de Duchenne (DMD) é considerada
a segunda doença genética mais comum nos seres humanos. É uma condição
ligada ao cromossomo X, do gene Xp21, no qual afeta aproximadamente 3300
nascidos masculinos vivos. O rompimento ou ausência da distrofina da proteína
é o fator causal da doença, a distrofina pode ser encontrada em uma
diversidade de tecidos, como nos músculos esqueléticos e nos neurônios em
regiões particulares do SNC. DMD é caracterizada clinicamente por uma
doença severa da musculatura esquelética, resultando na morte prematura do
indivíduo. Trinta por cento dos meninos com distrofia muscular de Duchenne
(DMD) sofrem dos vários graus de alteração cognitiva (ANDERSON et al.,
2002; CARAKUSHANSKY, 2001).
Já foram mapeados genes responsáveis por mais de 30 formas de
distrofias, cuja herança pode ser autossômica dominante, autossômica
recessiva e ligada ao cromossomo X. As distrofias musculares devem possuir
cinco características essenciais, como: miopatia, definida por critérios clínicos,
histológicos e eletromiográficos (EMG), sem sinais de desenervação ou déficits
sensitivos; todos os sintomas são efeitos da fraqueza dos músculos
(ROWLAND, 2002; MARQUES, 2005).
Bem como o histórico da Distrofia Muscular de Duchenne que foi
descrita pela primeira vez no século XIX, década de 60, por Guillaume
Duchenne (STOKES, 2000). Na metade do século descrito, descobriu-se que a
fraqueza dos músculos voluntários poderia ser causada por uma degeneração
primária destes, onde o termo “distrofia muscular” designa esta característica
de
degeneração,
sendo
frequentemente
de
caráter
hereditário,
e
implacavelmente progressivo. O estudo morfológico, realizado nesta época,
demonstra necrose das fibras musculares, atividade regenerativa, fibrose
progressiva e infiltração do músculo com tecido gorduroso (RUBIN, 2002).
17
2.3 Distrofina
Logo após que se descobriu à localização do gene da Distrofia Muscular
de Duchenne, constatou-se que o produto deste, é uma proteína, distrofina do
citoesqueleto da membrana celular. No entanto ainda não se sabe exatamente
qual a real função desta proteína. Originalmente, a distrofina foi relatada como
sendo principal proteína reguladora do complexo glicoproteico no qual
estabiliza a membrana celular dos músculos esqueléticos (CARAKUSHANSKY,
2001; THOMPSON, 2002).
Na DMD, a distrofina é produzida defeituosamente, causando alteração
do complexo glicoproteico, tornando a membrana plasmática instável. Esta
alteração pode ser responsável pela maior fragilidade osmótica, bem como
pelo influxo excessivo de íons de cálcio que se acumulam no interior da fibra
muscular, levando a uma degradação das miofibrilas, áreas de necrose
segmentares, ocasionando contínua degeneração e regeneração das fibras
musculares, até que, a capacidade de reparo não seja suficiente e as fibras
musculares esqueléticas sofram degeneração irreversível com substituição por
tecido fibro-adiposo (MARQUES, 2005; RUBIN, 2002).
A ausência da proteína distrofina proporciona nas membranas
musculares
maior
permeabilidade,
aumentando,
consequentemente,
a
concentração de cálcio. O cálcio ativa as enzimas que causam colapso das
células
musculares
(CARAKUSHANSKY,2001
apud
CULLEN
&
FUTHORPE,1975; MONTRI & ENGEL,1975).
A perda da habilidade de regeneração pode ser o resultado da exaustão
das células miogênicas satélites causada pelos excessivos ciclos de
degeneração e regeneração (ARAUJO, 2005; RUBIN, 2002). A distrofina ela
também é produzida no cérebro, e a sua deficiência no SNC pode esclarecer a
alteração da cognição em meninos com DMD, bem como a sua ausência nos
músculos destes meninos leva a alterações físicas (KUMAGAI et al., 2001;
GILIBERTO et al., 2004).
18
2.4 Camundongos mdx X a distrofia muscular de Duchenne
A Distrofia Muscular de Duchennne (DMD) se caracteriza por ser uma
desordem recessiva, ligadas ao cromossomo X, causando distúrbios de caráter
genético na região Xp21, onde os músculos cardíaco, esquelético e cerebral
são os mais acometidos. (CARAKUSHANSKY, 2001; THOMPSON, 2002).
Dados recentes reforçam a hipótese que a deficiência da distrofina do
cérebro está correlacionada com a disfunção cognitiva e indicam que os
camundongos mdx podem ser um modelo para a alteração da cognição
encontrada em meninos com DMD (MUNTONI et al .,1991; VAILLEND et al.,
1995 ).
No camundongo mdx, a distrofina encontra-se ausente em tecidos do
músculo e do cérebro, é considerado ser um modelo valioso de DMD humano
(VAILLEND et al., 1995). No sistema nervoso central, a distrofina é restringida
às populações neurais específicas que mostram a suscetibilidade aos danos
excito-tóxicos, localizados em dendritos proximais e nos corpos neurais.
Relatou-se que os neurônios CA1 piramidais hipocampal no rato mdx, exibe
uma significativa suscetibilidade aumentada aos danos hipóxicos-induzidos à
transmissão
sináptica.
Esta
vulnerabilidade
seletiva
foi
melhorada
substancialmente pela administração de diphenylhydantoin um anticonvulsivo
que obstrui ambos os potenciais de ação sódio-dependentes e condutores de
cálcio de baixo-ponto inicial. Estes achados sugerem que a deficiência da
distrofina poderia predispor populações neurais susceptíveis aos insultos
hipóxicos cumulativos que podem contribuir ao desenvolvimento de déficits
cognitivos em pacientes com distrofia muscular de Duchenne e que os efeitos
de tais períodos de hipóxia podem ser farmacologicamente remediados
(MEHLER et al., 1992).
Um aspecto importante de DMD que recebe menos atenção é o papel
pela ausência ou pelo rompimento da distrofina na função do SNC. Os estudos
comportamentais comparativos entre meninos com DMD e ratos mdx,
mostraram que os meninos com DMD têm um déficit cognitivo e um QI mais
baixo (média 85), enquanto os ratos mdx indicam um déficit na aprendizagem
passiva de latência e na memória a curto prazo. Em meninos com DMD, há
uma evidência de desordem na arquitetura do SNC, anormalidades nos
19
dendritos e perda neural. No rato mdx, relatórios recentes descrevem uma
diminuição de 50% no número de neurônios e perdas neurais nas regiões do
cortex cerebral. A evidência histológica mostra que a densidade de conjuntos
do canal de GABAA está reduzida assim como as células de Purkinje e os
neurônios CA1 hipocampal do mdx. A nível bioquímico, os meninos com DMD
apresentam níveis bioenergéticos do SNC anormais e há um aumento nos
níveis de compostos choline-containing, indicativos de patologia do SNC. Os
ratos mdx também indicam bioenergética anormal, com um nível aumentado do
fosfato inorgânico e aumento dos níveis de compostos choline-containing.
Funcionalmente, os meninos com DMD têm anormalidades no EEG e há
alguma evidência preliminar que a função sináptica está afetada adversamente
pela ausência da distrofina. Os estudos eletrofisiológicos de ratos mdx
mostraram que os neurônios hipocampais têm uma suscetibilidade aumentada
à hipóxia (ANDERSON et al., 2002).
Estudo recente mostrou que déficits cognitivos são associados
freqüentemente com a distrofia muscular de Duchenne (DMD). Podem ser
devido a um déficit nos isoformos do cérebro da distrofina. Os ratos mdx
apresentam ausência na distrofina no músculo e no cérebro, causando déficits
moderados de aprendizagem e memória, além de comportamentais, ansiedade
e a locomoção reduzida em comparação aos ratos do controle (VAILLEND,
UNGERER, 1999).
Estudos investigativos de alterações em células endoteliais e da glia na
barreira hemato-encefálica realizado por Nico et al.2003, indicam que a
deficiência do distrofina no cérebro do mdx conduz a lesão severa das células
endoteliais e gliais, indicando alterações na barreira hemato-encefálica,
sugerindo que as mudanças na permeabilidade vascular estão envolvidas na
patogênese da disfunção neurológica associada com a DMD.
20
2.5 Metabolismo energético
Em 1937, Hans Krebs apresentou uma série de reações do metabolismo
intermediário de carboidratos. O ciclo proposto por Krebs leva o seu nome nos
dias de hoje. O ciclo de Krebs, ou ciclo do ácido cítrico, é a via final comum
para a oxidação das moléculas alimentares, servindo também como fonte de
precursores para biossínteses (BERG et al., 2004)
Kennedy e Lehninger, em quase meio século, descobriram que as
mitocôndrias contêm as enzimas do ciclo de Krebs e as enzimas de oxidação
dos ácidos graxos, além dos complexos respiratórios (STRYER, 2004).
Mitocôndrias são organelas intracelulares, cuja função principal é a produção
de ATP pelo metabolismo aeróbico. Do mesmo modo, exercem um papel
importante e crítico no processo de apoptose celular e servem de tampão de
cálcio. Tecidos com atividade metabólica aeróbica intensa, como o cérebro e
os músculos esquelético e cardíaco, apresentam altas concentrações dessa
organela (ORTH e SCHAPIRA, 2001).
Para que ocorra um bom funcionamento dos neurotransmissores,
sistema de segundos mensageiros, expressão gênica, hormonal entre outros, é
necessário à obtenção de energia celular, pois os seres vivos precisam de
energia para realizar várias funções, como, por exemplo, o transporte ativo de
íons e moléculas, síntese de macromoléculas e outras biomoléculas a partir de
precursores simples e para a contração muscular. A energia necessária para
realizar essas funções é obtida com a oxidação de substâncias pela respiração
celular. A adenosina trifosfato (ATP) é o principal combustível da célula na
maioria dos processos que precisam de energia. A energia é liberada pela
hidrólise de ATP e serve para impulsionar uma série de reações (NELSON et
al., 2000).
Tendo por vez que os carboidratos são degradados à glicose, bem como
os lipídios se convertem em ácidos graxos e as proteínas em aminoácidos,
estes produtos finais estão envolvidos no processo de respiração celular e,
conseqüentemente, na produção de ATP (LEHNINGER et al., 2002).
21
A glicose é um alimento importante e comum, em mamíferos, ela é a
única fonte de energia que o cérebro utiliza em condições sem jejum e a única
que as hemácias podem utilizar em qualquer circunstancia (BERG et al., 2004).
Cada tipo celular nos humanos é capaz de produzir ATP, por meio da glicólise,
uma rota no qual a glicose é transportada para dentro das células por proteínas
transportadoras específicas. Onde é oxidada e quebrada para formar piruvato,
produto final da via, por meio de reações metabólicas que ocorrem no citosol
(LEHNINGER et al., 2002; SMITH et al.,2007).
Em condições aeróbicas, o piruvato é transportado para dentro da
mitocôndria e sofre ação combinada do ciclo de Krebs e da fosforilação
oxidativa é responsável pela maior parte da produção de ATP gerada pelos
seres humanos. Os elétrons presentes nas coenzimas nicotinamida adenina
dinucleotideo (NADH) e flavina adenina dinucleotideo (FADH2) são transferidos
para os complexos enzimáticos e posteriormente para o oxigênio levando a
formação de água (WALLACE, 1999).
O piruvato formado na via glicolítica não é reduzido a lactato, a etanol ou
a qualquer outro produto de fermentação, em contrapartida ele é oxidado a
CO2 e H2O essa fase aeróbia do catabolismo é denominada respiração. A
respiração celular ocorre em três estágios: o primeiro, corresponde à molécula
dos combustíveis orgânicos (glicose, ácidos graxos e alguns aminoácidos),
liberam fragmentos de dois átomos de carbono na forma de um grupo acetil e
acetil-coenzima A (acetil-CoA). No segundo momento os grupos acetil entram
no ciclo do ácido cítrico, que os oxida por meio de enzimas até CO2. O NADH
e o FADH2, que são elétrons reduzidos, transportam energia liberada pela
oxidação e por fim no terceiro estágio da respiração o NADH e o FADH2
(coenzimas reduzidas), são oxidadas desfazendo-se de prótons e elétrons. A
cadeia
de
moléculas
transportadora
de
elétrons
denominada
cadeia
respiratória, vai conduzir os elétrons até o O2, no qual se reduzem para formar
água. Durante a transferência de elétrons, grande quantidade de energia é
liberada e conservada na forma de ATP e esse processo dá-se o nome de
fosforilação oxidativa (LEHNINGER et al., 2002; SMITH et al., 2007).
Em condições aeróbicas, o piruvato é transportado para dentro da
mitocôndria e sofre ação do complexo enzimático da piruvato desidrogenase,
que forma acetil coenzima A (acetil-CoA). A acetil-CoA inicia o ciclo de Krebs.
22
É importante salientar que a acetil-CoA pode ser formada também pela
oxidação de ácidos graxos e aminoácidos (BERG et al, 2004; CLARK et al,
1993; SMITH et al., 2007; NELSON e COX, 2000).
O ciclo de Krebs é a rota central para recuperação de energia do
metabolismo e ocorre na matriz mitocôndrial, no qual consiste de uma
seqüência de reações onde, em cada volta do ciclo, são formadas três
moléculas de NADH, uma de FADH2, duas de CO2 e uma de GTP. O NADH e
FADH2 produzidos no ciclo de Krebs são carreadores de elétrons e são
utilizados na cadeia respiratória para a produção de ATP na fosforilação
oxidativa. Altos níveis de ATP inibem o ciclo de Krebs por mecanismos
complementares em vários locais do ciclo. (MARKS et a.l, 2005; NELSON e
COX, 2000).
23
Figura A: Ciclo de Krebs. Fonte: SMITH et.al, 2007.
Durante o processo de transporte de elétrons, tais proteínas obtêm os
prótons da matriz e quando são reoxidadas elas liberam os prótons dentro do
espaço intermembrana, originando assim o gradiente de prótons, que resulta
em um aumento da concentração de prótons no espaço intermembrana, e a
produção de ATP ocorre quando esses prótons migram de volta para o interior
da matriz mitocondrial (VOET et al., 2002).
Outra forma de produção de ATP é a partir da creatina quinase, uma
enzima responsável por catalisar reversivelmente à reação entre a creatina
fosfato e a adenosina difosfato (ADP), formando creatina e ATP (BERG et al.,
2004).
A enzima possui um papel central no metabolismo energético,
24
principalmente para tecidos com alta demanda energética, como cérebro,
músculo cardíaco e esquelético, onde funciona como um efetivo sistema de
tampão para os níveis celulares de ATP, sendo assim é uma enzima crucial
para a homeostase energética (PAGANA et al., 2001).
Estudos com músculo demonstraram deficiência no metabolismo
energético mitocôndrial em pacientes com depressão, havendo redução da
atividade da cadeia de transporte de elétrons e diminuição da produção de
ATP (GARDNER et al., 2002), bem como foi demonstraram uma inibição da
cadeia de transporte de elétrons em cérebro de ratos submetidos ao estresse
crônico (MADRIGAL et al., 2001).
No estudo realizado por NAVARRO et al (2004), afirma que a atividade
enzimática mitocôndrial, NADH desidrogenase e citocromo oxidade, são
marcadores de comportamento no cérebro. Os aumentos da atividade dessas
enzimas são diretamente relacionados com os produtos oxidativos e a função
neurológica em ratos mdx.
Sabendo da gravidade da DMD, dos possíveis danos causados pelos
tratamentos e da necessidade de ATP para o bom funcionamento celular, e
também que a alteração no metabolismo energético cerebral parece estar
associada com algumas doenças neurodegenerativas (BEAL, 1992; HEALES
et.al, 1999), é importante conhecer possíveis alterações metabólicas na DMD,
ou provenientes de formas de tratamentos para a mesma, como a Fisioterapia
neuro-funcional que contribui de maneira construtiva e benigna para o bom
desenvolvimento motor, prevenindo alterações osteomusculares mais graves,
amenizando os sinais clínicos da distrofia muscular de Duchenne, tal qual a
fadiga, melhora o padrão respiratório, prevenindo e minimizando os efeitos
posteriores da evolução clínica da doença.
25
2.6 Cadeia respiratória
A cadeia respiratória e a fosforilação oxidativa, assim como o ciclo de
Krebs, ocorrem nas mitocôndrias, fonte principal de ATP em organismos
aeróbios. A transferência de elétrons pela cadeia respiratória leva ao
bombeamento de prótons da matriz para o lado citossólico da membrana
mitocondrial interna. O gradiente de prótons é usado para impulsionar a síntese
de ATP (ERECINSKA e DAGANI, 1990; HEALES et al., 1999; WALLACE,
1999; NELSON e COX, 2000).
O NADH e o FADH2, formados na glicólise, na oxidação dos ácidos
graxos, e no ciclo de Krebs, são moléculas ricas em energia, pois cada uma
delas possui um par de elétrons com alto potencial de transferência. Estes
elétrons quando são utilizados para reduzir o oxigênio molecular até a água,
libera-se grande quantidade de energia que pode ser usada para gerar ATP. A
fosforilação oxidativa é o estágio final do metabolismo que produz energia nos
organismos aeróbicos, formada por uma série de complexos protéicos, e é o
processo no qual se forma ATP quando o NADH e o FADH2 transferem
elétrons, por uma série de transportadores de elétrons (SMITH et al., 2007;
LEHNINGER et al., 2002; STRYER, 2004). As únicas espécies a atravessarem
a membrana interna, que é impermeável, à maior parte das moléculas
pequenas e de íons e prótons, são aquelas para as quais existem
transportadores específicos. A membrana interna contém os componentes da
cadeia respiratória e ATP sintase. Já na matriz mitocôndrial possui todas as
vias de oxidação dos combustíveis, com exceção a glicólise, que ocorre no
citosol.
A membrana interna que é seletivamente permeável segrega os
intermediários e as enzimas das vias metabólicas citosólicas por meio de
processos metabólicos que ocorrem na matriz. O ATP recém-sintetizado é
transportado para fora por meio de transportadores específicos ADP e o Pi que
se encontram no interior da matriz (LEHNINGER et al., 2002). A maioria da
energia da oxidação dos substratos energéticos no ciclo de Krebs e em outras
vias é conservada na forma de co-enzimas aceptoras de elétrons, NADH e
FADH2. A fosforilação oxidativa dá início com a entrada de elétrons na cadeia
respiratória a maioria desses elétrons originados da ação desidrogenases que
arrecadam elétrons das vias catabólicas e os canalizam para os aceptores
26
universais de elétrons, citados anteriormente. Na cadeia transportadora de
elétrons o NADH ou FADH2 doam elétrons que passam de forma seqüencial
por meio de uma série de carregadores de elétrons que estão localizados na
membrana interna da mitocôndria que apresentam grupos prostéticos no qual
são capazes de aceitar ou doar um ou dois elétrons. Os elétrons transferidos
para o oxigênio passam por meio de uma cadeia de três grandes complexos
protéicos, denominados NADH desidrogenase, citocromo redutase e citocromo
c oxidase. O fluxo de elétrons por estes complexos pelas membranas levam
transportes de prótons através da membrana mitocôndrial interna (MARZZOCO
e TORRES, 1999; STRYER, 2004).
Os elétrons transportados da NADH desidrogenase para citocromo
redutase o segundo complexo da cadeia, pela forma reduzida da co-enzima Q
(ubiquinona) também transporta elétrons do FADH2 gerado na succinato
desitrogenase do ciclo de Krebs, para o citocromo redutase por meio da
succinato oxirredutase. Transporte de elétrons para o oxigênio ocorre por uma
série de etapas de oxirredução, onde cada componente sucessivo da cadeia
quando recebe elétrons é reduzido e quando passa os elétrons para o próximo
componente da cadeia é oxidado. A Flavina mononucleotideo (FMN), centros
Fe-S, CoQ e Fe nos citocromos b, c1, c, a e a3, são componentes de oxiredução. O cobre também é um componente dos citocromos a e a3.
Desconsiderando o CoQ, todos os aceptores de elétrons citados
anteriormente
são
fortemente
ligados
a
subunidades
protéicas
dos
carregadores. O potencial de redução de cada complexo da cadeia está em um
nível de energia mais baixo do que o anterior, de tal modo que a energia é
liberada quando os elétrons passam de um complexo para outro. A energia é
utilizada para mover prótons contra o seu gradiente de concentração da
maneira que eles se tornam concetrados do lado citosolico da membrana
interna (SMITH et al.2007).
NADH carrega os elétrons derivados das reações catabolicas até o inicio
da cadeia respiratória, com complexo NADH desidrogenase. O NADPH
geralmente fornece elétrons nas reações anabólicas.
Tanto NADH como
NADPH não podem atravessar a membrana interna da mitocôndria, mas os
elétrons que elas carregam podem ser lançados por meio delas. Os
transportadores de elétrons funcionam em complexos multienzimáticos.
27
A cadeia respiratória é dividida em quatro complexos. Os complexos I e
II catalisam a transferência de elétrons para ubiquinona a partir de dois
doadores de elétrons diferentes o NADH (complexo I) e o succinato (complexo
II). O complexo III transporta elétrons da ubiquinona até o citocromo c, e o
complexo IV completa a seqüência transferindo elétrons do citocromo c para o
complexo II (STRYER, 2004; LEHNINGER et al., 2002).
Complexo I: NADH – ubiquinona oxirredutase. Realiza a transferência de
elétrons do NADH para a ubiquinona, formando ubiquinol (QH2). Um FMN
recebe dois elétrons do NADH, originando a forma reduzida FMNH2, e é capaz
de passar elétrons single para os centros Fe-S. Estes centros são capazes de
deslocar elétrons single para orbitais grandes, quando sofrem reação de óxidoredução sem liberar ou captar prótons, deste modo transferindo elétrons para a
CoQ e a partir dela. Por meio da NADH desidrogenase ocorre o bombeamento
de quatro iontes de hidrogênio para fora da matriz da mitocôndria. A redução
de CoQ a QH2 resulta na captação de dois prótons da matriz. O par de elétrons
na QH2 ligada são transferidos a um centro 4 Fe-S, e os prótons são liberados
no lado citossólico, por fim estes elétrons são transferidos a uma Q móvel no
centro hidrófobo da membrana, resultando na captação de mais dois prótons
da matriz.
O
complexo
II, denominado
de succinato:
Q(ubiquinona)
oxirredutase, é formado pela succinato desidrogenase (SDH), enzima do ciclo
do ácido cítrico que gera FADH2 na oxidação de succinato a fumarato e três
subunidades hidrofóbicas. Esta enzima tem FAD como grupo protético. Os
elétrons e os prótons do succinato são transferidos para o FAD, que se reduz a
FADH2. O FADH2, não sai do complexo. Também fazem parte do complexo II
alguns centros de Fe-S e o citocromo b560. Por esses componentes passam
os elétrons derivados do FADH2 antes de finalmente serem doados para a
coenzima Q são transferidos para centros Fe-S e daí para coenzima Q, para
entrarem na cadeia transportadora de elétrons. Duas outras enzimas a glicerol
fosfato desidrogenase e a acil CoA desidrogenase, transferem do mesmo modo
seus elétrons de alto potencial do FADH2, para coenzima Q, formando
ubiquinol (QH2), o estado reduzido da ubiquinona. O complexo succinato: Q
oxiredutase e outras enzimas que transferem elétrons do FADH2 para
ubiquinona, ao contrário da NADH: Q oxirredutase, não transportam próton. Em
28
conseqüência, menos ATP é formada na oxidação do FADH2 do que do NADH
(STRYER, 2002; SMITH et al., 2007).
Figura B – Cadeia Respiratória Mitocondrial. Fonte: NELSON e COX (2000).
O complexo III, ou citocromo c oxirredutase, transfere elétrons do
ubiquinol para o citocromo c, reação que serve para o bombeamento de mais
quatro prótons. O complexo IV mais conhecido como, citocromo c oxidase,
contém dois citocromos do tipo (a e a3) e dois íons de cobre, cada qual
associado a um dos dois citocromos. Os íons de cobre, alternando entre os
estados de oxidação Cu2+ e Cu1+, fazem parte do transporte dos elétrons. O
complexo IV é responsável pela doação de quatro elétrons para a molécula de
oxigênio (O2) que, liga-se a prótons do meio e converte-se em água (NELSON
e COX, 2000). A retirada de prótons da matriz mitocondrial para o espaço
intermembrana contribui para o restabelecimento do gradiente de prótons.
Nessa etapa os últimos dois prótons são bombeados (BERG et al, 2004;
WALLACE, 1999). A importância da ligação indireta entre a transferência de
elétrons é que um não ocorre sem o outro. Assim quando os prótons não estão
sendo utilizados para a síntese de ATP, o gradiente de prótons e o potencial de
membrana estão sendo formados. Essa pressão de retorno de prótons é o que
29
vai controlar a velocidade de bombeamento de prótons, no qual controla o
transporte de elétrons e o consumo de oxigênio (SMITH et al., 2007).
O gradiente eletroquímico formado pelo bombeamento de prótons
durante a cadeia respiratória mitocondrial é utilizado como força motriz para a
ATPsintase, formar ATP (fosforilação oxidativa). O ATP é transportado para
fora da mitocôndria com o concomitante transporte de ADP para dentro da
mitocôndria, através de um sistema antiporte (BERG et al, 2004; HEALES et al,
1999; WALLACE, 1999; NELSON e COX, 2000). A membrana mitocondrial
interna é impermeável a prótons em toda a sua extensão, exceto na ATP sintase; e é por este canal que os prótons atravessam a membrana e retorna a
matriz mitocôndrial, o ATP recém – sintetizado é utilizado para processos que
necessitam de energia, como transporte ativo, a contração muscular ou as
reações de biossíntese. Da mesma forma que o ADP, fosfato, piruvato e outros
metabólicos devem ser transportados para o interior da matriz (SMITH et al.,
2007).
As necessidades celulares de ATP variam segundo o estado fisiológico
do tecido ou órgão, o cérebro é um tecido de alta demanda mesmo em
repouso. Evidências clínicas indicam que o cérebro é extremamente sensível
às variações no metabolismo energético. O cérebro humano constitui somente
2% do peso corporal, entretanto pelos seus altos processos de energia
consome aproximadamente 25% do total da glicose corporal. A glicose, em
determinados tecidos, pode seguir vários caminhos metabólicos, no entanto no
cérebro, é quase que totalmente oxidada a CO2 e H2O através de uma
seqüência de passagens pela glicólise, ciclo do ácido cítrico associado à
fosforilação oxidativa, na qual tem um rendimento de ATP por molécula de
glicose. De fato, o consumo de oxigênio pelo cérebro é de 20% do consumo de
todo o organismo.
Deficiências
no
funcionamento
normal
da
cadeia
respiratória
mitocondrial levam à diminuição da síntese de ATP (HEALES et al, 1999).
Sabe-se também que o dano causado à mitocôndria leva a uma rápida queda
na produção de energia e conseqüente morte celular (ANKARCRONA et al,
1995).
30
2.7 Creatina Quinase
A creatina quinase consiste de um grupo de isoenzimas com um papel
central no metabolismo energético, principalmente para tecidos com alta
demanda energética, como cérebro, músculo cardíaco e esquelético, onde
funciona como um efetivo sistema de tampão para os níveis celulares de ATP.
(BESSMAN e CARPENTER, 1985; SCHNYDER et al., 1991; WALLIMANN et
al., 1992).
O suprimento de ATP no cérebro dura em torno de segundos, o que
explica a rápida deterioração que ocorre no cérebro devida a privação de O2
(VOET, VOET e PRATT,2002). A creatina quinase catalisa a transfosforilação
reversível entre ATP e creatina a ADP e fosfocreatina, auxiliando a manter os
níveis
dos
substratos
fosforilados.
Durante
a
excitação
nervosa
e
neuromuscular, sabe-se que ocorre um aumento de dez vezes no turnover
celular de ATP, e que durante essas mudanças rápidas, o sistema
creatina/fosfocreatina é necessário atuar tanto como um tampão de ATP nas
células quanto como um sistema de transporte entre os locais de produção e
consumo de ATP pelas ATPases para evitar grandes oscilações nos níveis de
ATP/ADP celulares nesses tecidos excitáveis (BESSMAN e CARPENTER,
1985; SCHNYDER et al., 1991; WALLIMANN et al., 1992;VOET, VOET e
PRATT,2002). As isoformas da creatina quinase estão localizadas em sítios de
demanda e produção energética. Por ter à sua localização próxima a sítios
onde ocorre a geração de energia e transporte de íons através de membranas,
o sistema CK/fosfocreatina exerce um papel fundamental na homeostase
energética neuromuscular. As células musculares e nervosas, que possuem
uma alta reciclagem de ATP, dependem das fosfoguanidinas, um grupo de
fosfato que regeneram ATP rapidamente e pode ser dividida em um grupo de
fosfocreatina, de alto potencial de energia, e em fosfoarginina com potencial
baixo de energia para a formação de ATP. Nos vertebrados a fosfocreatina é
sintetizada pela fosforilação reversível da creatina e ATP, pela reação
catalisada pela creatina quinase (VOET, VOET e PRATT, 2002).
Assim, é presumível que alterações na função da creatina quinase levem
ao desenvolvimento de vários estados patológicos envolvendo o cérebro,
31
músculo esquelético e músculo cardíaco (HAMMAN et al., 1995; DAVID et al.,
1998, AKSENOV et al., 1999; AKSENOV et al., 2000).
32
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Caracterização da pesquisa
No que diz respeito ao problema o estudo é quantitativo, sobre os
objetivos, a pesquisa se mostra descritiva e exploratória e em relação aos
procedimentos é experimental e ex-post-facto.
3.2 Local e Caracterização da amostra
Foram utilizados camundongos mdx machos procedentes do biotério da
Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC). Os animais foram
mantidos em ambiente climatizado (22º C) com ciclo claro-escuro de 12 horas
e livre acesso a água e alimentação padrão. Com base em estudos prévios
para uma diferença de até 20% nos parâmetros a serem analisados entre os
grupos, com uma variância de no máximo 10% entre as médias calculou-se um
tamanho de amostra de 10 ratos por grupo, para um erro alfa de 0,05 e um
poder de 80%. O experimento foi executado no Laboratório de Fisiopatologia
Experimental - FISIOPAT.
3.3 Instrumentos para coleta de dados
Através de técnicas espectrofotométricas, as atividades das enzimas
creatina quinase e complexos respiratórios foram medidas. O laboratório de
Fisiopatologia Experimental – FISIOPAT, sob a coordenação do Prof. Dr.
Emílio Streck, aprovou o seguinte estudo, que foi enviado e analisado pelo
comitê de ética da UNESC e conta com os recursos necessários para o estudo
tais como: reagentes específicos para o experimento, tampões, micropipetas,
eppendorfs, balança analítica, homogeneizador entre outros equipamentos que
foram utilizados para a pesquisa.
33
3.4 Procedimentos para coleta de dados
Após a aprovação do estudo pelo CEP, se deu início a coleta de dados
que foi realizado pela pesquisadora, também bolsista no laboratório de
Fisiopatologia Experimental. O estudo foi iniciado pelo aprendizado da
pesquisadora sobre o metabolismo energético normal e as possíveis alterações
da bioenergética nos camundongos com Duchenne; a partir disto os protocolos
necessários para a pesquisa, estes baseados na continuação de um estudo
prévio utilizando o modelo animal mdx, onde a autora deste estudo aplicou nos
camundongos testes comportamentais para verificar a existência de alterações
da cognição comparada ao grupo controle; logo após a aplicação desses testes
os camundongos foram mortos por decaptação para análise.
No presente trabalho, a primeira etapa consistiu em pegar as amostras
de cérebros dos camundongos mortos e fazer a - Preparação de tecido e
homogeneizado - O cérebro foi rapidamente removido e o córtex pré-frontal,
estriado, hipocampo, córtex e cerebelo, separados. As estruturas cerebrais
serão homogeneizadas (1:10 w/v) em tampão SETH, pH 7,4 (250 mM
sacarose, 2 mM EDTA, 10 mM Trizma base, 50 IU/mL heparina). O
homogeneizado foi centrifugado a 800 X g por 10 min e o sobrenadante foi
armazenado a -70°C. As proteínas foram determinadas pelo método de Lowry
et al (1951), e albumina sérica bovina foi utilizada como padrão.
Na seqüência, a estrutura cerebral foi homogeneizada (atividade da
creatina quinase) em solução salina (1:10, p/v), o homogeneizado foi
centrifugado a 800 x g por 10 minutos e o sobrenadante utilizado para
determinação da atividade da creatina quinase total. As frações mitocondriais
foram separadas por centrifugação e dosadas da mesma forma. O meio de
incubação é composto por fosfocreatina, ADP e glutationa reduzida. A
formação de creatina foi utilizada para medir a atividade enzimática (Hughes,
1962). Após as técnicas citadas anteriormente iniciou-se a verificação da Atividade do complexo I - onde mostra a atividade da NADH desidrogenase
foi avaliada pelo método descrito por Cassina e Radi (1996) pela taxa de
NADH-dependente da redução do ferricianeto a 420 nm, seguindo da Atividade do complexo II + Succinato Desidrogenase - nos quais mostrou
as atividades enzimáticas foram medidas pelo método descrito por Fischer et al
34
(1985), onde a diminuição da absorbância do 2,6-DCIP em 600 nm é usada
para o cálculo da atividade do complexo II. Para o cálculo da SDH foi utilizado
o mesmo sistema na presença de metassulfato de fenazina. Na seqüência,
analisou-se - Atividade do complexo II-III - No qual a atividade do citocromo c
oxiredutase (complexo II–III) foi determinado de acordo com Fischer et al
(1985), onde foi medido pela redução do citocromo c para succinato.
Finalizando com a preparação da amostra, a mesma utilizada para citrato
sintase. (A atividade do complexo IV) foi determinada de acordo com Rustin e
colaboradores (1994), e é calculada pela diminuição da absorbância causada
pela oxidação do citocromo c reduzido, medido em 550 nm.
3.5 Procedimentos para análise
Após a coleta e tabulação dos dados, os mesmos foram analisados e
discutidos através de análise de variância de uma via seguida pelo teste de
Duncan, quando o F for significativo, ou pelo teste t de Student, utilizando o
programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences).
35
4 APRESENTAÇÃO E ANÁLISE DOS DADOS
A Figura 1 apresentou atividade da cadeia respiratória mitocondrial no
cérebro de camundongos mdx. No Complexo I (1A) a atividade do hipocampo
está diminuída (P=0,007), pré-frontal (P=0,004), córtex (P=0,010) estriado
(P=0,008) e cerebelo (P=0,007). A atividade do Complexo II (1B) não foi
alterada nas estruturas cerebrais. Já no Complexo III (1C) houve um aumento
da atividade somente no córtex (P=0,014). Complexo IV (1D) teve uma
diminuição na atividade do pré-frontal (P=0,026) e estriado (P=0,038). Todos os
resultados foram comparados com o grupo controle.
36
Com relação à figura 1 sabe-se que houve uma diminuição na atividade
de todas as estruturas do complexo I. A proteína distrofina está localizada na
membrana interna celular nas células musculares e cerebrais. No músculo
esquelético dos camundongos mdx, estudos indicam disfunção na mitocôndria
e
alteração
na
composição
da
proteína
mitocôndrial.
Estes
autores
demonstraram uma diminuição de 50% na atividade de todas as enzimas
ligadas à cadeia respiratória do músculo quadríceps de camundongos mdx
adultos quando comparados com grupo controle. Nas fibras dos músculos
esqueléticos de camundongos mdx, a taxa máxima de respiração mitocôndrial
foi cerca de duas vezes menor do que o controle. Essas alterações também
foram encontradas em mitocôndrias isoladas demonstrando somente 60% de
hemoproteínas na membrana interna mitocôndrial (KUZNETSOV et al., 1998).
Achados similares foram observados na biópsia de músculo esquelético
em pacientes com distrofia muscular de Duchenne (SCHOLET et al., 1985).
Dados demonstrados por Kuznetsov e colaboradores sugerem que uma
diminuição específica na quantidade de todas as enzimas na membrana interna
da mitocôndria, provavelmente como resultado de sobrecarga de Ca+ nas
fibras
musculares,
respondendo
ao
déficit
bioenergético
no
músculo
esquelético deficiente de distrofina.
Outros estudos também demonstraram que na mitocôndria isolada do
músculo quadríceps de camundongos mdx ocorre uma elevação do conteúdo
de cálcio e diminuição da taxa de controle respiratório com NAD associado aos
substratos piruvato/malato (GLESBY et al., 1988) e disfunção mitocôndrial no
soro de ratos mdx.
No cérebro de ratos, a proteína distrofina esta presente em todas as
regiões (LIDEOV et al., 1990). No entanto, existem vários caminhos que podem
afetar o cérebro.
Primeiro, a distrofina é expressa no desenvolvimento cerebral (SOGOS
et al., 1992), e mutações que afetam o complexo distrofina pode afetar a
migração neuronal e diferenciação (MEHLER et al.,1992). Segundo, a falta de
distrofina afeta a exitabilidade neuronal. A distrofina é encontrada nos aparatos
pós-sinapticos, servindo de receptor ancora, incluindo o receptor GABAA.
(HAENGGI e FRITSCHY, 2006). A falta de distrofina também afeta em longo
prazo a plasticidade sinaptica (CULLIGAN e OHLENDIECK, 2002). Terceiro, a
37
perda de distrofina pode levar à morte neuronal (JAGADHA e BECKER, 1988),
deixando os neurônios mais suscetíveis a insultos metabólicos e fisiológicos
(CULLIGAN e OHLENDIECK, 2002).
Devido à ausência de estudos e uma melhor compreensão desses
mecanismos avaliamos a atividade da cadeia respiratória mitocondrial e da
creatina quinase. Uma série de doenças neurológicas está associada à morte
neuronal e neurodegeneração, culminando no comprometimento cognitivo
(MANCUSO et al., 2007) causados principalmente pela diminuição da energia
cerebral e disfunção mitocôndrial. Demonstramos, neste estudo, uma disfunção
no cérebro de camundongos mdx. No hipocampo, uma estrutura importante
para o aprendizado e memória, houve diminuição da atividade do Complexo I.
Outras estruturas que contém proteína distrofina também apresentaram uma
diminuição da atividade no complexo I. No estriado, complexo I e IV estava
alterado.
Recentemente, foi demonstrado no estriado que os níveis protéicos de
BDNF estavam reduzidos (TUON et al.; 2009).
A disfunção na função mitocôndrial poderia diminuir a produção de ATP.
Foi comprovado um aumento da atividade de creatina quinase no hipocampo,
córtex, estriado e pré-frontal no cérebro dos camundongos mdx.
A Figura 2 demonstrou a atividade da creatina quinase no cérebro de
camundongos mdx. Houve um aumento na atividade de CK no hipocampo (t=7,266; dp=8; p=0,0001), pré-frontal (t=-8,608; dp=8; p=0,0001), córtex (t=4,983; dp=8; p =0,0001) e estriado (t=-4,983; dp=8; p=0,001), comparado com
o grupocontrole.
38
Neste contexto, o aumento da capacidade de regeneração de ATP via
reação da creatina quinase pode ser relacionado a um retardo na depleção de
ATP, e assim, proteger o cérebro contra danos. A creatina quinase
desempenha um papel central no metabolismo de tecidos que consomem
bastante energia, tais como o cérebro, ele catalisa a transferência reversível de
fosforil para grupo de fosfocreatina a ADP, regenerando ATP (LIPTON e
WHITTINGHAM,1982). A diminuição na atividade de creatina quinase está
associada a uma via de neurodegeneração que resulta em perda neuronal
(GREEN e FRY,1980; BRUSTOVETSKY, BRUSTOVETSKY e DUBINSKY,
2001). No camundongo mdx, a creatina quinase no soro é elevada em 5, 10 e
23 semanas de idade (GLESBY et al., 1988).
.
Outro estudo mostrou que no músculo esquelético a ausência de
distrofina está associada à redistribuição de energia intracelular e um feedback
nos sistemas de transferência de sinais entre mitocôndrias e ATPases. Como o
mecanismo mediado por creatina quinase foi ineficiente, o papel de difusão da
adenina nucleotídeos aumenta, devido à uma maior permeabilidade da
membrana externa mitocondrial para ADP e aumenta a compartimentalização
do fluxo de ADP.
39
5 CONCLUSÃO
Fica evidente, em nossos resultados, uma disfunção na atividade da
cadeia respiratória mitocôndrial e o aumento da atividade da creatina quinase
no cérebro de camundongos mdx. Este aumento na atividade da creatina
quinase pode estar causando um efeito protetor contra o dano celular.
Futuros estudos podem ser realizados para elucidar o envolvimento dos
mecanismos neurobiológicos envolvidos na alteração cognitiva no cérebro de
camundongos mdx.
40
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46
ANEXOS
47
ANEXO A – Protocolo de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa
(CEP) – UNESC
48
ANEXO B – Artigo publicado pela autora e colaboradores Mitochondrial respiratory chain and creatine kinase activities in mdx
mouse brain.
49
MITOCHONDRIAL RESPIRATORY CHAIN AND CREATINE
KINASE ACTIVITIES IN THE BRAIN mdx MOUSE
Lisiane Tuona; Clarissa M. Comima; Daine B. Fragab; Giselli Scaini
b
;Gislaine T. Rezin b; Bruna R. Baptista b; Emilio L. Streck b; Mariz
Vainzoinf c; João Quevedo a
a
Laboratório de Neurociências, Programa de Pós-Graduação Ciências da
Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000 Criciúma,
SC, Brazil;
b
Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-Graduação
em Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806000 Criciúma, SC, Brazil.
c
Human Genome Research Center, Biosciences Institute, University
of São Paulo, São Paulo, Brazil.
*Corresponding author:
Prof. Emílio Streck, MD, Ph
Laboratório de Fisiopatologia
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde,
Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde,
Universidade do Extremo Sul Catarinense,
88806-000 Criciúma, SC, Brazil
Fax: +55 48 3443 4817.
50
ABSTRACT
Objective: To evaluate mitochondrial respiratory chain and creatine kinase
activities in the brain mdx mouse.
Design: Prospective, controlled experiment.
Setting: Animal basic science laboratory.
Subjects: mdx mouse (03 month week old) and normal C57BL10 (wild-type)
Interventions: male dystrophic (mdx) and normal C57BL10, were killed by
decapitation, and brain structures (cerebellum, hippocampus, striatum and
cortex) were isolated. Mitochondrial respiratory chain and creatine kinase
activity were then measured.
Measurements and Main Results: There was observed that mdx mouse
presented decreased mitochondrial respiratory chain activity in complex I, but
not in complex II, increase in cortex complex III and decreased in striatum
complex IV. Activity of succinate dehydrogenase was increase in cortex and
striatum. Creatine kinase activity increased prefrontal, hippocampus, cortex and
striatum.
Conclusion: Our results showed that a fist relationship between mitochondrial
respiratory chain and creatine kinase activities in brain and mdx mice.
Key Words: mouse mdx; mitochondrial respiratory chain; creatine kinase;
brain.
51
INTRODUCTION
The mdx mouse with essential dystrophin deficiency is an
established animal model de Duchenne’s muscular de dystrophy in humans. It
well documented that dytrophin localizes at the sarcolemma creating a tight
association with a glycoprotein complex of the plasma membrane. The protein
is located at the inner-cell membrane in muscles and brain cells, in association
with a membrane-bound cytoskeletal protein an complex known as the
dystrophin-associated proteins. The selective loss of dystrophin is of
significance in pathophysiology of muscular dystrophy. The current hypotheses
attribute the necrosis of the dystrophin-deficient muscle fibrers to mechanical
weakening of the outer membrane, to an excessive influx of de Ca2++ ions, or
to a combination of these two mechanisms.
Mitochondrial permeability
transition pore by the Ca2++ overload or the release of cytochrome c from de
defective mitochondria.
The Brain dystrophin is enriched in the postsynaptic densities of
pyramidal neurons specialized regions of the subsynaptic cytoskeletal network
that are critical for synaptic transmission and plasticity [2].
The lack of dystrophin in brain structures have been involved in
cognitive functions, such as the hippocampus and neocortex [3]. However, the
nature, magnitude and biological support of the cognitive deficits involving the
dystrophin still remain unclear, though they have been partly addressed by
studies in the dystrophin-deficient mouse, a genetic model of DMD commonly
named the mdx mouse [3,4].
52
The brain dystrophin is abundant in the hippocampus and absent in
other subcortical areas [2], selective behavioural deficits involving hippocampal
function were predicted to occur in the mdx mice mutant. Pioneer studies
showed that dystrophin deficiency in mdx mice is associated with impaired
memory retention at long delays in certain procedural learning tasks and spatial
alternation tasks [5-6]. At the cellular level, the absence of dystrophin in mdx
mice causes altered calcium homeostasis and hippocampal neuronal function
[8], particularly specific alterations of hippocampal long-term potentiation a form
of plasticity widely believed to be critical for memory formation [4].
In accordance with this concept, substantial alterations of energy
metabolism in skeletal muscle of mdx mice and patients with Duchenne’s
muscular dystrophy not study on mitochondrial respiratory chain and creatine
kinase activities. In this context, the present study investigated whether
dystrophin deficiency modifies mitochondrial respiratory and creatine kinase
activities activity in mdx mice in brain.
53
MATERIALS AND METHODS
Animals
MATERIALS AND METHODS
Animals
We used male dystrophic (mdx) and normal C57BL10 mice (3 months:
wild-type n=5, mdx n=5) ceded by Human Genome Research Center,
Biosciences Institute, University of São Paulo. The animals were housed 5 to
a cage with food and water available ad libitum and were maintained on a 12h light/ dark cycle (lights on at 7:00 am). All experimental procedures
involving animals were performed in accordance with the NIH Guide for the
Care and Use of Laboratory Animals and the Brazilian Society for
Neuroscience and Behavior (SBNeC) recommendations for animal care.
Mitochondrial respiratory chain enzymes activities
Brain structures were homogenized (1:10, w/v) in SETH buffer (250 mM
sucrose, 2 mM EDTA, 10 mM Trizma base, 50 IU/ml heparin, pH 7.4). The
homogenates were centrifuged at 800 x g for 10 min and the supernatants were
used for determination of mitochondrial respiratory chain enzyme activities
(complexes I, II, II–III and IV). NADH dehydrogenase (complex I) was evaluated
according to the method described by Cassina and Radi (1996) by the rate of
NADH-dependent ferricyanide reduction at 420 nm (07). The activities of
succinate: DCIP oxidoreductase (complex II) and succinate: cytochrome c
oxidoreductase (complex II–III) were determined according to the method of
Fischer et al. (1985) (08). Complex II activity was measured by following the
54
decrease in absorbance due to the reduction of 2,6-DCIP) at 600 nm. Complex
II-III activity was measured by cytochrome c reduction from succinate. The
activity of cytochrome c oxidase (complex IV) was assayed by following the
decrease in absorbance due to the oxidation of previously reduced cytochrome
c at 550 nm (09). The activities of the mitochondrial respiratory chain complexes
were expressed as nmol/min mg protein (09).
Creatine kinase activity
Creatine kinase activity was measured in brain homogenates pre-treated
with 0.625 mM lauryl maltoside. The reaction mixture consisted of 60 mM Tris–
HCl, pH 7.5, containing 7 mM phosphocreatine, 9 mM MgSO4 and
approximately 0.4–1.2 g protein in a final volume of 100 L. After 15 min of preincubation at 37 oC, the reaction was started by the addition of 0.3
plus 0.08
mol of ADP
mol of reduced glutathione. The reaction was stopped after 10 min
by the addition of 1
mol of p-hydroxymercuribenzoic acid. The creatine formed
was estimated according to the colorimetric method of Hughes (1962) (10). The
color was developed by the addition of 100 mL 2% -naphtol and 100 mL 0.05%
diacetyl in a final volume of 1 mL and read spectrophotometrically after 20 min
at 540 nm. Results were expressed as units/min x mg protein.
The group mdx and wild type with five mouse were killed by decapitation, and
brain structures (cerebellum, hippocampus, striatum and cortex) were
immediately isolated and stored at -80ºC for posterior analyses. Sham
animals (n=5) were killed at the same time after operation.
55
Statistical Analysis
Data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA) followed
by the Tukey test when F was significant and are expressed as mean ±
standard deviation. All analyses were performed using the Statistical Package
for the Social Science (version 12.0) software.
RESULTS
As demonstrated in Fig. 1 complex I activity decreased in all analyzed
structures. In complex II (Figure 2) activities were not altered in all analyzed
structures, III (Figure 3) activity increased in cortex, IV (Figure 4) activity
increased in prefrontal and estriatum. Figure 5 demonstrated that succinate
dehydrogenase activity increased cortex e striatum. We demonstrated in
figure 6 that creatine kinase activity increased in hippocampus, prefrontal,
cortex and striatum.
DISCUSSION
The present study demonstrated that (1figura) complex I and
complex IV activity decreased dystrophy mdx mice in several rat brain
structures (2 figura) creatine kinase, complex III and succinato activity
increased in several rat brain structures in mice mdx.
Researchs indicate that a substantial change in mitochondrial protein
composition, most probably as result of the Ca++ overload of muscle fibers, is
the reason for the bioenergetic deficts in adult mdx skeletal muscle and may of
pathophysiological significance for the development of muscle fiber necrosis in
diseases
associated.
In
this
context,
mitochondrial
dysfunction
was
demonstrated in musculus quadriceps of de mdx mice adult but, to the best of
our knowledge, never in the brain. Brain energy impairment has been linked to
neuronal death and neurodegeneration (11,12). Castaldo et al. demonstrated in
56
neurons, as in other excitable cells, mitochondria extrude Ca(2+) ions from their
matrix in exchange with cytosolic Na(+) ions. This exchange is mediated by a
specific transporter located in the inner mitochondrial membrane, the
mitochondrial Na(+)/Ca(2+) exchanger (NCX(mito)). The stoichiometry of
NCX(mito)-operated Na(+)/Ca(2+) exchange has been the subject of a long
controversy, but evidence of an electrogenic 3 Na(+)/1 Ca(2+) exchange is
increasing. Although the molecular identity of NCX (mito) is still undetermined,
data obtained in our laboratory suggest that besides the long-sought and as yet
unfound mitochondrial-specific NCX, the three isoforms of plasmamembrane
NCX can contribute to NCX(mito) in neurons and astrocytes. NCX(mito) has a
role in controlling neuronal Ca(2+) homeostasis and neuronal bioenergetics.
(13)
The inhibition in mitochondrial function could decrease ATP
production. We demonstrated an increase in creatine kinase activity in the,
hippocampus, cortex, striatum and prefrontal. The increase ATP-regenerating
capacity via the creatine kinase reaction might be related to a delay in ATP
depletion and, thereby, to protect the brain from damage (Lipton &
Whittingham). Creatine kinase plays a central role in the metabolism of highenergy consuming tissues such as brain. It catalyzes the reversible transfer of
the phosphoryl group from phosphocreatine to ADP, regenerating ATP. Our
analysis, shown that a decrease in creatine kinase activity is associated with a
neurodegenerative pathway that results in neuronal loss (13,14). We suppose
that the observed increase in creatine kinase activity could be a response to
dystrophy brain dysfunction
57
Our results showed that a fist relationship between mitochondrial
respiratory chain and creatine kinase activities in brain and mdx mice. further
studies are required for elucidate the neurobiology mechanisms involved on
dystrophy in brain.
58
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10 – Hughes BP: A method for the estimation of serum creatine kinase and its
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60
FIGURE LEGENDS
Figure 1 – Complex I activity in different brain regions mdx. Results are
expressed as mean ± S.D. (n=5). *significantly different from wild-type
(p<0.05).
Figure 2 – Complex II activity in different brain regions mdx. Results are
expressed as mean ± S.D. (n=5).
Figure 3 – Complex III activity in different brain regions.
Results are
expressed as mean ± S.D. (n=5). * significantly different from wild-type
(p<0.05).
Figure 4 - Complex IV activity in different brain regions. Results are
expressed as mean ± S.D. (n=5). * significantly different from wild-type
(p<0.05).
Figure 5 - Succinate dehydrogenase activity in different brain regions.
Results are expressed as mean ± S.D. (n=5). * significantly different from
sham-operated (p<0.05).
Figure 6 – Creatine kinase activity in different brain regions. Results are
expressed as mean ± S.D. (n=5). * significantly different from wild-type
(p<0.05).
61
FIGURES
1) Complex I
WT
250
mdx
Complex I
200
150
100
*
50
*
*
*
*
0
Hippocampus
Prefrontal
Cortex
Striatum
Cerebellum
2) Complex II
Wt
5
mdx
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Hippocampus
Prefrontal
Cortex
Striatum
Cerebellum
62
3) Complex III
Wt
3,5
*
mdx
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Hippocampus
Prefrontal
Cortex
Striatum
Cerebellum
4) Complex IV
Wt
450
mdx
400
350
300
250
200
150
*
100
*
50
0
Hippocampus
Prefrontal
Cortex
Striatum
Cerebellum
63
5)SuccinateDehydrogenase
Wt
18
mdx
16
*
14
*
12
10
8
6
4
2
0
Hippocampus
Prefrontal
Cortex
Striatum
Cerebellum
6) Creatine Kinase activity
Wt
9
mdx
*
8
7
6
*
*
*
5
4
3
2
1
0
Hippocampus
Prefrontal
Cortex
Striatum
Cerebellum