UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LABORATÓRIO DE EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO
CARBOXIPEPTIDASE
(DCP1)
INSERÇÃO/DELEÇÃO
DO GENE DIPEPTIL-
COM FATORES DE RISCO PARA DOENÇAS
CARDIOVASCULARES EM ESCOLARES.
Ouro Preto
Agosto- 2009
I
ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO
CARBOXIPEPTIDASE
(DCP1)
INSERÇÃO/DELEÇÃO
DO GENE DIPEPTIL-
COM FATORES DE RISCO PARA DOENÇAS
CARDIOVASCULARES EM ESCOLARES.
Dissertação de mestrado apresentada ao Núcleo de
Pesquisa em Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto, como requisito parcial para
obtenção do grau de mestre em Ciências Biológicas.
Mestranda: Cristiane Vilas Boas Neves
Orientadora: Renata Nascimento Freitas
Co-orientador: George Luiz Lins Machado Coelho
Ouro Preto
Agosto- 2009
II
III
IV
DEDICATÓRIA
À minha família e amigos pelo apoio incondicional
V
AGRADECIMENTOS
Ao CNPq e FAPEMIG pela concessão do financiamento para o projeto;
À CAPES pela concessão da bolsa de mestrado;
À Prof. Renata Nascimento Freitas, pela oportunidade, pela capacidade em transmitir
seus conhecimentos, pela confiança no meu trabalho, pela paciência e pela amizade;
Ao Prof. George Luiz Lins Machado Coelho pela acolhida no LEPI, pela
disponibilidade e pelo incentivo;
À Profa. Ana Paula Carlos Cândido, pelo auxílio incondicional, pelos conselhos, força,
incentivo e carinho durante a execução deste trabalho. Agradeço pela amizade;
À Profa Riva Oliveira de Paula pela atenção e apoio;
Aos amigos do laboratório de Epidemiologia Molecular da Escola de Nutrição pela
amizade, pelo espírito de equipe na execução do trabalho experimental, cada um
auxiliando de formas diferentes mas todos com o empenho em executá-lo da melhor
forma possível: Denise, Erica, Bruno, Alínia , Aninha, Fernando, Mariane;
À bolsista de Iniciação Científica Denise Xavier Amora pela valiosa contribuição para
esse projeto, pela amizade e companheirismo;
À mestranda Alínia Bastos, pela disposição e companheirismo;
Ao Wander Furtado, pela contribuição nos momentos iniciais deste projeto e pelas
conversas e incentivo;
Aos bolsistas de iniciação cientifica Aninha, Fernando e Mariane por sempre
disponibilizarem tempo para auxiliar na execução dos experimentos, obrigada por fazer
parte dessa equipe;
VI
À doutoranda Erica, agradeço pelos conselhos, incentivos, pelos ensinamentos e pela
paciência;
Ao doutorando Bruno pela convivência;
Aos ex- alunos do LEM: Dani, Ângelo, Geórgia, Yara, Carol, Dárlen, Wander. Tivemos
bons momentos no LEM, saudades;
Aos Professores Marcelo Eustáquio Silva e Aureliano Claret da Cunha dos laboratórios
de Nutrição Experimental e de Bromatologia da Escola de Nutrição, pelo apoio, e
especialmente aos técnicos Jair e Rosângela pela disponibilidade;
Ao Prof. José Geraldo Sabioni e ao técnico Caetano do Laboratório de Microbiologia
dos Alimentos da Escola de Nutrição, pelo apoio;
Ao auxiliar de laboratório Luiz Carlos pela autenticidade e prontidão em resolver nossas
limitações físicas e de equipamentos;
Aos professores do NUPEB pelos ensinamentos transmitidos;
Ao Prof. Ieso de Miranda Castro por disponibilizar material, sempre que solicitado;
Aos amigos do mestrado: Helen, Roenick pela convivência, amizade e cumplicidade;
Aos técnicos Chicão, Bruno e Leandro que cederam equipamentos e laboratório para a
realização da destilação do fenol;
A todos os funcionários da Escola de Nutrição, especialmente “Zezinho” por tornar
mais segura nossas empreitadas noturnas; à Elenice e Eliete companheiras e grande
incentivadoras; ao Sérgio e a Lulu pelo apoio administrativo;
À Cida, secretária do NUPEB, pela dedicação aos alunos e ajuda permanente;
Aos amigos de LEPI, pela convivência;
VII
Enfim, agradeço a todos que de alguma forma tornou possível a execução deste
trabalho.
VIII
RESUMO
Foi realizado estudo epidemiológico transversal descritivo das associações entre fatores
de risco para DCV (antropométricos, bioquímicos e clínicos) e o polimorfismo de
inserção e deleção (In/Del) do gene da enzima conversora de angiotensina (DCP1) em
escolares do ensino fundamental. O polimorfismo In/Del DCP1 foi determinado a partir
do DNA obtido de 773 amostras de sangue pela amplificação por reação em cadeia da
polimerase (PCR). As crianças foram agrupadas conforme o genótipo apresentado (DD,
homozigotas para deleção; ID, heterozigotas e II, homozigotas para inserção)
e
variáveis contínuas (peso, altura, IMC, CC, %GC, glicose, colesterol total, HDL-c,
LDL-c, triglicerídeos e pressão arterial) foram comparadas entre os grupos de genótipos
considerando a amostra total e após estratificar por sexo e por maturação sexual.
Observou-se que os níveis glicêmicos para as crianças DD (83,57 mg/dl) eram
estatisticamente maiores que das crianças II (81,81 m g/dl) resultado similar foi
encontrado ao avaliar os meninos no estádio pós-púbere. Os meninos DD também
apresentaram percentual de gordura corporal estatisticamente maior que os meninos ID.
Adicionalmente os meninos DD apresentaram níveis da pressão arterial diastólica
(60,50 mmHg) menores do que meninos ID (61,56 mmHg) seguidos dos meninos II
(63,21 mmHg), comportamento similar encontrado para todas as crianças no estádio
puberal. Ao avaliar os meninos estratificados por estádio de maturação sexual, foram
observadas associações apenas no estádio pré-pubere e pós-púbere. No estádio prépúbere, além de manter o comportamento para o percentual de gordura corporal
mencionado, os meninos DD apresentaram níveis de TG (78,73 mg/dl) e IMC (17,49
Kg/m2) maiores do que meninos ID (16,31 mg/dl; 16,31 Kg/m2); e no estádio póspuberal, o comportamento da pressão arterial alterou, os meninos DD (113,8 mmHg)
apresentaram níveis da pressão sistólica maiores do que os meninos ID (107,1 mmHg).
Para as meninas foram encontradas associações entre as variáveis avaliadas e o
polimorfismo apenas após a estratificação por estádio de maturação sexual. Observou-se
que na fase pós-puberal as meninas DD apresentavam fenótipo associado ao menor
risco para DCV que meninas ID ou II. Nossos resultados indicam uma interação entre o
polimorfismo In/Del do gene DCP1 e fatores hormonais na determinação de fenótipos
associados ao risco de DCV em crianças e adolescentes.
IX
ABSTRACT
A descriptive cross-sectional study was accomplished on the associations between risk
factors for CVD (anthropometric, biochemical and clinical) and the insertion/deletion
polymorphism (In/Del) of the gene of the angiotensin-converting enzyme (DCP1dipeptidylcarboxipeptidase 1) in schoolchildren. The In/Del DCP1 polymorphism was
determined from DNA obtained of 773 participants by the amplification for polimerase
chain reaction (PCR). The children were grouped according to the genotype (DD,
homozygous for deletion; ID, heterozygous and II, homozygous for insertion) and
continuous variables (weigh, height, BMI, waist circumference, % body fat, glycemia,
total cholesterol, HDL-c, LDL-c, triglycerides and blood pressure) were compared
among the genotypes groups considering the total sample and after stratifying for sex
and for sexual maturation. It was observed that the glycemia levels were statistically
higher in children DD (83,57 mg/dl) than in children II (81,81 m g/dl); similar result
was observed when evaluating boys in the post-puberty stage. The boys DD also
presented % body fat statistically higher than boys ID. Additionally, boys DD presented
lower levels of the diastolic blood pressure (60,50 mmHg) than boys ID (61,56 mmHg)
followed by boys II (63,21 mmHg); similar behavior was found for all children in the
pubertal stage. When boys stratified by stadium of sexual maturation were evaluated,
associations were observed only at the pre-pubertal and pubertal stages. In the prepubertal stage, besides maintaining the behavior for the % body fat, boys DD presented
higher TG (78,73 mg/dl) and BMI (17,49 Kg/m2) than boys ID (16,31 mg/dl and 16,31
Kg/m2, respectively); and in the pubertal stage, the behavior of the blood pressure
altered, with boys DD presenting higher systolic blood pressure (113,8 mmHg) than
boys ID (107,1 mmHg). For the girls, associations between risk factors and the
polymorphism were found only after categorizing for sexual maturation stage. It was
observed that in the pubertal phase, girls DD presented phenotype associated to lower
risk for cardiovascular disease than girls ID or II. Our results indicate an interaction
between the In/Del polymorphism of the DCP1 gene and hormonal factors in the
determination of phenotypes associated to the risk of cardiovascular disease in children
and adolescents.
X
LISTA DE FIGURAS E QUADRO
Página
Figura 1 Esquema ilustrativo de todos os órgãos e seus produtos
19
responsáveis pela formação da angiotensina II.
Quadro 4.1 Seqüência das soluções utilizadas para corar os géis de
42
poliacrilamida seguindo-se uma adaptação do método descrito por
Saguinetti et al (1994).
Figura 2 Representação dos possíveis genótipos para o polimorfismo In/Del
do gene da enzima conversora de angiotensina (DCP1).
XI
48
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 5.1 Frequência alélica e genotípica do polimorfismo In/Del do gene
47
DCP1 em escolares do município de Ouro Preto, Minas Gerais.
Tabela 5.2 Média e desvio-padrão dos fatores de risco selecionados para
51
DCV em escolares de acordo com o polimorfismo In/Del do gene DCP1.
Tabela 5.3 Média e desvio padrão dos fatores de risco selecionados para
53
DCV em escolares separados por sexo de acordo com o polimorfismo
In/Del do gene DCP1.
Tabela 5.4 Frequência do genótipo da DCP1 de acordo com os estádios de
56
maturação sexual dos escolares de 6-14 anos do município de Ouro Preto.
Tabela 5.5 Média e desvio-padrão dos fatores de risco selecionados para
57
DCV em escolares pré-puberes de acordo com o polimorfismo In/Del do
gene DCP1.
Tabela 5.6 Média e desvio-padrão dos fatores de risco selecionados para
59/60
DCV em escolares pré-puberes separados por sexo de acordo com o
polimorfismo In/Del do gene DCP1.
Tabela 5.7 Média e desvio-padrão dos fatores de risco selecionados para
63/64
DCV em escolares púberes de acordo com o polimorfismo In/Del do gene
DCP1.
Tabela 5.8 Fatores de risco selecionados para DCV em escolares púberes
65/66
separados por sexo de acordo com o polimorfismo In/Del do gene DCP1.
Tabela 5.9 Média e desvio-padrão dos fatores de risco selecionados para
DCV em escolares púberes separados por sexo de acordo com o
XII
67/68
polimorfismo In/Del do gene DCP1.
Tabela 5.10 Média e desvio-padrão dos fatores de risco selecionados para
DCV em escolares pós-puberes separados por sexo de acordo com o
polimorfismo In/Del do gene DCP1.
XIII
69/70
LISTA DE ABREVIATURAS
DCV- Doenças cardiovasculares
IMC- índice de massa corporal
LDL-c- low density lipoprotein
HDL-c High density lipoprotein
CC- circunferência da cintura
PAS- pressão arterial sistólica
PAD- pressão arterial distólica
GG% T- Gordura corporal obtido pela Tanita
GG% Nhanes III- gordura corporal obtido pelo método Nhanes III
WHO- World Health Organization
IBGE- Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
Dcp1-dipeptidil-cardboxipeptidase
In/Del DCP1- polimorfismo inserção/deleção do gene da dipeptilcarboxipeptidase
XIV
LISTA DE ANEXOS
Página
ANEXO 1 Questionário e termo de consentimento livre e esclarecido
111
ANEXO 2 Desenvolvimento Puberal Masculino e Feminino
142/143
ANEXO 3 Parecer do Comitê de Ética Projeto n° 054/2007
144
ANEXO 4 Parecer do Comitê de Ética n° 020/2005
145
XV
SUMÁRIO
Página
Resumo
IX
Abstract
X
Lista de Figuras e Quadros
XI
Lista de Tabelas
XII
Lista de Abreviaturas
XIV
Lista de Anexos
XV
1 Introdução
01
2 Revisão Bibliográfica
04
2.1 Dislipidemia
04
2.1.1 Dislipidemia e hábitos alimentares
04
2.1.2 Dislipidemia associada ao sexo e idade
05
2.1.3 Dislipidemia e obesidade
05
2.1.4 Dislipidemia e fatores genéticos
05
2.2 Diabetes Mellitus e hiperglicemia
06
2.2.1 Diabetes Mellitus
06
2.2.2 Hiperglicemia e hiperinsulinemia
08
2.3 Sobrepeso e Obesidade
09
2.4 Tabagismo, Sedentarismo, Hábitos alimentares
11
2.4.1 Tabagismo
11
2.4.2 Sedentarismo
12
2.4.3 Hábitos alimentares
13
2.5 Idade e gênero
13
2.6 Hipertensão Arterial
13
2.6.1 Prevalência da Hipertensão Arterial no Brasil
14
2.6.2 Estudos realizados com crianças
14
2.6.3 Hipertensão, idade e gênero
15
2.6.4 Hipertensão e fatores ambientais (obesidade, atividade física)
15
XVI
2.6.5 Fator ambiental: ingestão de sódio
16
2.6.6 Hipertensão e fatores genéticos
18
2.6.7 Hipertensão e Sistema Renina Angiotensina
19
2.6.7.1 Sistema Renina Renina Angiotensina
19
2.7 Polimorfismo Inserção/Deleção DCP_1 e DCV
22
3 Objetivos
32
3.1 Objetivo Geral
32
3.2 Objetivos Específicos
33
4 Material e Métodos
34
4.1 Área de Estudo
34
4.2 População e Amostra do Estudo
34
4.3 Delineamento do Estudo
35
4.4 Consentimento
36
4.5 Instrumentos de coleta de dados
36
4.5.1 Amostras biológicas e determinações bioquímicas
36
4.5.2 Aferição da pressão arterial
37
4.5.3 Variáveis antropométricas
37
4.5.3.1 Peso
37
4.5.3.2 Altura
37
4.5.3.3 Pregas Cutâneas
37
4.5.3.4 Porcentagem de gordura corporal
38
4.5.3.5 Maturação sexual
38
4.6 Extração de DNA
38
4.7 Avaliação e quantificação do DNA em espectofotômetro
39
4.8 Genotipagem do polimorfismo inserção/deleção do gene da enzima
conversora da angiotensina I (DCP1)
40
4.8.1 Reação em cadeia da polimerase para polimorfismo inserção/deleção do
gene da enzima conversora da angiotensina I (DCP1)
40
4.8.2 Reação em cadeia da polimerase para polimorfismo inserção/deleção do
gene da enzima conversora da angiotensina I (DCP1) para amostras
consideradas homozigotas para deleção
42
XVII
4.9 Processamento e Análise dos Dados
43
4.9.1 Bancos de Dados e Análises Estatísticas
43
4.10 Comitê de Ética
44
5 Resultados
45
6 Discussão
71
7 Conclusão
84
8 Perspectivas
85
9 Referências Bibliográficas
86
10 Anexos
111
XVIII
1 Introdução
As doenças cardiovasculares (DCV) constituem importante causa de morte nos países
desenvolvidos e também naqueles em desenvolvimento (LAURENTI, 2000), por isso, têm
sido foco de estudo e preocupação. Vários estudos epidemiológicos têm demonstrando
que fatores de risco cardiovascular são identificados ainda na infância e estes são
considerados precursores do risco para doenças cardiovasculares na fase adulta (LI et
al; 2003).
Estudos têm evidenciado que a aterosclerose é um importante mecanismo para a doença
coronariana, sendo uma importante causa de morte em todo mundo (mais de 16 milhões
de mortes por ano). O processo aterogênico pode iniciar-se durante a infância e
adolescência e permanecer como processo silencioso por muitos anos (STRUFALDI et al,
2008). Além disso, tem sido observado que eventos aterotrombóticos podem ocorrer
precocemente
(RABELO,
2001).
Estrias
gordurosas
precursoras
das
placas
ateroscleróticas podem aparecer na camada íntima da aorta aos três anos de idade e nas
coronárias durante a adolescência (FORD, 2004), e as placas fibrosas podem ser
observadas antes dos 20 anos de idade (RABELO, 2001).
Corroborando com o relato acima mencionado, estudos de autópsia após morte
inesperada em crianças e adultos jovens demonstraram que a presença e a gravidade de
lesões ateroscleróticas correlacionam- se positiva e significativamente com os fatores de
risco cardiovascular. O período de maior progressão das estrias gordurosas para placas
fibrosas ocorre a partir dos 15 anos de idade (TRACY, 1995). Com isso, a aterosclerose
passou, gradualmente, de um modelo de doença crônico-degenerativa não-transmissível
e exclusivamente de pacientes de idade avançada para um modelo de doença
inflamatória crônica subclínica, presente já na infância (VERRI, 1997).
A possibilidade de desenvolvimento da DCV aumenta na presença de múltiplos fatores
de risco resultantes de mudanças de hábitos de vida (CORONELLI, 2003) como
sedentarismo, tabagismo, hábitos alimentares e obesidade. Em adição a esses fatores, a
prevalência aumentada da doença crônica durante infância como hipertensão e diabete
mellitus têm sido importante para detectar os fatores indicadores de maior risco cujo
manejo pode prevenir a DCV na fase adulta (STRUFALDI et al, 2008).
-1-
Os fatores de risco cardiovascular como hipertensão, obesidade, dislipidemia, diabetes,
podem se manifestar como resultado da interação entre fatores genéticos e ambientais.
A doença cardiovascular é uma doença multifatorial com uma predisposição genética
clara associada a fatores de risco ambientais (SEKURI et al, 2005). Para identificar o
risco de desenvolver uma doença cardiovascular precocemente, estudos de associação
entre variantes do DNA e doenças tem sido extensivamente realizados com o intuito de
identificar regiões no genoma ou genes candidatos que contribuem para o
desenvolvimento de doenças, especialmente não-transmissíveis, como é o caso das
doenças cardiovasculares ( ZINTZARAS et al, 2008).
Portanto, o objetivo dos estudos de epidemiologia genética é identificar o perfil genético
do indivíduo com alto risco de desenvolver uma doença usando a análise de
polimorfismos ou variantes genéticas em diferentes loci do DNA. Na abordagem de
genes candidatos são selecionados polimorfismos presentes em genes envolvidos no
metabolismo dos lipídeos, na regulação dos níveis da pressão arterial, na coagulação e
adesão das células endoteliais que poderiam revelar o caminho molecular que leva ao
início e progressão da doença. Determinam-se então as freqüências alélicas e
genotípicas e defini-se sua contribuição relativa para variação dos fatores de risco para
doenças cardiovasculares (ALAVANTIC et al, 2006).
Em Ouro Preto, como para muitas cidades brasileiras, a doença cardiovascular é a
principal causa de mortalidade e representa segunda maior causa de hospitalização entre
os adultos de 20 anos ou mais (DATASUS, 2007). Em 2001 foi realizado estudo na área
urbana do município de Ouro Preto com a população a partir dos 15 anos de idade que
mostrou uma alta prevalência dos fatores de risco para doenças cardiovasculares como
sobrepeso (11%); obesidade (3,9%), hipertensão leve (17,4%) e dislipidemia (6,6%) na
população de 15 a 19 anos (FREITAS et al, 2007). Foram também observadas frequências
de 72% 20% e 8% para os alelos e3, e4 e e2, respectivamente do gene da
apolipoproteína E (APOE) e a associação do alelo 4 com maior risco para ocorrência de
dislipidemia (MENDES-LANA et al, 2007). Diante desses resultados, percebeu-se a
necessidade em analisar a associação de fatores de risco para DCV e variantes genéticas
na população jovem de Ouro Preto.
-2-
Nosso grupo iniciou então diferentes estudos que têm como objetivo analisar a
associação de polimorfismos genéticos em genes candidatos com fatores de risco para
doenças cardiovasculares em idades precoces. Assim, foi realizado estudo com
escolares de 6 a 14 anos de idade de Ouro Preto que revelou prevalência de préhipertensão, hipertensão leve do tipo 1, hipertensão leve do tipo 2, de 1,2%; 1,2% e
1,5%, respectivamente. A prevalência de sobrepeso nesta população foi de 8,7% e de
obesos foi de 6,2% e a prevalência de dislipidemia (colesterol elevado, 36,9% e LDL-c elevado, 5,8% e baixos níveis de HDL-c, 18,6%) foi notavelmente alta. Quase a metade
dos indivíduos apresentou uma combinação de dois ou três fatores de risco para doenças
cardiovasculares e, ainda 8,2% desses indivíduos tinham de quatro a seis fatores de
risco. Este número de fatores de risco aumentou significativamente com a idade
(CÂNDIDO et al, 2009). Esses achados apontam para a importância da realização de
estudos que investiguem a interação entre polimorfismos genéticos e fatores de risco
para DCV que possam contribuir na identificação de indivíduos que apresentam maior
risco e que devem ser considerados em programas de atenção preventiva reduzindo
assim o risco para doença cardiovascular futura.
Assim, no presente trabalho propusemo-nos a avaliar as associações entre fatores de
risco para DCV e o polimorfismo In/Del do gene da enzima conversora de angiotensina,
que pode, de acordo com alguns estudos, estar relacionado com alterações dos níveis
pressóricos e a um maior risco para DCV em adultos (ZHANG et al, 2006). Na secção a
seguir será feita uma breve revisão bibliográfica sobre os principais fatores de risco para
DCV e sua prevalência em crianças e adolescentes. Serão também revistos os estudos
que avaliaram o polimorfismo In/Del e o risco para DCV. A seguir serão apresentados
os objetivos do trabalho seguidos pela descrição dos materiais e métodos utilizados e da
apresentação e discussão dos resultados. Finalmente serão apresentadas algumas
limitações e perspectivas do presente trabalho no contexto de outros trabalhos
realizados pelo grupo.
-3-
2. Revisão Bibliográfica
2.1 Dislipidemia
Segundo Rabelo (2001), a dislipidemia, é uma alteração dos níveis de lipídeos ou de
lipoproteínas circulantes, causada pelas alterações na produção, no catabolismo ou no
clearence, em conseqüência de fatores genéticos e/ou ambientais, dieta inadequada e/ou
sedentarismo.
Existem vários estudos na literatura que enfatizam as dislipidemias como fator de risco
cardiovascular. De acordo com o Programa Nacional de Educação sobre o Colesterol
dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos (NCEP, 2001),
a
hipercolesterolemia, em particular o aumento do LDL-c, é o principal preditor das
DCVs porque as partículas de LDL-c contêm 70% de colesterol no sangue, sendo o
principal alvo de intervenção médica. Níveis séricos aumentados de HDL-c diminuem
o risco relativo para a DCV. O mecanismo para esse efeito protetor ocorre pela
habilidade de o HDL-c fazer o transporte reverso do colesterol, ou seja, de removê-lo
das células e transportá-lo para o fígado para posterior excreção. O HDL-c também
previne a oxidação e agregação das partículas de LDL na parede arterial, diminuindo o
potencial aterogênico dessa lipoproteína (GIULLUM, 2000).
2.1.1 Dislipidemia e hábitos alimentares
As modificações de hábitos e preferências alimentares introduzidas na infância podem
se tornar permanentes. Não obstante, a ingestão de gorduras durante a amamentação é
fundamental para a mielinização do sistema nervoso central (BATISTA, 2003) e as
recomendações para uma dieta pobre em gorduras saturadas e colesterol só são
aceitáveis para crianças acima de dois anos de idade (ABRANTES, 2002).
É importante evidenciar que a ingestão excedente de gorduras saturadas e trans têm
mais efeito aterogênico do que a ingestão excedente de colesterol, sendo, portanto
necessário atentar para o teor desses nutrientes na alimentação, uma vez que as gorduras
saturadas em excesso são a principal causa dos aumentos do colesterol plasmático e do
LDL-c (ADULT TREATMENT PANEL III, 2001).
-4-
2.1.2 Dislipidemia associados à idade e sexo
Os níveis de lipídeos e lipoproteínas sofrem variações importantes durante a fase de
crescimento e desenvolvimento humano, com diferenças segundo idade e sexo. Os
níveis séricos de lipídeos e lipoproteínas são superiores nas crianças e adolescentes do
sexo feminino, sendo esta diferença mais expressiva durante a adolescência. Em média,
as meninas apresentam níveis superiores de colesterol total, HDL- c e LDL-c (GIULIANO
et al, 2005; RIBEIRO, 2000; BROTONS et al, 1998).
As variações decorrentes da maturação sexual ocorrem em ambos os sexos. Nas
meninas, observa-se um aumento progressivo do HDL- c a partir dos 10 anos, sendo
este marcadamente superior ao dos meninos no final da adolescência. Também o LDL-c
e o colesterol total elevam-se progressivamente a partir dos 14-15 anos nas meninas,
sendo superiores aos dos meninos por volta dos 17-18 anos. Talvez a maturação sexual
seja importante no desencadeamento deste fenômeno na adolescência. Nos meninos, a
maturação sexual acarreta diminuição progressiva do colesterol total, LDL e HDL-c em
função da evolução dos estágios puberais de Tanner (MORRISON et al, 2002).
2.1.3 Dislipidemia e obesidade
Há uma associação positiva entre a incidência da obesidade e dislipidemia em crianças.
Foram encontradas prevalências de cerca de 50% de dislipidemia em crianças com
índice de massa corporal acima de percentil 99 para a idade, sendo a obesidade
considerada um critério para triagem de perfil lipídico em crianças e adolescentes.
Nestas crianças, a adiponectina possui uma associação positiva com a sensibilidade à
insulina e com os níveis de HDL-c e negativa com os níveis de triglicerídeos. Por outro
lado, a dislipidemia na infância pode estar associada ao desenvolvimento de obesidade
na vida adulta, especialmente no sexo feminino. Isto pode sugerir que haja algum
mecanismo geneticamente determinado que explique a associação dessas variáveis
(WEISS et al, 2004).
2.1.4 Dislipidemia e fatores genéticos
Os epidemiologistas genéticos (PERUSSE et al, 1989) calcularam que 50% da variação
nas concentrações de colesterol na população geral podem ser explicados por
polimorfismos nos genes que influenciam o colesterol total sérico e o LDL-colesterol
(THOMPSON , 1990).
-5-
Então, provavelmente polimorfismos genéticos dos genes da Apo E, Apo B e dos genes
dos receptores de LDL responsabilizam-se por grande parte da variabilidade nas
concentrações de colesterol e alguns polimorfismos indubitavelmente contribuem para o
desenvolvimento das dislipidemias. Portanto, a grande variabilidade de valores
plasmáticos deve-se à interação poligênica e dos múltiplos fatores ambientais,
acarretando, assim, uma ampla gama de fenótipos em nível populacional (HUMPHRIES et
al,1995). Dessa forma, para melhor entender o processo que determina o
desencadeamento das dislipidemias, é importante avaliar todos os fatores ambientais e
genéticos relacionados a este fator de risco, sempre com o intuito de prevenção precoce.
2.2 Diabetes Mellitus e hiperglicemia
2.2.1 Diabetes Mellitus
Diabetes Mellitus é uma doença crônica determinada pela diminuição ou total supressão
da insulina (hormônio responsável pela captação da glicose sanguínea) pelas células β
pancreáticas (ECDCDM, 2003). Até pouco tempo atrás, o diabetes encontrado na
adolescência era exclusivamente conseqüência do diabetes tipo 1 (ou seja, doença
resultante da destruição das células β pancreáticas mediadas pela resposta auto-imune
celular, tendo como resultado a hiperglicemia em decorrência do déficit absoluto da
insulina) (ATKISON et al, 1994). Enquanto o diabetes tipo 2 (ou seja, doença
determinada pela supressão parcial da produção de insulina pelas células β pancreáticas,
uma combinação de resistência à ação da insulina e à incapacidade das células β em
manter uma adequada secreção de insulina) era exclusivo dos adultos (HOTU et al, 2004;
GOBRAY et al, 2003).
Entretanto, nos últimos anos, tem-se observado um aumento crescente na prevalência do
diabetes mellitus tipo 2 entre os jovens. Anteriormente, essa forma correspondia de 12% dos casos de diabetes na juventude. Vários autores vêm relatando uma tendência no
aumento da incidência do diabetes em adolescentes, com características similares às do
diabetes mellitus do adulto (FAGOT-CAMPAGNA et al, 2000; PIHOKER et al, 2000;
PINHAS-HAMOL et al, 1996; GLASER et al, 1995). Crianças e adolescentes de origem
mexicana e da raça negra residentes dos EUA, além de populações indígenas, mostram
maior susceptibilidade à doença em relação aos indivíduos brancos (PIHOKER et al,
2000; NEUFELD et al, 1998; PINHAS-HAMOL et al, 1996; GLASER et al, 1995). Sessenta e
-6-
nove a 75% dos adolescentes, residentes nos EUA, e portadores de DM2 são da raça
negra (NEUFELD et al, 1998; PINHAS-HAMOL et al, 1996). Em contrapartida, esse
aumento do DM2 na juventude não é fato exclusivo da América do Norte. Entre os
japoneses em idade escolar, em vinte anos, essa incidência elevou de 0,2 para 7,6 por
100 mil indivíduos (KITAGAWA et al, 1994).
No Brasil, dados do Plano de Reorganização da Atenção a Hipertensão Arterial e ao
DM de 2001 apontaram para uma prevalência na população brasileira acima de 40 anos
de idade de 10%, e estimou-se que, de mais de 3,6 milhões de usuários do sistema
público, quase metade desconhecia este diagnóstico e apenas 2/3 destes indivíduos estão
em
acompanhamento
nas
unidades
de
atenção
básica.
Inúmeros
estudos
epidemiológicos demonstraram nas últimas décadas que a presença de alguns fatores de
risco (hipertensão, diabetes, tabagismo, dislipidemia, história familiar, sedentarismo,
obesidade) explicam 90% do risco atribuível da doença ao redor do mundo. Em
indivíduos adultos, o diabetes está associado a um alto risco de doença cardiovascular,
em torno de 2 a 4 vezes maior em relação a indivíduos sem diabetes, sendo a doença
cardiovascular a principal causa de mortalidade e morbidade em indivíduos com
diabetes tipo 2 (FURTADO et al, 2007).
Indivíduos com DM, mesmo sem doença aterosclerótica estabelecida, têm um risco
elevado de desenvolver eventos vasculares no futuro. Estima-se em torno de 20% a taxa
de desenvolvimento de evento cardíaco em um período de 7 anos em pacientes
diabéticos sem doença cardiovascular prévia. Por este motivo, sociedades internacionais
(American Heart Association, American Diabetes Association) corroboradas pelas
respectivas sociedades brasileiras, definem essa condição como sendo “alto risco” para
eventos cardiovasculares (FURTADO et al, 2007). Conforme NHANES III (Third
National Health And Nutrition Survey, USA), pacientes diabéticos possuem uma maior
prevalência de doença arterial coronariana (19,2%) quando comparados a indivíduos
que não apresentam essa patologia. Como regra, indivíduos adultos jovens (<40 anos) e
crianças têm um risco baixo de apresentar esse tipo de complicação, mas este risco
depende das condições ambientais e genéticas a que estiverem expostos (FURTADO et al,
2007).
-7-
Os estudos mostram que a idade média de diagnóstico se situa entre doze e quatorze
anos (PINHAS-HAMOL et al, 1996; GLASER et al, 1995). Ao avaliar a incidência
estratificado por sexo, observa-se que sexo feminino, entre crianças, adolescentes e
adultos jovens, mostrou-se mais susceptível ao risco de desenvolver o DM2 em
praticamente todas as comunidades estudadas (PINHAS-HAMOL et al, 1996; KITAGAWA
et al, 1994). A literatura demonstra que esse crescimento exacerbado do diagnóstico de
diabetes tipo 2 em adolescentes, está atribuída a transição nutricional, ou seja, ao
crescente aumento da obesidade nas crianças em idade escolar no mundo.
2.2.2 Hiperglicemia
Como se sabe, a hiperglicemia é um estágio intermediário para desenvolvimento do
diabetes (JOLLIFFE et al, 2006). Muitos estudos têm encontrado que a hiperglicemia se
manifesta precocemente nas crianças e/ou adolescentes obesos ou com sobrepeso
(JOLLIFFE et al, 2006). A hiperglicemia pode levar ao aumento na captação da glicose
pelos tecidos e sua metabolização. Além disso, a hiperglicemia pode levar a glicosilação
de proteínas extracelulares (como a LDL, que é mais aterogênica), geração de radicais
livres (aumento do estresse oxidativo) e de produtos terminais de glicosilação avançada.
A ligação desses produtos terminais aos receptores presentes no endotélio, músculo liso
e fibroblastos pode levar ao aumento da permeabilidade vascular, da coagulação,
diminuição da trombólise, maior proliferação celular e aumento da produção de
proteínas de matriz extracelular. A geração de radicais livres pela hiperglicemia pode
promover a aterogênese por meio da peroxidação da LDL (molécula mais aterogênica),
pela oxidação do fibrinogênio (aumento da coagulação), por aumentar a ativação
plaquetária pelo colágeno e por diminuir a produção do óxido nítrico (GIULIANO et al,
2005). Dentro do grupo pediátrico, hiperglicemia raramente ocorre (ALMEIDA et al,
2008).
Estudos revelam uma associação entre obesidade e diabetes, principalmente em grupos
étnicos considerados de alto risco para diabetes, como indianos, canadenses, africanos
hispânicos, japoneses e asiáticos (INVITTI et al, 2003) e mais recentemente, em grupos
multi-étnicos dos Estados Unidos da América. Nestas populações a evolução da
hiperglicemia está associada com resistência a insulina e diminuição da capacidade
secretora das células β, e com a deterioração destas, evolui para diabetes. Portanto, o
risco de progressão da hiperglicemia crônica pode também estar relacionado a fatores
-8-
constitucionais, uma vez que crianças americanas de origem africana e jovens japoneses
com hiperglicemia exibem maior e menor resposta insulínica, respectivamente, a uma
elevação aguda dos níveis de glicose comparados aos caucasianos (INVITTI et al, 2003;
GABBAY et al, 2003).
Sabe-se que durante a puberdade, em função do aumento de esteróides sexuais, há
profundas transformações na composição corporal e no perfil de secreções hormonais.
O aumento do hormônio do crescimento pode ser determinante do aumento da
resistência insulínica. Indivíduos predispostos podem não se adaptar a esta situação e,
na presença de defeito na secreção de insulina pelo pâncreas, correm o risco de
desenvolver a diabete mellitus tipo 2 na puberdade (GIULIANO et al, 2005) .
Portanto, o Diabetes mellitus (DM) é uma condição crítica, com elevado impacto
individual e coletivo ao considerar o risco para doenças cardiovasculares (FURTADO et
al, 2007), devendo ser bem avaliado na fase escolar para prevenir problemas de saúde
pública.
2.3 Sobrepeso e Obesidade
Obesidade é um dos problemas crônicos mais comuns, sendo a obesidade infantil um
importante problema de saúde pública. Primeiramente, devido ao fato de na infância e
adolescência, estar associada a um número de fatores de risco para doenças
cardiovasculares (DCV) que incluem dislipidemia, diabetes tipo 2 e hipertensão.
Segundo, a obesidade é um dos muitos fatores de risco associados com DCV que tem
uma forte tendência a persistir na fase adulta. Portanto, a obesidade durante a infância e
a adolescência aumenta o risco cardiovascular na fase adulta (COURTNEY, 2006).
A Obesidade no âmbito internacional representa um dos mais importantes problemas de
saúde pública, sendo o peso corporal em excesso o sexto fator de risco mais importante
contribuindo para o peso global dessa doença; aproximadamente 110 milhões de
crianças são classificadas, atualmente com sobrepeso ou obesidade (HASLAM et al,
2005). Esse fato ocorre especialmente em decorrência de uma rápida transição
nutricional que acometeu o mundo, especialmente os países em desenvolvimento. A
América Latina apresentou tendências crescentes de obesidade infantil determinada por
-9-
fatores ambientais como a disponibilidade de comida calórica e barata combinada com
estilos de vida sedentários (CALI et al, 2008).
Reforçando essa tendência mundial da obesidade infantil, Wang & Lobstein (2006)
avaliaram população de escolares de 25 países e população em idade pré-escolar de 42
países, observando que a prevalência de sobrepeso infantil tem aumentado em quase
todos os países e obesidade e sobrepeso tinham aumentado drasticamente em países
economicamente desenvolvidos e em população urbanizada (CALI et al, 2008; STURM,
2003).
Nos EUA, as porcentagens da obesidade para americanos de 12 a 17 anos variam de 13
a 36%, e as porcentagens de sobrepeso de 4 a 12%, dependendo do sexo e da raça.
(SALGADO et al, 2008). De 1960 a 1990, a prevalência do sobrepeso em crianças
cresceu de 5 para 11% (JONATHAN et al, 2002). Já a prevalência de adolescentes (12 a 19
anos) obesos aumentou de 5% para 15% na virada do século nos EUA (1976-1980).
Similarmente, a prevalência de obesidade em jovens canadenses (12 a 17 anos) tem
aumentado até três vezes (COURTNEY, 2006).
A obesidade tem aumentado para ambos os gêneros e em todos os grupos raciais,
étnicos
e
socioeconômicos;
entretanto,
a
prevalência
da
obesidade
é
desproporcionalmente maior dentre os africanos, mexicanos e americanos nativos
quando comparados a outros grupos étnicos (CALI et al, 2008; COURTNEY, 2006).
No Brasil a velocidade, com a qual a obesidade está aumentando, varia entre diferentes
regiões geográficas, classe social, grupos de idade e sexo (STRUFALDI et al, 2008) e
corroborando com a tendência mundial, a prevalência da obesidade tem aumentado
significativamente nas últimas décadas (SALGADO et al, 2003; KUSCHNIR et al, 2007).
Cole et al (2000) estudando adolescentes de 18 anos, encontraram prevalências para o
sexo masculino e feminino de 4,7% e 15,2%, respectivamente.
O Estudo Nacional de Despesa Familiar (ENDEF) com os dados da pesquisa sobre
padrões de vida revelou que a prevalência de sobrepeso dentro dos adolescentes
brasileiros foi 3,9% nos meninos e 7,5% nas meninas no período de 1974-1975. Nos
anos 2002-2003, sobrepeso foi observado em 18% ao avaliar os meninos e 15,4% para
- 10 -
as meninas. A prevalência da obesidade nas crianças na fase pré-puberal estimado pelo
IMC está cerca de 10% (STRUFALDI et al, 2008).
Embora a mais severa complicação da obesidade não manifeste precocemente na vida,
problemas cardiovasculares podem já estar evidente em idade jovens. A obesidade em
crianças e adolescentes está associada com níveis aumentados de hipertensão,
hiperlipidemia, diabetes tipo 2 e desenvolvimento de lesão aterosclerótica precoce. A
presença desses fatores de risco não necessariamente representa morbidade em idade
jovem
mas um risco aumentado de desenvolvimento da DCV na fase adulta
(COURTNEY , 2006; ROBISON et al, 2004; HANEVOLD et al, 2004; SALGADO et al, 2003).
A obesidade é uma doença multifatorial sendo que o excesso energético que resulta na
obesidade ocorre como resultado de fatores genéticos ou de mudanças adquiridas no
comportamento alimentar e na prática de exercícios físicos. A eficiência do
metabolismo e estoque energéticos são bons candidatos para serem determinantes na
susceptibilidade a obesidade (PALOU , 2000).
Sendo um importante preditor das DCV, o aumento da prevalência da obesidade na
infância e na adolescência traz conseqüências em curto e longo prazo, por estar
associada a fatores de risco para doenças cardiovasculares como hipertensão,
dislipidemia e fatores genéticos (NCEP, 2001).
2.4 Tabagismo, Sedentarismo e Hábitos Alimentares
2.4.1 Tabagismo
Além de ser fator de risco para o baixo peso ao nascer, para o escolamento prematuro da
placenta e para doenças pulmonares, o tabagismo está associado a um risco elevado de
doenças cardiovasculares e outras condições patológicas, sendo um dos fatores de risco
em que a intervenção na infância é a mais claramente necessária e efetiva.
Estudos sugerem que a exposição passiva ao tabaco está relacionada a baixos níveis
plasmáticos de HDL colesterol, associado a uma disfunção endotelial significativa dose
dependente (GOLD et al, 1998; MCGILL et al, 1996). Em relação aos efeitos diretos, há
evidências demonstrando que leve obstrução nas vias aéreas e retardo de crescimento da
função pulmonar em adolescentes estão relacionados ao tabagismo (GOLD et al, 1998).
- 11 -
No Brasil, até a década de 1980, o hábito de fumar entre estudantes dos níveis
fundamentais e médios estava presente em 1 a 34% dos jovens entrevistados. Trabalhos
mais recentes demonstram que o tabagismo continua presente em 3 a 12,1% dos
adolescentes (BORDIN et al, 1991).
Entretanto, vale ressaltar que investigações
realizadas em 10 capitais brasileiras, envolvendo 24.000 alunos de Ensino Fundamental
e Médio, nos anos de 1987, 1989, 1993 e 1997, revelaram um aumento progressivo na
experimentação de cigarros pelos jovens em todas as capitais. Outra conclusão
importante da pesquisa de 1997 diz respeito à tendência de equilíbrio no consumo entre
estudantes de ambos os gêneros, diferentemente do que ocorria no ano de 1987, quando
o predomínio era do gênero masculino.
2.4.2 Sedentarismo
O sedentarismo tem sido apontado como outro fator de risco para as DCV, presente já
na infância e adolescência. Observou-se que as crianças diminuíram o nível de atividade
física por várias razões, como a menor tendência de caminhar e/ou andar de bicicleta e o
aumento do uso de carros para transporte. Houve também uma diminuição de atividades
recreativas e esportivas realizadas no tempo livre das crianças, com aumento de
atividades sedentárias, como assistir à televisão, jogar videogames e fazer uso do
computador (PINTO et al, 2001).
Há poucos estudos sobre a prevalência do sedentarismo em crianças e adolescentes no
Brasil, variando de 42% a 93,5%, o que depende do critério utilizado (SILVA et al,
2005). Embora alguns estudos demonstrem que adolescentes que praticam mais
atividade física tendem a permanecerem mais ativos quando adultos jovens, outros
autores demonstraram que a atividade física durante a infância não confere proteção
cardiovascular se não estiver associada à permanência de um estilo de vida ativo,
durante a fase adulta. Trabalhos demonstram que a atividade física de qualquer
intensidade pode ser mais importante e um alvo mais real do que tentar determinar uma
intensidade benéfica de atividade física. É importante ressaltar que a infância é a etapa
ideal o estímulo à prática de atividades físicas, já que, a aquisição desse hábito durante a
infância, aumenta a probabilidade de que o mesmo seja valorizado e permaneça na vida
adulta (PELLANDA et al, 2002). A prática de atividade física exerce um efeito positivo
para os riscos cardiovasculares em adultos, e, em crianças ela vinha sendo relacionada
- 12 -
como uma estratégia para o desenvolvimento físico (STEINBECK, 2001). Porém, alguns
dados mostram que o menor nível de atividade física e o sedentarismo estão associados
com maior prevalência de obesidade infantil, apontando o sedentarismo como um fator
de risco presente em idades precoces (BYRNES et al, 1999).
2.4.3 Mudança nos hábitos alimentares
Outro fator de risco que tem sido apontado como um dos responsáveis pela maior
prevalência das DCV é a mudança nos hábitos alimentares. Essa mudança provocou a
redução do consumo de vegetais e frutas e um aumento do percentual de gordura
saturada e animal e da ingestão de sal e de carboidratos simples, acarretando uma menor
ingestão de micronutrientes alimentares antioxidantes que são importantes para
controlar ou reduzir a ação deletéria dos radicais livres no organismo (RIQUE et al,
2002) favorecendo a precocidade da ocorrência dos fatores clássicos para as doenças
cardiovasculares como dislipidemia, hiperglicemia , obesidade e hipertensão arterial.
2.5 Idade e gênero
Os riscos para as DCV aumentam com a idade, e a cada dez anos há uma possibilidade
de aumentar em 2,5 vezes a mortalidade por essas doenças (RABELO et al, 2001).
Considerando o gênero, percebe-se que as DCVs são as principais causas de morbimortalidade para ambos os sexos, mas a magnitude dos fatores de risco e a ocorrência
de manifestações clínicas aparecem mais tardiamente em mulheres do que em homens.
Essa diferença tem sido atribuída a menores concentrações dos hormônios esteróides na
menopausa, mas as explicações biológicas para essas diferenças são mais complexas,
uma vez que é necessário entender a fisiologia molecular e celular de cada hormônio
esteróide sexual e seus receptores no sistema cardiovascular, mas esses mecanismos
ainda estão sendo elucidados. Enquanto essas diferenças sexuais estão sendo analisadas
minuciosamente, é unânime o papel tanto da testosterona para o desenvolvimento e do
estrógeno na proteção contra os fatores de risco clássicos (hipertensão, dislipidemia e
diabetes) para doenças cardiovasculares (OBER et al, 2008; HUXLEY, 2007;
MENDELSOHB et al, 2005; REGITZ-ZAGROSEK et al, 2007).
2.6 Hipertensão Arterial
- 13 -
A hipertensão arterial sistêmica primária é uma doença multifatorial definida pelo III
Consenso
Brasileiro
de
Hipertensão
Arterial
(SOCIEDADE
BRASILEIRA
DE
HIPERTENSÃO,1999) como uma síndrome caracterizada pelo aumento da pressão arterial
associado a mudanças metabólicas e hormonais e fenômenos ambientais, na qual
diferentes mecanismos estão implicados, levando ao aumento do débito cardíaco e da
resistência vascular periférica. Por isso, hipertensão é um grave fator de risco
independente para DCV, sendo também considerado um problema de saúde pública em
todo mundo (SALGADO et al, 2003).
Uma recente análise da hipertensão em diferentes regiões do mundo, estimou 972
milhões de
desenvolvidos
adultos com hipertensão em 2000, sendo 333 milhões em países
e 639 milhões em países em desenvolvimento. Essa proporção irá
aumentar em 60%, ou seja, 1,56 bilhões, até 2025 (KEARNEY et al, 2005).
Adicionalmente, sabe-se que a magnitude da hipertensão contribui para predizer uma
epidemia de doença cardiovascular mundial (MURRAY et al,1994).
2.6.1 Prevalência da Hipertensão Arterial no Brasil
No Brasil, as síndromes coronarianas isquêmicas e DCV são responsáveis por um terço
das mortes na população em geral ( SALGADO et al, 2003). Alguns estudos apontam
prevalência de 22 até 44% entre os adultos. Embora a maior prevalência predomine nos
adultos, em crianças e adolescentes brasileiros, a prevalência da hipertensão arterial não
é desprezível. Os estudos epidemiológicos sobre hipertensão primária na infância e
adolescência realizados no Brasil demonstraram uma prevalência que variou de 0,8% a
8,2% (GUS et al, 2004 ; FUCHS et al, 2001). No Rio Grande do Sul, observou-se uma
proporção de 6,6% de adolescentes com níveis tensionais acima do percentil 95 para
pressão diastólica e 12,9% para pressão sistólica. Em São Paulo, foi observada
prevalência de 2,7% entre crianças e adolescentes (KUSCHNIR et al, 2007). Em Ouro
Preto foi encontrada uma prevalência de 17,4% de hipertensão leve em jovens de 15 a
19 anos (FREITAS et al, 2007).
2.6.2 Estudos realizados da hipertensão arterial em crianças
Vários estudos têm sido realizados para investigar a hipertensão na infância; estudos
epidemiológicos de hipertensão na infância têm sugerido que crianças com altos níveis
de pressão arterial durante a adolescência têm uma maior tendência a desenvolver
- 14 -
hipertensão durante a fase adulta (JONATHAN et al, 2002). Corroborando com estes
estudos longitudinais tem sido demonstrado que níveis elevados da pressão arterial,
inclusive dentro dos padrões normais, tendem a progredir ao longo da vida, com níveis
maiores do que outros indivíduos e com maiores chances de tornarem um adulto com
hipertensão (SALGADO et al, 2003 ; JONATHAN et al, 2002).
2.6.3 Hipertensão, idade e gênero
A pressão arterial aumenta linearmente com a idade (VASAN et al,
2001). Em
indivíduos jovens, a hipertensão decorre mais freqüentemente apenas da elevação na
pressão diastólica, enquanto a partir da sexta década o principal componente é a
elevação da pressão sistólica (FRANKLIN et al, 2005). A hipertensão essencial é
raramente encontrada em crianças menores que 10 anos de idade, mas quando ocorrem
os fatores de risco significativo para o desenvolvimento da hipertensão essencial
incluem história familiar e IMC aumentado (KEAMEY et al, 2005 ).
As diferenças encontradas entre os sexos para a hipertensão arterial também podem ser
parcialmente explicadas pela proteção oferecida pelos hormônios esteróides femininos
(estrógeno) e pelo favorecimento a altos níveis pressóricos determinado pelos
hormônios esteróides masculinos (testosterona). Sendo assim, espera-se que durante o
estádio puberal, as meninas estejam protegidas das alterações nos níveis pressóricos
determinados pela ação do estrógeno, enquanto os meninos precisam ser mais
monitorados por terem maior tendência, neste estádio, de apresentar alterações nos
níveis pressóricos que podem determinar um fenótipo de risco caso o aumento perpetue
até a fase adulta. Existem estimativas globais que sugerem taxas de hipertensão mais
elevadas para homens até os 50 anos e para mulheres a partir da sexta década (HUXLEY ;
2007; KEAMEY et al, 2005).
2.6.4 Hipertensão e fatores ambientais (obesidade e atividade física)
O excesso de massa corporal é um fator predisponente para a hipertensão, podendo ser
responsável por 20% a 30% dos casos de hipertensão arterial (WHO, 1997; V DBHA,
2007). Segundo a Organização Mundial de Saúde , 75% dos homens e 65% das
mulheres apresentam hipertensão diretamente atribuível a sobrepeso e obesidade.
Apesar do ganho de peso estar fortemente associado com o aumento da pressão arterial,
nem todos os indivíduos obesos tornam-se hipertensos. Estudos observacionais
- 15 -
mostraram que ganho de peso e aumento da circunferência da cintura são índices
prognósticos importantes de hipertensão arterial, sendo a obesidade central um
importante indicador de risco cardiovascular aumentado (NISKANEN et al, 2004;
CARNEIRO et al, 2003; WHO, 1997). Estudos sugerem que obesidade central está mais
fortemente associada com os níveis de pressão arterial do que a adiposidade total.
Portanto, indivíduos com nível de pressão arterial ótimo, que no decorrer do tempo
apresentam obesidade central, tem maior incidência de hipertensão (DE SIMONE et al,
2006). Neste caso, a perda de peso pode acarretar redução da pressão arterial (NETER et
al, 2003).
Outro fator ambiental que deve ser mencionado é o sedentarismo, uma vez que este
aumenta a incidência de hipertensão arterial. Alguns estudiosos sugerem que indivíduos
sedentários apresentam risco aproximado 30% maior de desenvolver hipertensão que os
ativos (FAGARD, 2007; PAFFENBARGER et al, 1991), especificamente quando realiza-se
exercício aeróbico. Uma vez que o exercício aeróbio apresenta efeito hipotensor maior
em indivíduos hipertensos que normotensos (WHELTON et al, 2002). Adicionalmente, o
exercício não-aeróbico possui efeito hipotensor semelhante, mas menos consistente
(COMELISSEN et al, 2005).
2.6.5 Hipertensão e fator ambiental: Ingestão de sódio
Um dos fatores ambientais mais importantes na predição dos níveis pressóricos é a
dieta, especialmente, a ingestão de altas concentrações de sódio.
Vários estudos
demonstram a associação entre ingestão de sódio e hipertensão em modelos animais e
em humanos. Ainda são poucos os estudos realizados em crianças, mas percebe-se, ao
investigar o efeito do sal dietético na pressão arterial de crianças e adolescentes, que
uma restrição de sal dietético foi mais eficiente em pacientes com história familiar de
hipertensão e em pacientes obesos comparados a população geral (FALKER & MICHEL et
al, 1997).
Estudo de meta-análise realizado por He et al (2006) revelou que uma redução modesta
(1 mmHg tanto na pressão sistólica quanto na pressão diastólica) na ingestão de sal em
crianças tem um efeito significante na pressão arterial, podendo ter uma importante
implicação na saúde pública em termos de prevenção de doenças cardiovasculares no
futuro. Além disso, este estudo evidenciou que os países desenvolvidos possuem uma
- 16 -
concentração de sal em fórmulas de leite 3 vezes maior quando comparada ao leite
materno. Em contrapartida, países em desenvolvimento, apresentam concentrações
similares de sódio em fórmula de leites àquelas encontradas no leite materno (HE et al,
2006).
Estudos realizados na década de 80 revelaram que a ingestão de sal em crianças por
causa do aumento dos alimentos processados, explica 80% do total de sal ingerido.
Estudos realizados nos Estados Unidos mostrou que a proporção de alimentos
consumidos em restaurantes e fast foods aumentou aproximadamente 300%, e as
comidas produzidas nesses locais
geralmente possuem altas concentrações de sal,
açúcar e gordura. Um recente estudo com 856 meninos e 845 meninas da Grã-Bretanha
quantificou o sal ingerido e encontrou uma ingestão de 5,2 g para os meninos e 4,6 g
para meninas ambos com idade entre 4 a 6 anos. Com o aumento da idade, observou
um aumento na ingestão de sal; entre 15 e 18 anos, a ingestão de sal foi de 8,2 e 5,7 g
por dia para meninos e meninas, respectivamente. Portanto, ainda que a necessidade
fisiológica para a ingestão de sal não tenha sido bem elucidade nessa faixa etária, é
necessária cautela na ingestão deste nutriente em qualquer idade. Existem trabalhos em
andamento sobre o efeito a longo prazo da ingestão de sal no controle da pressão arterial
em humanos e os resultados preliminares revelaram uma similaridade com os resultados
encontrados em modelos animais, sugerindo um efeito programado da ingestão de sal na
pressão arterial em indivíduos jovens (HE et al, 2006).
De qualquer forma, nem todos os indivíduos que consomem altas quantidades de sódio
desenvolvem hipertensão. Este fenômeno é conhecido como sensibilidade ao sódio, e é
mais freqüente em pacientes com hipertensão severa, em indivíduos negros, em
pacientes com história familiar de hipertensão, em idosos e em pacientes com
hiperaldosteronismo (SALGADO et al, 2003). Os mecanismos de sensibilidade ao sal são
complexos e não totalmente conhecidos. Um consenso na literatura é que ocorre uma
menor capacidade renal para excreção de sódio, com consequente aumento no volume
circulante e da pressão arterial (CAMPESE E BIANCHI, 1994).
Sendo assim, o excesso de consumo de sódio contribui para a ocorrência de hipertensão
arterial. Como consenso, sabe-se que existe uma relação associado ao avanço da idade e
uma maior ingestão de sal. Povos que consomem dieta com reduzido conteúdo deste
- 17 -
têm menor prevalência de hipertensão e a pressão arterial não se eleva com a idade. A
população urbana brasileira foi identificada por ter a maior ingestão de sal nos níveis
socioeconômicos mais baixos, sendo motivo de preocupação (V D B H A, 2007).
2.6.6 Hipertensão e fatores genéticos
Considerando a hipertensão arterial uma doença multifatorial, percebe-se uma interação
entre os fatores genéticos e ambientais para seu desenvolvimento. Estudos conduzidos
no âmbito genético sugerem que fatores hereditários contribuem com cerca de 20 a 50%
da variação na pressão arterial em humanos (SALGADO et al, 2003).
Pesquisadores notaram que 49% dos pacientes com hipertensão infantil primária tinham
um parente com hipertensão secundária. Adicionalmente, em outro estudo foi possível
observar que adolescentes com hipertensão primária têm 86% de história familiar
positiva para hipertensão. Um fator importante a ser considerado é a raça; sabe-se que
na população adulta, a porcentagem da prevalência, morbidade, mortalidade em
decorrência da hipertensão são maiores dentre os negros. Ainda não está bem
estabelecida a mesma relação em crianças hipertensas (SALGADO et al, 2003), pois
existem dados insuficientes para definir o papel da raça na hipertensão infantil. Muitos
estudos mostram crianças negras com maiores níveis de pressão arterial comparadas as
crianças brancas (GREGORY et al, 2006) . Adicionalmente, outro estudo detectou que
algumas desordens do sono e raça negra podem ser fatores de risco potenciais para
hipertensão essencial na infância (PAFFEMBARGER et al, 1991). Existem estudos que
sugerem que a hipertensão é mais prevalente em mulheres afrodescendentes com
excesso de risco de hipertensão de até 130% em relação às mulheres brancas (V D B H
A, 2007).
Diante do que foi exposto, fica clara que as DCVs podem ter sua origem na infância e
adolescência e como são doenças multifatoriais, é importante monitorar as crianças em
cada estádio da maturação sexual para evitar que as alterações determinadas pelos
hormônios sexuais caracterizem um fenótipo de risco. Quando necessário deve ser
realizadas intervenções precoces mais efetivas sobre os fatores de risco (alterações nos
níveis lipídicos; nos níveis glicêmicos, nos níveis pressóricos, na composição corporal),
reduzindo, a morbidade e mortalidade futura (SANTOS et al, 2008).
- 18 -
Considerando que as DCVs são poligênicas, a patogênese da hipertensão tem
comportamento similar. Na seção a seguir iremos rever o papel de genes do Sistema
Renina-Angiotensina, levando em conta que a ocorrência de alterações em alguns dos
genes deste sistema ou a combinação dessas alterações podem resultar em manifestação
clínica de hipertensão (SALGADO et al, 2003).
2.6.7 Hipertensão Arterial e o Sistema Renina-Angiotensina
2.6.7.1 Sistema Renina-Angiotensina
O Sistema Renina-Angiotensina (SRA) é coordenado por uma cascata hormonal e
protéica responsáveis por controlar as funções cardíacas, renais e das adrenais (CAREY
et al, 2003) envolvidas em especial no controle do balanço eletrolítico, dos fluidos
corporais e na pressão arterial. A figura 1 apresenta um desenho esquemático do
funcionamento desse sistema.
Figura 1: Esquema ilustrativo de todos os órgãos e seus produtos responsáveis pela formação da
angiotensina II. Esta figura mostra que o angiotensinogênio (origem hepática) é substrato da renina
(produzida pelos rins), enzima responsável pela degradação à angiotensina I e esta sob ação da enzima
conversora da angiotensina I ( produzida por vários órgãos ,especialmente ,rins e pulmão) digere a
angiotensina I em angiotensina II que é um potente vasopressor determinando assim um aumento da
pressão arterial.
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O sistema renina angiotensina clássico é constituído por quatro proteínas principais:
renina (REN), angiotensinogênio (AGT), enzima conversora da angiotensina (ECA) e
os receptores para a angiotensina II (AII) (LIMA et al, 2007). Portanto, os genes que
codificam esses componentes possuem um papel central na determinação da
susceptibilidade genética para desenvolvimento de doenças cardiovasculares e tem sido
exaustivamente estudados (GUI-YAN et al, 2006; ZHU et al, 2003; PONTREMOLI et al,
1996; HARRAP et al, 1993 ). A seguir, vamos sintetizar todas as funções dessas proteínas
e, posteriormente falar especificamente do polimorfismo da enzima conversora da
angiotensina I estudos deste polimorfismo relacionado a doenças cardiovasculares que
será o foco do presente trabalho.
A renina é uma enzima circulante liberada pelas células justaglomerulares dos rins
sendo responsável pela quebra do décimo aminoácido do angiotensinogênio
convertendo-o a angiotensina I (que é um decapeptídeo) (ZHUO et al, 2007). No homem,
o gene da renina (REN) está localizado na região do cromossomo 1q32 (LIMA et al,
2007) . Apesar de ser uma das proteínas que iniciam o processo de degradação, esta
enzima não é o foco principal dos pesquisadores, por isso, ainda existem poucos artigos
elucidando esse gene e seus polimorfismos.
O angiotensinogênio é uma proteína circulante de origem hepática, composta por 13
aminoácidos, que requer glicocorticóides das glândulas adrenais e estrógeno das
gônadas, e é o substrato da ação da renina (angiotensinogenase) (ZHUO et al, 2007)
(Figura 1). O angiotensinogênio é expresso em muitos tecidos incluindo fígado, tecido
adiposo, coração, veia, cérebro e rim (DICKSON ET AL, 2006) . Além disso, é codificado
pelo gene AGT localizado no cromossomo 1q42-43 (DIKMEN et al, 2006) e contêm cinco
exóns (DICKSON et al, 2006). Esta proteína pode ser clivada por diferentes enzimais para
gerar angiotensina I ou angiotensina II diretamente. Muitos polimorfismos no exon e na
região promotora do gene AGT (por exemplo: C532T; A217G; C18T; A20C; T+31C;
T174M ; G6A e M235T) têm sido estudados em relação às doenças cardiovasculares
(JEUNEMAITRE, 2008; XU et al, 2007).
Angiotensina II
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A angiotensina II é um octapeptídeo hormonal (RABELO et al, 2001) e potente
vasoconstritor direto (FRANCO et al; 2007). As ações da angiotensina II ocorrem pela
interação desta com receptores de membrana celular das células alvo, que ao ligar ao
receptor tipo I determina um controle da pressão arterial (PA), ativando estruturas como
vasos sangüíneos (arteríolas e veias sistêmicas) rins, coração, adrenais e SNS (ZHUO et
al, 2007; BLOEM et al, 1995), promovendo vasoconstrição, promoção do crescimento
das células do músculo liso vascular, aumento na síntese da matriz de colágeno
extracelular, secreção de aldosterona e hormônio antidiurético (RABELO et al, 2001)
como ilustrado na figura 1. Se acoplada ao receptor tipo II , apresenta efeitos
antagônicos aos mencionados.
Os componentes do SRA acima mencionados já foram encontrados em tecidos como
coração, cérebro, rins, glândulas adrenais, vasos sangüíneos e órgãos reprodutores.
(LIMA et al, 2007) e devem ser bem elucidados para melhor entender o mecanismo do
SRA e suas possíveis correlações com as doenças cardiovasculares.
Enzima conversora da angiotensina I ou dipeptilcarboxipepidase I (DCP1)
Na literatura existem várias nomeclaturas para esta enzima, mas como a enzima
conversora da angiotensina I é uma dipeptidil-carboxipeptidase (DCP1), iremos nomeála como DCP1.
A DCP1 pertence à classe das metaloproteases de zinco (FRANCO et al, 2007; DIKMEN et
al, 2006) com função principal de converter a angiotensina I (um decapeptídeo inativo)
em angiotensina II (um octopeptídeo vasopressor), além de inativar a bradicinina
(potente vasodilatador), ou seja, a DCP1 aumenta a produção da angiotensina II, além
de ser responsável pela degradação da bradicinina, uma substância vasodilatadora e
natriurética (LIMA et al, 2007).
A importância da DCP1 na homeostase circulatória está bem documentada. Além de
estar presente como uma enzima de ligação de membrana na superfície de células
endoteliais vasculares, a DCP1 também circula no plasma. A enzima plasmática pode
ser sintetizada no endotélio vascular (FRANCO et al, 2007; DIKMEN et al, 2006; YOO et
al, 2005; IGIC et al, 2003; PONTREMOLI et al, 1996; HARRAP et al, 1993).
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Em humanos, o gene DCP1 está localizado no cromossomo 17q23, contêm 26 exons
interrompidos por 25 introns e codifica uma proteína de 21Kb (DIKMEN et al, 2006).
Este gene é um dos principais alvos da pesquisa molecular ao mencionar sistema reninaangiotensina e hipertensão arterial. Mais de 100 polimorfismos foram identificados no
locus da enzima conversora da angiotensina I (DCP1). Sendo que o mais comumente
estudado é o polimorfismo de inserção e deleção (In/Del DCP1).
2.7 Polimorfismo In/Del DCP1 e doença cardiovascular
O polimorfismo inserção/deleção do gene da enzima conversora da angiotensina I
(In/Del DCP1) é caracterizado pela inserção ou deleção de 287 pares de base de
sequência ALU no intron 16 (RIGAT et al, 1992). Alguns estudos relatam a associação
deste polimorfismo com fatores de risco para doenças cardiovasculares (GESANG et al,
2006 ; SEKURI et al, 2005; SAEED et al, 2005 ; WANG et al, 2004; KUEZNETSOVA et al,
2004; HENSKENS et al, 2003; POCH et al, 2001; GINER et al, 2000; HIGAKI et al, 2000;
JENG et al, 2000; TIRET et al, 1998; NAKANO et al, 1998; BARLEY et al, 1996; HIRAGA et
al, 1996; DURU et al, 1994; MORISE et al, 1994; CAMBIEN et al, 1992; ZEE et al, 1992),
embora evidência para esta hipótese tem variado em diferentes estudos (MIRIS et al,
2006; YOO, 2005; BORECKI et al, 1997; WINKELMANN et al, 1996; SINGER et al, 1996;
VASSILIKIOTI et al, 1996; KIEMA et al, 1996; LINDPAINTNER et al, 1995; HARRAP et al,
1993; SCHMIDT et al, 1993).
Em humanos, ao quantificar os níveis plasmáticos e intracelulares da DCP1 percebe-se
que estes podem ser modulados por polimorfismos comuns (ZHU et al, 2003), como o
polimorfismo de inserção-deleção. Segundo Rigat e colaboradores (1990) o
polimorfismo In/Del DCP1 está fortemente associado com o nível de enzima circulante,
sendo o nível da DCP1 plasmática para os indivíduos considerados homozigotos para
deleção (DD) cerca de duas vezes maior que os II, e os indivíduos ID apresentavam
níveis enzimáticos intermediários.
Corroborando com alguns trabalhos (PONTREMOLI et al, 1996; RIGAT et al, 1990),
Suehiro e colaboradores (2004) demonstrou que o alelo D do polimorfismo In/Del
DCP1 leva a alta expressão do RNAm da DCP1 podendo afetar o sistema na região
local. Portanto, sugere-se que este polimorfismo tem uma relação direta com a atividade
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enzimática, ou seja, indivíduos que carreiam o alelo D por apresentar uma atividade
enzimática maior, podem ter uma produção da angiotensina II maior, o que leva
alterações nos níveis pressóricos. Harrap et al examinou a distribuição dos alelos I e D
do gene DCP1 e quantificou a atividade enzimática DCP1, caucasianos jovens adultos
com ou sem história familiar de hipertensão (HARRAP et al, 1993) . A frequência dos
alelos I e D não diferiram entre as duas populações, mas a atividade DCP1 foi maior nos
indivíduos carreadores do genótipo DD.
Portanto, sugere-se que a presença do alelo D está associada com elevado risco de
desenvolver doenças tanto micro quanto macrovasculares na hipertensão individual (
GINER et al, 2000). Todavia, o mecanismo que determina essa associação positiva ou
negativa entre os alelos I/D do gene DCP1 e doença ainda não está claro (DIKMEN et al,
2006; SINGER et al, 1996). A maioria dos estudos genéticos é conduzida em adultos
sendo que relativamente poucos estudos têm examinado a contribuição de genes
candidatos e especialmente do polimorfismo In/Del DCP1, no fenótipo de pressão
arterial, adiposidade e intolerância a glicose em crianças (EINSENMANN et al, 2009;
KOURLABA et al, 2008; BLOEM et al, 1996).
O primeiro pesquisador a elucidar essa possível correlação em adultos foi Cambien e
colaboradores (1992) que demonstraram um possivel papel do genótipo DD como fator
de risco cardiovascular. Em contrapartida, ao avaliar o efeito deste polimorfismo para o
desenvolvimento de DCV em diferentes populações observa-se resultados conflitantes.
Entretanto, a maioria dos estudos sugerem que o genótipo possa ser o primeiro passo
para síndrome coronariana, apresentando um possível papel no mecanismo envolvido na
estabilidade plaquetária, ulceração e trombose (KRETSWSKI et al, 2007; IGIC et al,
2003). Zee e colaboradores mostraram uma frequência significativamente menor do
alelo D em indivíduos hipertensos com mais de 50 anos (ZEE et al, 1992). Esses
resultados foram justificados pelo maior risco de mortalidade nos indivíduos DD. Como
mostrado por Morris e colaboradores, a frequência diminui com a idade, neste estudo,
apenas 14% dos indivíduos com hipertensão familiar severa com mais de 60 anos eram
homozigotos para deleção (DD) (MORRIS et al, 1994).
Ao avaliar o risco a aterosclerose, um estudo realizado por Arbustini e colaboradores
(1995) encontrou que o alelo D, tanto homozigoto quanto heterozigoto, conferia maior
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risco para aterosclerose. Adicionalmente, esse alelo estava significativamente associado
com o risco de infarto (embora em menores extensões quando comparadas a
aterosclerose permanente). Em contrapartida, a hipertensão parece não estar
correlacionada com o genótipo In/Del DCP1 neste estudo. Similarmente, nenhuma
associação foi observada entre o genótipo e infarto do miocárdio. Adicionalmente, dois
estudos populacionais observaram ligação entre locus do gene DCP1 e hipertensão
(O’DONNELL et al, 1998; FORNAGE et al, 1998). No Japão, estudo de coorte mostrou
uma associação significante entre o locus do gene DCP1 com hipertensão e pressão
arterial (HIGAKI et al, 2000), mas outros estudos transversais não encontraram
diferenças na pressão arterial e prevalência da hipertensão (MATSUBARA et al, 2002).
Estudo realizado por Pontremoli e colaboradores (1996), ao avaliar uma população
italiana de adultos concluiu que o alelo D do gene DCP1 está associado com
microalbuminúria bem como retinopatia, hipertrofia ventricular esquerda, e parece ser
um fator de risco independente para dano do órgão na hipertensão essencial
(PONTREMOLI et al, 1996), outro estudo realizado numa população italiana indicou um
aumento do risco para doenças cardiovasculares na presença do genótipo DD (FANTINI
et al, 2000). Thameem e colaboradores (2008) sugeriram que o polimorfismo In/Del
DCP1 em sinergismo com outros polimorfismos (AGTM235T; AT1R-A1166C), pode
modular os fatores de risco associados com doença renal e cardiovascular, numa
população de mexicanos.
Berge e colaboradores (1994) não encontrou nenhuma evidência de associação entre o
polimorfismo In/Del DCP1 e os níveis de pressão arterial sistólica ou diastólica. Em
adição,
Lindpaintner e seus colaboradores (1995) também não confirmaram a
associação entre genótipo DCP1 e hipertrofia ventricular esquerda em indivíduos do
Estudo do Coração de Framingham. Em resumo, estes estudos não confirmaram a
associação entre o alelo D e o risco aumentado de doença isquêmica ou infarto do
miocárdio em estudo longitudinal de homens dos EUA.
Similarmente, o estudo
realizado por Winkelmann e colaboradores (1996) falhou em encontrar associação entre
o polimorfismo In/Del DCP1 e a doença cardiovascular, embora o efeito da atividade
enzimática tenha sido demonstrado.
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Estudo realizado por Franken e colaboradores (2004) avaliando 80 jovens normotensos
e divindindo-os em filhos de pais hipertensos e filhos de pais não-hipertensos, não
encontrou diferenças entre os grupos considerando o polimorfismo do gene DCP1,
assim como qualquer relação do polimorfismo com a espessura do septo e massa
ventricular.
Outro fato importante a ser relatado são as diferenças nas associações dos fatores risco
para doenças cardiovasculares e este polimorfismo entre os sexos. Nos últimos anos, a
diferenciação sexual na pressão arterial têm sido analisada em decorrência da regulação
hormonal. A incidência e a severidade da hipertensão tem sido revelada ser menor em
mulheres quando comparadas aos homens (AMLOV et al, 2006; MARIC et al, 2005;
RECKELHOFF et al, 2001). Estudos enfatizam que nas crianças os níveis de pressão
arterial aumentam tanto em meninos quanto em meninas. Entretanto, depois do início da
puberdade, os meninos tem maiores níveis de pressão arterial comparados às meninas
da mesma idade (HUXLEY,2007). Em adolescentes e na puberdade, quando os níveis de
andrógenos estão aumentados, a pressão arterial é maior nos meninos quando
comparados as meninas ( XUE et al, 2005; HINOJOSA-LABORDE et al, 2004; RECKELHOOF
et al, 1998; BROSNIHAN et al, 1997), mas outros hormônios também podem estar
envolvidos (LANDAZURI et al, 2008 ) .
Por isso, aumentos da pressão arterial nas crianças mais velhas (SHANKAR et al, 2005;
SÁNCHEZ-BAYLE et al, 1999), e a influência da puberdade na pressão arterial devem ser
investigados. Alguns estudos sugerem que o estrógeno e a testosterona podem modular
a atividade enzimática do gene DCP1 ( FRESHOUR et al, 2002; GALLAGHER et al, 1999).
O efeito protetor proposto pelo estrógeno pode ser devido a ação na regulação da
expressão da DCP1, reduzindo sua atividade com consequente redução nos níveis
circulatórios da angiotensina II, como sugerido por Gallager e colaboradores
(GALLAGHER et al, 1999).
Muitos estudos têm também mostrado que os níveis de DCP1 variam com a idade
(RIGAT et al, 1990; CAMBIEN et al, 1988). Em crianças, a atividade da DCP1 é alta e
diminui com a idade, até alcançar níveis dos adultos, que parece ser constante no
indivíduo, embora possa variar de um indivíduo para outro (RIGAT et al, 1990) . Em
contrapartida, um estudo de caso-controle com 338 centenários comparados a adultos de
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20 a 70 anos, Schachter e colaboradores (1994) surpreendentemente, acharam que o
genótipo DD predispõe a doença cardiovascular e tem uma freqüência aumentada nos
centenários, sugerindo que os centenários mantiveram a alta atividade enzimática.
DCP1 e obesidade
Muitos componentes do SRA têm sido detectados no tecido adiposo ( ENGELI et al,
1999). O SRA local pode estar envolvido na regulação da fisiologia do tecido adiposo e,
possivelmente, na patofisiologia da obesidade e obesidade associada a hipertensão.
Desde então, tem sido revelado que a angiotensina II (Ang II) aumenta a lipogênese
(JONES et al, 1997) por promover o crescimento e diferenciação dos adipócitos e por
inibir a lipólise ao reduzir o fluxo sanguíneo nos tecidos esquelético e adiposo levando a
um aumento no estoque de gordura em indivíduos com peso normal e obesos
(GOOSSENS et al, 2004), assim como a Ang II aumenta a síntese de lipídeos e das células
adiposas in vitro (JONES et al, 1997).
Levando-se em conta as considerações acima, pode-se supor que níveis aumentados de
Ang II observados em portadores do alelo D com alterações na oxidação de
macronutrientes, possuem um maior estoque de gordura e ganho de peso (KOURLABA et
al, 2008). Portanto, a ativação do SRA no tecido adiposo tem sido implicada na
regulação da adiposidade e
obesidade evidente pela habilidade em aumentar o
crescimento e diferenciação das células gordurosas, aumento da síntese, capacitação e
armazenamento dos ácidos graxos e triglicerídeos (JONES et al, 1997). Embora a
elucidação do mecanismo patofisiológico ainda esteja subentendido no risco associado
com os genes polimórficos do SRA, é razoável assumir que variantes genéticas podem
influenciar de diferentes maneiras na ativação do SRA em níveis sistêmicos. Muitas
células vasculares bem como os adipócitos expressam todos os componentes do SRA,
sendo a Ang II o componente mais efetor neste sistema (THAMEEM et al, 2008).
Assim, a ativação do SRA no tecido adiposo pode representar uma importante ligação
tanto com a obesidade como com a hipertensão, ou seja, variantes do SRA examinados
podem estar associados com a ativaçao do SRA no tecido vascular e adiposo e,
portanto contribuir para alteração da pressão arterial e no índice de massa corporal
(IMC) (THAMEEM et al, 2008). Em particular, um estudo observou que a ingestão
energética total está correlacionada com circunferência da cintura (CC), e a ingestão de
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proteína associada com IMC (marginalmente) apenas dentre os carreadores do alelo D
(e.x. genótipos ID or DD) (KOURLABA et al, 2008).
Relação positiva entre peso corporal, adiposidade e pressão arterial tem sido observada
(GUO et al, 1998) e sugere-se que a gordura corporal está relacionada à pressão arterial
em crianças e que esta diferença é mais pronunciada nos extremos, ou seja, tendo um
risco de 3,5 vezes maior de serem hipertensas aquelas crianças consideradas com
sobrepeso comparadas àquelas com peso adequado. Adicionalmente foi encontrado que
a história familiar de DCV não modificou a relação entre adiposidade e pressão arterial
em crianças (EINENMANN et al, 2005). Corroborando com estes estudos, foi observada
uma considerável variação na pressão arterial em indivíduos com níveis de adiposidade
similares. Isto sugeriu que fatores genéticos podem modular a relação entre adiposidade
e pressão arterial, especialmente nas crianças (CUI et al, 2002).
Estudo realizado com crianças americanas observou que apesar da pressão arterial não
ter alterado de acordo com o genótipo apresentado, a pressão arterial foi adversamente
influenciada nas crianças com sobrepeso carreadoras do alelo D, ou seja, essas crianças
apresentaram níveis pressóricos maiores comparadas às crianças eutróficas carreadoras
do alelo I (EINSENMANN et al, 2009).
A distribuição dos genótipos de DCP1 nos diferentes estudos populacionais pode ter um
importante papel nesses resultados discrepantes, uma vez que acredita-se que o
polimorfismo In/Del DCP1 modifique o efeito da ingestão da energia total e de
macronutrientes na obesidade, revelando que este polimorfismo possa estar relacionado
ao fenótipo obesidade, especialmente para os carreadores do alelo D (KOURLABA et al,
2008). Entretanto, os mecanismos não estão estabelecidos, e ainda existem muitas
controversas nessa avaliação.
Diabetes
Estudo realizado em adultos chineses avaliou o polimorfismo In/Del DCP1 com relação
aos níveis pressóricos e glicêmicos, e não encontrou associação deste polimorfismo com
a pressão arterial; em contrapartida foi observada uma correlação entre o alelo I e
diabetes tipo 2/ intolerância a glicose, além disso, este alelo foi mais encontrado nos
indivíduos que possuíam maiores níveis glicêmicos (THOMAS et al, 2001).
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Similarmente, estudo realizado por Cardoso e colaboradores (2008) determinou a
freqüência do polimorfismo In/Del DCP1 e associação com fatores de risco para
doenças cardiovasculares numa população adulta do Rio de Janeiro. Foi observado que
altos níveis da atividade DCP1 e baixos níveis de HDL colesterol e glicose, foram
associados com o genótipo DD. Finalmente, o genótipo II foi associado com variáveis
relacionadas à intolerância a glicose (CARDOSO et al, 2008). Em concordância com esse
estudo, Thomas e colaboradores (2001) observaram, numa população chinesa, que o
alelo I foi significativamente mais freqüente no grupo que possuía diabetes tipo 2/
intolerância a glicose, e o alelo I foi associado a maiores níveis de glicose plasmática
(THOMAS et al, 2001).
Estudo realizado com adultos hipertensos da Malásia provou uma forte evidência de
associação entre o gene DCP1 e diabetes tipo 2, sugerindo que esse alelo possa ser um
importante marcador genético para diabetes nessa população (RAMACHANDRAN et al,
2008).
Portanto, a maioria dos estudos concordam que o alelo I parece ter uma forte associação
com níveis glicêmicos alterados, podendo ser um importante marcador genético para
detectar precocemente as crianças com maior risco de desenvolver diabetes tipo 2.
Etnia
Há alguns anos vem ocorrendo uma migração e separação das populações ocasionando
uma grande variedade na diversidade genética entre diferentes grupos raciais.
Polimorfismos do SRA têm sido analisados como fatores de risco para doenças
cardiovasculares em diferentes populações com resultados conflitantes. Acredita-se que
polimorfismo In/Del DCP1 tenha uma freqüência diferenciada de acordo com o grupo
étnico da população estudada. A relação entre esse polimorfismo e os níveis séricos de
DCP1 foi descrita em estudo que incluía indivíduos brancos (FANTINI et al, 2000). Na
verdade, este estudo de associação genética demonstrou relação em um grupo racial
requerendo confirmação nos outros grupos. Adicionalmente, está bem estabelecido que
diferenças entre grupos raciais existem no SRA, sendo relatado que os negros
apresentam menor atividade da renina plasmática comparados aos brancos (BLOEM et
al, 1996). Estudo realizado por Bloem e colaboradores (1996) ao avaliar o polimorfismo
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In/Del DCP1 em relação à atividade sérica em crianças saudáveis em dois grupos
raciais observou que em crianças e adolescentes a atividade enzimática estava
relacionada ao polimorfismo em questão somente nas crianças brancas, mas não nas
crianças negras, indicando uma importante variação na regulação genética da atividade
sérica DCP1 e a relação do polimorfismo com a doença cardiovascular (BLOEM et al,
1996).
Adicionalmente, Jeffery e colaboradores (1999) num estudo realizado em africanos
concluiu que o alelo D mostra uma dominância comparada a co-dominância do alelo I.
Revelando que na população africana houve predominância do alelo D, sugerindo ser
esta uma característica genética deste grupo racial. Staessen e colaboradores realizou
um amplo estudo de meta-análise de associação do polimorfismo In/Del DCP1 e
desordens cardiovasculares. Este estudo incluiu dados de 175 trabalhos totalizando uma
amostra de 49.959 indíviduos brancos, negros e asiáticos (STAESSEN et al, 1997).
Comparando os genótipos II com DD, os indivíduos carreadores do genótipo DD
mostraram um risco significativamente maior para doenças cardiovasculares. Quando
analisaram todos os pacientes envolvidos no estudo de meta-análise, o genótipo DD
não estava associado com um risco aumentado da hipertensão arterial. Considerando
que os trabalhos foram significativamente heterogêneos, os autores optaram por
estratificar a amostra em subgrupos mais homogêneos para mais adiante analisar, por
exemplo, brancos, negros e asiáticos, homens, mulheres, jovens (<50 anos) e velhos
(>50 anos). Realizando a análise separadamente, ao comparar com o genótipo II, o
genótipo DD foi associado com um risco significativamente maior de hipertensão,
somente nos pacientes asiáticos e em mulheres.
Outra meta-análise (ZINTZARAS et al, 2008) incluindo 118 estudos envolvendo 43733
indivíduos com doença cardiovascular e 82606 indivíduos controles, observou uma
heterogeneidade dos estudos. Quando comparou alterações cardiovasculares entre os
carreadores dos alelos D e I, o polimorfismo In/Del DCP1 foi associado com 25% de
aumento no risco para doenças cardiovasculares. Análise dos subgrupos para infarto
agudo do miocárdio, diabetes mellitus, sexo masculino, raça branca, asiáticos e turcos
mostraram associação significativa. Não foi encontrada associação entre outros grupos
raciais/étnicos, em mulheres nos casos prematuros, ou em casos com baixos níveis dos
fatores de risco. Este estudo de meta-análise demonstrou uma associação positiva
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modesta entre os variantes polimórficos DCP1 e doenças cardiovasculares (ZINTZARAS
et al, 2008).
Estudo realizado com uma população caucasiana de 18 a 70 anos ao avaliar alguns
polimorfismos do SRA concluiu que, para essa população, o polimorfismo In/Del DCP1
apresentou um sinergismo com outros polimorfismos, e ao associar a fatores de risco
para doenças cardiovasculares, a presença do genótipo DD intensificava o risco
cardiovascular, especialmente nos homens. Neste estudo, foi possível observar que o
polimorfismo DCP1 tem um importante papel na susceptibilidade individual para o
desenvolvimento da DCV, demonstrando que este polimorfismo pode se tornar um
possível marcador genético para doenças cardiovasculares em caucasianos (FREITAS, et
al, 2008).
Um estudo realizado por Pereira e colaboradores (2001) analisou 382 indivíduos de três
subgrupos de uma população urbana altamente heterogênea, sendo um grupo formado
por 150 indivíduos brancos, outro grupo composto por 142 mulatos e finalmente um
grupo constituído por 90 indivíduos negros. Os pesquisadores encontraram uma
diferença significativa na distribuição da estrutura da população para o polimorfismo
In/Del DCP1, sendo maior a frequência do alelo D para os negros, seguidos dos mulatos
e os caucasianos apresentando as menores freqüências observadas (PEREIRA et al, 2009).
Estudo realizado por Dalal e colaboradores (2006) com 268 indivíduos do norte da Índia
com doença cardiovascular e 90 indivíduos controles pareando pela idade, observou que
a freqüência do alelo D foi significativamente maior para os pacientes ao comparar com
indivíduos controles. Portanto, concluiu que a doença cardiovascular no norte da Índia
está fortemente associada com o alelo D do polimorfismo In/Del DCP1 (DALAL et al
2006).
Convencionalmente, fatores ambientais que influenciam na pressão arterial incluem
obesidade, falta de atividade física, alta ingestão de sal e de carboidratos que estão
relacionada ao estilo de vida adulto (WHELTON, 1994). Portanto, cada background
histórico pode promover uma oportunidade em testar
o efeito combinatório entre
polimorfismo genético comum e fatores ambientais. Talvez pelo fato da etiologia da
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hipertensão ser multifatorial, ainda existem muitos estudos controversos (JUN-HYUN,
2005).
Diante disso, propusemo-nos avaliar a correlação de alguns fatores de risco para
doenças cardiovasculares, como pressão arterial, índice de massa corporal, níveis
séricos dos lipídeos, níveis séricos glicêmicos com o polimorfismo DCP1 em escolares
do ensino fundamental do município de Ouro Preto, MG.
- 31 -
3 Objetivos
3.1 Objetivo Geral
O objetivo geral desse trabalho foi avaliar a associação do polimorfismo de
inserção/deleção da enzima dipeptidil-carboxipeptidase I (DCP1) com fatores de risco
(antropométricos, bioquímicos, clínicos) para doenças cardiovasculares em escolares de
6 a 14 anos de idade do município de Ouro Preto, Minas Gerais.
Hipótese 1: O polimorfismo In/Del do gene DCP1, pode estar associado com alterações
da pressão arterial em crianças e adolescentes.
Predição: A atividade do SRA consiste no principal mecanismo de regulação da
pressão arterial e alterações nos componentes deste sistema podem causar hipertensão
arterial primária e secundária. O polimorfismo In/Del de DCP1 está associado com 20 –
50% da variabilidade dos níveis da enzima conversora de angiotensina e alguns estudos
mostram correlação com risco para hipetensão arterial em adultos. É possível que os
efeitos do polimorfismo sobre os níveis pressóricos possam ser observados em fases
precoces da vida antes mesmo de um quadro hipertensivo clinicamente detectável.
Hipótese 2: O polimorfismo In/Del do gene DCP1, pode estar associado com outros
fatores de risco para DCV como obesidade, porcentagem de gordura corporal, lipídios
séricos e glicemia em crianças e adolescentes, como observado em adultos.
Predição: Fatores genéticos interagem com fatores ambientais determinando a
ocorrência de fatores de risco importantes para DCV como obesidade, hipertensão
arterial, dislipidemia e hiperglicemia. O efeito de variantes genéticas podem ser melhor
observados em fases onde os fatores ambientais ainda não exerceram efeito significativo
sobre os fatores de risco acima mencionados.
Hipótese 3: O efeito do polimorfismo In/Del do gene DCP1 associado a maturação
sexual, sexo e fatores de risco para DCV.
Predição: O dismorfismo sexual e o efeito da idade observado na epidemiologia da
hipertensão arterial e DCV em adultos pode ocorrer em função de diferenças observadas
na produção de hormônios esteróides sexuais. Desta maneira, a puberdade pode
modular diferentemente as associações entre o polimorfismo e as variáveis estudadas.
- 32 -
3.2 Objetivos específicos
3.2.1- Determinar a freqüência alélica e genotípica do polimorfismo In/Del do gene
DPC1 na população;
3.2.2- Avaliar a associação entre o polimorfismo mencionado e variáveis
antropométricas, bioquímicas e clínicas na população, utilizando diferentes modelos
genéticos: dominante, recessivo e co-dominante;
3.2.3- Avaliar o efeito do sexo e do estádio de maturação sexual sobre as associações
observadas.
- 33 -
4 Material e Métodos
4.1 Área do estudo
A área do estudo foi a sede do Município de Ouro Preto, Minas Gerais, situado a 98Km
da região metropolitana de Belo Horizonte, no quilômetro 40 da Rodovia dos
Inconfidentes. A cidade de Ouro Preto apresenta uma população de aproximadamente
9.730 crianças e adolescentes na faixa etária de 6-14 anos matriculadas em escolas
públicas e privadas (INEP, 2003). A escolha da área se deveu ao fato de já ter sido
realizado um estudo para identificar os fatores de risco prevalentes na população de
adolescentes e adultos de Ouro Preto, tendo sido observado prevalência de hipertensão
arterial acima do esperado em adolescentes.
4.2 População e amostra do estudo
Foi utilizada a mesma população amostrada no projeto “Estudo dos fatores de risco para
as doenças cardiovasculares na população do ensino fundamental de Ouro Preto MG”.
O referido estudo foi realizado nas escolas do ensino fundamental da área urbana da
cidade de Ouro Preto com crianças e adolescentes de 6 a 14 anos de idade. Foram
excluídas as crianças e adolescentes das Associações de Pais e Amigos dos Alunos
Excepcionais (APAE).
Em um universo de 6587 estudantes matriculados no ensino fundamental na cidade de
Ouro Preto, foram selecionadas 850 crianças e adolescentes. O cálculo da amostra foi
baseado em três parâmetros:
(1) Proporção da população, na faixa etária estudada, com sobrepeso e obesidade
(8%);
(2) Precisão desejada de 2%;
(3) 20% de perdas, devido à ausência de crianças no dia da coleta de dados ou às
recusas (não consentimento da criança, dos pais ou responsável).
- 34 -
4.3 Delineamento do estudo
Foi realizado um estudo epidemiológico de delineamento transversal descritivo para a
avaliar a associação dos fatores de risco para a doença cardiovascular e o polimorfismo
In/Del do gene DCP1.
O processo amostral utilizado foi o aleatório simples estratificado pela proporção de
alunos matriculados em cada escola.
Inicialmente foi calculada a frequência relativa de alunos de cada escola (municipal,
estadual, particular) na população total de escolares a partir do levantamento dos
Diários de Classe das 12 escolas municipais, 4 estaduais e 2 particulares.
Posteriormente, foi calculada a proporção de meninos e meninas em cada escola na
faixa etária de 6 a 14 anos. Utilizando o programa EPI-INFO e respeitando a
proporcionalidade por escola, série, sexo e idade foram elaborados uma tabela de
número aleatórios na qual os estudantes de cada classe foram numerados em ordem
crescente para identificação das crianças a serem convidadas a participar do estudo. No
caso de recusa ou transferência para outra instituição ou cidade, foi convidada a
participar do projeto a próxima criança do mesmo sexo e idade constante do Diário de
Classe.
Após autorização da diretora da escola, uma carta convite citando os objetivos e
procedimentos do trabalho foi encaminhada aos responsáveis pelas crianças. Na carta
foram informadas a data e local (na própria escola) onde seriam realizados os exames
antropométricos, bioquímicos, clínico-cardiológico, assim como a entrevista com os
responsáveis para avaliar hábitos comportamentais, inclusive os alimentares e a
atividade física.
Todos os exames bioquímicos foram realizados no Laboratório Piloto de Análises
Clínicas (LAPAC) da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto
(credenciado pela Sociedade Brasileira de Análises Clínicas).
Após entrega dos laudos aos responsáveis, e feito o encaminhamento ao Sistema Único
de Saúde (SUS) do município de Ouro Preto (nutricionista, pediatra ou cardiologista)
das crianças com alterações clínicas, foram proferidas reuniões-palestras enfocando um
- 35 -
programa de prevenção primária voltadas para os escolares e seus responsáveis,
respeitando as características de cada faixa etária.
4.4 Consentimento
Aos responsáveis legais e diretores do estabelecimento de ensino, depois de informados
sobre os objetivos da pesquisa, o protocolo e os procedimentos a serem realizados, bem
como os riscos e benefícios da participação no estudo, foram entregues folhas de
informações impressas e solicitada a assinatura de Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (ANEXO 1). Das instituições escolhidas obteve-se a autorização dos
diretores e foram estabelecidas formas adequadas de abordagem das crianças de
maneira a não comprometer o andamento e rotina das atividades escolares.
4.5 Instrumentos de coleta de dados
4.5.1 Amostras biológicas e determinações bioquímicas
As amostras de sangue foram coletadas por punção venosa na região anticubital dos
pacientes após período mínimo de 12 horas de jejum. Foram coletados três tubos com
sangue, sendo um tubo contendo 2 ml de sangue com EDTA para realização do
hemograma e extração de DNA, um tubo com 2 mL com fluoreto para realização de
glicemia, e um tubo de 6 mL para obtenção de soro. Após obtenção do soro, este foi
fracionado em três alíquotas devidamente codificadas e acondicionadas em tubo âmbar
a -200C.
As dosagens bioquímicas para colesterol total, lipoproteína de alta densidade (HDL),
triglicerídeos e glicose em jejum foram conduzidas pelo método enzimático
colorimétrico, conforme especificado pelo representante Diagnóstica In vitro S/A,
Itabira, MG, Brasil e adaptados ao analisador automático Airone 200 (Instrumento
Crony, Roma, Itália). O cálculo da concentração da lipoproteína de baixa densidade
(LDL) foi conduzido segundo a equação de Friedwald (1972).
Os procedimentos como recompilação das amostras, métodos de calibragem, métodos
analíticos, controle de qualidade interna e externa, codificação dos escolares em jejum
ou não; foram normatizados no Laboratório Piloto de Análises Clínicas (LAPAC)
(credenciado pela Sociedade Brasileira de Análises Clínicas) da Escola de Farmácia da
- 36 -
Universidade Federal de Ouro Preto, a fim de uniformizá-los durante o período de
execução do estudo.
4.5.2 Aferição da pressão arterial
A aferição da pressão arterial foi realizada nas escolas durante o processo de coleta dos
dados. Os valores de pressão arterial foram obtidos como uma média de três
mensurações alternadas utilizando-se o aparelho oscilométrico digital (ONROM
705CP). Para tanto o indivíduo permaneceu sentado e com o braço esquerdo estendido
na altura do coração. Nos casos em que se verificaram níveis pressóricos alterados, foi
conduzida uma nova mensuração em data posterior para confirmação dos valores.
Portanto, para esses casos, foram realizadas duas medições em ocasiões diferentes,
conforme sugerido pela Sociedade Brasileira de Cardiologia, 2006.
4.5.3 Variáveis antropométricas
4.5.3.1 Peso
O peso foi aferido em balança com bioimpedância TANITA (BF 542®), com capacidade
máxima de 136 Kg. Após cada medição, a balança foi calibrada para que os
participantes fossem pesados em pé, portando roupas leves e sem calçados ou objetos de
metal.
4.5.3.2 Altura
A estatura foi aferida por meio do estadiômetro de campo (WCS, Cardiomed, Curitiba,
Brasil), com escala em centímetros e precisão de um milímetro, Para tanto o individuo
foi encostado no aparelho estando de costas para o marcador, com os pés unidos, em
posição ereta, olhando para frente, sendo que a leitura foi feita no milímetro mais
próximo quando o esquadro móvel, que acompanha a haste vertical, encostava-se à
cabeça do indivíduo.
4.5.3.3 Pregas cutâneas
A espessura da prega triciptal foi medida no ponto médio da distância entre o acrômio e
o olécrano, na face posterior do braço esquerdo. A espessura da prega subescapular foi
medida no ângulo inferior da escápula, em diagonal a 45°. A espessura da prega cutânea
bicipital foi feita com os cotovelos fletidos em 90°, meio caminho entre a axila e a fossa
cubital. A medida da prega supra-ilíaca foi feita sobre a linha média axilar, entre a
última costela e a crista ilíaca. Todas as medidas das pregas mencionadas foram
- 37 -
realizadas com adipômetro (Cescorf®) com uma precisão de 0,1 mm, conduzidas em
triplicata, utilizando-se para análise dos dados a média dos dois valores mais próximos.
4.5.3.4 Percentual de gordura corporal
O percentual de gordura corporal foi estimado pelas medidas das pregas cutâneas
utilizando como referência as fórmulas de Deurenberg (1990) e com o aparelho de
impedância bioelétrica tetrapolar (Quantum II, RJL System). Para as dobras cutâneas
foram utilizadas a espessura das pregas triciptal, biciptal, suprailíaca e subescapular,
considerando-se os estádios de maturação sexual. Na impedância bioelétrica estimou-se
o percentual de gordura corporal através da resistência e da reactância em relação de
acordo com a idade.
4.5.3.5 Maturação sexual
Quando se pretende avaliar o crescimento físico envolvendo estado nutricional na
adolescência, além do peso e da estatura, deve-se considerar a maturação sexual, uma
vez que o estádio de maturação sexual, evidenciado pelo desenvolvimento dos
caracteres sexuais secundários, influencia o desenvolvimento pondero-estatural.
Portanto, a maturação sexual é um parâmetro fundamental nas estimativas de
crescimento físico na adolescência. Para situar em que fase da maturação sexual o
indivíduo se encontra, segue-se o critério de Tanner (TANNER, 1962). Através da
visualização de pranchas com figuras correspondentes aos estádios de maturação
(mamas e pêlos pubianos no sexo feminino e genitália externa e pêlos pubianos no sexo
masculino) é possível que o próprio adolescente identifique o estádio em que se
encontra. (ANEXO 3)
4.6 Extração do DNA
A obtenção de DNA genômico foi realizada no Laboratório de Epidemiologia
Molecular/Escola de Nutrição/Universidade Federal de Ouro Preto segundo técnica
descrita por Madisen e colaboradores (1987) com adaptações.
Foi transferido aproximadamente 2 ml de papa de células de sangue para tubos de
fundo cônico com capacidade para 15 mL (FalconTM, BD Biosciences) devidamente
etiquetados. Nestes, foram adicionados aos tubos 10 ml de solução TRIS:NH4Cl ( 0,017
M Tris-HCl pH 7,65: NH4Cl 0,14M)
- 38 -
previamente aquecida à 37°C por
aproximadamente 5 minutos. As misturas sofreram uma homogeneização lenta e
contínua, e posteriormente foram incubadas a 37°C por 5 minutos. Após o período de
incubação as amostras foram submetidas à centrifugação a 14 000 x g durante 10
minutos (CentriBio Modelo 80-2B). O sobrenadante foi descartado por aspiração em
solução de hipoclorito a 5%, enquanto o sedimento de células foi mais uma vez lavado
com solução de Tris-HCl : NH4Cl. Ao precipitado foram adicionados 10 ml de solução
salina 0,85%, homogeneizado e centrifugado a 14000 x g durante 10 minutos. Depois
de aspirado e descartado o sobrenadante, adicionou-se ao precipitado 1,5 ml de High TE
(Tris HCl pH 8 0,1M; EDTA 0,04M pH 8), ressuspendendo-se fortemente o sedimento
de células. Posteriormente, foi acrescentado 2 ml de mistura de Lise de Madissen (Tris
HCl pH 8 0,1 M; EDTA 0,04 M pH 8; SDS 0,2%; NaCl 1M pH 8) pré-aquecida a 50°C
com seringa descartável e agulha de calibre grosso. O tubo foi agitado em vórtex,
adicionou-se 50µL de solução de proteinase K (20 mg/mL) e incubou-se a 37°C durante
aproximadamente 12 horas (overnight).
Na etapa posterior, acrescentou-se a cada tubo 4 mL de fenol saturado com TRIS e
homogeneizou-se lenta e continuamente durante 20 minutos com centrifugação
posterior a 14 000 x g durante 5 minutos. Na etapa seguinte, o sobrenadante contendo
DNA foi aspirado e transferido para novo tubo ao qual foi adicionado 4 ml de
clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) à temperatura ambiente; homogeneizando por mais
20 minutos. Posteriormente centrifugou-se a 14 000 x g por 5 minutos, aspirou-se o
sobrenadante que foi transferido para um novo tubo; foi adicionado 400 µL de acetato
de amônio (1M), 4,5 mL de álcool isopropílico gelado homogeneizando lentamente até
a precipitação do DNA.
Finalmente, o DNA foi transferido para microtubo contendo 300 µL de Low TE (Tris
HCl 10 mM, pH 8; EDTA 1 mM, pH 8). O tubo foi colocado em estufa a 50°C por 2
horas; incubados a 37°C overnight, e posteriormente estocados a 4°C.
4.7 Avaliação e quantificação do DNA em espectofotômetro
A concentração de uma solução de DNA pode ser precisamente medida por
espectrofotometria de absorbância de ultravioleta (UV). A quantidade de radiação UV
absorvida pela solução de DNA é diretamente proporcional à quantidade de DNA na
amostra. A absorbância é medida a 260 nm e, nesse comprimento de onda, uma
- 39 -
absorbância (A260) de 1,0 corresponde a 50 µg de DNA de fita dupla por mL de
solução (GLASEL, 1995; STULNING et al, 1994).
Para avaliar a quantidade de DNA presente nas amostras de DNA extraídas de sangue
periférico foi utilizada uma solução 25 vezes diluída de DNA lidas no espectofotômetro
(FEMTO 700S) a 280 nm e a 260 nm. Foram realizadas leituras em triplicatas a 260 nm
e uma leitura a 280 nm. A partir desses valores foi obtida a concentração de DNA para
cada amostra, multiplicando a média dos valores encontrados a 260 nm pelo fator de
diluição (25) e por 50 (corresponde a 50µg de DNA cada A260), como na fórmula
abaixo:
[ DNA] = média A260 x 50 x fator de diluição (FD)
Além disso, a absorbância de ultravioleta pode ser utilizada para verificação da pureza
de uma preparação de DNA. Uma amostra sem contaminação deve apresentar uma
razão da absorbância a 260 nm e 280 nm (A260/A280) ao redor de 1,8. Valores
menores que 1,8 indicam que a preparação está contaminada com proteína ou fenol
(GLASEL, 1995; STULNING et al, 1994). Após essa quantificação e a avaliação da
qualidade das amostras, estas foram diluídas de tal forma que as amostras de trabalho
(work solution) apresentassem uma concentração final de 20 ng/µl para serem utilizadas
na reação em cadeia da polimerase (PCR).
4.8 Genotipagem do polimorfismo In/Del de DCP1
4.8.1- Reação em cadeia da polimerase para o polimorfismo In/Del do gene DCP1
O polimorfismo de inserção/deleção do gene da DCP1 foi detectado pela presença
(alelo I de inserção) ou ausência (alelo D de deleção) do fragmento correspondente a
287 bp no intron 16 do gene da enzima conversora da angiotensina I localizado no
cromossomo 17 com a técnica da reação em cadeia da polimerase como descrito por
Rigat e colaboradores (1992) e modificado no laboratório de Epidemiologia
Molecular/ENUT/UFOP.
Para genotipagem deste polimorfismo foram realizadas duas amplicações. Na primeira
amplificação realizada, utilizamos os seguintes iniciadores (Alfa DNA, Montreal,
Canadá):
- 40 -
DCP1F- 5’ CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT
DCP1R- 5’ GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT
A mistura da reação, em volume final de 25µl, foi composta por: aproximadamente 200
ng de DNA genômico, tampão fornecido com a enzima (Invitrogen ou Promega),
250µM de dNTPs; 3 mM de MgCl2, 0,1 pmoles de cada iniciadores, 10% de BSA
(soroalbumina bovina), 1U de Taq DNA polimerase (Invitrogen ou Promega) e água
altamente purificada para completar o volume final da reação. Em cada experimento foi
adicionado um controle negativo o qual não continha DNA molde, mas um volume
correspondente de água e um controle positivo com genótipo conhecido (heterozigotoID).
A amplificação foi realizada em termocicladores MJ96/MJ966 (Biosystems, Peltier
Cycler) e Techine Modelo FPRO G054 (Progene) conforme o seguinte programa: uma
desnaturação inicial a 95°C por 10 minutos seguidos de 35 ciclos de desnaturação a
95°C por 1 minuto e trinta segundos; anelamento a 52°C por um minuto e vinte
segundos e extensão a 72°C por um minuto e vinte segundos. Foi realizada uma
extensão final a 72°C por 5 minutos.
Os produtos da PCR foram visualizados em gel de poliacrilamida a 6% por meio de
corrida eletroforética, ao qual foi aplicado 5µL de produto de PCR em tampão TBE 1X,
a 100 V, por aproximadamente 2 horas. Posteriormente, cada gel foi revelado por nitrato
de prata para verificação e análise do material amplificado, seguindo-se uma adaptação
do método descrito por Saguinetti et al (1994) que consiste na imersão de cada gel em
uma série de soluções específicas, numa ordem definida (Quadro 4.1). Após o término
do processo, os géis foram fotografados e devidamente armazenados. Os dois
fragmentos esperados tinham aproximadamente 190 pb para alelo D e 490 pb para alelo
I.
- 41 -
Quadro 4.1- Seqüência das soluções utilizadas para corar os géis de poliacrilamida
seguindo-se uma adaptação do método descrito por Saguinetti et al (1994)
Soluções
Tempo Regular
Solução Fixadora
5 minutos
(etanol 10%, ácido acético glacial 0,5%
(v/v))
Solução de nitrato de prata
10 minutos
(50 mL de solução fixadora, 0,15 g de
nitrato de prata e 100 mL de água
destilada e deionizada.)
Água destilada
2 lavagens
Solução reveladora
o suficiente
(hidróxido
de
sódio
3%
(p/v),
formaldeído 0,3% (v/v))
4.8.2 Reação em cadeia da polimerase para o polimorfismo In/Del do gene DCP1
para as amostras consideradas homozigotas para deleção
Um dos artefatos da técnica de PCR é a amplificação preferencial do alelo menor
(SASSE et al, 2006), portanto todas as amostras homozigotas para deleção foram
reanalisadas por uma segunda amplificação independente com um iniciador desenhado
para a sequência de inserção, produzindo um fragmento de tamanho mais similar ao
fragmento produzido pela deleção. Após esta segunda amplificação obtivemos a
confirmação dos genótipos para este polimorfismo.
Nesta segunda amplificação o produto final esperado apresentava de 136 pb e foi
utilizado o iniciador DCP1F 5’ CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT (Alfa DNA,
Montreal, Canadá) usado anteriormente, com o iniciador específico para a sequência de
inserção: DCP1INR- 5’ TTGCAG TGAGCCGAGATCC (Invitrogen, Brasil).
A reação foi realizada em volume final de 25µl , com aproximadamente 200 ng de
DNA genômico, tampão da enzima (Invitrogen ou Promega), 250µM de dNTPs, 3 mM
de MgCl2, 0,1 pmoles de cada iniciador (DCP1F e DCP1INR), 10% de BSA
(soroalbumina bovina), 1U de Taq DNA polimerase (Invitrogen ou Promega) e água
- 42 -
altamente purificada para completar o volume final da reação. Da mesma forma como
descrito anteriormente em cada experimento foi incluído um controle negativo (sem
DNA genômico) e um controle positivo heterozigoto (ID).
A amplificação ocorreu por uma desnaturação inicial a 95°C por 10 minutos seguidos
por 35 ciclos de desnaturação a 95°C por 1 minuto e trinta segundos; anelamento a 55°C
por um minuto e vinte segundos e extensão a 72°C por um minuto e vinte segundos de 1
ciclo de anelamento a 55°C por 1 minuto e extensão final a 72°C por 5 minutos.
Ao realizar essa amplificação foi possível visualizar em gel de poliacrilamida a 6% um
fragmento de aproximadamente 136 pb para os alelos de inserção. Em todos os géis
foram aplicados um controle positivo (ID) considerado heterozigoto a fim de assegurar
o resultado da reação e confirmar as amostras amplificadas com o iniciador de inserção.
Os géis foram corados pela prata para verificação e análise do material amplificado
como descrito acima. Todos os géis foram fotografados e devidamente arquivados. A
análise dos géis foi realizada por também outro pesquisador, para garantir a certeza dos
resultados.
4.9 Processamento e Análise dos dados
4.9.1 Banco de dados e análises estatísticas
O banco de dados contendo todas as informações dos questionários de identificação,
antropometria, dados bioquímicos, clínicos e genéticos foram digitados e analisados no
software SPSS (Software Package Statitical System)14.0 for Windows.
Foi realizada contagem gênica para determinar a distribuição alélica e genotípica do
polimorfismo In/Del DCP1 na população de escolares. Realizou-se o teste qui-quadrado
para avaliar se a freqüência genotípica observada estava de acordo com a freqüência
esperada pelo Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Adicionalmente, foi realizada o teste
kappa para analisar a concordância entre 2 observadores utilizando duplicata de
aproximadamente 10% das amostras escolhidas aleatoriamente.
Valores médios de variáveis contínuas foram comparados entre os grupos formados
pelos diferentes genótipos por análises de variância (ANOVA). Esta comparação foi
realizada utilizando-se três diferentes modelos genéticos: co-dominante, recessivo e
- 43 -
dominante. No modelo co-dominante os indivíduos foram separados em três grupos de
genótipos: homozigotos para deleção (DD), homozigotos para inserção (II) e
heterozigotos (ID). No modelo recessivo, os homozigotos para o alelo D foram
comparados ao um grupo formado pelos heterozigotos e homozitos para o alelo I (DD
vs ID+II); enquanto que no modelo dominante os indivíduoas carreadores do alelo D
compuseram um único grupo que foi comparado aos homozigotos II (DD+ID vs II).
Teste do qui-quadrado foi utilizado para comparar o estádio de maturação de acordo
com as freqüências dos genótipos na população geral e separada por sexo. As mesmas
análises acima descritas foram realizadas separadamente para meninos e meninas e após
categorizar a amostra de acordo conforme o estádio de maturação sexual. Quando as
variáveis
quantitativas
contínuas
não
apresentavam
distribuição
normal
ou
homogeinidade das variâncias, foi utilizado o teste Kruskal Wallis. Os resultados foram
apresentados como posição média das observações. Para todos os testes foi utilizado
como nível de significância estatística valor de P<0,05.
4.10 Comitê de ética
Os protocolos para os projetos “Associações entre polimorfismos e fatores de
risco modificáveis para doenças cardiovasculares em crianças e adolescentes do
município de Ouro Preto, MG” e “Estudo de fatores de risco para doenças
cardiovasculares na população do ensino fundamental de Ouro Preto, MG” foram
avaliados e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de
Ouro Preto (Pareceres n°2005/59 e n0 2004/46, ANEXOS 3 e 4).
- 44 -
5 Resultados
A tabela 5.1 apresenta a frequência alélica e genotípica encontrada na população geral e
separada por sexo. A frequência do alelo D foi de 57,4% nos escolares, ao estratificar
por sexo observou uma frequência deste alelo de 51,4% nas meninas e 48,6% nos
meninos. O alelo I apresentou freqüência na população geral de 42,6%, e ao estratificar
por sexo, a frequência foi de 52% e 48% para meninas e meninos, respectivamente.
Ao avaliar a freqüência genotípica nesta população foram constados 32,3%; 50,2% e
17,5% para os genótipos DD, ID e II, respectivamente na população geral. Ao
estratificar por sexo, as meninas apresentaram freqüências genotípicas de 50,8%, 52,1%
e 51,9% para DD, ID e II, respectivamente, já os meninos as freqüências foram de
49,2% de homozigotos para deleção (DD), 47,9% de heterozigotos (ID) e 48,1% de
homozigotos para inserção (II). Não foram encontradas diferenças estatisticamente
significantes nas distribuições das frequência alélicas (P=0,81) e genotípicas (P=0,95)
entre os sexos. A freqüência observada dos genótipos estava de acordo com a freqüência
esperada demonstrando que este polimorfismo está em equilíbrio de Hardy-Weinberg
nesta população (P= 0,46).
A genotipagem do polimorfismo In/Del DCP1 foi realizada para 773 crianças utilizando
a técnica de PCR descrita por Rigat e colaborados (1992). Na primeira amplificação os
indivíduos homozigotos para deleção (DD) apresentaram um fragmento de
aproximadamente 190 pb (canaletas 2 e 4 da figura 2); os indivíduos homozigotos para
inserção (II) apresentavam um único fragmento de aproximadamente 490 pb (canaleta 6
da figura 5), enquanto os indivíduos heterozigotos (ID) apresentavam os dois
fragmentos: um fragmento de 190 pb e outro fragmento de 490 pb (canaletas 7 e 8 da
figura 2).
Todos os indivíduos homozigotos para deleção (DD), ou 287 crianças, tiveram sua
tipagem confirmada por uma segunda amplificação conforme Sasse e colaboradores
(2006). Nesta amplificação os indivíduos que não apresentaram o fragmento de 136 pb
foram identificados como verdadeiros homozigotos para deleção, ou seja, 250 crianças.
Por outro lado, aqueles que apresentaram o fragmento de 136 pb foram identificados
como heterozigotos (ID) o que correspondeu a 37 crianças. Em todos os géis foi
- 45 -
utilizado um controle positivo (ID). Esses resultados podem ser visualizados na figura 5
que mostra um gel de poliacrilamida 6% corado pelo nitrato de prata.
Na tipagem baseada no mesmo gel, mas interpretada por dois observadores diferentes,
foi observado um valor de Kappa igual a um, ou seja, houve 100% de concordância
entre os observadores. Quando um experimento independente foi realizado para repetir
a genotipagem de 102 amostras, houve discrepância de apenas 1,7%, resultando em um
valor de Kappa igual a 0,98 indicando que a técnica usada para tipagem deste
polimorfismo apresenta boa concordância.
- 46 -
Tabela 5.1 Frequência alélica e genotípica do polimorfismo In/Del do gene DCP1
em escolares do município de Ouro Preto, Minas Gerais.
Todos*
Meninos
Alelos†
Meninas
%
D
57,4
48,6
51,4
I
42,6
48,0
52,0
Genótipos‡
n (%)
DD
250
(32,3)
123
(32,9)
127
(31,8)
ID
388
(50,2)
186
(49,7)
202
(50,7)
II
135
(17,5)
65
(17,4)
70
(17,5)
Total
773
(100)
374
(100)
399
(100)
*χ2=0,55; P=0,46, para diferenças entre as frequências observadas e esperadas dos
genótipos.
†
‡
P= 0,81 para distribuição alélica entre meninos e meninas (qui-quadrado de Pearson).
P= 0,95 para frequência genotípica entre meninos e meninas (qui-quadrado de
Pearson).
- 47 -
Figura 2- Representação dos possíveis genótipos para o polimorfismo In/Del do gene da enzima
conversora de angiotensina (DCP1). Foram realizadas reações de PCR conforme descrito em Métodos,
utilizando DNA genômico e iniciadores que amplificam fragmentos de 490 pb para o alelo de inserção (I)
e de 190 para o alelo de deleção (D). Um terceiro iniciador específico para a sequência de inserção foi
utilizado para amplificar, em uma PCR independente, as amostras homozigotas D, produzindo fragmento
de 136 pb. Os produtos da PCR foram resolvidos em gel de poliacrilamida a 6% corado por nitrato de
prata. Canaleta 1: padrão peso molecular 25 pb ladder; Canaleta 2: amostra A, homozigota D (fragmento
de 190 pb na 1ª reação); Canaleta 3: amostra A, heterozigota DI (fragmento de 136 pb na reação com
iniciador específico para a inserção); Canaleta 4: amostra B, homozigota D (fragmento de 190 pb na 1ª
reação); Canaleta 5: amostra B, homozigota D (não apresentou amplificação com iniciador para inserção);
Canaleta 6: amostra C homozigota I; Canaleta 7: heterozigota ID; Canaleta 8: controle positivo ID;
Canaleta 9: controle negativo (sem DNA genômico).
- 48 -
Ao realizar a segunda amplificação das amostras DD utilizando o iniciador que
detectaria um fragmento de 136 pb correspondente a inserção, 13% das crianças
anteriormente consideradas homozigotos para deleção foram genotipadas como
heterozigotas, ou seja, de um total de 287 homozigotos para deleção 37 crianças foram
consideradas heterozigotas.
Sequencialmente, os genótipos foram separados em grupos para realizar as análises
posteriores: homozigoto DD; heterozigoto ID e homozigoto II, na população geral e
separada por sexo. As análises foram também realizadas utilizando um modelo
recessivo, no qual se comparou o genótipo DD com os genótipos II e ID agrupados,
uma vez que, de acordo com dados da literatura (EISENMANN et al, 2009), o genótipo
DD estava associado com risco aumentado para hipertensão e obesidade; e um modelo
dominante que comparou os genótipos DD e ID agrupados com o genótipo II.
- 49 -
A tabela 5.2 apresenta os valores obtidos pela análise de variância (ANOVA) com as
variáveis contínuas: idade, altura, peso, índice de massa corporal (IMC), circunferência
da cintura (CC), porcentagem de gordura corporal, pressão arterial sistólica (PAS), e
pressão arterial diastólica (PAD), colesterol total, colesterol LDL (LDL-c), colesterol
HDL (HDL-c), triglicerídeos, glicose e hemoglobina, de acordo com o genótipo para a
população geral.
Para essa população, as variáveis % GC, PAD e os níveis séricos de HDL-c, que não
apresentavam distribuição normal ou homogeneidade das variâncias, foram submetidas
ao teste Kruskal-Wallis.
- 50 -
Tabela 5.2 Média e desvio-padrão dos fatores de risco selecionados para DCV em
escolares de acordo com o polimorfismo In/Del do gene DCP1.
DD
ID
II
n=250
n=388
n=135
P*
Idade (anos)
10,6 (2,4)
10,4 (2,4) ‡
10,9 (2,6) ‡
0,11
Altura (cm)
141,9 (14,9)
142,0 (15,1)
144,4 (15,4)
0,24
Peso (Kg)
37,8 (12,6)
37,6 (14,0)
39,2 (13,7)
0,50
IMC (Kg/m2)
18,2 (3,3)
18,0 (3,7)
18,2 (3,3)
0,72
CC (cm)
62,7 (9,0)
62,8 (10,0)
63,6 (9,5)
0,62
% GC- Nhanes III
19,9 (8,1)
19,0 (10,5)
19,3 (9,0)
0,43†
%GC Tanita
23,1 (8,4)
22,9 (9,6)
22,3 (9,1)
0,70
PAS (mmHg)
99,8 (11,9)
100,4 (12,5)
98,7 (12,4)
0,37
PAD (mmHg)
61,2 (8,0)
62,1 (8,6)
62,8 (9,8)
0,32†
Colesterol total (mg/dl)
161,8 (32,7)
158,1 (28,0)
157,8 (29,4)
0,26
LDL-c (mg/dl)
87,7 (33,0)
85,4 (28,9)
84,9 (28,1)
0,58
HDL-c (mg/dl)
58,9 (14,3)
58,1 (14,3)
58,7 (12,2)
0,60†
TG (mg/dl)
75,8 (49,4)
76,7 (48,0)
71,7 (33,4)
0,56
Glicemia (mg/dl)
83,6 (8,1) ‡
82,5 (7,9)
81,8 (8,2) ‡
0,09
Hemoglobina (g/dl)
13,2 (1,2)
13,2 (1,1)
13,2 (1,2)
0,91
Variável
Abreviações: IMC, índice de massa corporal; CC, circunferência da cintura; %GC,
porcentagem de gordura corporal; PAS, pressão arterial sistólica; PAD, pressão arterial
diastólica; LDL-c, colesterol LDL; HDL-c, colesterol HDL; TG, triglicerídeos.
* Valor de P para teste ANOVA entre os grupos de genótipos : DD, ID e II.
†
‡
Valor de P para teste Kruskall-Wallis para variáveis heterogêneas.
P=0,04.
- 51 -
A Tabela 5.3 apresenta os valores obtidos pela análise de variância (ANOVA) estratificada
por sexo. A maioria das variáveis quantitativas contínuas analisadas para o grupo das
meninas seguiu uma distribuição normal, com exceção da gordura corporal e os níveis de
HDL-c que apresentaram heterogeneidade das variâncias e foram, portanto submetidas
posteriormente ao teste Kruskal-Wallis. Não foi observada nenhuma diferença significativa
para as variáveis analisadas entre os diferentes genótipos no grupo das meninas.
Ao avaliarmos o grupo dos meninos, todas as variáveis quantitativas contínuas seguiram
uma distribuição normal. Ao realizarmos comparações entre cada grupo de genótipo, foram
encontradas diferenças significativas. Os meninos DD possuíam tanto %GC Nhanes III
(18,6%) e %GC Tanita (19,0%) como os níveis glicêmicos médios (84,8 mg/dl)
estatisticamente maiores em relação aos meninos ID (16,6%, 17,3% e 82,7 mg/dl,
respectivamente). Adicionalmente, ao avaliarmos a PAD, observamos que os meninos DD
tinham valores inferiores (60,5 mmHg) quando comparados aos meninos ID (61,6 mm Hg)
seguido dos II (63,2 mm Hg),
Ao realizar a análise de variância das médias para o modelo recessivo (DD vs II +ID) e para
o modelo dominante (DD+ID vs II ) na população geral e separado por sexo, observou-se
que não houve nenhuma diferença entre os genótipos do modelo dominante (dados não
mostrados). Em contrapartida, ao considerar a população geral, no modelo recessivo,
observou-se que os níveis glicêmicos tinham valores superiores para as crianças DD (83,6
mg/dl) comparadas as crianças II e ID (82,3 mg/dl). Ao estratificar o modelo recessivo por
sexo, não foi observada nenhuma associação significativa para as variáveis contínuas
analisadas e os grupos de genótipos entre as meninas. Ao avaliar o grupo dos meninos,
todas as variáveis quantitativas contínuas seguiram uma distribuição normal, e foram
observadas algumas diferenças significativas dentro do grupo dos genótipos. Assim, os
resultados observados utilizando o modelo recessivo não apresentaram diferença
substancial dos observados no modelo co-dominante.
- 52 -
Tabela 5.3 Média e desvio padrão dos fatores de risco selecionados para DCV em escolares separados por sexo de acordo com o
polimorfismo In/Del do gene DCP1.
Meninos
Meninas
DD
ID
II
DD
ID
II
n=123
n=186
n=65
P*
n=127
n=202
n=70
P*
Idade (anos)
10,5 (2,4)
10,5 (2,4)
11,1 (2,7)
0,21
10,7 (2,5)
10,3 (2,4)
10,6 (2,5)
0,26
Altura (cm)
141,5 (14,9)
142,1 (15,1)
145,3 (15,8)
0,24
142,3 (14,9)
141,9 (15,1)
143,5 (15,2)
0,74
Peso (Kg)
37,5 (13,2)
36,5 (12,9)
39,0 (13,0)
0,41
38,0 (12,1)
38,6 (14,9)
39,3 (14,4)
0,82
IMC (kg/m2)
18,2 (3,4)
17,5 (3,1)
18,0 (2,7)
0,15
18,3 (3,1)
18,5 (4,1)
18,4 (3,8)
0,87
CC (cm)
63,2 (8,8)
62,0 (8,9)
63,5 (8,1)
0,38
62,2 (8,1)
63,4 (10,8)
63,8 (10,7)
0,45
%GC Nhanes III
18,6 (6,4) ‡
16,6 (9,1)‡
17,8 (6,1)
0,08
21,1 (9,4)
21,1 (11,1)
20,6 (10,9)
0,62†
%GC Tanita
19,0 (8,0) §
17,3 (7,2)§
17,2 (6,7)
0,11
27,0 (6,8)
28,0 (8,7)
27,0 (8,6)
0,48
PAS (mmHg)
101,4 (12,0)
102,0 (11,9)
99,9 (11,8)
0,50
98,2 (11,7)
99,0 (13,0)
97,5 (12,9)
0,68
PAD (mmHg)
60,5 (7,3) ‡
61,6 (8,0)‡
63,2 (8,7) ‡
0,08
61,9 (8,7)
62,6 (9,0)
62,4 (10,7)
0,82
Colesterol total (mg/dl)
157,6 (27,7)
154,5 (27,1)
156,8 (30,0)
0,59
165,8 (36,6)
161,5 (28,4)
158,7 (29,1)
0,27
LDL-c (mg/dl)
83,78 (26,7)
83,6 (27,6)
83,9 (27,6)
0,99
91,5 (37,9)
87,2 (30,0)
85,9 (28,7)
0,39
HDL–c (mg/dl)
59,30 (13,54)
57,6 (13,8)
58,8 (11,9)
0,52
58,6 (15,0)
58,5 (14,8)
58,6 (12,6)
0,90†
TG (mg/dl)
73,13 (34,8)
69,3 (32,4)
70,9 (34,6)
0,61
78,4 (60,3)
83,5 (58,0)
72,4 (32,4)
0,33
Variável
53
Glicemia (mg/dl)
84,76 (8,1) ||
82,7 (7,7) ||
82,9 (7,9)
0,07
82,4 (8,0)
82,3 (8,1)
80,8 (8,4)
0,34
Hemoglobina (g/dl)
13,26 (1,3)
13,3 (1,2)
13,4 (1,2)
0,84
13,1 (1,1)
13,1 (1,0)
13,0 (1,1)
0,75
Abreviações: IMC, índice de massa corporal; CC, circunferência da cintura; %GC, porcentagem de gordura corporal; PAS, pressão arterial
sistólica; PAD, pressão arterial diastólica; LDL-c, colesterol LDL; HDL-c, colesterol HDL; TG, triglicerídeos.
* Valor de P para comparação das médias entre os grupos (ANOVA).
†
Valor de P para comparação das variáveis heterogêneas ( teste Kruskall-Wallis)
‡
P=0,03; § P=0,05; || P=0,02.(teste t student)
54
Quando estratificamos a população quanto ao estádio de maturação sexual (Tabela 5.4),
pôde-se observar que a maioria das crianças avaliadas se encontrava no período prépúbere, o que corresponde a 44,3%, seguidos por 30,2% no estádio púbere e 25,5% na
fase pós-púbere. Ao avaliar a distribuição da freqüência de cada estádio de acordo com
os genótipos do polimorfismo In/Del DCP1 não foi observada diferença entre os grupos
(P=0,63). Ao avaliar essas freqüências estratificadas por sexo, também não foi
observada diferenças na distribuição da frequência de acordo com o estádio de
maturação sexual nem para meninos (P=0, 77) e tampouco para as meninas (P=0,33).
Avaliamos a seguir, utilizando o modelo co-dominante, as mesmas variáveis na
população geral e separada por sexo separadamente em cada estádio de maturação
sexual.
55
Tabela 5.4 Frequência do genótipo da DCP1 de acordo com os estádios de
maturação sexual dos escolares de 6-14 anos do município de Ouro Preto.
Genótipos n (%)
Maturação Sexual
DD
ID
II
Pré-púbere
108 (31,6)
176 (51,5)
58 (16,9)
Púbere
76 (32,3)
122 (51,9)
37 (15,8)
Pós-púbere
66 (33,7)
90 (45,9)
66 (20,4)
Total
250 (100)
388 (100)
135 (100)
Pré-púbere
64 (52,0)
93 (50)
28 (43,1)
Púbere
37 (30,1)
57 (30,6)
21 (32,3)
Pós-púbere
22 (17,9)
36 (19,4)
16 (24,6)
Total
123 (100)
186 (100)
65 (100)
Pré-púbere
44 (34,6)
83 (41,1)
30 (42,8)
Púbere
39 (30,7)
65 (32,2)
16 (22,9)
Pós-púbere
44 (34,6)
54 (26,7)
24 (34,3)
Total
127 (100)
202 (100)
70 (100)
P*
Todos
0,63
Meninos
0,77
Meninas
0,33
Resultados apresentados como número (n) e frequência (%) de indivíduos em cada
estádio de maturação sexual e grupo de genótipo.
* Valor de P para comparação da frequência de indivíduos em cada estádio de
maturação sexual entre os grupos de genótipos da DCP1 (qui-quadrado de Pearson)
56
A tabela 5.5 apresenta os resultados para a população geral no estádio pré-puberal. A
maioria das variáveis contínuas analisadas seguiu uma distribuição normal, com
exceção da idade e dos níveis séricos de HDL-c que apresentaram heterogeneidade das
variâncias. Não foi observada diferença significativa para as variáveis contínuas entre os
genótipos no estádio pré-puberal.
Tabela 5.5 Média e desvio-padrão dos fatores de risco selecionados para DCV em
escolares pré-puberes de acordo com o polimorfismo In/Del do gene DCP1.
Variável
DD
ID
II
n=108
n=176
n=58
P*
Idade (anos)
8,6 (1,6)
8,7 (1,5)
8,83 (1,9)
0,95†
Altura (cm)
130,3 (10,5)
131,8 (10,3)
130,9 (9,7)
0,47
Peso (Kg)
29,2 (8,8)
29,0 (7,3)
28,6 (6,7)
0,90
IMC (Kg/m2)
16,9 (3,0)
16,5 (2,4)
16,5 (2,0)
0,28
CC (cm)
58,5 (8,7)
58,2 (6,7)
58,3 (5,6)
0,70
% GC- Nhanes III
17,0 (6,9)
15,2 (9,8)
14,7 (7,6)
0,16
%GC Tanita
20,6 (8,2)
19,8 (7,8)
19,8 (5,9)
0,67
PAS (mmHg)
96,3 (11,1)
96,5 (11,3)
93,7 (11,8)
0,24
PAD (mmHg)
58,8 (7,4)
59,6 (8,4)
57,7 (7,8)
0,28
Colesterol total (mg/dl)
162,7 (27,2)
159,2 (28,5)
155,6 (28,0)
0,27
LDL-c (mg/dl)
88,6 (27,5)
85,1 (29,5)
82,4 (28,2)
0,37
HDL-c (mg/dl)
58,6 (14,5)
59,1 (14,1)
59,4 (11,5)
0,84†
TG (mg/dl)
76,1 (33,8)
74,9 (50,8)
68,8 (33,8)
0,57
Glicemia (mg/dl)
81,4 (8,1)
81,3 (6,9)
80,6 (7,7)
0,75
Hemoglobina (g/dl)
13,0 (1,1)
13,0 (1,1)
12,9 (1,0)
0,81
Abreviações: IMC, índice de massa corporal; CC, circunferência da cintura; %GC,
porcentagem de gordura corporal; PAS, pressão arterial sistólica; PAD, pressão arterial
diastólica; LDL-c, colesterol LDL; HDL-c, colesterol HDL; TG, triglicerídeos.
* Valor de P para teste ANOVA entre os grupos dos genótipos : DD, DI e II.
†
Valor de P para teste Kruskall-Wallis para variáveis heterogêneas.
57
Na tabela 5.6 são apresentados os resultados no estádio pré-puberal separado por sexo.
A maioria das variáveis contínuas analisadas para o grupo das meninas seguiram uma
distribuição normal, com exceção do IMC, da CC e da %GC Nhanes III que
apresentaram heterogeneidade das variâncias e foram, portanto submetidas ao teste
Kruskal-Wallis.
Ao avaliar os meninos no estádio pré-puberal, todas as variáveis contínuas seguiram
uma distribuição normal. Foi observada diferença estatisticamente significativa entre os
grupos de genótipos para as seguintes variáveis contínuas: IMC, %GC Nhanes III e
triglicerídeos.
58
Tabela 5.6 Média e desvio-padrão dos fatores de risco selecionados para DCV em escolares pré-puberes separados por sexo de acordo
com o polimorfismo In/Del do gene DCP1.
Variável
Meninos
Meninas
DD
ID
II
n=64
n=93
n=28
DD
ID
II
P*
n=44
n=83
n=30
P*
Idade (anos)
8,9 (1,6)
8,7 (1,5)
9,1 (2,1)
0,50
8,3 (1,45)
8,6 (1,5)
8,5 (1,70)
0,52
Altura (cm)
131,9 (10,8)
132,0 (10,4)
132,5 (9,3)
0,96
127,8 (9,6) ||
131,6(1,3) ||
129,4 (9,9)
0,13
Peso (Kg)
31,05 (10,3)
28,9 (7,2)
30,4 (6,8)
0,28
26,5 (4,6)
29,1 (7,4)¶
27,0 (6,3)¶
0,07
IMC (kg/m2)
17,5 (3,6) ‡
16,3 (2,4)‡
17,1 (2,1)
0,02
16,1 (1,5)
16,6 (2,4)
15,9 (1,9)
CC (cm)
60,2 (10,2)
58,2 (5,9)
59,9 (5,9)
0,22
56,0 (4,9)
58,2 (7,6)
56,7 (5,0)
18,4 (6,9) ‡
14,9 (10) ‡
16,4 (5,8)
0,04
15,0 (6,5)
15,6 (9,6)
13,1 (8,8)
%GC Tanita
18,7 (9,6) §
15,7 (6,7) §
17,4 (5,6)
0,06
23,2 (4,6)
24,3 (6,4)
22,0 (5,3)
0,16
PAS(mmHg)
98,2 (10,5)
98,6 (9,7)
96,9 (10,4)
0,74
93,5 (11,4)
94,1 (12,5)
90,8 (12,4)
0,44
§
§
%GC Nhanes III
0,77
†
0,40
†
0,60
†
PAD(mmHg)
59,0 (7,1)
59,4 (7,6)
60,2 (7,9)
0,80
58,6 (7,9)
59,9 (9,2)
55,5 (7,1)
0,05
Colesterol T(mg/dl)
158,8 (28,3)
155,9 (26,5)
154,6 (29,8)
0,73
168,4 (24,8)
162,8 (30,3)
156,4 (26,8)
0,20
LDL-c (mg/dl)
82,7 (28,4)
83,4 (27,7)
81,1 (28,3)
0,93
97,23 (23,7)||
86,9 (31,5)
83,7 (28,5)||
0,08
59
HDL–c (mg/dl)
60,4 (14,3)
59,5 (14,2)
59,3 (11,7)
0,90
56,7 (14,6)
58,7 (14,0)
59,4 (11,3)
0,64
TG (mg/dl)
78,7 (36,5) §
63,4 (29,6) §
71,2 (39,7)
0,05
72,3 (29,3)
85,5 (65,6)
66,6 (27,6)
0,16
Glicemia (mg/dl)
82,5 (7,8)
81,6 (7,3)
81,0 (7,3)
0,63
79,9 (8,3)
81,0 (6,5)
80,2 (8,2)
0,70
Hemoglobina (g/dl)
12,9 (1,1)
13,0 (1,1)
13,0 (1,1)
0,86
13,1 (1,1)
13,0 (1,1)
12,8 (0,90)
0,61
Abreviações: IMC, índice de massa corporal; CC, circunferência da cintura; %GC, porcentagem de gordura corporal; PAS, pressão arterial
sistólica; PAD, pressão arterial diastólica; LDL-c, colesterol LDL; HDL-c, colesterol HDL; TG, triglicerídeos.
* Valor de P para comparação das médias entre os grupos (ANOVA).
†
Valor de P para comparação das variáveis heterogêneas ( teste Kruskall-Wallis)
60
‡
P=0,01; § P=0,02; || P=0,05; ¶ P =0,03.
Entre participantes no estádio puberal (Tabela 5.7), apenas a idade apresentou
heterogeneidade da variância. Ao analisar diferenças entre os genótipos, apenas a PAD
revelou diferença significativa, ou seja, crianças DD apresentaram valores médios de
PAD inferiores (61,3 mm Hg) às crianças heterozigotas (62,4 mmHg) e estas inferiores
as crianças II (66,7 mmHg). Adicionalmente as crianças ID apresentaram níveis médios
da altura (143,8 cm) estatisticamente menores comparadas às crianças II (148,3 cm).
Quando meninos e meninas no estádio puberal são analisados separadamente (Tabela
5.8), entre as meninas apenas a PAD apresentou diferença estatisticamente significativa
entre os genótipos. Meninas DD (62,9 mmHg) e ID (62,6 mmHg) apresentaram níveis
pressóricos menores do que os meninas II (70,3 mm Hg) seguidas das meninas ID. As
meninas ID também apresentaram valores médios para altura e peso (140,8 cm; 37,2
Kg, respectivamente) estatiticamente menores que meninas II (147,9 cm e 44,1 Kg,
respectivamente). Ao avaliar os meninos, apenas a PAD não seguiu uma distribuição
normal e não foi observada nenhuma correlação entre as variáveis contínuas analisadas.
Estes resultados reforçam a sugestão de uma influência do estádio puberal na relação
entre o genótipo e as variáveis estudados e sugerem que a associação é diferente entre
meninos e meninas.
A tabela 5.9 apresenta os resultados a população no estádio pós-puberal, onde a maioria
das variáveis contínuas analisadas seguiram uma distribuição normal, com exceção da
%GC Nhanes III e %GC Tanita. Neste estádio, apenas a CC apresentou diferenças entre
os grupos de genótipos. Crianças DD apresentaram medidas menores de CC (67,5 cm)
que crianças ID (71,1 cm) e que crianças II (69,5 cm).
A tabela 5.10 apresenta os resultados obtidos analisando meninos e meninas no estádio
pós-puberal separadamente. No grupo das meninas, todas as variáveis analisadas
seguiram distribuição normal e observamos diferenças significativas para as variáveis
altura, peso, IMC, CC, %GC Nhanes III e %GC Tanita segundo o grupo do genótipo.
Para altura e CC as meninas DD apresentaram medidas significativamente menores
(155,4 cm e 65,4 cm, respectivamente) que as meninas ID (159,1 cm de altura e 72,2 cm
de CC) e
que as meninas II (158,2 cm e 69,8 cm, respectivamente). O mesmo
comportamento foi também observado para peso, IMC, %GC Nhanes III e %GC
Tanita. Meninas DD apresentaram medidas significativamente menores de IMC, %GC
61
Nhanes III e %GC Tanita (46,9 Kg; 19,4 Kg/m2; 24,2% e 29%, respectivamente) que
meninas ID (54,7 Kg; 21,5 Kg/m2; 29,3% e 33,7%, respectivamente) e que as meninas
II (51,5 Kg; 20,5 Kg/m2; 27,4% e 30,7%, respectivamente).
Para os meninos no estádio pós-puberal observamos diferenças significativas para
glicemia de acordo com o genótipo. Meninos DD apresentaram níveis glicêmicos
maiores (90,2 mg/dl) que meninos II (84,5 mg/dl) e que os meninos ID (82,2 mg/dl).
Em contrapartida, apesar da pressão arterial não ter apresentado diferenças
estatisticamente significativas ao comparar os três genótipos, quando foi realizada a
comparação em separado, foram encontradas diferenças significativas: meninos DD
apresentaram níveis de PAS maiores (113,8 mmHg) que os meninos ID (107,1 mm Hg).
62
Tabela 5.7 Média e desvio-padrão dos fatores de risco selecionados para DCV em escolares púberes de acordo com o polimorfismo
In/Del do gene DCP1.
DD
ID
II
n=76
n=122
n=37
P*
Idade (anos)
11,0 (1,7)
10,7 (2,0)
11,2 (1,2)
0,32†
Altura (cm)
144,9 (10,4)
143,8 (12,3)‡
148,3 (9,6)‡
0,11
Peso (Kg)
39,5 (10,0)
38,5 (12,2)
41,8 (12,1)
0,30
IMC (Kg/m2)
18,6 (3,2)
18,2 (3,6)
18,8 (4,1)
0,65
CC (cm)
64,3 (7,9)
63,2 (9,8)
65,7 (10,4)
0,34
% GC- Nhanes III
21,6 (8,7)
19,7 (8,8)
21,3 (9,1)
0,32
%GC Tanita
23,9 (8,2)
23,6 (8,9)
23,1 (11,3)
0,88
PAS (mmHg)
99,6 (11,1)
101,9 (13,5)
100,4 (13,6)
0,49
PAD (mmHg)
61,3 (7,9) ||
62,4 (8,8) §
66,7 (11,6)§,||
0,01
Colesterol total (mg/dl)
161,4 (31,7)
160,0 (27,1)
166,3 (32,0)
0,52
LDL-c (mg/dl)
89,3 (31,1)
86,2 (26,0)
91,0 (27,3)
0,59
HDL-c (mg/dl)
57,9 (13,2)
57,6 (13,5)
58,7 (12,4)
0,91
TG (mg/dl)
71,1 (30,3)
80,8 (52,3)
83,2 (37,7)
0,24
Glicemia (mg/dl)
84,4 (7,4)
83,0 (7,7)
82,6 (9,4)
0,39
Hemoglobina (g/dl)
13,1 (1,1)
13,2 (1,2)
13,3 (1,3)
0,53
Variável
63
Abreviações: IMC, índice de massa corporal; CC, circunferência da cintura; %GC, porcentagem de gordura corporal; PAS, pressão arterial
sistólica; PAD, pressão arterial diastólica; LDL-c, colesterol LDL; HDL-c, colesterol HDL; TG, triglicerídeos.
* Valor de P para teste ANOVA entre os grupos dos genótipos : DD, DI and II.
†
Valor de P para teste Kruskall-Wallis para variáveis heterogêneas.
‡
P= 0,04; § P= 0,01; || P=<0,001.
64
Tabela 5.8 Média e desvio-padrão dos fatores de risco selecionados para DCV em escolares púberes separados por sexo de acordo com o
polimorfismo In/Del do gene DCP1.
Variável
Meninos
Meninas
DD
ID
II
DD
ID
II
n=37
n=57
n=21
n=39
n= 65
n=16
P*
P*
Idade (anos)
11,5 (1,4)
11,4 (1,7)
11,6 (1,8)
0,88
10,6 (1,8)
10,0 (2,1)
10,7 (1,6)
0,25
Altura (cm)
146,0 (8,7)
147,3 (10,4)
148,5 (10,8)
0,63
143,8 (11,7)
140,8 (13,1)‡
147,9 (8,0)‡
0,09
Peso (Kg)
38,1 (7,5)
39,9 (11,5)
40,1 (11,2)
0,65
40,8 (11,9)
37,2 (12,7)§
44,1(13,2)§
0,10
IMC (kg/m2)
17,7 (2,2)
18,1 (2,9)
17,9 (3,3)
0,84
19,4 ( 3,7)
18,4 (4,1)
19,9 (4,8)
0,26
CC (cm)
63,1 (6,0)
63,4 (9,4)
63,9 (8,5)
0,95
65,4 (9,3)
63,0 (10,2)
68,0 (12,3)
0,17
%GC Nhanes III
18,6 (6,0)
18,0 (7,4)
19,0 (6,9)
0,81
24,4 (10,0)
21,2 (9,7)
24,1 (11,0)
0,25
%GC Tanita
18,6 (5,1)
18,7 (6,8)
17,4 (8,2)
0,71
29,1 (7,2)
27,9 (8,3)
30,6 (10,5)
0,48
PAS(mmHg)
100,0 (9,7)
104,6 (13,0)
98,7 (13,5)
0,08
99,3 (12,5)
99,4 (13,5)
102,6 (13,8)
0,66
PAD(mmHg)
59,9 (5,9)
62,2 (7,8)
63,9 (10,2)
0,19†
62,9 (9,4)¶
62,6(9,6)||
70,3(12,5)||,¶
0,02
159,2 (27,5)
153,8 (26,6)
162,5 (31,1)
0,41
163,4 (35,4)
165,4 (26,6)
171,3 (33,4)
0,68
LDL-c (mg/dl)
89,1 (26,4)
83,9 (25,6)
87,6 (27,6)
0,62
89,4 (35,4)
88,3 (26,3)
95,5 (27,2)
0,69
HDL–c (mg/dl)
57,6 (10,7)
55,1 (12,8)
59,6 (12,2)
0,31
58,2 (15,3)
59,7 (13,8)
57,5 (12,9)
0,78
TG (mg/dl)
62,6 (28,5)
73,9 (34,7)
76,5 (31,6)
0,17
79,3 (30,1)
86,8 (63,5)
91,8 (44,0)
0,67
Colesterol total (mg/dl)
65
Glicemia (mg/dl)
85,5 (7,6)
84,8 (6,7)
84,3 (9,0)
0,82
83,4 (7,1)
81,4 (8,1)
80,5 (9,8)
0,36
Hemoglobina (g/dl)
13,1 (1,3)
13,4 (1,3)
13,4 (1,2)
0,47
13,0 (0,9)
13,0 (1,0)
13,2 (1,5)
0,83
Abreviações: IMC, índice de massa corporal; CC, circunferência da cintura; %GC, porcentagem de gordura corporal; PAS, pressão arterial
sistólica; PAD, pressão arterial diastólica; LDL-c, colesterol LDL; HDL-c, colesterol HDL; TG, triglicerídeos.
* Valor de P para comparação das médias entre os grupos (ANOVA).
†
Valor de P para comparação das variáveis heterogêneas ( teste Kruskall-Wallis)
‡
P=0,04; § P=0,05; || P=0,007; ¶ P=0,01.
66
Tabela 5.9 Média e desvio-padrão dos fatores de risco selecionados para DCV em escolares pós-puberes de acordo com o polimorfismo
In/Del do gene DCP1.
DD
ID
II
n=66
n=90
n=40
P*
Idade (anos)
13,3 (1,0)
13,3 (0,9)
13,5 (1,2)
0,55
Altura (cm)
157,5 (7,8)
159,5 (7,3)
160,2 (7,5)
0,13
Peso (Kg)
49,8 (9,9)
53,1 (12,4)
51,9 (10,3)
0,18
IMC (Kg/m2)
20,0 (2,9)
20,8 (4,1)
Variável
‡
20,1 (2,9)
0,30
‡
CC (cm)
67,5(7,6)
71,1(10,0)
69,5 (9,0)
0,05
% GC- Nhanes III
22,6 (7,7)
25,2 (10,6)
23,9 (7,6)
0,14†
%GC Tanita
26,1 (7,8)
27,9 (11,2)
25,2 (9,9)
0,43†
PAS (mmHg)
106 (11,9)
106,2 (11,0)
104,4 (8,8)
0,68
PAD (mmHg)
65,1 (7,7)
66,5 (6,5)
66,6 (6,9)
0,44
Colesterol total (mg/dl)
160,6 (41,5)
153,5 (27,8)
153,2 (28,0)
0,36
LDL-c (mg/dl)
84,9 (42,9)
82,8 (27,0)
82,4 (28,1)
0,91
HDL-c (mg/dl)
59,6 (14,4)
55,6 (13,7)
57,8 (13,3)
0,20
TG (mg/dl)
80,7 (79,8)
75,6 (34,7)
65,2 (25,7)
0,35
Glicemia (mg/dl)
86,1 (8,1)
84,1 (9,6)
82,9 (7,5)
0,16
67
Hemoglobina (g/dl)
13,7 (1,2)
13,6 (1,1)
13,4 (1,2)
0,65
Abreviações: IMC, índice de massa corporal; CC, circunferência da cintura; %GC, porcentagem de gordura corporal; PAS, pressão arterial
sistólica; PAD, pressão arterial diastólica; LDL-c, colesterol LDL; HDL-c, colesterol HDL; TG, triglicerídeos.
* Valor de P para teste ANOVA entre os grupos dos genótipos : DD, DI and II.
†
Valor de P para teste Kruskall-Wallis para variáveis heterogêneas.
‡
P= 0,015.
68
Tabela 5.10 Média e desvio-padrão dos fatores de risco selecionados para DCV em escolares pós-puberes separados por sexo de acordo
com o polimorfismo In/Del do gene DCP1.
Meninos
Meninas
DD
ID
II
DD
ID
II
n=22
n=36
n=16
n=44
n=54
n=24
P*
P*
Idade (anos)
13,7 (1,0)
13,6 (0,8)
13,9 (1,5)
0,65
13,1 (1,0)
13,1 (1,0)
13,2 (0,8)
0,81
Altura (cm)
161,6 (8,9)
160,0 (9,8)
163,3 (9,2)
0,51
155,4(6,4)†,§
159,1(5,2)§
158,2(5,4)†
<0,001
Peso (Kg)
55,4 (11,4)
50,8 (12,0)
52,6 (11,6)
0,35
46,95(7,7)||
54,7 (12,5)||
51,5 (9,6)
<0,001
IMC (kg/m2)
21,1 (3,2)
19,7 (3,4)
19,5 (2,4)
0,21
19,4(2,6)||
21,5 (4,4) ||
20,5 (3,1)
0,02
CC (cm)
71,9 (9,1)
69,6 (9,2)
69,1 (8,0)
0,58
65,4 (5,7)† ||
72,2(10,5)||
69,8 (9,7)†
<0,001
||
27,4 (6,9)
0,02
30,7 (7,7)
0,01
%GC Nhanes III
19,4 (5,5)
19,0 (8,4)
18,7 (5,4)
0,95
24,2(8,3)
||
29,3(10,0)
||
||
%GC Tanita
20,4 (6,6)
19,2 (8,1)
16,8 (6,5)
0,32
29,0 (6,7)
PAS(mmHg)
113,8 (12,7)†
107,1(12,7)†
106,8 (9,2)
0,10
102,1 (9,4)
105,7 (9,9)
102,8 (8,4)
0,16
PAD(mmHg)
66,0 (7,7)
66,4 (7,2)
67,7 (5,7)
0,76
64,7 (7,7)
66,6 (6,2)
103,8 (9,5)
0,43
Colesterol total (mg/dl)
151,3 (26,5)
151,6 (29,7)
153,3 (29,6)
0,97
165,3 (46,9)
154,8 (26,6)
153,1 (27,6)
0,26
LDL-c (mg/dl)
79,2 (23,9)
80,6 (28,5)
83,9 (27,4)
0,86
87,7 (49,8)
84,2 (26,2)
81,4 (29,1)
0,78
HDL–c (mg/dl)
57,3 (12,5)
56,6 (14,0)
56,8 (12,1)
0,98
60,8 (15,2)
55,0 (13,6)
58,4 (14,2)
0,13
TG (mg/dl)
74,6 (36,7)
71,9 (35,1)
63,0 (28,4)
0,57
83,8 (94,5)
78,1 (34,6)
66,7 (24,3)
0,56
Glicemia (mg/dl)
90,2(7,0)‡§
82,2(9,5)§
84,52(6,9)‡
<0,01
84,0 (8,0)
85,4 (9,5)
81,8 (7,8)
0,23
69
33,7(9,1)
Hemoglobina (g/dl)
14,5 (1,1)
13,9 (1,1)
13,9 (1,3)
0,20
13,3 (1,1)
13,4 (1,0)
13,1 (1,0)
Abreviações: IMC, índice de massa corporal; CC, circunferência da cintura; %GC, porcentagem de gordura corporal; PAS, pressão arterial
sistólica; PAD, pressão arterial diastólica; LDL-c, colesterol LDL; HDL-c, colesterol HDL; TG, triglicerídeos.
* Valor de P para comparação das médias entre os grupos (ANOVA).
†
P=0,05; ‡ P=0,04; § P=0,02; || P<0,001.
70
0,63
6 Discussão
Realizamos a análise genética para o polimorfismo In/Del DCP1 para avaliar o
comportamento dos fatores de risco cardiovasculares tradicionais, especialmente
aqueles relacionados a hipertensão arterial. Para tanto, foi escolhida uma população
jovem de escolares do ensino fundamental, uma vez que, nesta fase da vida, supõe-se
que os fatores genéticos tenham um efeito maior do que os ambientais, considerando
que estes últimos ainda não tiveram tempo suficiente para
exercerem efeito no
individuo, podendo portanto, ser o fator genético determinante do fenótipo nesta
população (SEKURI et al, 2005).
Após a realização das contagens gênica e alélica para o polimorfismo In/Del DCP1 na
população estudada, observamos que este polimorfismo encontrava-se em equilíbrio de
Hardy-Weinberg (CARDOSO et al, 2008; PEREIRA et al, 2001 ).
Em estudos genéticos, é essencial conhecer a distribuição dos alelos de interesse na
população e avaliar se essa distribuição alélica segue o que se chama de equilíbrio de
Hardy-Weinberg (EHW), da mesma forma que é necessário avaliar se as variáveis
contínuas de um estudo epidemiológico seguem uma distribuição normal. (ATTIA et al,
2009; RODRIGUEZ et al, 2009).
O equilíbrio de Hardy-Weinberg (também princípio de Hardy-Weinberg, ou lei de
Hardy-Weinberg)
é
a
base
da
genética
de
populações.
Foi
demonstrado
independentemente por Godfrey Harold Hardy na Inglaterra e por Wilhelm Weinberg
na Alemanha, em 1908.
Afirma que, em uma população mendeliana, dentro de
determinadas condições, as frequências alélicas permanecerão constantes ao passar das
gerações. Independentemente de um gene ser raro ou frequente, sua frequência
permanecerá a mesma com relação aos outros desde que essas condições sejam
mantidas. Por pura intuição poder-se-ia supor que alelos raros se tornariam cada vez
mais raros e que alelos frequentes aumentassem cada vez mais sua frequência,
simplesmente por já serem raros ou comuns, mas o princípio de Hardy-Weinberg
demonstra matematicamente que isso não ocorre. Considerando a existência de 2 alelos
em um locus particular, nomeados A e a, com freqüências p e q, respectivamente,
depois de um ‘cruzamento’ aleatório, as freqüências genotípicas dos grupos AA, Aa e
71
aa na população serão p2, 2pq, q2. Sabendo que existem somente essas 2 possibilidades
de alelos: A ou a, então p+q=1, e p2+ 2pq+q2 =1. Sendo assim, em um cruzamento
aleatório de uma população homogênea, a amostra teria poucas chances de discordar do
equilíbrio de Hardy-Weinberg, o que pode ser confirmado pela estatística paramétrica
(RODRIGUEZ et al, 2009) onde se compara a freqüência dos alelos observada com a
freqüência que seria esperada e oferecendo um resultado considerado acerto biológico
para os genótipos (ATTIA et al, 2009), podendo-se excluir a possibilidade de erros no
procedimento de genotipagem.
Em contrapartida, a derivação do equilíbrio de Hardy-Weinberg na população pode
ocorrer sob certas condições como:
• Consangüinidade (por exemplo, por casamento fechado entre parentes), uma
vez que o equilíbrio depende do cruzamento aleatório;
• Derivação genética, ou seja, por um processo no qual uma população é isolada,
apresentando um número limitado de cruzamentos possíveis;
• Novas mutações, várias mutações podem modificar o equilíbrio HardyWeinberg porque esse equilíbrio é usualmente pesquisado dentro de uma
geração em população suficientemente ampla;
• Seleção, por exemplo, uma desvantagem seletiva do alelo particular que leva a
morte fetal ou prematura; (ATTIA et al, 2009)
Além dessas razões, a derivação do equilíbrio pode também ser ocasionada por
problemas metodológicos, como erros sistemáticos na genotipagem ou padrões perdidos
que podem gerar um desequilibrio HW relativamente consistente (por exemplo,
desproporção de heterozigoto pode conduzir um padrão
de desequilibrio HW
consistente com um excesso de homozigoto) (ATTIA et al, 2009; RODRIGUEZ et al,
2009). Entretanto alguns pesquisadores alertam sobre a real sensibilidade deste teste,
considerando o mesmo pouco sensível em detectar, especialmente os erros de
genotipagem, alegando que as causas da derivação não implicam necessariamente em
erros de genotipagem, sendo necessários métodos mais robustos para detectar tais erros
(COX et al, 2006).
De qualquer maneira, a avaliação do equilíbrio ainda é uma ferramenta importante para
controle de qualidade da genotipagem em estudos genéticos, possibilitando um melhor
72
entendimento da característica genética da população (WITTKE-THOMPSON et al, 2005).
Assim, considerando que encontramos uma freqüência alélica concordante com o
princípio de HW, podemos concluir que o método utilizado para a genotipagem foi
sensível e específico para a determinação do genótipo. Adicionalmente, calculamos a
reprodutibilidade da técnica utilizada para tipagem do polimorfismo em questão e
obtivemos uma concordância de 100% entre dois observadores o que implica que a
técnica utilizada além de ter sido sensível e específica foi de fácil reprodutibilidade.
Em nosso estudo, a prevalência do alelo D (57,4%) foi similar a encontrada em
americanos de origem africana (60,3% a 65%) (PEREIRA et al, 2001; STAESSEN et
al,1997; BLOEM et al, 1996) e em estudos com caucasianos (47% a 58%;) (EISENMANN
et al, 2009; FRANKEN et al, 2004; GINER et al, 2000; FATINI et al, 2000; PONTREMOLI et
al, 2000; HARRAP et al,1993), e foi maior que a prevalência observada em asiáticos (8%
a 39%) (JOSHI et al, 2009; ZHANG et al, 2006; FRANKEN et al, 2004; HARRAP et al,
2003; TAMAKI et al, 2002; THOMAS et al, 2001; STAESSEN et al, 1997) e latinos
residentes em Los Angeles e México, respectivamente (48,6% e 43%) (THAMEEM et al,
2008; HENDERSON et al, 2004). Nos três estudos brasileiros avaliados, nossos achados
corroboram com os estudos realizados no Rio de Janeiro e em São Paulo onde foram
encontradas freqüências do alelo D de 59% e 65%, respectivamente; em contrapartida, a
freqüência da deleção encontrada na região amazônica foi de 14%, inferior a encontrada
no presente estudo (CARDOSO et al, 2008; FREITAS et al, 2007; PEREIRA et al, 2001).
Logo, ao avaliar
a frequência alélica encontrada na população de Ouro Preto,
percebemos uma similaridade a de africanos e caucasianos (EISENMANN et al, 2009;
BAUTISTA et al, 2008; FRANCO et al, 2007; FRANKEN et al, 2004; PEREIRA et al, 2001;
GINER et al, 2000; PONTREMOLI et al, 2000 ; FATINI et al, 2000; STAESSEN et al,1997;
BLOEM et al, 1996; HARRAP et al, 1993).
Considerando a frequência do genótipo DD
(32,3%), esta
foi
maior na nossa
população quando comparados a outros estudos com população de asiáticos e brancos
(EISENMANN et al, 2009; THAMEEM et al, 2008; FREITAS et al, 2007; ZHANG et al, 2006;
HARRAP et al, 2003; TAMAKI et al, 2002; PEREIRA et al, 2001; PONTREMOLI et al, 1996;
HARRAP, 1993) e estudos avaliaram a frequência desse polimorfismo em populações de
origem africana que revelaram uma maior prevalência do genótipo DD comparado a
outras etnias (caucasianos, asiáticos, latinos)( HENDERSON et al, 2004).
73
Apesar de ainda não existirem estudos que revelam a estrutura genética da população
de Ouro Preto, existem dados históricos relatando que durante o período da ocorrência
do tráfico negreiro (1551-1850), aproximadamente 3,5 milhões de africanos chegaram
ao Brasil, vindo da costa oeste africana para trabalharem em lavouras de cana de açúcar,
de café, extração de ouro, diamantes e outras pedras preciosas (ALVES-SILVA et al,
2000). Por conta da intensa mineração na antiga Vila Rica, esta cidade contou com uma
presença maciça de africanos que em determinado momento foi a etnia mais prevalente,
e, com o término da extração do ouro, essa população manteve-se nesta cidade
contribuindo de maneira predominante para o background étnico da população atual.
Desta maneira, dada a maciça contribuição de africanos na formação da população de
Ouro Preto, é esperado que esta população apresente similaridades genéticas com
populações africanas. Vários estudos corroboram com o conceito de background étnico,
ou seja, que a etnicidade determina a variação na freqüência do polimorfismo em
algumas populações determinando o risco desta população (HUEMER et al, 2006).
Durante a última década, muitos debates na literatura médica e científica têm
questionado a relevância em se continuar mencionando a raça para diferenciação das
populações. Embora alguns grupos do Projeto Genoma Humano sinalizem a iminência
do fim da caracterização do indivíduo por raça, nos anos de 1990 e 2000, ainda tem-se
discutido extensivamente como considerar raça/etnicidade em estudos genéticos
(TUTTON et al, 2008). De maneira que, conhecendo-se a raça/etnicidade de um indivíduo
ou do grupo populacional inserido, pode-se ter conhecimento do risco em desenvolver
determinadas patologias.
Outro fator importante a ser mencionado é que a atividade enzimática de DCP1 pode
estar associada a grupos étnicos e alguns estudos têm avaliado se essa associação é
limitada a certos grupos étnicos/raciais. Harrap e colaboradores (2003), ao avaliarem
adolescentes e crianças negras, não encontraram associação do polimorfismo In/Del
DCP1 e níveis da atividade enzimática DCP1, já nas crianças brancas essa associação
foi encontrada, sugerindo que existe uma consistente diferença racial em como a
atividade enzimática DCP1 é regulada em relação ao polimorfismo do gene DCP1
(HARRAP, 2003). Por isso, a importância de conhecer a etnicidade da população
estudada para melhor interpretar os dados obtidos nos estudos genéticos.
74
No nosso estudo foram encontradas diferenças importantes nas associações existentes
entre genótipos e fatores de risco para doenças cardiovasculares. Considerando nossa
população em geral, observamos que as crianças II apresentaram uma idade média (10,8
anos) ligeiramente maior do que as crianças ID (10,4 anos), sem maiores inferências.
Ao avaliarmos os níveis glicêmicos, observamos que as crianças DD apresentaram
glicemia aproximadamente 2 mg/dl maior em relação às crianças II e ao fazermos a
estratificação por sexo observamos que esta diferença estava restrita ao grupo dos
meninos DD em relação aos meninos ID. Embora os níveis médios encontrados não
caracterizem hiperglicemia, a diferença observada pode indicar alterações precoces no
metabolismo da glicose e como existem relatos do polimorfismo In/Del DCP1
associado à diabetes tipo 2, qualquer aglomeração de fatores de risco para doenças
cardiovasculares pode favorecer o desenvolvimento
das DCVs precocemente
(RAMACHANDRAN et al, 2008). Podemos sugerir que o fenótipo de risco conferido pelo
polimorfismo pode ser dependente da interação com fatores ambientais para se
manifestar, o que poderia ocorrer em etapas posteriores da vida. De fato, desordens do
metabolismo da glicose são incomuns em crianças (FERREIRA et al, 2007). Em
contrapartida, um estudo brasileiro em adultos, detectou uma tendência dos níveis de
glicose ser maiores nas mulheres com genótipo II (CARDOSO et al, 2008).
Ao estratificar nossa população por sexo no modelo co-dominante, pudemos observar
diferenças entre as associações de acordo com o sexo. As meninas não apresentaram
nenhuma associação dos fatores de risco analisados com o genótipo enquanto que nos
meninos observamos diferenças na PAD, glicemia e % GC.
Pudemos observar que os meninos DD tinham níveis pressóricos 2,7 mmHg e 1 mmHg
inferiores aos meninos II e
ID, respectivamente.
Segundo dados de estudos
epidemiológicos prévios (SIGHAL et al, 2001) esse nível de redução na pressão arterial
diastólica, pode reduzir, a longo prazo, a prevalência da hipertensão arterial de 17%, o
risco de doença coronariana de 6% e o risco de infarto e ataques isquêmicos de 15%.
Assim, uma PAD média 3 mmHg menor pode apresentar benefícios amplificados na
fase adulta (SIGHAL et al, 2001).
75
Por outro lado, não observamos diferença nos níveis de pressão arterial sistólica, em
concordância com outros trabalhos (CARDOSO et al,2008; ZHANG et al, 2006; HARRAP et
al, 2003;TAMAKI et al, 2002; ZAMAN et al, 2001; KATO et al, 2000; MATSUBARA, 2000;
GINER et al, 2000; BORECKI et al, 1997; VASSILIKIOTI et al, 1996; KIEMA et al ,1996;
HARRAP et al, 1993; SCHMIDT et al,1993) que não encontraram diferença na pressão
arterial com relação ao polimorfismo In/Del DCP1. Entretanto alguns estudos de
população observaram apenas uma pequena associação entre o polimorfismo In/Del
DCP1 e hipertensão (BAUTISTA et al, 2008; ISO et al, 1994).
A literatura apresenta resultados discrepantes quando se trata de estudos de associação
deste polimorfismo com a hipertensão arterial, e essas discrepâncias são difíceis de
serem explicadas. A maioria dos estudos tem confirmado que sobrepeso, dieta rica em
sal e ingestão severa de álcool são os principais fatores de risco para hipertensão (GUIYAN et al, 2006). Portanto, para avaliar o papel do polimorfismo e o fenótipo (pressão
arterial) é necessário avaliar outros fatores de risco que possam estar determinando essa
associação e antecipando o desenvolvimento de doenças cardiovasculares.
Outra possível explicação para as discrepâncias é que o polimorfismo do gene DCP1
tenha apenas um pequeno efeito na pressão arterial, e que este efeito possa ser
mascarado por diferenças no background genético ou fatores ambientais, incluindo
estilo de vida, os quais poderiam afetar o locus da variante genética (TAMAKI et al,
2002). Acredita-se que essas diferenças com relação ao risco de hipertensão arterial são
observadas inclusive entre os indivíduos que compartilham o mesmo background
genético, dependendo dos fatores ambientais (WOLF-MAIER et al, 2003; COOPER et
al,1997). Além disto, estudos recentes têm sugerido que o polimorfismo In/Del DCP1
está associado com hipertensão arterial de acordo com a idade. (NAKAMURA et al, 2002;
YOSHIDA et al, 2000; FORNAGE et al, 1998; JOHNSON et al, 1996). Finalmente, muitos
estudos têm sugerido que In/Del DCP1 pode ter um papel diferente na etiologia da
hipertensão de acordo com gênero, raça ou idade (ZHANG et al, 2006). Ou ainda que
possa existir uma interação entre o polimorfismo In/Del DCP1 e outro gene polimórfico
correlacionado com a hipertensão. Portanto, acredita-se que o efeito do polimorfismo
In/Del DCP1 na hipertensão pode ser mais evidente quando associado a outros fatores
genéticos e não-genéticos (ZHANG et al, 2006).
76
Em resumo, em concordância com alguns trabalhos, não encontramos associação do
polimorfismo e hipertensão arterial nas crianças em geral, e, ao estratificar por sexo,
somente os meninos DD apresentaram menores níveis da PAD comparados os demais
genótipos. É importante ressaltar que deve-se ter cautela ao comparar esses estudos,
uma vez que a população do nosso estudo é composta por crianças e adolescentes, então
o comportamento da pressão arterial tem um caráter diferenciado.
Observamos também que a gordura corporal foi 2% maior nos meninos homozigotos
para deleção (genótipo DD) que nos meninos ID. Nossos resultados estão em
concordância estudo de Eisenmann e colaborados (2009) no qual meninos DD
apresentaram maiores percentuais de gordura corporal do que os meninos ID. Além
disso, no referido estudo, indivíduos carreadores do alelo D apresentaram maiores
níveis de massa corporal, IMC, massa livre de gordura comparado as crianças II
(EISENMANN et al, 2009). Estas observações sugerem que, apesar dos valores estarem na
faixa desejável, se esse aumento percentual persistir na idade adulta, pode favorecer o
desenvolvimento de doenças cardiovasculares precocemente na fase adulta.
A literatura concorda com Kourlaba e colaboradores (2008) que sugeriu que na fase
infantil e na adolescência, atualmente, é extremamente possível que a ingestão de
energia em excesso, a composição de macronutrientes da dieta, os hábitos alimentares e
o sedentarismo possa estar influenciando o aumento na obesidade infantil.
Adicionalmente, foi encontrada associação positiva entre colesterol total, altos níveis de
LDL-c ou sobrepeso/obesidade e o genótipo DD (NAKAMURA et al, 2002; YOSHIDA et
al, 2000; FORNAGE et al, 1998; JOHNSON et al, 1996). Além disso, existem poucos
estudos relacionando a dieta infantil, fatores de risco cardiovascular e genéticos, sendo,
portanto, uma necessidade e preocupação principal (KOURLABA et al, 2008). Outro
ponto importante a ser levado em consideração ao avaliar estudos de associação do
genótipo com adiposidade é a forte evidência do efeito da dieta para o desenvolvimento
da obesidade determinada por fatores genéticos. Adicionalmente, um estudo revelou que
o polimorfismo In/Del DCP1 modifica o efeito da ingestão de energia total e da
proteína na obesidade somente naqueles indivíduos DD, mas o mecanismo ainda não
está claro (KOURLABA et al, 2008).
77
As discrepâncias observadas entre os estudos publicados sobre o efeito do polimorfismo
sobre os fatores de risco para doenças cardiovasculares podem ser explicados, como
dito acima, por diferenças no background genético entre diferentes populações, pela
baixa penetrância do polimorfismo avaliado e pelo fato de que alguns estudos
apresentam pequeno poder estatístico para detectar associações que podem estar
restritas apenas a um subgrupo relativamente pequeno da população (FREITAS et al,
2008). Como dito anteriormente, o gênero e idade, além da raça e outros fatores
ambientais podem influenciar o efeito do polimorfismo. Considerando que a faixa etária
da nossa população é bastante ampla (6 a 18 anos) e que a produção hormonal pode
influenciar de diferente maneira o efeito do polimorfismo, decidimos investigar estas
relações categorizando a população de acordo com o estádio de maturação sexual.
Estádio pré-puberal
Ao avaliar o estádio pré-puberal na população em geral e nos meninos, nenhuma
alteração significativa foi observada para os níveis pressóricos. Sugerindo que neste
grupo, o estádio pré-puberal não determinou nenhuma alteração nos níveis pressóricos
no modelo co-dominante, o que pode ser explicado pelo fato dos níveis de testosterona
estarem relativamente baixos para caracterizar qualquer alteração na expressão gênica
nos meninos.
Ao avaliarmos a pressão arterial diastólica no estádio pré-puberal, observamos que as
meninas ID apresentaram valores pressóricos médios maiores em 4,42 mmHg
comparados as meninas II, sugerindo que o estádio pré-puberal teve um efeito,
especialmente nas meninas carreadoras do alelo D. Embora as meninas ID do nosso
estudo tenham apresentado valores pressóricos médios maiores (59,9 mmHg) do que as
meninas II (55,5 mmHg), esses valores foram inferiores às meninas de 7 a 11 anos do
município de Brasília, que apresentaram valores médios de 66 mmHg (FERREIRA et al,
2007). Entretanto, Lewington et al (2002) observaram que uma diminuição na pressão
arterial diastólica de 5 mmHg poderia, a longo prazo, estar associada com redução em
até 40% do risco de morte por doença cardiovascular na idade adulta (LEWINGTON et al,
2002). Portanto, seguindo o racíonio inverso, se as meninas mantiverem esse aumento
de aproximadamente 5 mmHg na pressão arterial diastólica, isto pode implicar, a longo
prazo, um aumento do risco de morte por doenças cardiovasculares em até 40%.
78
Na nossa análise observamos também que meninas DD apresentaram altura média
menor em 3,8 cm comparadas as meninas ID. Adicionalmente as meninas DD
apresentaram 2,13 Kg a mais do que as crianças II. Em partes, nossos resultados
corroboram com os encontrados por Eisenmann (2009), neste trabalho as crianças de 3 a
12 anos carreadoras do alelo D apresentaram a mesma tendência de valores médios para
o peso maiores em 2,7 Kg para as crianças DD comparadas às II, apesar dessa diferença
não ter sido mantido para cada gênero.
Considerando os meninos, percebemos que os DD apresentaram IMC maior em 1,18
Kg/m2 comparados aos meninos ID. Apesar de serem faixas etárias diferentes, nossos
dados corroboram com estudo realizado com homens italianos que também encontrou
associação de IMC significativamente maiores nos indivíduos DD (STRAZZULLO et al,
2003).
Além das diferenças do IMC, encontramos diferenças no %GC entre os genótipos que
foi aproximadamente 3% maior nos meninos DD comparados aos meninos ID. Esses
achados corroboram com estudos em adultos, nos quais a associação do genótipo DCP1
e adiposidade relacionada à idade tem sido bem documentada. Foi observado que
sobrepeso e adiposidade abdominal foi mais freqüente em homens com genótipo DD
(OR=1,8), especialmente nos mais velhos (STRAZZULLO et al, 2003). Similarmente,
estudo realizado por Cardoso e colaborados (2008) detectou uma tendência do IMC ser
maior nos homens DD comparados aos homens II (CARDOSO et al, 2008) .
Com relação aos níveis dos lipídeos no estádio pré-puberal, observamos que as meninas
DD apresentavam níveis de LDL-c superiores em aproximadamente 14 mg/dl
comparadas as meninas II. Corroborando com nossos resultados alguns autores
encontraram associação positiva entre colesterol total elevado, altos níveis de LDL e o
genótipo DD (SAYED-TABATABAEI et al, 2004). Apesar das meninas do nosso estudo
não apresentarem níveis de lipídios que caracterizariam um fenótipo de risco, é de suma
importância acompanhar a evolução e o comportamento dos níveis LDL-c dessas
meninas, pois se esse aumento persistir na fase adulta, considerando a presença do alelo
D, intensificaria a possibilidade de risco para doenças cardiovasculares.
79
Meninos DD apresentaram níveis de triglicerídeos superiores em 15,33 mg/dl
comparados aos meninos ID. Similarmente, estudo realizado por Vittanen e colaborados
também encontrou altos níveis de TG nos individuos DD (VIITANEN et al, 2001) . Em
partes, nossos achados corroboram com estudo que encontrou a mesma tendência dos
níveis de TG para os meninos DD, apesar de não ter diferença estatística significativa
(REGITZ-ZAGROSEK et al, 2007).
Estádio puberal
Neste estádio, tanto as meninas quanto os meninos apresentam níveis hormonais mais
elevados e é o momento propício para atuação dos hormônios esteróides. Na população
em geral, apenas a pressão arterial diastólica apresentou alterações, sendo que as
crianças genotipadas DD apresentaram níveis médios inferiores comparadas às crianças
II. Então o genótipo DD para crianças no estádio puberal pode ter efeito protetor contra
as doenças cardiovasculares. No entanto, ao estratificarmos por sexo, a diferença na
pressão arterial diastólica manteve-se apenas para as meninas. Considerando que no
estádio puberal a concentração de estrógeno está elevada, nossos resultados sugerem
que o polimorfismo pode interagir com o estrógeno conferindo proteção para as
meninas DD. De fato, um estudo mostrou o estrógeno tem um efeito protetor atuando na
redução da atividade enzimática DCP1, que está associada a diminuição plasmática da
angiotensina II e um aumento nos peptídeos vasodilatadores Angiotensina (1-7)
favorecendo uma atenuação na pressão arterial (GALLAGHER et al, 1999).
Estádio Pós-puberal
Observamos que neste estádio apenas as meninas apresentaram diferenças nas variáveis
de composição corporal de acordo com o genótipo. Meninas DD apresentaram valores
médios inferiores de CC, altura, peso, IMC e%GC comparadas às meninas ID,
provavelmente como resultado da interação do genótipo com os níveis de estrogênio
que se encontram aumentados nesta fase, conferindo uma ação protetora para as
alterações na composição corporal, assim como atua nos níveis pressóricos.
Por outro lado, nesta fase os meninos apresentaram diferenças estatisticamente
significantes para pressão arterial sistólica de acordo com o genótipo. Meninos DD
apresentaram níveis médios da pressão arterial sistólica aproximadamente 7%
superiores comparados aos meninos ID. Partindo da idéia do estudo de Lewington e
80
colaborados (2002), de que a redução de 10 mmHg na pressão arterial sistólica usual
poderia, a longo prazo, estar associado com uma redução de cerca de 30% de morte por
doenças cardiovasculares, podemos supor que se esta diferença persistir na idade adulta,
indivíduos DD podem
No nosso estudo, arrisco dizer que esse aumento de
aproximadamente 7 mmHg na PAS persistir até a fase adulta, esses meninos podem
apresentar o risco de morte por doenças cardiovasculares até 21% maior. ( LEWINGTON
et al, 2002). É interessante notar que a pressão arterial é maior em homens comparada
as mulheres dentre os adultos acima de 45 anos, aumentando assim o risco relacionado
ao genótipo DD em homens (OBER et al, 2008).
Ainda que os níveis médios de pressão arterial sistólica estejam dentro de limites
desejáveis para faixa etária (<120 mmHg), o fato de que apenas os meninos no estádio
pós-puberal tenham apresentado alteração na pressão relacionada ao polimorfismo,
pode-se sugerir que a alteração tenha ocorrido pela atuação da testosterona que aumenta
a expressão gênica do DCP1, potencializando as alterações na pressão arterial em
indivíduos DD. Estas observações também apontam para a existência de um
dismorfismo sexual relacionado aos efeitos do polimorfismo In/Del DCP1 sobre os
fatores de risco como observado para outros polimorfismos (FREITAS et al, 2009).
Os maiores níveis glicêmicos observados nos indivíduos DD persistiram na póspuberdade apenas nos meninos DD em comparação com os meninos ID e II. Assim, o
alelo D pode conferir maior risco para diabetes. Este achado é consistente com o
resultado de estudo realizado com população asiática no qual o alelo D do gene DCP1
mostrou ser um marcador genético para diabetes tipo 2 (RAMACHANDRAN et al, 2008).
Cardoso e colaboradores (2008) também observaram um dismorfismo sexual na relação
entre o genótipo In/Del DCP1 e níveis glicêmicos em adultos com mulheres DD, mas
não homens, apresentando menores níveis glicêmicos.
Tomados juntos, nossos resultados sugerem que a maturação sexual pode intensificar a
ação determinada pelo genótipo In/Del DCP1 nos fatores de risco, particularmente
pressão arterial, níveis glicêmicos e composição corporal determinando a evolução para
um fenótipo de risco de maneira diferente em meninos e meninas.
81
O presente trabalho apresenta, no entanto algumas limitações que devem ser
consideradas. Trata-se de estudo transversal no qual todas as observações são feitas em
numa única oportunidade, o que pode distorcer a análise das relações entre evento
estudado e a amostra analisada. Adicionalmente, quando a observação tem um cunho
genético, ou seja, quando se trata de um estudo de associação de polimorfismos de
baixa penetrância com relação a fatores de risco para DCV, como foi o caso deste
estudo, o número de indivíduos avaliados deve ser grande o suficiente para que sejam
possíveis maiores inferências. Neste caso, às vezes, o estudo se torna inviável pelo custo
embutido neste tipo de pesquisa. A avaliação do estádio de maturação sexual de acordo
com o critério de Tanner pode apresentar um viés do observador, pois embora
acompanhado de quadros com desenhos explicativos, a classificação foi autodeclarada,
sendo necessária cautela ao utilizar essa classificação.
No entanto, acreditamos que tais limitações possam apenas atenuar as relações
encontradas e não produzir relações espúrias. Assim, diante dos resultados
apresentados, é importante considerar que a adolescência é uma fase de transição entre a
infância e a fase adulta, sendo, portanto o momento em que ocorrem intensas e
complexas transformações anatômicas e funcionais (LEAL & VARGAS, 2001).
Transformações essas determinadas pelo dismorfismo sexual que se encontra em
pequenos graus no nascimento, mas intensificam na puberdade. Esse dismorfismo atua
de forma peculiar direcionado por fatores endócrinos, especialmente coordenados pelos
hormônios de crescimento e esteróides gonodais (LOOMBA-ALBRECHT et al, 2009). Por
isso, durante a puberdade é importante monitorar a composição corporal e todos os
fatores clássicos para doenças cardiovasculares, uma vez que muitos destes aspectos
durante este período são preditivos podendo perpetuar até a fase adulta determinando
um fenótipo de risco incluindo dislipidemias, diabetes melitus, obesidade, hipertensão
arterial (SIERVOGEL et al, 2003). Além disso, sabe-se que com a rapidez que essas
mudanças ocorrem na adolescência, os fatores genéticos e étnicos passam a ser os
principais fatores de influência sobre o desenvolvimento, contrastando com a fase
adulta, em que se destacam os fatores ambientais (ANJOS et al, 1998).
Portanto, independente do sexo, a avaliação deve ser realizada com intuito de impedir
que os aumentos determinados pelos hormônios, seja pela ausência de estrógeno ora
pela presença da testosterona, perpetuem com o avançar da idade, aumentando assim o
82
risco desta criança apresentar na fase adulta ou precocemente um fenótipo de risco. Em
resumo, sabe-se que múltiplos determinantes genéticos e ambientais podem estar
envolvidos na patogênese da hipertensão, obesidade, dislipidemia, diabetes tipo 2 cada
um provavelmente executando um pequeno efeito. Portanto, deve-se considerar a
interação sinérgica dos genes polimórficos do SRA com os fatores de risco tradicionais,
e a maturação sexual das crianças para possibilitar identificação dos marcadores comuns
na identificação do grupo com pior prognóstico para testar a terapêutica mais eficaz
para aquele indivíduo.
83
7 Conclusões
A partir da análise e discussão dos resultados encontrados neste trabalho podemos
concluir que:
A distribuição encontrada para o polimorfismo In/Del DCP1 na população de
Ouro Preto é similar àquela encontrada em grupos étnicos não-asiáticos e
negros, supondo que nossa população tenha uma prevalência de africanos na
sua constituição.
Não houve relação estatisticamente significativa entre o polimorfismo In/Del
DCP1 com os fatores de risco cardiovascular tradicionais (idade, peso, altura,
IMC, CC,%GC, PAS, PAD, Colesterol total, HDL-c, LDL-c, TG, glicemia)
quando consideramos a população geral.
Ao estratificarmos a população de acordo com o sexo observamos uma
correlação gênero-específica na qual as crianças do sexo masculino DD
apresentaram porcentagem de gordura corporal maiores e PAD menores
quando comparados aos demais genótipos.
Ao avaliarmos a relação do polimorfismo com os fatores de risco de acordo
com o estádio de maturação sexual, nossos resultados indicam uma interação
entre o polimorfismo In/Del do gene DCP1 e fatores hormonais na
determinação de fenótipos associados ao risco de DCV diferente em meninos
e meninas.
No estádio pré-puberal, o alelo D foi associado a menores níveis de peso,
estatura e PAD e maiores níveis de LDL-c em meninas e em meninos o alelo
D foi associado níveis mais elevados de % GC, IMC e TG.
No estádio puberal, o alelo D continuou associado a menores níveis de peso,
estatura e PAD em meninas e nenhuma associação foi observada em meninos,
sugerindo que no estádio puberal os níveis de testosterona não determinaram
alterações na expressão gênica de DCP1 dependente do genótipo.
No estádio pós-puberal o alelo D foi associado a menores níveis de peso,
altura, IMC, CC e %GC em meninas e em meninos o alelo D foi associado a
maiores níveis glicêmico e PAS.
84
8 Perspectivas
Nossa equipe pretende avaliar outros polimorfismos do SRA, e de outros sistemas
(como polimorfismos do metabolismo da homocisteína) para verificar a atuação
sinérgica destes sobre os fatores de risco para DCV na população de Ouro Preto, na
tentativa de encontrar marcadores eficazes na determinação precoce do risco
cardiovascular.
Além disso, pretende-se analisar o consumo alimentar dessas crianças correlacionando
com o genótipo encontrado para avaliar possíveis associações, especialmente com
relação à ingestão de sal e de macronutrientes que poderiam contribuir no
desenvolvimento de fenótipos como hipertensão arterial, obesidade e diabetes tipo 2,
por exemplo.
85
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110
10 Anexos
ANEXO 1 Questionário e termo de consentimento livre e esclarecido
Estudo dos Fatores de Risco para Doenças Cardiovasculares
em Escolares de Ouro Preto
1- IDENTIFICAÇÃO DA ESCOLA
1.1-Escola:
1.2-Endereço:
1.3-Ponto referência:
1.4-Bairro:
1.5-Telefone:
1.6-Diretor(a):
2- IDENTIFICAÇÃO DO ALUNO
2.1-Nome:
2.2- Sexo: ( ) Masculino
( ) Feminino
2.3- Data de nascimento: _____/_____/_____
2.4- Série que freqüenta:
2.6- Período: ( ) Manhã
2.5- Turma:
( ) Tarde
( )
2.7- Data da entrevista: _____/_____/_____:
Noite
2.8-Endereço:
2.9-Bairro:
2.10-Ponto referência:
2.11-Telefone (casa):
2.12-Celular do responsável:
2.13-Telefone (recado para pais/responsáveis):
3- AVALIAÇÃO DA PERCEPÇÃO CORPORAL
3.1-Quanto você acha que está pesando agora?
3.2-Quanto você acha que tem de altura hoje?
111
3.3-O que você acha do seu peso? Com qual das seguintes opções você concorda:
1. ( )Você acha que seu peso está muito alto para sua altura.
2. ( )Você acha que seu peso está alto para a sua altura.
3. ( )Você acha que seu peso está adequado para a sua altura.
4. ( )Você acha que seu peso está baixo para a sua altura.
5. ( )Você acha que seu peso está muito baixo para a sua altura
4- ANTROPOMETRIA
4.1-Altura atual:
cm
4.2-Peso atual:
kg
4.3-Gordura corporal bipolar:
4.4-Gordura corporal tetrapolar:
4.5-PC
4.6-PC Biciptal :1ª______2ª______ 3ª______mm
Triciptal:1ª______2ª______3ª______mm
4.7-PC
4.8-PC
suprailíacal:1ª_____2ª______3ª______mm
3ª______mm
4.9-Circunferência cintura:
4.10-Circunferência braço
cm
Subescapular
Obs.:
5- PRESSÃO ARTERIAL
Medida: Pressão arterial sistólica:
Pressão arterial diastólica:
1a :
2a :
3a :
Obs.:
6- LAUDO ECG
112
:1ª______2ª______
cm
7- COR DA PELE
( ) branca
( ) morena-clara
(
)
morena- ( )preta
( ) não declarado
escura
8- FREQÜÊNCIA ALIMENTAR
8.1- Doces, salgadinhos e guloseimas:
meno
ALIMENTO
Medida
QUANTID Nunc s de
ADE
a
1x
mês
1. Batatinha tipo chips ou
Salgadinho
2. Chocolate/ bombom
3. Bolo comum/ Bolo Seven
Boys®
4. Sorvete massa/ picolé
5. Achocolatado em pó
(Nescau®, Quick®, Toddy®,
etc.)
6. Pipoca estourada (doce ou
salgada)
7. Açúcar adicionado em
café, chá, leite, etc.
8. Balas
9. Doces de frutas (goiabada,
marmelada, doce abóbora)
10. Sobremesas tipo mousse
11. Doce de festa/ Brigadeiro
12.Gelatina
113
1a
1x
3x
por
mês
sem
2 a 4x
1x
sem
dia
2 ou
mais
x dia
8.2- Salgados e preparações:
meno
ALIMENTO
Medid
QUANTID Nunc s de
a
ADE
a
1x
mês
13. Cheesebúrger de carne/
frango
14. Sanduíche (misto, queijo,
frios ou quentes)
15. Sanduíche natural
16. Coxinha/ Risólis/ Pastel/
Enroladinho frito de presunto e
queijo
17. Pão de queijo
18. Esfiha / Empada / Pão de
Batata / Enroladinho assado de
presunto e queijo
19. Salada de batata com
maionese
20. Sopa (canja, feijão, legumes)
21. Farofa (de farinha de
mandioca)
22. Pizza
23. Cachorro quente
24. Croissant presunto e queijo
114
2
1a
1x
2a
3x
por
4x
mês
sem sem
1x
dia
ou
mai
sx
dia
8.3- Leites e produtos lácteos:
meno
ALIMENTO
Medida
QUANTID Nunc s de
ADE
a
1x
mês
1a
1x
2a
3x
por
4x
mês
sem sem
1a
1x
2a
3x
por
4x
mês
sem
sem
1x
dia
2 ou
mais
x dia
25. Leite integral
26. Leite desnatado
27. Leite fermentado
(Yakult®)
28. Iogurte natural/ frutas
29. Petit suisse
(danoninho®, chambinho®)
30. Leite c/ chocolate
(Toddynho®)
31. Iogurte diet
32. Queijo minas frescal/
ricota/ cottage/ prato
33. Requeijão
8.4- Cereais, pães e tubérculos:
meno
ALIMENTO
Medida
QUANTID
Nun
s de
ADE
ca
1x
mês
34. Arroz cozido
35. Macarrão/ instantâneo/
ao sugo/ manteiga
36. Massas (lasanha,
raviole, capeleti)
37. Biscoitos maria/
maisena/ cream cracker
38. Bolachas doces
115
1x
dia
2 ou
mais
x dia
(rosquinha)
39. Bolinho de chuva
(doce, salgado)
40. Biscoitos com recheio
41. Pão francês/ forma/
integral/ caseiro/ pão de hot
dog
42. Cereal matinal tipo
Sucrilhos®/ Barra de cereal
43. Batatas fritas
44. Batatas (purê, sautée)
45. Polenta (angu)
46. Mandioca cozida
47. Batata baroa (cenoura
amarela)
48. Inhame
8.5- Óleos e Gorduras:
meno
ALIMENTO
Medida
QUANTID Nunc s de
ADE
a
1x
mês
49. Maionese tradicional
50. Manteiga (origem
animal)
51. Margarina (origem
vegetal)
116
1a
1x
2a
3x
por
4x
mês
sem sem
1x
dia
2 ou
mais
x dia
8.6- Verduras e legumes:
men
ALIMENTO
Medida
QUANTID
Nunc
os
ADE
a
de 1x
mês
52. Alface
53. Acelga/ repolho
54. Agrião/ rúcula
55. Mostarda/serralha
56. Broto samambaia
57. Ora-pro-nobis
58. Couve-flor/ brócolis
50. Beterraba
60. Cenoura
61. Espinafre
62. Couve
63. Milho verde/ Ervilha
64. Pepino
65. Tomate
66.Quiabo
67. Chuchu
68. Abobrinha
69. Abóbora
8.7- Leguminosas:
70. Feijão
71. Soja
117
1a
1x
2a
3x
por
4x
mês
sem
sem
1x
dia
2 ou
mais
x dia
8.8- Frutas:
meno
ALIMENTO
QUANTIDA Nunc
Medida
DE
s de
a
1x
mês
1a
1x
2a
3x
por
4x
mês
2 ou
1x
sem sem
dia
mais
x dia
72. Abacate
73. Abacaxi
74. Banana
75. Laranja
76. Mexerica
77. Maçã/ pêra
78. Mamão
79. Melão/ Melancia
80. Manga
81. Morangos
82. Goiaba
83. Ameixa/ Kiwi
84. Uva
8.9- Carnes e Ovos:
meno
ALIMENTO
Medid
QUANTID Nunc
a
ADE
a
s de
1x
mês
85. Carne cozida (bife role/ moída
de panela/ picadinho)
86. Bife frito/ bife à milanesa
87. Frango cozido ( ) assado ( )
frito ( ) grelhado ( )
88. Frango frito ( )
89. Peixe assado ( )
90. Peixe frito ( )
118
1a
1x
2a
3x
por
4x
mês
sem
sem
1x
dia
2 ou
mais
x dia
91. Carne suína (bisteca/lombo)
92. Ovo frito ( )
93. Ovo cozido ( )
94. Embutidos (presunto/ peito de
peru, mortadela, salame etc)
95. Salsicha frita ( )
96. Salsicha cozida ( )
97. Lingüiça frita ( )
98. Lingüiça cozida ( )
99. Chouriço
8.10- Bebidas:
ALIMENTO
Medida
QUANTIDA Nunc
DE
100. Refrigerante normal
101. Refrigerante diet
102. Chá mate com sabor
103. Suco de frutas com
açúcar
104. Limonada/ laranjada
com açúcar
105. Sucos naturais com leite/
Vitaminas de frutas
106. Sucos artificiais (em pó)
107. Sucos artificiais (Tial®,
Kapo®, etc)
108. Gatorade®
109. Café
110. Cerveja
111. Vinho
112. Batida
119
a
menos
1a
1x
2a
de 1x
3x
por
4x
mês
mês
sem sem
1x
dia
2 ou
mais
x dia
113. Cachaça
114. uísque
115. vodca
116. conhaque
117. Água
8.11- Outros:
meno
ALIMENTO
Medida
QUANTIDA Nunc s de
DE
a
1x
mês
1a
1x
2a
3x
por
4x
mês
sem sem
1x
dia
2 ou
mais
x dia
118. Adoçante gotas/ pó
119. Ketchup
120. Mostarda
8.12- Não mencionados:
meno
ALIMENTO
Medida
QUANTID Nunc s de
ADE
a
1x
mês
121.
122.
123.
124.
125.
120
1a
1x
2a
3x
por
4x
mês
sem sem
1x
dia
2 ou
mais
x dia
8.13- Consumo familiar
QUANTIDADE
ALIMENTO
Mensal
Semanal
126. Leite Condensado
127. Creme de Leite
128. Açúcar
129. Óleo*
130. Gordura
131. Azeite
132. Alho
133. Sal
134. Cebola
135. Pasta de alho e sal
136. Caldo de carne (Knor,
outros)
*137. Reaproveitamento: ( ) sim
( ) não
138.Toma suplemento vitamínico?
1.( ) Sim
2.( ) Não
139. Qual (is) tipo (s)? ___________________________________
140. Quanto? ___________________________________________
141. Freqüência:
1. ( )Menos de 1 vez por mês
2. ( )De 1 a 3 vezes por mês
3. ( )1 vez por semana
4. ( )De 2 a 4 vezes por semana
5. ( )1 vez ao dia
6. ( )De 2 a mais vezes ao dia
121
N0 PESSOAS
9- RECORDATÓRIO DE 24 HORAS
9.1. Que dia da semana foi ontem? (Atenção: o entrevistador deve responder esta
questão, não solicite a resposta ao entrevistado)
1.Segunda-feira
3.Quarta-feira
5.Sexta-feira
2.Terça-feira
4.Quinta-feira
6.Sábado
7.Domingo
CAFÉ DA MANHÃ
9.2. Ontem você tomou café da manhã?
( ) Sim (passe para questão seguinte)
( ) Não (passe para questão 5- Período da Manhã)
9.3. A que horas você tomou seu café da manhã? _________
9.4. Onde você tomou seu café da manhã?
1.( ) Em casa. ( ) na frente da televisão
( ) sentado à mesa
( ) outro
_____________________________
2. ( )Na escola: merenda ou qualquer outro alimento oferecido de graça pela escola.
3. ( )Na escola: alimentos trazidos de casa.
4. ( )Na escola: alimentos comprados na lanchonete da escola ou de vendedores de rua.
5. ( )Outro local. Qual? ______________________________________
CAFÉ-DA-MANHÃ
ALIMENTO/ BEBIDA
QUANTIDADE (em medidas caseiras)
122
PERÍODO DA MANHÃ
9.5. Ontem você comeu ou bebeu alguma coisa entre o café da manhã e almoço?
( ) Sim (passe para questão seguinte)
( ) Não (passe para questão 7- Almoço)
9.6. Onde você comeu esses alimentos?
1.( ) Em casa. ( ) na frente da televisão
( ) sentado à mesa
( ) outro
_____________________________
2.( ) Na escola: merenda ou qualquer outro alimento oferecido de graça pela escola.
3. ( )Na escola: alimentos trazidos de casa.
4. ( )Na escola: alimentos comprados na lanchonete da escola ou de vendedores de rua.
5. ( )Outro local. Qual? ______________________________________
PERÍODO DA MANHÃ
ALIMENTO/ BEBIDA
QUANTIDADE (em medidas caseiras)
ALMOÇO
9.7. Ontem você almoçou?
( ) Sim (passe para questão seguinte)
( ) Não (passe para questão 10- Período da tarde)
123
9.8. A que horas você almoçou? _________
9.9. Onde você almoçou?
1.( ) Em casa. ( ) na frente da televisão
( ) sentado à mesa
( ) outro
_____________________________
2. ( )Na escola: merenda ou qualquer outro alimento oferecido de graça pela escola.
3. ( )Na escola: alimentos trazidos de casa.
4. ( )Na escola: alimentos comprados na lanchonete da escola ou de vendedores de rua.
5. ( )Outro local. Qual? ______________________________________
ALMOÇO
ALIMENTO/ BEBIDA
QUANTIDADE (em medidas caseiras)
PERÍODO DA TARDE
9.10. Ontem você comeu ou bebeu alguma coisa entre o almoço e o jantar?
( ) Sim (passe para questão seguinte)
( ) Não (passe para questão 12- Jantar)
9.11. Onde você comeu esses alimentos?
124
1.( ) Em casa. ( ) na frente da televisão
( ) sentado à mesa
( ) outro
_____________________________
2. ( )Na escola: merenda ou qualquer outro alimento oferecido de graça pela escola.
3. ( )Na escola: alimentos trazidos de casa.
4. ( )Na escola: alimentos comprados na lanchonete da escola ou de vendedores de rua.
5. ( )Outro local. Qual? ______________________________________
PERÍODO DA TARDE
ALIMENTO/ BEBIDA
QUANTIDADE (em medidas caseiras)
JANTAR
9.12. Ontem você jantou?
( ) Sim (passe para questão seguinte)
( ) Não (passe para questão 15- Período da noite)
9.13. A que horas você jantou? _________
9.14. Onde você jantou?
1.( ) Em casa. ( ) na frente da televisão
( ) sentado à mesa
( ) outro
_____________________________
2. ( )Na escola: merenda ou qualquer outro alimento oferecido de graça pela
escola.
3. ( )Na escola: alimentos trazidos de casa.
4. ( )Na escola: alimentos comprados na lanchonete da escola ou de vendedores de rua.
5. ( )Outro local. Qual? ____________________________________
125
JANTAR
ALIMENTO/ BEBIDA
QUANTIDADE (em medidas caseiras)
PERÍODO DA NOITE
9.15. Ontem você comeu ou bebeu alguma coisa depois do jantar (ou antes de dormir)?
( ) Sim (passe para questão seguinte)
( ) Não (passe para questão 17- Hábitos alimentares)
9.16. Onde você comeu esses alimentos?
1.( ) Em casa. ( ) na frente da televisão
( ) sentado à mesa
( ) outro
_____________________________
2. ( )Outro local. Qual? ______________________________________
PERÍODO DA NOITE
ALIMENTO/ BEBIDA
QUANTIDADE (em medidas caseiras)
126
HÁBITOS ALIMENTARES
Assinale as refeições realizadas normalmente (4 vezes por semana ou mais) e o
respectivo local:
9.17. Café da manhã:
(
)
Não
(
)
Sim.
Local?________________________
9.18. Lanche da manhã/ merenda: (
) Não
(
)
Sim.
Local?________________________
9.19. Almoço:
(
)
Não
(
)
Sim.
Local?________________________
9.20. Lanche da tarde/ merenda
(
) Não
(
) Sim.
Local?________________________
9.21. Jantar:
(
)
Não
(
)
Sim.
Local?________________________
9.22. Lanche da noite:
(
) Não
Local?________________________
127
(
) Sim.
10- QUESTIONÁRIO
Dados do responsável
9.1-Nome:
9.2-idade:
9.3-Grau de parentesco:
9.4-Peso:
9.5-Altura:
9.6-% gordura:
9.7-C cintura:
9.8-Pressão arterial Mãe:
1a
2a :
3a :
9.8-Pressão arterial Pai:
1a
2a :
3a :
9.12-Grau de instrução:
(b)
(
primário
)incompleto
(a) analfabeto ou <4anos
)
(c)ginasial (
completo
)
( (d) 20grau (
)
completo
(
)incompleto
completo
( (e) superior (
)incompleto
)
completo
(
)incompleto
9.13-Trabalha fora (a) sim (b) não
9.14-Tipo de trabalho:
9.15-Turno:
9.16-Doenças crônico –degenerativas: Apresenta alguma doença citada abaixo?
( ) hipertensão arterial
( ) diabetes mellitus
( ) osteoporose
( ) outras. Qual (ais)?
9.17-Medicamento(s)? Qual (ais)____________________________________________
9.9-Número de filhos:
10.17 – Idade que a mãe teve o 10 filho:
9.11-Tipo de parto do(a) aluno (a): (a) normal n0
(b) cesariana
História de doenças familiares: (a) sim (b) não
9.18-( ) hipertensão arterial
9.20-( ) diabetes mellitus
9.19-( ) osteoporose
9.21-(
)
outras.
Qual
(ais)?_____________________
Dados da criança:
9.22-Fez pré-natal durante a gestação da criança (a) sim (b) não quantas consultas:
9.23-Peso ao nascer: __________________g
9.24-A
criança
teve
alguma
( ) não sabe informar
complicação
pós-parto:
(a)
sim
(b)
não
Qual?___________________________
9.25-A
criança
já
foi
internada
(a)
motivo:______________________________________
Por quanto tempo: ________________________________
128
sim
(b)
não
Qual
9.26-Patologias
atuais
(
)
sim
(
)
não
Qual?______________________________________________
Medicamento?________________________________________________________________________
_
9.27-Qual a data de nascimento do irmão que nasceu antes da criança:
/
/
Sobre os hábitos da criança:
9.28-A criança mamou no peito: (a) sim (b) não
( ) Exclusiva
( )≤6 meses ( )>7meses < 1 ano ( )> 1 ano
( )Predominante
( )≤6 meses ( )>7meses < 1 ano ( )> 1 ano
( ) Complementar
( )≤6 meses ( )>7meses < 1 ano ( )> 1 ano
9.30-A criança faz suas refeições principais em frente à televisão (a) sim (b) não (c) às vezes
9.31-Qual o responsável que está presente nas refeições principais: ___________________________
10- AVALIAÇÃO DA MATURAÇÃO SEXUAL
SEXO FEMININO
10.1-Estágios de Tanner:
Mamas:
Pêlos Pubianos:
1. ( )M1
1. ( )P1
2. ( )M2
2. ( )P2
3. ( )M3
3. ( )P3
4. ( )M4
4. ( )P4
5. ( )M5
5. ( )P5
10.2-Menarca:
1.( ) Sim. Idade da menarca:
Anos
2. ( )Não.
3. ( )Não sabe/ não lembra.
SEXO MASCULINO
10.3-Estágios de Tanner:
Genitália
Pêlos Pubianos
1. ( )G1
6. ( )P1
2. ( )G2
7. ( )P2
3. ( )G3
8. ( )P3
4. ( )G4
9. ( )P4
5. ( )G5
10. ( )P5
129
11- AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FÍSICA
11.1-Você pratica ou praticou esporte ou exercício físico em clubes, academias, (
) Sim
escolas de esportes, parques, ruas ou em casa nos últimos 12 meses?
) Não
(
11.2-Qual esporte ou exercício físico você pratica freqüentemente?
( ) futebol ( ) natação ( ) ginástica ( ) basquete ( ) vôlei ( ) caminhada ( ) handebol ( )
judô ( ) musculação
11.3-Quantas horas por dia você pratica?
( ) 30-1 hora ( ) 1- 2 horas ( ) mais de 2 horas
11.4-Quantas vezes por semana você pratica?
( ) 1-2 x/semana ( ) 3-4x/semana ( ) todos os dias
11.5-Você participa das aulas de Educação Física escolar?
( ) Sim
(
) Não
(
) É dispensado. Por que?
11.6-Quantas aulas por semana?
( ) 1-2 x/semana ( ) 3-4x/semana ( ) todos os dias
11.7-Qual a duração de cada aula?
( ) 30-1 hora ( ) 1- 2 horas
11.8-Você costuma ir de bicicleta ou a pé para a escola, clube, academia ou cursos ( ) Sim
em geral?
(
) Não
11.9-Quantas horas por dia você gasta nessas atividades?
( ) 30-1 hora ( ) 1- 2 horas ( ) mais de 2 horas
11.10-Quantas horas por dia você costuma assistir à televisão nos dias de semana?
( ) 30-1 hora ( ) 1- 2 horas ( ) mais de 2 horas
11.11-Quantas horas você costuma assistir à televisão nos finais de semana, somando sábado e
domingo?
( ) 30-1 hora ( ) 1- 2 horas ( ) mais de 2 horas
11.12-Você costuma jogar vídeo-game?
( ) Sim
(
) Não
11.13-Quantas horas por dia você costuma jogar vídeo-game?
( ) 30-1 hora ( ) 1- 2 horas ( ) mais de 2 horas
11.14-Quantas vezes por semana você costuma jogar vídeo-game?
( ) 1-2 x/semana ( ) 3-4x/semana ( ) todos os dias
130
11.15-Você costuma usar o computador?
( ) Sim
(
) Não
11.16-Quantas horas por dia você costuma usar o computador?
( ) 30-1 hora ( ) 1- 2 horas ( ) mais de 2 horas
11.17-Quantas vezes por semana você costuma usar o computador?
( ) 1-2 x/semana ( ) 3-4x/semana ( ) todos os dias
ANOTAÇÕES GERAIS:
131
12- CONDIÇÃO SÓCIO-ECONÔMICA
Indicadores de Renda
12.1- Quantas pessoas na família recebem alguma remuneração por seu trabalho ou aposentadoria?
12.2- Quantos estão desempregados?
12.3- Há quanto tempo( em meses) estão desempregados?
Individuo 1______________
Individuo 2______________
Individuo 3______________
Individuo 4______________
12.4- Qual foi a renda total de sua família incluindo salários, aposentadorias, pensões e outros
rendimentos (como aluguel) ?
132
13- CONSUMO DE BEBIDA A LCOÓLICA
13.1-Você ingere bebidas alcoólicas ?
(0) sim (1) não
13.2-Qual a idade que você tinha quando bebeu pela primeira vez ? __________
13.3- Qual a freqüência que você consome 6 ou mais doses de bebidas alcoólica em uma ocasião?
(0) Menos que mensalmente
(1) Mensalmente
(2) Semanalmente
(3) Diariamente ou quase diariamente
13.4- No último ano quantas vezes você ficou alcoolizado (tomou um porre)?
(0) Nunca
(1) Todos os dias
(2) 5-6 dias/semana
(4) 1-2 dias/semana
(3) 3- 4dias/semana
(5) 3-4 dias/mês
(6) 1-2 dias/mês
(7) menos 1
vez/mês
13.5- Quantas vezes durante os últimos 12 meses você precisou de uma primeira dose pela manhã
para sentir-se melhor depois de uma bebedeira?
(0) Nunca
(2) Mensalmente
(1) Menos que mensalmente
(4) Diariamente ou quase diariamente
(3) Semanalmente
13.6-Quantas vezes durante o ano passado você não conseguiu lembrar o que aconteceu na noite
anterior por que você estava bebendo?
(0) Nunca
(2) Mensalmente
(1) Menos que mensalmente
(4) Diariamente ou quase diariamente
(3) Semanalmente
13.7-Você foi criticado pelo resultado das suas bebedeiras?
(0) Nunca
(1) Menos que mensalmente
Pai
(2) Mensalmente
(4) Diariamente ou quase diariamente
(3) Semanalmente
Mãe
133
13.8-Consome bebida alcoólica? ( )sim
( 13.9-Consome bebida alcoólica? ( )sim
(
)não
)não
13.10- Qual freqüência ele consome bebidas
13.11-Qual a freqüência que ele consome
alcoólicas?
bebidas alcoólicas?
(0) Não se aplica
(0) Não se aplica
(1) Uma ou menos de uma vez por mês
(1) Uma ou menos de uma vez por mês
(2) 2 a 3 vezes por semana
(2) 2 a 3 vezes por semana
(3) 2 a 4 vezes por mês
(3) 2 a 4 vezes por mês
(4) 4 ou mais vezes por semana
(4) 4 ou mais vezes por semana
13.12- Em sua casa há outros que consomem álcool?
(
) sim
(
13.13-O consumo de bebidas alcoólicas ocorre dentro de sua residência? ( ) sim
( ) não
) não
Quem?__________________
134
14- TABAGISMO
14.1-Você tem o hábito de fumar ? (0) sim (1) não
14.2-Qual a idade você tinha quando fumou pela primeira vez ?
(0) abaixo de 9 anos
(2) 10 anos
(4) 12 anos
(1) 9 anos
(3) 11 anos
(5) 13 anos
(6) 14 anos
14.3-Que idade você tinha quando começou a fumar diariamente?
(0) Não se aplica
(2) 9 anos
(4) 11 anos
(6) 13 anos
(1) abaixo de 9 anos
(3) 10 anos
(5) 12 anos
(7) 14 anos
14.4-Qual a freqüência de uso do cigarro no último ano?
(0) Atualmente não fumo
(1) fumo todos os dias
(2) 5-6 dias/semana
(4) 1-2 dias/semana (6) 1-2 dias/mês
(3) 3-4 dias/semana
(5) 3-4 dias/mês
(7) menos que 1
vez/mês
14.5-Se você fumava e parou, há quanto tempo está sem fumar
(0) Não se aplica
(2) até 1 mês
(4) Mais de 1 anos e menos de
3 anos
(1) 1 semana
(3) mais de 1 mês e menos de 1 anos
(5) mais de 3 anos
14.6-Quantos cigarros você fuma/dia?
(0) 1 a 10/dia
(2) 21 a 30/dia
(4)
mais
de
maços/dia
(1) 11 a 20/dia
(3) 31 a 40/dia
14.7-Após acordar, quanto tempo você demora para fumar o primeiro cigarro?
(0) 5 minutos ou menos
(1) 6-30 minutos
(2) 31-60 minutos (4) 4 horas ou mais
(3) 1 a 3 horas
135
2
14.8-Seu pai ou sua mãe tem o hábito de fumar?
(0) Nenhum dos dois
(2) Apenas minha mãe
(1) Os dois
(3) Apenas o meu pai
14.9-Sua mãe fumou durante a gravidez? ( ) sim ( ) não
14.10-Em
sua
casa
há
mais
algum
fumante?
(
)sim
(
)não
Quem?_________________________
14.11-O fumante tem o hábito de fumar dentro de sua residência? ( )sim
( )não
136
1. Anexo 01
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA E DO
RESPONSÁVEL LEGAL
NOME DO ALUNO (A):________________________________________________
DOCUMENTO
DE
IDENTIDADE
No.________________ÓRGÃO
EXPEDIDOR:__________
SEXO: M [__] F [__]
DATA NASCIMENTO:____/____/____
RESPONSÁVEL LEGAL:_______________________________________________
NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.) __________________________
DOCUMENTO DE IDENTIDADE:________________ÓRGÃO EXPEDIDOR______
SEXO:
M [__]
F [__]
DATA NASCIMENTO:____/____/____
ENDEREÇO:___________________________________________________________
BAIRRO:____________________________
TELEFONE: DDD (31) _____________________
137
DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTÍFICA
TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA: Estudo dos fatores de risco para
doenças cardiovasculares na população do ensino fundamental de Ouro Preto,MG.
Coordenação do Estudo:
George
Luiz
Lins
Pesquisadores Participantes do Estudo:
Machado
Coelho Ana Paula Carlos Cândido (NUPEB)
(DEFAR/UFOP)
Sílvia Nascimento de Freitas (DENCS/UFOP)
Renata Nascimento de Freitas (DENCS/UFOP)
Aline Cristina de Souza Lopes (UFMG)
Waleska Teixeira Caiaffa (UFMG)
AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA:
[__] SEM RISCO [ X ] RISCO MÍNIMO[__] RISCO MÉDIO
[__] RISCO BAIXO [__] RISCO MAIOR
DURAÇÃO DA PESQUISA: Quatro anos
138
CONSENTIMENTO PÓS-ESCLARECIDO
Declaro que, após convenientemente esclarecido(a) e ter entendido as informações
acima explicitadas, consinto que meu (minha) _____________ participe do protocolo da
pesquisa acima especificado. Autorizo também que as amostras de sangue coletadas
sejam armazenadas no Laboratório de Epidemiologia sob responsabilidade do Prof.
George Luis Lins Machado Coelho da UFOP para estudos posteriores desde que
autorizados pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos.
Ouro Preto,
de
de 2006.
_______________________________________________
Nome do aluno participante
________________________
________________________
Assinatura do pesquisador
MOTIVO
Assinatura do responsável legal
DA
RECUSA:
___________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
139
REGISTRO DAS EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU SEU
REPRESENTANTE LEGAL SOBRE A PESQUISA
A pesquisa que a criança ou adolescente está sendo convidado(a) a participar tem como objetivos:
(1) determinar a prevalência dos fatores de risco para as doenças cardiovasculares na faixa etária
de 7 a 14 anos na cidade de Ouro Preto, (2) identificar os fatores biológicos, ambientais e sócioeconômico que fazem com que um indivíduo tenha mais ou menos chance de apresentar uma
doença do coração na idade adulta, e (3) promover o desenvolvimento de padrões
comportamentais
adequados
(hábitos
alimentares,
atividade
física)
que
previnam
o
desenvolvimento da doença cardiovascular na vida adulta. Nesta pesquisa os alunos serão
avaliados nas escolas quanto às características antropométricas (peso, altura e percentual de
gordura corporal), bioquímicas (proteína C reativa, vitaminas, minerais, colesterol total e frações,
glicose, triglicérides e homocisteína), clínicas (avaliação da pressão arterial e eletrocardiograma) e
genéticas (polimorfismos dos genes APOE, LDL-R, PPAR, MTHFR, MS, TYMS, OB, OB-R,
NR3C1 e DCP1) em data e horário previamente agendados com a direção do estabelecimento de
ensino. Para as análises bioquímicas e genéticas será necessário coletar 10 mL de sangue após
jejum de 12 horas. As medidas antropométricas e a coleta do sangue serão realizadas por
profissional qualificado e treinado. O responsável legal por cada participante deverá responder a
um questionário aplicado pela equipe. Todas as análises serão realizadas por pessoas treinadas e
orientadas, estando sob a supervisão dos orientadores do projeto. Os exames bioquímicos serão
realizados por profissionais do LAPAC (Laboratório de Análises Clínicas da Universidade Federal
de Ouro Preto) e as análises genéticas serão realizadas no Laboratório de Epidemiologia Molecular
da Escola de Nutrição da UFOP. As amostras de sangue receberão um número (código) e apenas o
coordenador do projeto terá conhecimento da origem dos dados. Estas amostras ficarão
armazenadas sob a responsabilidade do Prof. George Luis Lins Machado Coelho e poderão ser
utilizadas futuramente em outros estudos, de caráter semelhante, desde que com sua autorização e
se esta não for possível, esta utilização deverá ser justificada e aprovada pelo Comitê de Ética. Em
nenhum momento desse estudo, as pessoas que estarão trabalhando com o material das crianças e
dos adolescentes saberão a quem pertence, garantindo o sigilo dos dados. Nenhuma outra pessoa
ou instituição, que não aquelas envolvidas no presente projeto, terá acesso aos dados gerados por
esta pesquisa. Os resultados deste trabalho serão publicados apenas em veículos de divulgação
científica (revistas especializadas e congressos) garantindo-se o anonimato dos participantes. Os
resultados das análises bioquímicas serão informados ao representante legal e se for do interesse
deste, também os resultados das análises genéticas. Se necessário e se for de seu interesse, nossa
equipe agendará uma consulta para aconselhamento genético. A participação ou não neste estudo
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não influenciará de nenhuma forma o tipo e a qualidade do atendimento médico que a criança ou
adolescente está ou poderá está recebendo no futuro. O responsável legal poderá solicitar aos
pesquisadores o desligamento do estudo a qualquer momento. É através deste tipo de pesquisa que
esperamos poder aumentar o nosso conhecimento sobre os riscos de desenvolver doenças do
coração (pressão alta, colesterol alto, obesidade etc.), sobre as formas de se prevenir essa doença
na fase adulta e os benefícios da prevenção e do tratamento que o participante poderá vir a receber.
A participação dos alunos poderá ajudar a conhecer os fatores de risco presente nessa faixa etária e
prevenir as doenças cardiovasculares na idade adulta. Ainda, o participante estará realizando uma
série de exames e consulta médica que poderão identificar alterações que, tratadas ou prevenidas,
irão diminuir a chance de se desenvolver essas doenças na fase adulta. Caso você queira se
informar de mais detalhes sobre a pesquisa agora, ou no futuro, poderá entrar em contato com o
Prof.
George
Luiz
Lins
Machado
Coelho
(Escola
de
Farmácia/Laboratório
de
Epidemiologia/UFOP- Tel: 35591638), Obrigado!
ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE GARANTIAS DO SUJEITO
DA PESQUISA:
Acesso, a qualquer tempo, às informações sobre procedimentos, riscos e benefícios
relacionados à pesquisa, inclusive para dirimir eventuais dúvidas.
Liberdade de retirar seu consentimento a qualquer momento e de deixar de participar do
estudo, sem que isso traga prejuízo à comunidade da assistência.
Salvaguarda da confidencialidade, sigilo e privacidade.
Disponibilidade de assistência no Serviço Municipal de Saúde, por eventuais danos à
saúde, decorrentes da pesquisa.
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ANEXO2 Estádios de Maturação Sexual Tanner, 1962
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ANEXO2 Estádios de Maturação Sexual Tanner, 1962
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ANEXO 3 COMITÊ DE ÉTICA Projeto n°054/2007
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ANEXO 4 COMITÊ DE ÉTICA Projeto n°020/2005
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