Mecanismos de Splicing
Claudia Junqueira, Nuno Couto, Pedro Reis , Pedro Sousa
Introdução
Orientadora: Professora Delminda Neves
Objectivo dos Mecanismos de Splicing?
Disciplina de Biologia Celular e Molecular, 2004/2005
O nosso DNA é constituído por 25 000 genes distribuídos pelos 23 pares de
cromossomas.
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
O DNA é transcrito no núcleo dando origem a um pré-mRNA que
posteriormente será processado por vários mecanismos, um dos quais é o
Splicing, antes de se tornar num RNA “maduro” ou funcional.
Mas nem todo o DNA codifica proteínas, apenas 5% do DNA total é
codificante, os exões. O restante 95% corresponde a DNA que não é
codificado que tanto se pode encontrar fora dos genes (sequências não
codificantes), como dentro dos genes (intrões). Logo, os mecanismos de
Splicing são de extrema importância porque seleccionam as partes
codificantes do gene de forma a facilitar a tradução dos péptidos e proteínas
nos ribossomas (processo de tradução), pois existem em média, nos
humanos, 10 vezes mais intrões que exões.
Qual o papel dos Intrões? Os intrões são variáveis tanto em tamanho como
em número e são as partes não codificantes que, após serem retiradas do préRNA, são destruídas dentro do núcleo gerando nucleotídeos livres que são
reciclados. Pensa-se que a grande quantidade de intrões deve-se à
acumulação de genes (outrora importantes) ao longo da evolução, o que não
implica forçosamente que os seres mais evoluídos tenham mais intrões que
os seres menos complexos. Podem também ter função reguladora ou
simplesmente não apresentar qualquer função. Mas desengane-se quem
pensa que não têm utilidade, pois é a sua grande diversidade que permite a
caracterização individual ou de determinados grupos. Esta diferença na
sequência intrónica reflecte a diversidade genética humana, permitindo-nos
realizar coisas tão extraordinárias como os testes de paternidade ou a
identificação de indivíduos envolvidos em acidentes e crimes.
Qual o papel dos Exões? Os exões constituem o RNA funcional e são
sequências semelhantes entre indivíduos, pois codificam as proteínas básicas
à sobrevivência humana. Assim, não podem apresentar grande variabilidade,
contrariamente aos intrões, porque manifestam-se fenotipicamente, o que
significa que qualquer alteração pode tornar-se incompatível com a vida.
Splicing nos Spliceossomas
Onde ocorre? O Splicing do mRNA ocorre no Spliceossoma (fig.2) que é composto por proteínas e RNAs. Os componentes de
RNA são 5 tipos de small nuclear RNAs (snRNAs) ricos em Uracilo chamados U1,U2,U4,U5 e U6. Estes snRNAs têm entre 107 e
210 nucleotídeos e estão associados a proteínas para formar small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs) que têm papel
central no processo de Splicing, ou seja, os snRNPs são snRNAs ligados a cerca de 6 e 10 proteínas (algumas comuns a todos,
outras específicas de cada um). Os snRNPs U1,U2 e U5 contêm uma única molécula de snRNA, enquanto que o U3 é nucleolar e o
U4 e o U6 formam um único complexo de snRNP (podem aparecer por isso com a seguinte notação U4/U6)
Como ocorre? O primeiro passo é a ligação do snRNP U1 à extremidade 5’ do splice site do pré-mRNA. A seguir, o snRNP U2
liga-se ao branch point (ponto de reconhecimento). Ambas as ligações se dão por complementaridade de bases, dado que a
sequência de nucleotídeos à volta destas regiões é muito conservada (fig.3). Em seguida, um complexo pré-formado de snRNP
U4/U6 + snRNP U5 é incorporado no Spliceossoma. O U5 liga-se ao exão na extremidade 5’ e o U4 dissocia-se do U6. O U4 sai
juntamente com o U1 e o U6 liga-se ao U2 para a primeira reacção de transesterificação que converte o intrão numa estrutura em
forma de laço (lariat). Entretanto há a clivagem do exão na extremidade 5’ e o U5 passa para a extremidade 3’. Por fim, ocorre a
clivagem do exão na extremidade 3’ e a segunda reacção de transesterificação unindo os dois intrões. Os snRNPs dissociam-se do
intrão que vai ser degradado e ficam disponíveis para novo processo.
Fig.3 - Sequências determinadas
à volta das extremidades 5’ e 3’
nos pre-mRNA dos vertebrados
onde ocorre o Splicing.
Fig.1 - Processo geral do Splicing nos Spliceossomas
Fig.2 - Um
Spliceossoma
visto ao ME
Auto-Splicing
Apesar da na maioria dos eucariontes o Splicing ocorrer nos Spliceossomas, encontra-se também um mecanismo de AutoSplicing que pode ocorrer no núcleo, nas mitocôndrias, nos cloroplastos e nas bactérias.
Este mecanismo é catalisado pelos seus intrões que agem como uma ribozima (RNA com função catalítica) levando à sua
auto-excisão.
Existem dois grupos de Auto-Splicing (fig.4):
Grupo I de Auto-Splicing de Intrões
Onde ocorre? Nos genes nucleares de rRNA de protozoários (exemplo: pré-RNAr de Tetrahymena thermophila).
Como ocorre? Por duas transesterificações, sendo a primeira entre o grupo 3’-hidróxilo do cofactor Guanosina livre (que não
é interior à cadeia de RNA) e o Fósforo da extremidade do intrão; e a segunda entre a extremidade 3’ do exão livre e a
extremidade 3’onde ocorre Splicing para retirar o intrão sob forma de molécula de RNA aberta.
Grupo II de Auto-Splicing de Intrões
Onde ocorre? Em genes que codificam proteínas e alguns genes tRNA da mitocôndria e cloroplastos de plantas e fungos.
Como ocorre? Também por duas transesterificações, mas que apresentam algumas diferenças. A primeira ocorre entre o
grupo 2’-hidroxilo de um nucleótido de Adenina reactivo (interior à cadeia de RNA) e o Fósforo da extremidade do intrão; e a
segunda é análoga à do grupo I sendo, no entanto de salientar que neste caso, o intrão é removido em forma de laço (lariat).
Fig.4 - Os dois diferentes tipos de Auto-Splicing
Splicing Alternativo
Onde ocorre? Este processo é frequente em eucariontes complexos, permitindo ampliar a diversidade de proteínas. Como
ocorre de forma diferente em cada tecido é importante na diferenciação tecidular (exemplo: cínase da tirosina).
Como Ocorre? A existência de múltiplos intrões e exões num gene abre a possibilidade de combinar os vários exões em mais
do que um mRNA. Isto significa que um pré-mRNA pode originar múltiplos mRNA e consequentemente várias proteínas
(fig.5).
Para que serve? Múltiplos mecanismos estão envolvidos na regulação do Splicing Alternativo que, por permitir grande
variabilidade, contribui para a multiplicidade de proteínas expressas durante o desenvolvimento e diferenciação (exemplo: o
mesmo mecanismo, no mesmo pré-RNA, pode dar origem tanto a um inibidor como a uma activador do mesmo processo).
Splicing dos tRNA
Fig.5 - Diferentes proteínas resultantes do mesmo gene por Splicing
alternativo
Onde ocorre? Ocorre no núcleo, em alguns tRNA mas está presente em todos os eucariontes. Pensa-se estar relacionado com
mecanismos de regulação, embora esta matéria não esteja bem esclarecida.
Como ocorre? O mecanismo de Splicing dos pré-tRNA difere em certos aspectos dos outros mecanismos. Durante o
processo de Splicing o intrão é "retirado" da sequência havendo uma clivagem em ambos os lados do mesmo. Forma-se então
um 2',3'-fosfomonoester cíclico na extremidade 3' do exão 5'. Este processo é efectuado por enzimas em vez de RNA.
Posteriormente, para a reacção de "ligação" dos dois exões, são necessários dois nucleosídeos trifosfatos: um GTP que
contribui com um grupo fosfato para a ligação 3‘ - 5' no final da molécula de tRNA e um ATP que forma um intermediário
da AMP-ligase activa.
No passo final, o 2'-fosfato da extremidade 5‘ do exão é removido.
Auto-Splicing
Splicing nos
Spliceossomas Grupo I Grupo II
Sequências de intrões
libertadas sob forma
linear
Sequências de intrões
libertadas em “lariat”
Cofactor nucleótido G
livre
“Cofactor” nucleótido
Adenina reactivo
Duas transesterificações
sem consumo de energia
Precisam de intrões para
manutenção da sua forma
tridimensional que lhe
atribui actividade
catalítica para a reacção
Onde ocorre
X
X
- Num caso extremo, um gene de Drosophila pode produzir 38 000 proteínas diferentes a partir de um único
gene através de Splicing alternativo, apesar de apenas alguma combinações terem sido observadas
experimentalmente.
X
- Nos vertebrados e nos insectos o mRNA forma-se a partir de um único pré-mRNA, enquanto que em dois
tipos de protozoários (tripanossomas e euglenóides) a molécula de mRNA é construída por Splicing de
moléculas de RNA separadas: Trans-Splicing.
X
- Splicing “normal” de DNA ocorre nos linfócitos B e T, apesar de ser muito mais raro.
X
X
- Um exemplo específico de Splicing Alternativo é o caso da determinação do sexo na espécie Drosophila,
onde o Splicing do mesmo pré-mRNA determina se a “mosca” é macho ou fêmea.
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CURIOSIDADES
Fig.6 - Processo geral do Splicing dos pre-RNAt
Referências:
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LODISH Harvey, BERK Arnold, ZIPURSKY S. Lawrence, MATSUDAIRA Paul, BALTIMORE David, DARNELL James E., Molecular Cell Biology, 4th ed, W. H. Freeman & Co., New York, 2000, pp 527-528.
COOPER Geoffrey M., HAUSMAN Robert E., The Cell - A Molecular Approach, 3rd ed., Sinauer Associates, Inc, 2004, pp 139-151, 261-280.
No núcleo, Núcleo, mitocôndrias,
Spliceossoma cloroplastos e bactérias
DA SILVA AD., GRAMAXO F., SANTOS, M.E., MESQUITA A.F., BALDAIA L., Terra, Universo de Vida, 1º parte – Biologia, 11º ano, Porto Editora, Porto, 2001, pp 101-114.
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