Departamento
de Engenharia Química e Biológica
Desenvolvimento de estruturas têxteis autolimpantes usando enzimas
Dissertação apresentada para a obtenção do grau de Mestre em Processos
Químicos e Biológicos
Autor
Ana Lúcia Godinho de Jesus
Orientador
Ana Cristina Araújo Veloso
Instituto Superior de Engenharia de Coimbra
Orientador
Carla Joana dos Santos Marinho da Silva
Centro de Nanotecnologia e Materiais Técnicos, Funcionais e Inteligentes
Coimbra, Dezembro, 2001
AGRADECIMENTOS
Quero expressar, em primeiro lugar, o meu mais sincero agradecimento à Prof.ª Doutora Ana
Cristina Veloso, minha orientadora, pela amizade, sugestões, apoio e incentivo, que me deu ao
longo da realização deste trabalho.
Quero agradecer ao CeNTI, na pessoa da Dr.ª Carla Silva, pelo acolhimento, ajuda e apoio,
contribuindo para a realização deste trabalho.
Ao Instituto Superior de Engenharia de Coimbra o meu agradecimento e reconhecimento pelas
facilidades e ajudas sempre concebidas.
Às minhas colegas Diva Correia, Ana Leite e Sandra Costa, pela ajuda, por todo o apoio e por
muitas vezes ouvirem desabafos difíceis.
Ao Avelino e à Rosa pelo incondicional apoio e ajuda preciosa ao longo de todo este tempo em
que acreditaram que seria possível.
Aos meus pais, por simplesmente o serem, sem necessitarem de mais palavras.
Ao Miguel por toda a paciência, cumplicidade, amor, coragem e entusiasmo que me deu desde o
primeiro dia e simplesmente pela sua presença constante na minha vida.
E por fim gostaria de agradecer a todos que de uma ou outra forma tornaram possível a
realização deste trabalho.
Desenvolvimento de estruturas têxteis auto-limpantes usando enzimas
Ana Lúcia Godinho de Jesus
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RESUMO
DESENVOLVIMENTO DE ESTRUTURAS TÊXTEIS
AUTO-LIMPANTES USANDO ENZIMAS
A facilidade de limpeza em roupa tem sido uma das inovações recentemente exploradas por
investigadores e fabricantes da área têxtil. Têm sido desenvolvidas estratégias baseadas na
combinação de materiais inovadores e na realização de tratamentos de superfície. O conceito
inovador de auto-limpeza aplicado aos têxteis permite obter roupa auto-limpante, acarretando
benefícios do ponto de vista técnico e económico.
O objectivo deste estudo foi imobilizar a enzima Alcalase num substrato têxtil, o algodão, usando a
ligação covalente enzima-algodão, utilizando dois agentes ligantes, glioxal e plasma químico.
Foi estudada a cinética da enzima livre e imobilizada, nomeadamente a determinação das constantes
cinéticas da equação de Michaelis-Menten. Estudou-se, ainda para a enzima livre, a temperatura e
pH óptimos, a estabilidade ao armazenamento e condições processuais e o efeito de inibidores.
Foi possível imobilizar a enzima ao tecido por ambas as técnicas, no entanto, verificou-se que o
método de imobilização necessita ser optimizado, visto que o tecido contendo enzima imobilizada
apresenta baixa solidez à lavagem, sendo este um requisito importante a cumprir. Verificou-se que a
constante de Michaelis-Menten para a enzima imobilizada apresenta um valor inferior ao da enzima
livre, 0,5 ± 0,1 mg/mL e 5,1 ± 0,9 mg/mL, respectivamente, indicando uma maior afinidade da enzima
imobilizada para a caseína. Verificou-se que as condições óptimas de operação da enzima livre são a
uma temperatura de 60 °C e a um pH de 11, a enzima apresenta maior estabilidade quando
armazenada a 4ºC e uma maior estabilidade de operação a 37 °C. Por outro lado, a enzima livre é
inibida pelo EDTA, detergente SKIP e CaCl2, e possui capacidade de degradar outras enzimas como
celulases.
Provou-se que tanto a enzima livre como a enzima imobilizada possuem capacidade para
degradação de nódoas comuns, e que é possível reutilizar a enzima imobilizada num suporte têxtil,
para posteriores tratamentos.
Palavras-Chave: Enzimas; Cinética, Imobilização, Têxteis funcionais, Auto-limpeza.
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ABSTRACT
DEVELOPMENT OF SELF-CLEANING TEXTILES
USING ENZYMES
The concept of easy-cleaning in garments has been one of the recent innovations explored by
researchers and textiles manufacturers. With this objective, several strategies have been developed
based on the combination of innovative materials and on surface treatments. The innovative selfcleaning concept applied to textiles allows for several technical and economic benefits, fulfilling the
consumer’s request of easy-care garments.
The objective of this study was to covalently immobilize the enzyme Alcalase into a textile substrate
(cotton), using two different cross-linking methods, glyoxal and chemical plasma.
The kinetics of the free and immobilized enzyme was studied, including the determination of
Michaelis-Menten parameters. Additionally, for the free enzyme, the optimum temperature and pH
profiles, the storage and operational stability as well the effect of some common inhibitors were
studied.
It was possible to attain a cotton fabric with immobilized proteases, for the two tested techniques.
Nevertheless, it was verified that the immobilization method needs to be further optimized, since the
washing fastness of the fabric is very low, and this is a mandatory requisite. It was verified that the
Michaelis-Menten constant for the immobilized enzyme showed values lower than for the free enzyme,
0.5 ± 0.1 mg/mL and 5.1 ± 0.9 mg mL, respectively, indicating a higher affinity of the immobilized
enzyme for the substrate, casein. Additionally, it was seen that the optimum conditions for the free
enzyme are a temperature of 60° C and a pH of 11, t he enzyme has higher storage stability at 4° C
and a higher operational stability at 37° C. By oth er side, the free enzyme is inhibited by EDTA, SKIP
detergent and CaCl2, and it has ability to degrade other enzymes such as cellulases.
Additionally, it has been proved that both the free and immobilized enzymes have ability to degrade
common stains and that it is possible to reuse the immobilized enzyme for subsequent treatments.
Keywords: Enzymes; Kinetics; Immobilization; Functional textiles; Self-cleaning
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INDICE
CAPÍTULO 1 ........................................................................................................................................... 1
1.
INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................................................... 2
1.1
Contexto e Motivação .............................................................................................................. 2
1.2
CeNTI: uma próspera ligação entre o mundo empresarial e académico ................................ 5
1.3
Objectivos e Metodologias....................................................................................................... 5
1.4
Organização da Tese .............................................................................................................. 6
CAPÍTULO 2 ........................................................................................................................................... 9
2.
AS ENZIMAS ................................................................................................................................. 10
2.1
Enzimas: a sua estrutura ....................................................................................................... 11
2.2
Classificação das enzimas .................................................................................................... 14
2.3
Cinética enzimática ................................................................................................................ 15
2.3.1
Factores que afectam a cinética enzimática ................................................................. 19
2.3.1.1
A temperatura ........................................................................................................ 19
2.3.1.2
O pH ....................................................................................................................... 20
2.3.2
Estabilidade enzimática ................................................................................................. 20
2.3.3
Inibição enzimática ........................................................................................................ 21
2.4
Imobilização de enzimas ....................................................................................................... 24
2.5
As enzimas: sua aplicação na Industria Têxtil....................................................................... 28
CAPÍTULO 3 ......................................................................................................................................... 33
3.
MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................................. 34
3.1
Material .................................................................................................................................. 34
3.1.1
Enzimas, Proteínas e reagentes.................................................................................... 34
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3.1.2
3.2
Equipamento ................................................................................................................. 34
Métodos ................................................................................................................................. 35
3.2.1
Determinação da concentração de proteína total em solução ...................................... 35
3.2.2
Determinação da actividade enzimática........................................................................ 36
3.2.3
Estudos cinéticos ........................................................................................................... 37
3.2.4
Saturação enzimática .................................................................................................... 37
3.3
3.2.4.1
Efeito da temperatura ............................................................................................ 37
3.2.4.2
Efeito do pH ........................................................................................................... 38
3.2.4.3
Estabilidade ao armazenamento e condições processuais .................................. 38
3.2.4.4
Inibição enzimática ................................................................................................ 38
3.2.4.5
Degradação de outras enzimas ............................................................................ 39
3.2.4.6
Parâmetros cinéticos Km e vmáx ............................................................................. 39
Imobilização da Alcalase ao algodão .................................................................................... 39
3.3.1
Imobilização da enzima usando glioxal como agente ligante ....................................... 39
3.3.2
Imobilização da enzima usando plasma químico como agente ligante ........................ 40
3.3.3
Degradação de caseína pela enzima imobilizada ......................................................... 40
3.4
3.3.3.1
Parâmetros cinéticos Km e vmáx ............................................................................. 41
3.3.3.2
Reutilização da enzima imobilizada ...................................................................... 41
3.3.3.3
Solidez à lavagem ................................................................................................. 42
Remoção de nódoas dos tecidos .......................................................................................... 42
3.4.1
Remoção de nódoas de ketchup ................................................................................... 42
3.4.2
Remoção de nódoas de gema de ovo - quantificação da proteína presente na solução
salina de gema de ovo .................................................................................................................. 43
3.4.2.1
Remoção de nódoas de gema de ovo, pela enzima imobilizada com glioxal....... 43
3.4.2.2
Remoção de nódoas de gema de ovo, pela enzima imobilizada com plasma
químico …… .............................................................................................................................. 44
CAPÍTULO 4 ......................................................................................................................................... 45
4.
RESULTADOS EXPERIMENTAIS DISCUSSÃO ......................................................................... 46
4.1
Determinação da concentração de proteína total em solução .............................................. 46
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4.2
Enzima Livre .......................................................................................................................... 47
4.2.1
4.3
4.2.1.1
Saturação enzimática ............................................................................................ 47
4.2.1.2
Efeito da temperatura ............................................................................................ 48
4.2.1.3
Efeito do pH ........................................................................................................... 49
4.2.1.4
Estabilidade ao armazenamento e condições processuais .................................. 50
4.2.1.5
Inibição enzimática ................................................................................................ 51
4.2.1.6
Degradação de outras enzimas ............................................................................. 53
4.2.1.7
Parâmetros cinéticos Km e vmáx.............................................................................. 54
Enzima Imobilizada ................................................................................................................ 56
4.3.1
4.3.1.1
4.3.2
4.4
Estudos cinéticos ........................................................................................................... 47
Imobilização da enzima usando glioxal como agente ligante ....................................... 56
Degradação da caseína pela enzima imobilizada ................................................. 56
Imobilização da enzima usando plasma químico como agente ligante ........................ 57
4.3.2.1
Parâmetros cinéticos Km e vmáx.............................................................................. 57
4.3.2.2
Reutilização da enzima imobilizada....................................................................... 59
4.3.2.3
Solidez à lavagem.................................................................................................. 60
Remoção de nódoas dos tecidos .......................................................................................... 61
4.4.1
Remoção de nódoas de ketchup ................................................................................... 61
4.4.2
Remoção de nódoas de gema de ovo - Quantificação do teor proteico da solução
salina de gema de ovo................................................................................................................... 63
4.4.2.1
Remoção de nódoas de gema de ovo pela enzima imobilizada usando o glioxal
como agente ligante .................................................................................................................. 64
4.4.2.2
Remoção de nódoas de gema de ovo pela enzima imobilizada usando o plasma
químico como agente ligante ..................................................................................................... 65
CAPÍTULO 5 ......................................................................................................................................... 69
5.
CONCLUSÕES GERAIS E TRABALHOS FUTUROS .................................................................. 70
5.1
Síntese do Trabalho e Conclusões Gerais ............................................................................ 70
5.2
Prosseguimento de Trabalhos Futuros ................................................................................. 71
CAPÍTULO 6 ......................................................................................................................................... 73
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6.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS .............................................................................................. 74
CAPÍTULO 7 ......................................................................................................................................... 77
7.
ANEXOS ........................................................................................................................................ 78
Anexo A: Carta de Controlo de Duplicados das amostras para a Curva de Calibração da actividade
enzimática ......................................................................................................................................... 78
Anexo B: Remoção de nódoas de ketchup ....................................................................................... 79
Anexo C: Remoção de nódoas de gema de ovo pela enzima imobilizada usando glioxal como
agente ligante .................................................................................................................................... 86
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 2.1. Representação esquemática dos dois tipos de estrutura secundária mais frequentes,
hélice α, à esquerda e folha plissada β, à direita (retirado de Cabral, Aires-Barros e Gama 2003)..... 12
Figura 2.2. Modelos de arranjo dos átomos no centro activo da enzima: Modelo da chave e fechadura,
em cima e Modelo de encaixe induzido, em baixo (retirado de Boyer 2005). ...................................... 13
Figura 2.3. Curva de progressão de uma reacção enzimática (retirado de Quintas, Freira e Halpern
2008). ..................................................................................................................................................... 16
Figura 2.4. Representação gráfica da equação de Lineweaver-Burk, (retirado de Quintas, Freira e
Halpern 2008. ........................................................................................................................................ 17
Figura 2.5. Representação gráfica da equação de Eadie-Hofstee, (retirado de Quintas, Freira e
Halpern 2008). ....................................................................................................................................... 18
Figura 2.6. Representação gráfica da equação de Hanes-Woolf, (retirado de Quintas, Freira e Halpern
2008). ..................................................................................................................................................... 19
Figura 2.7. Representação de Lineweaver-Burk com o efeito de um inibidor não-competitivo (retirado
de Cabral, Aires-Barros e Gama 2003). ................................................................................................ 22
Figura 2.8. Representação de Lineweaver-Burk com o efeito de um inibidor competitivo (retirado de
Cabral, Aires-Barros e Gama 2003). ..................................................................................................... 23
Figura 2.9. Representação de Lineweaver-Burk com o efeito de um inibidor anticompetitivo (retirado
de Cabral, Aires-Barros e Gama 2003). ................................................................................................ 24
Figura 2.10. Representação esquemática da morfologia da fibra de algodão (retirado de Cavaco
Paulo 1995). .......................................................................................................................................... 29
Figura 3.1. Representação gráfica da curva de calibração das proteínas e respectiva equação. ....... 36
Figura 3.2. Representação gráfica da curva de calibração para a actividade enzimática a 37 °C e pH
7,5 e respectiva equação....................................................................................................................... 37
Figura 3.3. Representação gráfica da curva de calibração para a actividade enzimática da protease a
40 °C e pH 7,5. ................................... ................................................................................................... 41
Figura 4.1. Representação gráfica da concentração de enzima em função da actividade enzimática. 48
Figura 4.2. Representação gráfica da variação da actividade enzimática em função do aumento da
temperatura. .......................................................................................................................................... 48
Figura 4.3. Representação gráfica da variação da actividade enzimática em função do aumento de
pH. ......................................................................................................................................................... 49
Figura 4.4. Representações gráficas das determinações efectuadas para a estabilidade ao
armazenamento e condições processuais às temperaturas de 4, 20, 37 e 60 °C. .......................... ..... 50
Figura 4.5. Representação gráfica das percentagens de inibição dos diversos inibidores estudados. 52
Figura 4.6. Representações gráficas das percentagens de actividade enzimática da Alcalase na
presença de outras enzimas. ................................................................................................................ 53
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Figura 4.7. Representação gráfica da actividade enzimática em função da concentração de substrato
para a enzima livre – Cinética de Michaelis-Menten............................................................................. 54
Figura 4.8. Representações gráficas das linearizações efectuadas através das equações de
Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee e Hanes-Woolf, para a enzima livre. ................................................ 55
Figura 4.9. Representação gráfica da variação da actividade enzimática da protease imobilizada ao
longo do tempo. ..................................................................................................................................... 56
Figura 4.10. Representação gráfica da actividade enzimática em função da concentração de substrato
para a enzima imobilizada – Cinética de Michaelis-Menten. ................................................................ 57
Figura 4.11. Representação gráfica das linearizações efectuadas através das equações de
Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee e Hanes-Woolf, para a enzima imobilizada. .................................... 58
Figura 4.12. Comparação entre a equação de Michaelis-Menten para a enzima livre e imobilizada. . 59
Figura 4.13. Representação gráfica da variação da actividade enzimática em função de sucessivas
utilizações. ............................................................................................................................................. 59
Figura 4.14. Representação gráfica da percentagem de rendimento obtido para diversas lavagens da
amostra.................................................................................................................................................. 60
Figura 4.15. Imagens SEM da amostra de algodão com Alcalase imobilizada por plasma com O2
(ampliação de 1000 vezes): A – Sem lavagens; B – Com uma lavagem; C – Com três lavagens; D –
Com cinco lavagens; E - Com dez lavagens. ....................................................................................... 61
Figura 4.16. Representações gráficas da variação do ∆K/S em função da concentração de ketchup,
para as três etapas do ensaio. .............................................................................................................. 63
Figura 4.17. Representação gráfica da absorvância em função do volume de padrão adicionado a
cada amostra. ........................................................................................................................................ 64
Figura 4.18. Comparação entre a percentagem de reflectância de todas as amostras com nódoas de
gema de ovo, sem lavagens. ................................................................................................................ 66
Figura 4.19. Comparação entre a percentagem de reflectância de todas as amostras com nódoas de
gema de ovo, após uma lavagem. ........................................................................................................ 66
Figura 4.20. Comparação entre a percentagem de reflectância de todas as amostras com nódoas de
gema de ovo, após duas lavagens. ...................................................................................................... 67
Figura 7.1. Representação gráfica da carta de controlo de duplicados efectuada para a curva de
calibração da actividade enzimática. .................................................................................................... 78
Figura 7.2. Percentagem de reflectâncias para as amostras de controlo com nódoas de ketchup. .... 79
Figura 7.3. Percentagem de reflectâncias para as amostras com nódoas de ketchup. ....................... 80
Figura 7.4. Percentagem de reflectâncias para as amostras de controlo com nódoas de ketchup, após
cinco pulverizações. .............................................................................................................................. 81
Figura 7.5. Percentagem de reflectâncias para as amostras com nódoas de ketchup, após cinco
pulverizações......................................................................................................................................... 82
Figura 7.6. Percentagem de reflectâncias para as amostras de controlo com nódoas de ketchup, após
o banho termostatizado a 40 °C e 100 rpm. ......... ................................................................................ 83
Figura 7.7. Percentagem de reflectâncias para as amostras com nódoas de ketchup, após o banho
termostatizado a 40 °C e 100 rpm. ................. ...................................................................................... 84
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Figura 7.8.Comparação entre a percentagem de reflectância das amostras de controlo e as amostras
com nódoas de ketchup......................................................................................................................... 85
Figura 7.9. Percentagem de reflectâncias para amostras CTR com nódoas de gema de ovo. ........... 86
Figura 7.10. Percentagem de reflectâncias para amostras LAV com nódoas de gema de ovo. .......... 87
Figura 7.11. Percentagem de reflectâncias para amostras ALC com nódoas de gema de ovo. .......... 88
Figura 7.12. Comparação entre a percentagem de reflectância dos CTR e os LAV com nódoas de
gema de ovo. ......................................................................................................................................... 89
Figura 7.13. Percentagem de reflectâncias para amostras CTR com nódoas de gema de ovo, depois
de colocadas na solução de SKIP 2,0 g/L. ............................................................................................ 90
Figura 7.14. Percentagem de reflectâncias para amostras ALC com nódoas de gema de ovo, depois
de colocadas na solução de SKIP 2,0 g/L. ............................................................................................ 91
Figura 7.15. Percentagem de reflectâncias para amostras CTR com nódoas de gema de ovo, depois
das seis pulverizações........................................................................................................................... 92
Figura 7.16. Percentagem de reflectâncias para amostras LAV com nódoas de gema de ovo, depois
das seis pulverizações........................................................................................................................... 93
Figura 7.17. Percentagem de reflectâncias para amostras ALC com nódoas de gema de ovo, depois
das seis pulverizações........................................................................................................................... 94
Figura 7.18. Comparação entre a percentagem de reflectância das amostras CTR e LAV com nódoas
de gema de ovo, depois das seis pulverizações. .................................................................................. 95
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ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 4.1. Concentração total de proteína presente nas enzimas. .................................................... 46
Tabela 4.2. Comparação entre os t1/2 para cada uma das temperaturas utilizadas para a avaliação da
enzima. .................................................................................................................................................. 51
Tabela 4.3. Comparação das constantes cinéticas determinadas pelas diferentes linearizações, para
a enzima livre. ....................................................................................................................................... 55
Tabela 4.4. Comparação das constantes cinéticas determinadas pelas diferentes linearizações, para
a enzima imobilizada. ............................................................................................................................ 58
Tabela 4.5. Valores médios de K/S nos diversos ensaios efectuados e para as diferentes amostras de
tecido. .................................................................................................................................................... 65
Tabela 4.6. Resultados obtidos dos valores de K/S nas diferentes situações testadas na detecção de
nódoas de gema de ovo. ....................................................................................................................... 67
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LISTA DE SÍMBOLOS
°C – Grau Celcius
µL – Microlitro
CE – Concentração total de enzima
cm – Centímetro
E – Concentração de enzima livre num dado instante
g – Gramas
I ou [I] – Concentração de inibidor
K/S – Intensidade da cor
k’I – Constante de dissociação do complexo ESI
k1 e k2 – Constantes de equilíbrio
kI – Constante de dissociação do complexo EI
Km – Constante de Michaelis-Menten
L – Litro
M – Molar
mL – Mililitro
mM – Milimolar
nm – Nanómetro
P – Concentração de produto formado
rpm – Rotações por minuto
S ou [S] – Concentração de substrato
t1/2 – Tempo de meia vida
v – Velocidade de reacção
vmáx – Velocidade máxima de reacção
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ABREVIAÇÕES
ALC – Designação para amostra de tecido com enzima imobilizada
BSA – Albumina bovina do soro
CTR – Designação para amostra de tecido para controlo
EDTA – Ácido etilonodiamino tetra-acético
EI – Complexo enzima-inibidor
EIS – Complexo enzima-inibidor-substrato
ES – Complexo enzima-substrato
LAV – Designação para amostra de tecido com enzima imobilizada lavado
SEM – Microscópio electrónico de varrimento
TCA – Ácido tricloroacético
UIB – União Internacional de Bioquímica
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CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO GERAL
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO GERAL
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CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO GERAL
1.
INTRODUÇÃO GERAL
1.1
Contexto e Motivação
As enzimas, designadas por catalisadores biológicos, são unidades fundamentais no metabolismo
celular e como tal têm sido objecto de vários estudos. Apesar de serem já muitas as enzimas
estudadas e descritas, apenas algumas estão disponíveis comercialmente e aplicadas a nível
industrial.
A baixa utilização das enzimas em processos industriais prende-se essencialmente com o seu custo
elevado e com a delicadeza do seu manuseamento, sendo as condições operacionais utilizadas
nesses processos muitas vezes extremas levando à perda de actividade desses catalisadores. Uma
outra razão, está associada ao facto das empresas químicas terem investido em instalações que
utilizam catalisadores convencionais, pelo que não têm interesse em se reconverter para utilizar
novos processos. Contudo, actualmente tem surgido uma necessidade crescente de produzir
moléculas orgânicas e biológicas mais complexas, o que permite inferir que as enzimas serão cada
vez mais utilizadas a nível industrial. As vantagens da utilização das enzimas relativamente aos
catalisadores químicos residem nas suas propriedades e características, nomeadamente:
(i)
a regio e estereoespecificidade;
(ii)
a capacidade de catalisar a síntese, degradação e modificação de compostos químicos
em condições moderadas;
(iii)
facilitar reacções complexas sequenciais;
(iv)
utilizar substratos relativamente baratos;
(v)
formar produtos residuais não tóxicos;
(vi)
existir um elevado número de enzimas na natureza.
As propriedades e características referidas anteriormente e que revelam a natureza e especificidade
da actividade catalítica devem-se à sua estrutura tridimensional. Esta estrutura depende da
sequência de aminoácidos, dando origem à existência de regiões ou centros com funções e
características próprias, que dependem do tipo e posição dos resíduos que os formam. As
interacções entre esses centros das enzimas com outras moléculas conferem-lhes as suas
características típicas e também a possibilidade de serem reguladas.
A produção e utilização de enzimas a nível industrial está ligada fundamentalmente às indústrias
agroalimentares, farmacêuticas, têxtil e de couros. Destacam-se as proteases essencialmente
utilizadas no fabrico de detergentes, as amilases que são usadas na hidrólise do amido em açúcares
mais simples, as reninas destinadas ao fabrico de queijos, as isomerases muito utilizadas na
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CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO GERAL
produção de açúcar invertido e as lipases usadas para hidrolisar ácidos e ésteres gordos. Estas
enzimas podem ser obtidas a partir de vegetais, animais ou microrganismos.
As enzimas obtidas a partir de microrganismos, por processos fermentativos, têm sido cada vez mais
utilizadas a nível industrial. Isso deve-se sobretudo, aos avanços alcançados na microbiologia e ainda
ao facto da sua produção não estar condicionada por questões sazonais ou geográficas, bem como
pela possibilidade de se utilizarem substratos relativamente baratos, podendo, ainda, por selecção
das estirpes e optimização dos meios de cultura, ser possível obter elevados rendimentos e enzimas
com propriedades e especificidades bem determinadas. Estas vantagens permitiram que estes
processos se evidenciassem relativamente aos processos de obtenção de enzimas por via extractiva
e sobrepor-se aos elevados custos de investimento e de consumo de energia e, ainda, aos riscos de
contaminação, que estão associados a estes processos de produção.
A utilização de enzimas na indústria têxtil já vem sendo conhecida e utilizada há muitos anos,
principalmente em fibras celulósicas, onde por exemplo, se utiliza a amilase para a desengomagem
do algodão. As enzimas são aplicadas a uma grande diversidade de processos, incluindo o prétratamento e bioacabamento do algodão, a desengomagem dos jeans, a abrasão e mudança de
tonalidade da cor, os processamentos de lã, seda e couro.
Desde o início dos anos 90 do século XX, muitos outros tratamentos enzimáticos têm sido
investigados, usando outros têxteis, e visando outro tipo de modificações. Novos tratamentos
enzimáticos incluem a modificação de fibras proteícas e sintéticas com classes de enzimas como
hidrolases, liases e oxiredutases. Nesses processos, as propriedades modificadas são as
relacionadas com alterações morfológicas, estruturais e químicas do têxtil.
A facilidade de limpeza em roupa tem sido um dos principais conceitos recentemente explorados por
investigadores e fabricantes da área têxtil. Neste sentido, têm sido desenvolvidas estratégias
baseadas na combinação de materiais inovadores e na realização de uma diversidade de tratamentos
de superfície. Os investigadores da área têxtil inspiraram-se nas propriedades naturais da folha de
Lotus para desenvolver o conceito inovador de “Self cleaning textiles”, aplicado a superfícies têxteis
que se limpam por si próprias, sem necessidade de qualquer acção de lavagem. O conceito inovador
de auto-limpeza aplicado aos têxteis permite obter roupa auto-limpante, acarretando benefícios do
ponto de vista técnico, mas também económico. É importante fazer a distinção entre dois conceitos:
têxteis com auto-limpeza e têxteis de fácil limpeza. O último conceito baseia-se na super
hidrofobicidade da superfície têxtil, ao passo que o conceito de têxtil com auto-limpeza tem um
significado mais amplo, implicando a possibilidade de remoção de uma mancha que se desenvolva
na sua superfície. Além disso, as superfícies com propriedades de auto-limpeza não apresentam
apenas resistência ao manchamento, mas são também repelentes a água, a sujidade em geral, a
odores, e também a microrganismos.
Desenvolvimento de estruturas têxteis auto-limpantes usando enzimas
Ana Lúcia Godinho de Jesus
ISEC, 2011
3
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO GERAL
A produção de têxteis com propriedades de auto-limpeza poderá ser realizada pela utilização de
enzimas hidrolíticas imobilizadas no tecido e que induzem a degradação in situ das nódoas.
Para que este processo tenha sucesso é essencial assegurar a solidez à lavagem e a resistência ao
uso dos têxteis com capacidade auto-limpante, bem como a manutenção das suas propriedades
intrínsecas, tais como a respirabilidade e o toque. Por outro lado, as enzimas hidrolíticas imobilizadas
no tecido poderão ser utilizadas em meios com baixo teor de água, ou serem activadas por um
determinado nível de humidade, permitindo a interacção com as manchas ou partículas que estão em
contacto directo com o substrato têxtil. As enzimas imobilizadas deverão ser suficientemente activas e
estáveis, em condições variadas de armazenamento, de modo a serem aplicadas em roupa e
estarem em contacto directo com a substância a hidrolisar, mantendo a sua actividade catalítica
direccionada para o substrato (por exemplo: resíduos de comida, suor, sangue, etc).
A produção destes têxteis funcionais poderá ser ainda optimizada ao se efectuar um pré-tratamento
da superfície do tecido, com recurso a tecnologias de plasma, ultra-sons e irradiação por ultravioleta.
Desta forma, poderão ser expostos ou incorporados na superfície têxtil, uma variedade de grupos
químicos funcionais activos, resultando no estabelecimento de interacções ácido-base e ligações
covalentes entre a superfície têxtil e as camadas de enzima. O pré-tratamento e acabamento do
tecido com recurso a tecnologias físicas tem vindo a substituir, de forma crescente, os processos
químicos convencionais, uma vez que envolvem operações a baixas temperaturas, e permitem a
manutenção das propriedades intrínsecas do têxtil, bem como a sua a morfologia, modificando
apenas as camadas mais externas da superfície do material. Além disso, este tipo de processos
dispensa a utilização de água e produtos químicos tóxicos, sendo por isso bastante atractivos do
ponto de vista económico e ecológico.
Apesar da importância e inovação reconhecida da problemática abordada verifica-se que, na
literatura, apenas se encontra um reduzido número de trabalhos que a descrevem e referem. Assim
sendo, e de modo a cativar uma maior atenção por parte da comunidade académica bem como da
indústria é fundamental criar estratégias simples mas, ainda assim, eficazes.
Deste modo, uma estratégia possível será aquela que combine:
- a imobilização de enzimas hidrolíticas na superfície do tecido nomeadamente, as contidas em
detergentes biológicos para roupa (proteases, amilases e lipases), através de ligações covalentes;
- o pré-tratamento da superfície do tecido, com recurso a tecnologias de plasma, ultra-sons e
irradiação por ultravioleta de modo a optimizar a imobilização das enzimas e manter a sua actividade;
- a utilização de um dispositivo que permita fornecer um teor de humidade necessário e adequado
para activar as enzimas, providenciando as condições adequadas à ocorrência da hidrólise.
A potencialidade da utilização da tecnologia descrita assenta nos seus benefícios económicos e
ecológicos. De facto, as superfícies com capacidades de auto-limpeza permitem reduzir
Desenvolvimento de estruturas têxteis auto-limpantes usando enzimas
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4
ISEC, 2011
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO GERAL
substancialmente as acções de limpeza, permitindo uma diminuição de custos e o aumento da
durabilidade dos materiais.
1.2
CeNTI: uma próspera ligação entre o mundo empresarial e académico
O Centro de Nanotecnologia e Materiais Técnicos, Funcionais e Inteligentes (CeNTI) surgiu em 2004
como projecto, da colaboração da Universidade do Minho, da Universidade do Porto, da Universidade
de Aveiro, do Centro Tecnológico das Indústrias do Couro (CTIC) e do Centro Tecnológico das
Indústrias Têxtil e do Vestuário de Portugal (CITEVE). O projecto foi concretizado em 2008 após a
selecção de tecnologias inovadoras e instalação em Vila Nova de Famalicão.
O seu sucesso resulta do trabalho e investigação de uma equipa multidisciplinar constituída,
actualmente, por 25 investigadores a tempo inteiro e por 24 técnicos e investigadores, a tempo
parcial. Neste momento várias áreas disciplinares estão abrangidas, nomeadamente na área das
engenharias, a engenharia química, têxtil, dos polímeros, dos materiais, a biotecnologia e electrónica,
e das ciências, a física, química e biologia.
Actualmente o CeNTI fornece, numa base de negócio, apoio à investigação e desenvolvimento
aplicados a projectos de engenharia e de aumento de escala de produção de materiais inovadores e
de dispositivos inteligentes. De entre estes produtos destacam-se os azulejos que são interruptores
de iluminação, as luvas sete vezes mais antiderrapantes do que as existentes no mercado, as toalhas
repelentes à sujidade e os têxteis que permitem a prevenção e controlo de doenças do foro
imunológico.
Nos seus laboratórios possuem tecnologia de ponta, alguma única na Europa, que complementa a
existente nas universidades e laboratórios de investigação do país, e que está inteiramente à
disposição da indústria para a ajudar a definir “como fazer” os seus projectos, de modo a criarem
novos produtos e vencer no mercado global.
1.3
Objectivos e Metodologias
Com o presente trabalho realizado em parceria com o CeNTI pretendeu-se:
(i)
Estudar a possibilidade de utilizar a enzima hidrolítica Alcalase, para remover nódoas in
situ num substrato têxtil, o algodão;
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CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO GERAL
(ii)
Imobilizar a enzima de forma permanente à superfície do tecido recorrendo à técnica de
imobilização por ligação covalente usando como agentes ligantes o glioxal e o plasma
químico;
(iii)
Estudar a cinética enzimática da Alcalase no seu estado livre e imobilizado, determinando
os seus parâmetros cinéticos, a sua estabilidade e efeitos de alguns factores como a
temperatura, o pH e a presença de inibidores e activadores;
(iv)
Verificar a imobilização da enzima e a sua capacidade de remoção de nódoas após a
imobilização.
Para a realização do presente trabalho, foram utilizados vários métodos analíticos alguns dos quais
necessitaram ser optimizados.
Os métodos colorimétricos utilizados foram: o método de Bradford para a determinação da
concentração de proteínas e o método de Folin&Ciocalteaus para a determinação da actividade
enzimática.
Para a imobilização da enzima ao algodão utilizaram-se três técnicas distintas: a impregnação da
enzima, a imobilização por ligação covalente entre a enzima e o algodão usando como agentes
ligantes o glioxal e o plasma químico utilizando o oxigénio e o azoto como gás de arraste.
A verificação da imobilização da enzima foi efectuada por microscopia electrónica de varrimento, e da
capacidade de remoção de nódoas através da medição de reflectâncias aos comprimentos de onda
de 421 e 455 nm.
Os resultados obtidos por computador nomeadamente a determinação de curvas de calibração, a
determinação dos parâmetros cinéticos e a maior parte dos gráficos apresentados nesta tese foram
gerados em Microsoft® Office Excel® 2010 (Microsoft Corporation, EUA) e GraphPad Prism 5
(GraphPad Software).
1.4
Organização da Tese
De acordo com os objectivos definidos anteriormente, este trabalho foi dividido em cinco capítulos
principais. No primeiro capítulo fez-se um breve enquadramento do tema, evidenciando-se ainda a
necessidade da presente investigação, e definiu-se os principais objectivos e metodologias utilizadas
na realização do trabalho.
No segundo capítulo apresenta-se a revisão bibliográfica que recai sobre os principais temas
relacionados com o objecto de estudo, as enzimas, e com o seu uso na indústria têxtil.
Desenvolvimento de estruturas têxteis auto-limpantes usando enzimas
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ISEC, 2011
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO GERAL
O terceiro capítulo diz respeito ao material e métodos utilizados, sendo estes explicados
pormenorizadamente. Os resultados experimentais obtidos durante o decorrer do desenvolvimento do
trabalho, e a discussão dos mesmos são apresentados no quarto capítulo.
Por fim, a síntese do trabalho e conclusões gerais, bem como sugestões para trabalhos futuros
dentro do mesmo campo de estudo são apresentadas no capítulo cinco.
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CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO GERAL
Desenvolvimento de estruturas têxteis auto-limpantes usando enzimas
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CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
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ISEC, 2011
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CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
2.
AS ENZIMAS
A descoberta das enzimas data do século XVIII, quando se iniciaram os estudos sobre a digestão dos
alimentos. Pasteur, no século XIX, estabeleceu o conceito de que as enzimas seriam células vivas,
quando concluiu que a fermentação de açúcar em álcool pela levedura era catalisada por fermentos.
Em 1878, Wilheme Kühne usou o termo “enzima” pela primeira vez, para descrever este fermento,
usando a palavra grega ενζυµον, que significa “levedar”. O termo “enzima” passou, mais tarde,
apenas a ser usado para proteínas com capacidade catalítica, enquanto o termo “fermento” se refere
à actividade exercida por organismos vivos (Dubois 1995, Cabral, Aires-Barros e Gama 2003,
Quintas, Freira e Halpern 2008).
Eduard Buchner, em 1897, descobriu que extractos de levedura podiam fermentar o açúcar
originando álcool, e provou que as enzimas envolvidas na fermentação continuavam a funcionar,
mesmo depois de removidas das células vivas. Esta descoberta valeu-lhe o prémio Nobel da Química
em 1907. Os trabalhos de purificação de enzimas começaram depois de 1920 (Cardoso, Cass e
Moraes 2009). Em 1926, com a obtenção de cristais da enzima urease, James B. Sumner provou
finalmente a natureza proteica das enzimas e recebeu o prémio Nobel da Química em 1946 (Bon,
Ferrara e Corvo 2008).
As enzimas são catalisadores biológicos que aumentam a velocidade das reacções químicas que
ocorrem nas células e organismos, sem se consumirem ou alterarem o equilíbrio químico da reacção,
mesmo quando presentes em pequenas quantidades. Cada uma das enzimas possui um carácter
específico, isto é, apenas actua sobre um determinado substrato convertendo-o em produto. O termo
substrato é utilizado para designar os reagentes que participam nas reacções catalisadas pelas
enzimas.
Na larga maioria dos casos, as enzimas são constituídas por proteínas com actividade catalítica,
polímeros complexos, constituídos por sequências de aminoácidos ligados entre si por uma ligação
peptídica. Cada molécula apresenta uma sequência bem definida de aminoácidos, e a sua variedade
e combinação são responsáveis pela sua diversidade funcional. A ligação peptídica entre os
aminoácidos envolve uma reacção, com perda de uma molécula de água, entre o grupo α-amino de
um aminoácido e o grupo α-carboxilo do aminoácido adjacente, com formação de uma amida. Esta
ligação peptídica é extremamente estável, sendo apenas hidrolisável a valores de pH extremos.
Como já referido, as enzimas apresentam especificidade face aos substratos, que pode ser para com
um grupo de substratos com estruturas semelhantes, ou para com um único substrato. Como
catalisadores, as enzimas são eficientes em quantidades mínimas (em relação às concentrações dos
reagentes) e permanecem inalterados após a libertação dos produtos. As reacções catalisadas por
4
17
enzimas (reacções enzimáticas) ocorrem a velocidades de 10 -10
vezes superiores às
correspondentes reacções na ausência de enzimas (Quintas, Freira e Halpern 2008).
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ISEC, 2011
CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
As enzimas podem ser obtidas a partir de vegetais, animais ou mesmo microrganismos, sendo estes
últimos os mais utilizados a nível industrial em que são utilizados processos fermentativos.
As enzimas actualmente utilizadas a nível industrial representam apenas uma pequena parte das que
existem na natureza. Proteases microbianas estão entre as mais importantes enzimas hidrolíticas e
têm sido estudadas extensivamente desde o início das investigações em enzimologia e engenharia
enzimática. Hoje em dia, as proteases representam mais de 60% das vendas totais de enzimas em
vários sectores industriais do mercado, tais como alimentos, detergentes, farmacêutica, couro,
diagnóstico de gestão de resíduos e recuperação de prata. No entanto, até hoje, a maior fatia do
mercado de enzimas tem sido sustentada por proteases alcalinas e diversas empresas no mundo têm
alcançado com sucesso, nos últimos anos, vários produtos baseados nestas enzimas (C. J. Silva
2005, Espósito, et al. 2009).
2.1
Enzimas: a sua estrutura
A análise estrutural das enzimas pode ser feita em diferentes níveis, dado que estas apresentam uma
estrutura compacta e complexa, em que as dimensões segundo os três eixos são semelhantes.
A estrutura primária da proteína reporta-se à sequência linear dos aminoácidos que compõem a
enzima, sendo esta responsável pelas suas propriedades químicas e biológicas, definindo os níveis
seguintes de organização estrutural. Sabe-se, também, que a ligação peptídica das estruturas
primárias possui um carácter parcial de ligação dupla impedindo assim a sua rotação livre.
A estrutura secundária diz respeito ao arranjo espacial de segmentos da cadeia principal
polipeptídica. Devido ao carácter parcial da ligação dupla CO-NH, apenas pode ocorrer rotação livre
para as ligações adjacentes à ligação peptídica, ou seja, ligação Cα-N (caracterizada por um ângulo
φ) e ligação Cα-C (caracterizada por um ângulo ψ), originando essencialmente dois tipos de estrutura
designados por hélice α e folhas plissadas ou pregueadas β. Estas estruturas estão representadas na
Figura 2.1.
A topologia global da molécula de uma enzima é a estrutura terciária, resultante dos arranjos
estruturais ao nível da cadeia polipeptídica e dos vários tipos de interacções que se estabelecem
entre as cadeias laterais de aminoácidos geométrica e espacialmente próximos. Tem uma
importância fundamental para a actividade biológica das proteínas, uma vez que, resíduos de
aminoácidos muito distanciados podem, de facto, encontrar-se próximos devido a enrolamentos e
formar regiões indispensáveis ao funcionamento da enzima.
Desenvolvimento de estruturas têxteis auto-limpantes usando enzimas
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CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
Figura 2.1. Representação esquemática dos dois tipos de estrutura secundária mais frequentes, hélice α, à esquerda e folha
plissada β, à direita (retirado de Cabral, Aires-Barros e Gama 2003).
O nível da estrutura quaternária existe somente em enzimas multiméricas, isto é, constituídas por
duas ou mais cadeias polipeptídicas associadas entre si, implicando a interacção, por ligações fracas,
de subunidades polipeptídicas. A proteína é, portanto, oligomérica, sendo um dímero se for composta
por duas subunidades e é um tetrâmero se for composta por quatro subunidades. Os diferentes tipos
de cadeias polipeptídicas são designados por letras gregas.
As propriedades funcionais das proteínas são determinadas a partir de forças físicas que advêm de
interacções simultâneas entre as várias partes da molécula, em função da disposição e orientação
dos seus grupos funcionais. De modo geral, estas ligações podem ser: (i) ligações covalentes, onde
se estabelecem pontes dissulfureto entre os resíduos; (ii) forças de Van der Walls, caracterizadas por
serem interacções do tipo electrostático entre as moléculas e os grupos polares não carregados; (iii)
pontes de hidrogénio; (iv) interacções electrostáticas e (v) interacções hidrófobas, dando-se as
primeiras entre grupos com cargas muito próximas, enquanto as segundas são estabelecidas entre
grupos hidrófobos próximos (Cabral, Aires-Barros e Gama 2003, Boyer 2005, Garrett e Grisham
2005).
As enzimas apresentam na sua anatomia pequenas regiões localizadas, os centros catalíticos, dos
quais se destaca o centro activo da enzima, sendo estes não só responsáveis, como também estando
directamente envolvidos nas reacções de catalisação (Carneiro 2003).
O centro activo da enzima ocupa apenas uma pequena parte do seu volume total, e é formado por
partes específicas da sequência linear dos aminoácidos que a constituem, estabelecendo ligações
múltiplas. Normalmente é uma cavidade hidrofílica que possui três tipos essenciais de configuração:
em fenda, isto é, uma depressão pouco profundo ou em poço, dependendo do local onde a enzima
tem que se ligar ao substrato. O centro activo em forma de fenda surge em enzimas que actuam em
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ISEC, 2011
CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
ligações mais expostas, mas se pelo contrário, a ligação estiver no interior das moléculas, a enzima
deve apresentar um centro activo em depressão, que lhe permita ficar encostada ao substrato. Para
as ligações que se encontram nas extremidades das cadeias, então o centro activo em forma de
poço, no qual a cadeia deve encaixar é o ideal (Cabral, Aires-Barros e Gama 2003, Carneiro 2003).
Dependendo do arranjo de átomos no centro activo foram propostos dois modelos, o modelo da
chave e fechadura e o modelo de ajuste induzido (Figura 2.2). No modelo da chave e fechadura, o
substrato e a enzima encaixam de forma precisa um no outro, o que implica que o centro activo da
enzima seja muito rígido e inflexível, enquanto no modelo de encaixe induzido, o centro activo da
enzima é flexível, moldando-se ao substrato e alterando a sua forma de modo continuo, devido à
flexibilidade da estrutura tridimensional das enzimas, o que leva a mudanças conformacionais do
centro activo. Este último é o modelo mais aceite actualmente (Cabral, Aires-Barros e Gama 2003,
Boyer 2005).
Figura 2.2. Modelos de arranjo dos átomos no centro activo da enzima: Modelo da chave e fechadura, em cima e Modelo de
encaixe induzido, em baixo (retirado de Boyer 2005).
É frequente as enzimas não serem apenas proteínas puras, sendo constituídas também por
pequenas quantidades de moléculas não proteicas ou inorgânicas, designadas de cofactores, mas se
este cofactor for uma molécula orgânica denomina-se de coenzima. À enzima sem o cofactor chamase apoenzima, inactiva isoladamente, e quando esta está ligada ao cofactor forma uma holoenzima,
tornando-se activa. Quando são necessários os cofactores, a enzima contém outros centros para
ligações adicionais. Portanto uma enzima para além dos resíduos de aminoácidos pode conter
também coenzimas ou iões, que intervêm na catálise enzimática (Jr., Chan e Krieg 1996, Cabral,
Aires-Barros e Gama 2003).
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CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
2.2
Classificação das enzimas
Devido ao rápido crescimento da Enzimologia e ao grande número de enzimas conhecidas, surgiram
algumas dificuldades de terminologia. Tendo em conta esta situação, em 1961, a Comissão para as
Enzimas (Enzyme Commission – EC) da União Internacional de Bioquímica (International Union of
Biochemistry – IUB), recomendou uma classificação e nomenclatura, que hoje em dia é a mais aceite.
Assim, as enzimas foram divididas em seis classes diferentes, de acordo com a reacção catalisada,
sendo elas (Quintas, Freira e Halpern 2008):
(i)
as óxido-redutases, que catalisam reacções de oxidação.
Incluem-se nesta classe as enzimas desidrogenases ou redutases (com co-enzimas
+
+
NAD ou NADP ), oxidases (redução do oxigénio molecular), oxigenases (incorporação
de oxigénio na substância oxidada e ainda as peroxidases (hidrogénio molecular como
redutor).
(ii)
as transferases, que catalisam reacções de transferência de átomos ou grupos químicos
entre compostos.
Nesta classe estão incluídas as aminotrasferases (transferência de grupos amina), as
cinases (transferência de grupos fosforilo a partir de ATP), as fosforilases (transferência
de grupos fosforilo a partir de fosfato inorgânico) e também as glicosilo transferases.
(iii)
as hidrolases que catalisam reacções de hidrólise.
É a classe mais extensa de enzimas contudo, poderia ser considerada um subgrupo das
transferases. Estão incluídas nesta classe, entre outras, as lipases, fosfolipases,
proteases, esterases, glicosidases e fosfatases. São as enzimas mais utilizadas a nível
industrial.
(iv)
as liases que são as enzimas responsáveis pelas reacções de remoção ou fixação de
grupos químicos, envolvendo ligações C-C, C-N e C-O de forma não hidrolítica e
deixando ligações duplas.
Na reacção inversa, uma liase catalisa a adição de um substrato a uma ligação dupla de
outro substrato. Nesta classe incluem-se as descarboxílases (removem CO2), as
aldolases (removem aldeídos) e as desidratases e hidratases (removem e fixam H2O,
respectivamente).
(v)
as isomerases que catalisam reacções de isomerização. Incluem-se as epimerases
(transformam epímeros entre si) e as racemases (transformam enantiómeros entre si).
(vi)
as ligases (sintetases) que promovem a formação de ligações entre dois substratos
acoplelados à hidrólise de uma ligação pirofosfato do ATP ou de nucleósido trifosforilado
análogo. As enzimas desta classe são designadas, de uma maneira geral, por
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ISEC, 2011
CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
carboxilases pois catalisam a união de CO2 com formação de ligações C-C. (Cabral,
Aires-Barros e Gama 2003).
A acção de uma enzima é descrita, tanto quanto possível, por um nome sistemático, formado de
acordo com as regras definidas pela UIB, identificando-a sem margem para dúvidas.
A designação sistemática de uma enzima deve ser sempre acompanhada, quando esta é pela
primeira vez mencionada num texto, do número de código e de origem. Este número de código
antecedido por E.C. contém quatro elementos com o seguinte significado: o primeiro algarismo diz
respeito a uma das seis classes de reacções catalisadas, o segundo e terceiro algarismos referem-se
à subclasse e sub-subclasse, respectivamente, e o quarto algarismo indica o número de série na
respectiva sub-subclasse, isto é, o tipo de substrato usado na reacção, como por exemplo, o código
para proteases alcalinas, que é E.C. 3.4.21.14 (Kumar e Takagi 1999, Quintas, Freira e Halpern
2008).
2.3
Cinética enzimática
A cinética enzimática estuda a velocidade de uma reacção na presença de uma enzima. Os estudos
cinéticos fornecem informações sobre os mecanismos envolvidos na reacção catalítica, através da
análise do efeito de factores como a temperatura, pH, actividade catalítica, e mecanismos da catálise
enzimática. Além disso, permite obter mecanismos reaccionais plausíveis, que descrevem em detalhe
as espécies intermédias que intervêm nas reacções entre substratos e produtos.
Ao misturar-se uma enzima com um excesso de substrato, verifica-se a existência de um período
inicial, chamado de pré-estacionário, durante o qual os complexos enzima-substrato aumentam até
atingirem o estado estacionário, onde a velocidade de reacção começa a variar mais lentamente ao
longo do tempo. Este estado estacionário é apenas uma aproximação, dado que, a concentração do
substrato vai sempre diminuindo à medida que a reacção prossegue, no entanto, se for considerado
um intervalo de tempo relativamente curto, pode-se estipular que a concentração dos complexos
enzima-substrato é constante e que a concentração do substrato não varia significativamente.
Se se seguir o aparecimento de um produto através de medições experimentais de concentrações de
substrato em função do tempo obtém-se uma curva de progressão para a reacção (Figura 2.3), que
representa a variação da velocidade da reacção com a variação da concentração do substrato,
verificando-se que para condições catalíticas especificas de pH e temperatura, a velocidade inicial é
directamente proporcional à concentração total de enzima (Cabral, Aires-Barros e Gama 2003,
Quintas, Freira e Halpern 2008).
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CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
v
vmáx
½ vmáx
Km
[S]
Figura 2.3. Curva de progressão de uma reacção enzimática (retirado de Quintas, Freira e Halpern 2008).
Michaelis e Menten propuseram em 1913, a Equação (1) para explicar resultados experimentais
sobre a cinética enzimática, onde consideraram que, estudando só o período inicial da reacção, a
concentração do produto é desprezável e por isso pode-se também ignorar a reacção inversa de
formação do complexo enzima-substrato a partir da enzima e do produto. Por outro lado, pode-se
considerar também que a combinação da enzima com o substrato é instantânea, rápida e reversível,
ficando ambos ligados por forças físicas e a conversão do complexo enzima-substrato em enzima e
produtos é muito lenta, não alterando o equilíbrio atingido anteriormente.
E S ↔ ES ↔ E P
(1)
Dado as enzimas possuírem uma elevada eficiência catalítica, a sua concentração pode ser
desprezada se comparada com a concentração do substrato, quando se estuda a cinética enzimática
do estado estacionário, então Michaelis e Menten obtiveram a expressão:
v vá
S
K S
(2)
Na qual v é a velocidade da reacção, vá é a velocidade máxima da reacção, S é a concentração
de substrato e K é a constante de Michaelis-Menten.
A análise da Equação (2) revela que para concentrações de substrato muito inferiores ao valor de K (S ≪ K ) a velocidade varia linearmente com a concentração de substrato, a reacção será de
primeira ordem. À medida que a concentração de substrato aumenta deixa de se verificar esta
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ISEC, 2011
CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
relação e para valores suficientemente elevados da sua concentração, ou seja, saturantes, (S ≫
K ), a velocidade torna-se independente da concentração de substrato, a reacção será de ordem
zero. Nestas condições, a velocidade tende para um valor limite, a velocidade máxima de reacção,
vá , de uma forma assitótica. A constante de Michaelis-Menten corresponde à concentração de
substrato para a qual a velocidade é igual a metade do valor da velocidade máxima da reacção
(v 12 vá ), ou em casos semelhantes também é igual à constante de dissociação do complexo
enzima-substrato.
A determinação dos parâmetros cinéticos K e vá é possível transformando a equação de
Michaelis-Menten numa forma linear, o que permite uma análise gráfica dos resultados e a detecção
de eventuais desvios ao comportamento ideal. Através de inversão directa dos termos da equação de
Michaelis-Menten obtém-se a equação de Lineweaver-Burk que é apresentada de seguida,
1
K 1
1
v vá S vá
(3)
Representando em função de obtém-se uma recta de declive
abcissa na origem igual a á
com ordenada na origem
á
e
. No entanto, esta representação tem a desvantagem de comprimir
pontos experimentais correspondentes a concentrações elevadas de substrato numa pequena parte
do gráfico e dar ênfase a pontos correspondentes a concentrações mais baixas (Cabral, Aires-Barros
e Gama 2003).
1/v
Km/vmáx
-1/Km
1/vmáx
1/[S]
Figura 2.4. Representação gráfica da equação de Lineweaver-Burk, (retirado de Quintas, Freira e Halpern 2008.
Para superar as desvantagens apresentadas pela equação de Lineweaver-Burk, outros autores
apresentaram alternativas para determinar os parâmetros cinéticos com menores erros associados.
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17
CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
Assim, multiplicando ambos os membros da equação de Lineweaver-Burk (3), por vá , obtém-se a
equação de Eadie-Hofstee:
v K Representando v em função de
vá , (Figura 2.5).
v
vá
S
(4)
obtém-se uma recta de declive K e ordenada no origem igual a
Esta representação é considerada superior à anterior, mas a relação entre as variáveis v e S não se
lêem tão directamente apresentando assim, dificuldades experimentais na sua implementação
(Cabral, Aires-Barros e Gama 2003). Manipulando a equação de Lineweaver-Burk (3) podem ser
obtidas outras linearizações como é o caso da linearização de Hanes-Woolf, que se obtém
multiplicando a Equação (3) por S dando origem à equação seguinte:
S
1
K
S v
vá
vá
v
(5)
vmáx
-Km
vmáx/Km
v/[S]
Figura 2.5. Representação gráfica da equação de Eadie-Hofstee, (retirado de Quintas, Freira e Halpern 2008).
Representando
á
em função de S obtém-se uma recta de declive
e ordenada no origem igual a
, (Figura 2.6).
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18
á
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CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
[S]/v
1/vmáx
-Km
Km/vmáx
[S]
Figura 2.6. Representação gráfica da equação de Hanes-Woolf, (retirado de Quintas, Freira e Halpern 2008).
O uso da equação de Eadie-Hofstee é o mais simples, uma vez que os coeficientes angular e linear
da recta fornecem directamente os valores de K e vá . A equação de Hanes-Woolf foi investigada
por Lineweaver e Burk que concluíram que a sua equação produzia melhores resultados para
concentrações baixas de substrato. No entanto, quando o erro de v é pequeno recomenda-se o uso
da equação de Hanes-Woolf e quando este é grande o uso da equação de Eadie-Hofstee (Cabral,
Aires-Barros e Gama 2003, Garrett e Grisham 2005, Quintas, Freira e Halpern 2008, Carvalho, et al.
2010).
2.3.1
2.3.1.1
Factores que afectam a cinética enzimática
A temperatura
A temperatura afecta a velocidade das reacções enzimáticas devido à natureza proteica das enzimas.
A estrutura terciária das enzimas e a estabilidade do complexo enzima-substrato são
consideravelmente afectados pelo aumento da temperatura até um determinado valor, designando-se
por temperatura de desnaturação. Tipicamente a velocidade da reacção passa por um máximo para
uma dada temperatura e para valores superiores a esta a velocidade da reacção decresce
rapidamente, levando à perda de actividade enzimática que resulta da desnaturação da proteína.
De um modo geral, a actividade enzimática aumenta com o aumento da temperatura, no entanto, é
dependente do tipo de enzima, correspondente a um factor (Q10) de 1,4 a 2 vezes por cada aumento
de 10 °C (entre 10 e 30 °C), o que equivale a varia ções na actividade de 4-10 % por variação de 1 °C.
Este factor é definido como a razão entre as actividades determinadas a duas temperaturas com
10 °C de diferença. Por isso é fundamental que dete rminações da actividade enzimática sejam
realizadas a temperaturas fixas e constantes, como também que todas as soluções utilizadas sejam
mantidas a essa temperatura (Garrett e Grisham 2005, Quintas, Freira e Halpern 2008).
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19
CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
2.3.1.2
O pH
Para a maioria das enzimas existe um valor de pH para o qual a formação do complexo enzimasubstrato é favorecida e a actividade enzimática é máxima, esse valor de pH é designado por pH
óptimo. Este varia com a temperatura e com a concentração de substrato, uma vez que o substrato
apresenta cargas eléctricas que o aproximam ao centro activo da enzima, dependendo também da
carga dos resíduos envolvidos na ligação.
As enzimas comportam-se cineticamente de modo diferente consoante o pH do meio. Assim, se se
tornar demasiado ácido ou demasiado básico o meio, a enzima perde a sua actividade enzimática
irreversivelmente, ou seja, esta não é recuperada se houver um reajuste do pH. Por outro lado, para
pequenas variações de pH, a enzima perde parte da sua actividade de modo reversível, sendo esta
recuperada aquando o reajuste do pH. Uma explicação plausível para este facto é a presença de
grupos ionizáveis determinantes na actividade enzimática, que actuam como ácidos ou bases gerais,
ou como nucleófilos em reacções catalisadas enzimaticamente (Cabral, Aires-Barros e Gama 2003,
Quintas, Freira e Halpern 2008).
2.3.2
Estabilidade enzimática
A variação da actividade da enzima ao longo do tempo é indicada pela estabilidade enzimática, pelo
que uma fraca estabilidade da preparação enzimática traduz uma rápida perda da sua actividade. Em
condições moderadas as enzimas são bons catalisadores em termos de actividade catalítica,
selectividade e capacidade de funcionamento. Contudo, é de realçar que a aplicação limitada de
enzimas na indústria é também devida à fraca estabilidade operacional em certas condições
presentes nos processos industriais. É sabido que a função biológica das enzimas está intimamente
ligada à sua estrutura tridimensional, logo a preservação desta é fundamental em todas as aplicações
envolvendo as enzimas, o que nem sempre acontece nos processos industriais devido às condições
extremas de operação (Cabral, Aires-Barros e Gama 2003, Boyer 2005, Quintas, Freira e Halpern
2008).
A perda de actividade das enzimas, ou seja, a sua desactivação pode ser devida a diversos factores,
tais como, elevadas temperaturas, pH demasiado alcalino ou demasiado ácido, ou por acção de
agentes desnaturantes ou inibidores. Estes são talvez os modos mais importantes de desactivação
enzimática na indústria têxtil, devendo-se ao facto de se operar a temperaturas elevadas e valores de
pH não neutros. Acresce ainda o facto de muitos substratos serem insolúveis e apenas dissolvidos a
elevadas temperaturas ou em solventes orgânicos (Carneiro 2003).
Desenvolvimento de estruturas têxteis auto-limpantes usando enzimas
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20
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CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
2.3.3
Inibição enzimática
Inibidores são substâncias que ao interagirem com as enzimas provocam uma diminuição na sua
actividade enzimática. Podem ser substâncias naturais, como os elementos de regulação do
metabolismo celular; ou sintéticos, como medicamentos ou insecticidas.
As enzimas podem ser inactivadas reversível ou irreversivelmente de diversos modos, como por
exemplo pela acção do calor ou de reagentes químicos, onde a enzima se liga covalentemente ao
reagente, mas também podem ser inibidas por ligação não covalente aos inibidores, (Cabral, AiresBarros e Gama 2003). Podem ser considerados vários tipos de inibição reversível das enzimas,
sendo as mais comuns a inibição competitiva, a inibição não-competitiva e a anticompetitiva. Na
inibição competitiva, o inibidor assemelha-se ao substrato ocupando o centro activo da enzima,
enquanto na inibição não competitiva, o inibidor é diferente do substrato ligando-se à enzima num
local diferente do centro activo, podendo ligar-se também ao complexo enzima-substrato, segundo a
reacção:
E
+
S
k
ES E +
P
+
I
↕ k EI
+
S
+
I
↕ k′
ESI
(6)
Onde k e k′ são as constantes de dissociação dos complexos EI e ESI, respectivamente. Partindo do
principio que a ordem da reacção é aleatória, considera-se que k = k′ e então a velocidade da
reacção é dada por:
v=
S
k C
I K + S
1+
k
(7)
Onde C é a soma da concentração de enzima com a concentração do complexo enzima-substrato.
Comparando com o caso em que não existe qualquer inibidor, obtém-se para a velocidade máxima
de reacção:
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21
CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
vá ′ vá
I
1
k
(8)
Ou seja, a velocidade máxima fica dividida sempre por um factor maior que 1, pelo que vá ′ vá
como se mostra na Figura 2.7 (Cabral, Aires-Barros e Gama 2003, Boyer 2005, Quintas, Freira e
Halpern 2008).
Figura 2.7. Representação de Lineweaver-Burk com o efeito de um inibidor não-competitivo (retirado de Cabral, Aires-Barros e
Gama 2003).
Na inibição competitiva o inibidor e o substrato competem pelo centro activo da enzima, segundo a
reacção:
E
I
↕ k EI
S
k
ES E P
(9)
Onde, mais uma vez k é a constante de dissociação do complexo EI. A velocidade de reacção neste
caso é dada por:
v k C
1
I 1
1 1
k (10)
Comparando a constante de Michaelis-Menten com o caso em que não existe inibidor:
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CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
K ′ K !1 Ou seja, K vem multiplicado por factor de 1 I
"
k
(11)
que é sempre maior que 1, verificando-se então,
K ′ # K , (Figura 2.8).
Figura 2.8. Representação de Lineweaver-Burk com o efeito de um inibidor competitivo (retirado de Cabral, Aires-Barros e
Gama 2003).
A velocidade máxima de reacção é a mesma porque concentrações infinitamente elevadas de
substrato removem o inibidor do centro activo da enzima (Cabral, Aires-Barros e Gama 2003, Boyer
2005, Quintas, Freira e Halpern 2008).
Na inibição anticompetitiva o inibidor liga-se directamente e apenas ao complexo enzima-substrato e
não à enzima livre. Nesta reacção a ordem de ligação do substrato e do inibidor é obrigatória,
ligando-se primeiro o substrato e depois o inibidor.
E
S
ES
I
↕ k ESI
k E
P
(12)
A velocidade de reacção neste modelo é determinada a partir de:
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23
CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
v
k C
I $
1
S
k
I
1
k
(13)
Comparando com o caso em que não existe inibidor, tem-se que K ′ # K e vá ′ vá (Figura 2.9)
(Cabral, Aires-Barros e Gama 2003, Boyer 2005, Quintas, Freira e Halpern 2008).
O efeito da concentração de inibidor nas representações gráficas lineares permite distinguir entre os
dois tipos de inibição e obter o valor de k .
Figura 2.9. Representação de Lineweaver-Burk com o efeito de um inibidor anticompetitivo (retirado de Cabral, Aires-Barros e
Gama 2003).
Numa outra vertente existem substâncias que se unem às enzimas aumentando a sua actividade
enzimática, estando frequentemente envolvidas na regulação alostérica de enzimas no controlo do
metabolismo.
De salientar que apenas se apresentam estes três exemplos de inibição por serem os mais
importantes para a realização deste trabalho.
2.4
Imobilização de enzimas
Um aspecto importante na utilização de enzimas em processos tecnológicos é o seu preço, de facto,
a utilização de enzimas na sua forma livre tem implicado agravamentos nos custos de operação,
principalmente na sua recuperação devido em parte à sua reduzida estabilidade. De entre os factores
responsáveis por essa reduzida estabilidade pode citar-se a inibição pelo substrato e/ou produto ou
inertes presentes no meio reaccional, a elevada instabilidade operacional das enzimas e ainda
factores dependentes da escala de operação, como as elevadas tensões de corte, gradientes de
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24
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CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
pressão e temperatura, etc., susceptíveis de induzir a rápida desnaturação das enzimas (Ramos
1991).
Genericamente pode-se tirar um maior partido das enzimas, se forem utilizados métodos de
imobilização que podem ser definidos como métodos que condicionam as enzimas no seu
movimento, ou seja, a enzima fica ligada a um suporte. A imobilização das enzimas é utilizada por
diversas razões, entre elas, uma maior facilidade na sua aplicação industrial, uma vez que as
enzimas na sua forma livre podem ser difíceis de separar do meio reaccional e ser utilizadas em
processos de operação em contínuo, ou ainda, em processos de operação em catálise heterogénea
com elevada actividade biocatalítica em volume reduzido. A capacidade de ligação das enzimas
depende da densidade de locais de ligação à superfície, área superficial volumétrica, distribuição de
carga e polaridade da superfície (carácter hidrofóbico/hidrofílico), quer na enzima, quer no suporte.
O termo “enzima imobilizada” inclui: (i) a modificação de enzimas de forma a torna-las insolúveis em
água; (ii) a utilização de enzimas na forma solúvel em reactores equipados com membranas de
ultrafiltração, que permitem o escoamento dos produtos da reacção, mas retêm a enzima no interior
do reactor; (iii) a restrição da mobilidade de enzimas pela ligação a outra molécula, que torna o
sistema insolúvel no meio da reacção. O sistema imobilizado permite, como já referido, a condução
de reacções em reactores contínuos, com fácil separação de catalisador/produto, e o aumento da
produtividade do processo (Bon, Ferrara e Corvo 2008).
Os vários métodos de imobilização baseiam-se nas ligações físicas e químicas entre as biomoléculas
e o suporte. Os mais utilizados são: adsorção física, ligação iónica, ligação covalente, métodos de
oclusão, microencapsulação e micelas invertidas.
A adsorção física é o método mais simples e mais antigo, de aplicabilidade generalizada envolvendo
forças de interacção de baixa energia, como as forças de Van der Waals, pontes de hidrogénio e
interacções hidrofóbicas. A ligação efectua-se através do contacto da enzima com o suporte e
posterior lavagem das enzimas que não foram ligadas, sem qualquer modificação prévia da matriz ou
do biocatalisador. Este método, de custo reduzido, assegura uma retenção elevada da conformação
nativa da enzima e da sua actividade intrínseca. Possui, ainda, as vantagens de uma fácil obtenção
de complexos activos, do método não ser de todo lesivo preservando a actividade dos
biocatalisadores e também pode ser utilizado em células, para além das enzimas. Porém, as forças
entre o biocatalisador e o suporte são fracas e facilmente podem conduzir à sua desorção, sendo
ainda influenciadas pelas condições operacionais, nomeadamente, a força iónica, pH, temperatura e
constante dieléctrica do meio, e portanto existe a necessidade de manter constantes as condições de
operação. Outras desvantagens associadas a este método residem na possibilidade de sobrecarga
do suporte, de onde pode resultar uma redução da actividade específica, bem como, a deposição de
espécies carregadas, que podem originar modificações dos parâmetros cinéticos (Cabral, AiresBarros e Gama 2003, Cardoso, Cass e Moraes 2009).
Desenvolvimento de estruturas têxteis auto-limpantes usando enzimas
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25
CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
A ligação iónica é devida à atracção entre cargas eléctricas de sinais contrários à superfície do
biocatalisador e do suporte. Esta união pode ser utilizada como uma forma de imobilização por
adsorção iónica, que no fundo é mais efectiva que a adsorção física, mas torna-se inferior quando
comparada com outros métodos. Ao contrário da adsorção física, esta permite a regeneração do
biocatalisador, porém as suas ligações são menos estáveis que as ligações covalentes (Cabral,
Aires-Barros e Gama 2003, Bon, Ferrara e Corvo 2008, Cardoso, Cass e Moraes 2009).
A imobilização por ligação covalente é um dos métodos mais estudados para a imobilização de
enzimas, envolve a formação de ligações covalentes entre os grupos funcionais presentes na
superfície do suporte e os resíduos de aminoácidos da enzima. O grande número de processos que
visam a activação da superfície e a formação de ligações covalentes permite a sua aplicação a uma
vasta gama de sistemas. No entanto, a sua aplicação é muitas vezes limitada pelo elevado custo de
algumas matérias-primas, complexidade de certos processos de imobilização e uma considerável
perda de actividade enzimática. No entanto, este método de imobilização origina biocatalisadores
muito estáveis, não se registando qualquer remoção da enzima numa vasta gama de condições
operacionais (Cabral, Aires-Barros e Gama 2003).
Este método de imobilização envolve a formação de uma forte ligação covalente entre a enzima e o
suporte ou matriz. A utilidade relativa dos grupos funcionais encontrados nas enzimas para formar a
ligação depende da sua disponibilidade, nucleofilicidade e estabilidade depois da formação da
ligação. Os resíduos de lisina são os mais utilizados para efectuar a ligação covalente a suportes
insolúveis devido à sua exposição de superfície e alta reactividade, especialmente em soluções
ligeiramente alcalinas (C. J. Silva 2005).
Como vantagens, a imobilização covalente evita o fenómeno de desorção, a diminuição da
velocidade de desactivação espontânea, além de aumentar o tempo de vida útil e a estabilidade
térmica do biocatalisador. As ligações covalentes promovem rigidez na estrutura da enzima, limitando
o seu movimento quando submetida a altas temperaturas. No entanto, apresenta como desvantagem
a facilidade em alterar a estrutura terciária nativa da enzima, com subsequente redução da actividade
catalítica. Neste tipo de imobilização, pode-se recorrer ao uso de espaçadores, moléculas que se
ligam entre os biocatalisadores e o suporte de modo a aumentar a mobilidade de ambos, evitando
assim, a inacessibilidade do substrato ao centro activo do biocatalisador e aumentando a sua
actividade enzimática (Cabral, Aires-Barros e Gama 2003, Cardoso, Cass e Moraes 2009).
Existem outros métodos de imobilização de enzimas, designados por métodos de oclusão, como a
imobilização por oclusão em gel, em que a enzima está livre em solução, mas com o seu movimento
restrito por uma rede de gel ou polímero, não estabelecendo ligações químicas, nem registando
alterações estruturais ou interacções com o centro activo enquanto os substratos/produtos se podem
difundir através da matriz. As principais limitações associadas ao uso deste método residem na baixa
estabilidade mecânica e na reduzida longevidade do gel, podem também verificar-se limitações
significativas à transferência de massa que ocorre apenas por difusão (Cabral, Aires-Barros e Gama
2003, Bon, Ferrara e Corvo 2008).
Desenvolvimento de estruturas têxteis auto-limpantes usando enzimas
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26
ISEC, 2011
CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
A imobilização por microencapsulação consiste no envolvimento das enzimas por membranas semipermeáveis, e compreende a imobilização em microcápsulas, por micelas invertidas formadas por
surfactantes, e ainda a bioencapsulação sol-gel. Permite obter uma gama de porosidade com várias
ordens de magnitude, dependendo da natureza, porosidade e dimensões da membrana, definidas de
modo a que esta se adapte ao sistema reaccional escolhido. Oferece menores restrições à
transferência de massa do que a oclusão em gel, devido às menores dimensões das partículas de
suporte e, por consequente maior área específica. Dependendo da natureza do material que constitui
as microcápsulas, as enzimas possuem maior estabilidade química e mecânica, têm a possibilidade
de incorporar nutrientes ou co-substratos, que contribuem para a viabilidade da enzima e/ou para
incrementar velocidade na biotransformação (Cabral, Aires-Barros e Gama 2003).
As micelas invertidas são agregados quase esféricos de moléculas de tensioactivos, onde a camada
externa é constituída pelas caudas hidrófobas das moléculas dos tensioactivos, enquanto o interior
das micelas são constituídos pelos grupos polares dessas moléculas. Uma vez que se formam
espontaneamente quando um tensioactivo é dissolvido num solvente orgânico apolar, os sistemas de
micelas invertidas são fáceis de preparar, bastando adicionar a enzima, com agitação, à solução de
solvente orgânico contendo um tensioactivo. Estes sistemas têm sido muito utilizados para
conversões enzimáticas em que os substratos são pouco solúveis (Cabral, Aires-Barros e Gama
2003).
Na imobilização por ligação cruzada, o suporte não é necessário uma vez que as enzimas estão
ligadas umas às outras, ou a proteínas inactivas, formando uma estrutura tridimensional complexa
(Cabral, Aires-Barros e Gama 2003, Cardoso, Cass e Moraes 2009).
Todos os exemplos de métodos de imobilização apresentados são métodos de imobilização em
suportes sólidos, onde as enzimas são retidas à superfície de um sólido mediante uma vasta gama
de interacções estabelecidas entre a matriz e a enzima, desde forças de Van der Waals a ligações
covalentes, como já referido.
A imobilização da enzima envolve o seu manuseamento, o que adiciona custos ao processo e
invariavelmente resulta na sua inactivação parcial. Para melhor aproveitamento da técnica, deve-se
utilizar elevadas concentrações de enzima relativamente ao suporte. Como os métodos de
imobilização envolvem interacções fracas ou fortes, entre a frágil estrutura da enzima e o suporte
ocorre alteração da estrutura tridimensional da proteína, resultando numa menor actividade
enzimática, ou ainda levando à redução aparente da especificidade pelo substrato. Isto poderia ser
vantajoso porque diminui os efeitos de inibição pelo substrato. Porém, como a maior parte dos
processos enzimáticos envolvem transformação de macromoléculas, a redução da especificidade é
uma desvantagem, que pode ser superada protegendo o centro activo da enzima durante o processo
de imobilização, empregando-se altas concentrações de substrato ou um inibidor no centro activo.
Nestes casos, as substâncias protectoras devem ser facilmente removidas no final do processo de
imobilização (Bon, Ferrara e Corvo 2008).
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ISEC, 2011
27
CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
As enzimas imobilizadas têm uma série de características especiais que tornam as suas aplicações
mais promissoras em relação às enzimas livres. Existem na literatura muitos trabalhos e livros que
apresentam e discutem o uso de enzimas imobilizadas nos campos industrial, analítico, médico,
química fina, entre outros (Chibata 1978). De entre as aplicações de enzimas imobilizadas em larga
escala, e que são consideradas um sucesso, podem citar-se: a produção de xaropes de glicose e
frutose a partir de amido de milho, a produção de ácido 6-aminopenicilínico, penicilina semi-sintética,
com a enzima penicilina-G ou L-acilase, cuja produção mundial é da ordem de 5000 ton/ano, a
produção de acrilamida empregando células imobilizadas, a produção de termolisina imobilizada e a
hidrólise da lactose presente no soro do queijo (Bon, Ferrara e Corvo 2008).
2.5
As enzimas: sua aplicação na Industria Têxtil
Muitos processos de transformação química em diversas indústrias possuem desvantagens sob o
ponto de vista comercial e ambiental, nomeadamente: (i) a ocorrência de reacções indesejadas que
podem resultar num baixo rendimento de produto; (ii) a necessidade de utilização de temperaturas
e/ou pressões elevadas para levar a cabo as reacções pretendidas, requerendo um aumento de
energia e grandes quantidades de água de refrigeração; (iii) a utilização de duros e perigosos
processos envolvendo temperaturas, pressões, acidez ou alcalinidade elevadas necessitando de um
elevado custo de investimento especialmente concebido para sistemas de controlo e equipamentos
específicos; (iv) a formação de subprodutos indesejáveis e que podem revelar-se difíceis e caros de
eliminar; e (v) o excesso de consumo de energia, de produtos químicos bem como os subprodutos
formados podem ser prejudiciais e ter um impacto negativo para o ambiente.
Em muitos casos, estes inconvenientes podem ser praticamente eliminados com o uso de enzimas,
uma vez que, as reacções enzimáticas podem ser realizadas sob condições moderadas e envolvem
reacções altamente específicas. Assim, as condições de operação moderadas permitem o uso de
equipamentos amplamente disponíveis para serem usados a nível industrial, envolvendo processos
mais fáceis de controlar. O uso de enzimas também reduz o impacto da produção sob o meio
ambiente através da redução do consumo de produtos químicos, água e energia, logo uma
subsequente redução de resíduos. Por outro lado, as enzimas de origem microbiana para uso a nível
industrial contribuem para um desenvolvimento sustentável pois o seu isolamento a partir de
microrganismos é feito principalmente através do uso de recursos renováveis (Banerjee, Sani e Soni
1999, Banik e Prakash 2004, Espósito, et al. 2009, www.novozymes.com 2010).
Há muitos anos que a aplicação das enzimas na indústria têxtil é conhecida. As primeiras aplicações
remontam a meados do século XIX. É uma tecnologia com baixo impacto ambiental e por isso, é
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28
ISEC, 2011
CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
objecto de estudo aprofundado. As primeiras aplicações enzimáticas na indústria têxtil consistiam na
modificação química da superfície da fibra do algodão, de modo a melhorar as suas propriedades, por
remoção de componentes indesejáveis adsorvidos como gorduras, ceras, etc..
O algodão é uma fibra natural de origem vegetal, proveniente da planta Glossypium. Existem diversas
variedades de algodão, que dependem da sua origem geográfica e do grau de maturação da planta.
Na sua composição o algodão, para além da celulose em excesso, possui também gorduras, ceras,
óleos, pectoses, pectinas, proteínas e compostos azotados, ácidos orgânicos e material corante
natural. Os tecidos e os fios de algodão podem possuir ainda na sua composição, sujidades,
encolantes e óleos de máquinas, resultantes dos processos de fabrico (Cavaco Paulo 1995).
As fibras do algodão têm uma estrutura multifibrilar ao longo do seu comprimento, apresentando
várias camadas consecutivas, cujo corte transversal se assemelha a um feijão, (Figura 2.10).
Figura 2.10. Representação esquemática da morfologia da fibra de algodão (retirado de Cavaco Paulo 1995).
Os tratamentos enzimáticos têm vindo a ser introduzidos em várias etapas dos processos têxteis de
forma a satisfazer as necessidades de qualidade dos materiais, resultando daí vários benefícios que
não se conseguiriam obter com os tradicionais processos químicos, como redução do consumo de
energia, menor custo de produção e também menor carga poluente dos efluentes têxteis (Soares
2000, www.genencor.com 2010).
O processo de remoção do amido adicionado ao algodão, designado por desengomagem, permite
aumentar a sua resistência e é um passo preliminar e essencial no processamento de tecidos de
algodão. Nestes tecidos, existe amido constituído por dois hidratos de carbono, a amilose e a
amilopectina, que deve ser retirado para operações finais de branqueamento e tinturaria.
Hoje em dia, em traços gerais, a desencolagem passa pela gelatinização do amido a 80 ou 90 °C,
seguido do ajuste de pH e temperatura, dependendo da enzima, tratamento com amilase e
aquecimento para a remoção dos resíduos de amido hidrolisado. A utilização de enzimas, para além
de reduzir o impacto ambiental, visa também evitar modificações indesejáveis que possam ocorrer
Desenvolvimento de estruturas têxteis auto-limpantes usando enzimas
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ISEC, 2011
29
CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
nos têxteis, nomeadamente a perda de peso e a redução da sua resistência (Cabral, Aires-Barros e
Gama 2003, www.genencor.com 2010).
As enzimas, biocatalisadores naturais, proporcionam
uma alternativa sustentável para o
processamento têxtil. São aplicadas a uma diversidade de processos, incluindo o pré-tratamento e
bioacabamento do algodão, a desengomagem dos jeans, a abrasão e mudança de tonalidade da cor,
e os processamentos de lã, seda e couro. Em vez dos métodos tradicionais para a remoção do
peróxido residual, após o branqueamento, implicando várias lavagens ou o uso de produtos químicos
que decompõem o peróxido, como o bissulfito, as catálises enzimáticas permitem a remoção do
peróxido apenas com uma reduzida quantidade de produtos químicos e de água, reduzindo o
composto aos seus constituintes naturais, água e oxigénio (www.genencor.com 2010, Nielsen,
Kuilderd e Lu s.d.).
Inicialmente, o bio-polimento foi introduzido com o objectivo de fornecer ao algodão uma aparência
mais limpa, suave e um toque mais agradável. O bio-polimento é um processo, com acção
degradativa, resultando num tecido com menor peso e resistência. As perdas resultantes devem ser
moderadas e por isso existe a necessidade de controlar as operações do processo. Produz-se o
efeito “stonewashing” por uma acção mais severa do tratamento enzimático associado a stress
mecânico, como a fricção. Esta acção produz nos tecidos uma aparência vela, através da remoção
não homogénea de corante índigo. A enzima responsável por este efeito é a celulase, enquanto a
lacase é responsável pela mudança de tonalidade dos jeans, que durante a sua lavagem converte o
corante índigo, resultando numa tonalidade e numa nuance mais claras, um aspecto de desgaste
melhorado e um backstaining mínimo. Esta abordagem enzimática é capaz de criar novos looks da
moda sem danificar as fibras e sem o uso prejudicial do branqueamento pelo cloro ou permanganato
(www.genencor.com 2010).
As enzimas são também aplicadas no processamento da lã, nomeadamente no acabamento, antiencolhimento, amaciamento e depilling (limpeza da superfície das fibras e dos tecidos, com remoção
de fibras curtas ou fibrilas), incutindo resistência ao encolhimento da mesma. Isto porque os tecidos
de lã não tratados possuem uma tendência natural para o encolhimento irreversível. Para evitar este
efeito indesejado, os tecidos podem ser modificados quimicamente, ou tratados enzimaticamente,
sendo esta última opção, uma tecnologia ambientalmente mais limpa. As enzimas que actuam na lã
são as proteases. O ataque enzimático na lã tem como consequência uma perda de resistência e
peso, pelo que mais uma vez, devem ser controladas as condições de operação, como a
temperatura, o pH e a concentração enzimática. As proteases são também utilizadas para diversas
aplicações nos curtumes, incluindo a imersão, amaciamento, calagem e decapagem (C. J. Silva 2005,
Bon, Ferrara e Corvo 2008).
Hoje em dia, a aplicação das enzimas na indústria têxtil não se fica apenas pelas modificações das
propriedades superficiais dos tecidos. A sua aplicação tem sido investigada na substituição de
processos agressivos ao meio ambiente, para a remoção de agentes contaminantes dos efluentes
têxteis. Além de minimizar a exposição química e a poluição, as enzimas incrementam a
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30
ISEC, 2011
CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
produtividade, o consumo de água e energia são diminuídos, da mesma forma que as emissões de
CO2, em comparação com o uso de produtos químicos (Carneiro 2003, Cabral, Aires-Barros e Gama
2003, Basto 2007).
Um outro sector industrial intimamente ligado à indústria têxtil e neste momento, um dos sectores
industriais mais competitivos e que tem estado em constante evolução reagindo positivamente às
pressões do mercado, é o sector dos detergentes, ocupando cerca de 25-30 % do total de todos os
sectores que utilizam enzimas nos seus processos.
A aplicação das enzimas nos detergentes teve início em 1930, com o uso de enzimas pancreáticas
em soluções de pré-lavagem. Foi Otto Röhm o primeiro a patentear o uso de enzimas pancreáticas,
em 1913, extraídas do pâncreas de animais abatidos, que incluíam tripsina e quimotripsina,
carboxipeptidases, α-amilases, lactases, sucrases, maltases e lipases. Assim, com excepção das
celulases, o uso comercial de enzimas em detergentes já estava previsto em 1913.
Hoje em dia, as enzimas mais usadas nos detergentes são: celulases, no cuidado dos tecidos e em
manter a aparência do algodão lavado, suavizando e melhorando o brilho da cor; proteases, lipases,
mananases, e amilases para o aumento da eficácia da lavagem, em que cada uma delas fornece
benefícios específicos na lavagem, removendo as manchas difíceis formadas por proteínas, lípidos e
polissacarídeos. Embora a lista de ingredientes presentes nos detergentes varie bastante, os
mecanismos de actuação são semelhantes, onde sujidade e manchas são removidas por acção
mecânica assistida por enzimas e surfactantes que diminuem a tensão superficial e aumentam a
força de repulsão entre a sujidade e o tecido (www.genencor.com 2010, www.novozymes.com 2010).
Uma das forças motriz por detrás do desenvolvimento de novos detergentes é tornar as enzimas mais
tolerantes a outros componentes, como os surfactantes ou produtos químicos para branqueamento.
Idealmente as enzimas usadas nas formulas dos detergentes devem ter uma alta actividade e
estabilidade numa larga gama de temperaturas e pH (Kumar e Takagi 1999).
A acção dos detergentes enzimáticos é rápida e semelhante à digestão. Isto ocorre devido à
presença das enzimas, sendo estas mais eficientes sobre a matéria orgânica do que os detergentes
iónicos, porque agem de forma específica e não danificam os materiais constituintes dos
equipamentos e instrumentos. Os detergentes enzimáticos são superiores aos detergentes comuns
uma vez que agem na etapa completa de limpeza removendo detritos e sujidade, tendo como
consequência a diminuição de grande parte dos microrganismos presentes (Bon, Ferrara e Corvo
2008).
As enzimas têm contribuído muito para o desenvolvimento e melhoramento de detergentes
domésticos e industriais modernos, dado que são eficazes a temperaturas e valores de pH
moderados que caracterizam as condições de lavagem de roupa, de louça e de um modo geral todos
os meios envolvendo a limpeza moderna. Assim as enzimas contribuem para:
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31
CAPÍTULO 2
AS ENZIMAS
(i)
Melhor desempenho da limpeza em geral;
(ii)
Rejuvenescimento dos tecidos de algodão através da acção de celulases nas fibras;
(iii)
Consumo reduzidos de energia, permitem lavagens a menores temperaturas;
(iv)
Consumo reduzido de água através de uma liberação efectiva dos solos;
(v)
Redução do impacto ambiental, uma vez que as enzimas são facilmente biodegradadas;
(vi)
Efluentes das águas de lavagem mais amigos do ambiente, livres de fosfatos e menos
alcalinos (www.novozymes.com 2010, www.genencor.com 2010).
O mercado mundial de enzimas passou de cerca de 400 milhões de dólares americanos em 1983
para 1 bilião em 1995 e esse valor terá duplicado até 2004. De acordo com as projecções o
crescimento do mercado das enzimas é de aproximadamente 4-5% ao ano, acompanhado pela
redução de preço, decorrente do número de empresas a comercializar enzimas a preços mais
competitivos (Bon, Ferrara e Corvo 2008, C. J. Silva 2005).
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ISEC, 2011
CAPÍTULO 3
MATERIAL E MÉTODOS
CAPÍTULO 3
MATERIAL E MÉTODOS
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33
CAPÍTULO 3
MATERIAL E MÉTODOS
3.
MATERIAL E MÉTODOS
Nesta secção serão apresentados os materiais e os métodos utilizados no desenvolvimento do
trabalho. Os estudos para a determinação das propriedades físico-químicas da enzima livre e da
enzima imobilizada serão descritos, bem como os diversos métodos de imobilização efectuados.
3.1
3.1.1
Material
Enzimas, Proteínas e reagentes
A enzima utilizada para os estudos foi uma protease, a Alcalase, sendo também utilizadas uma
amílase e uma celulase, gentilmente cedidas pela Aquitex. As proteínas usadas foram a Albumina
bovina do soro (BSA) como padrão para a determinação da proteína total, e a caseína como
substrato para a determinação da actividade enzimática, ambas adquiridas à Sigma-Aldrich, (S.
Louis, USA). A L-tirosina, adquirida à Sigma-Aldrich, (S. Louis, USA), foi utilizada como padrão
também para a determinação da actividade enzimática.
Na simulação das nódoas utilizou-se Egg yolk emulsion, FD045-1VL, obtido pela Himedia (Mumbai,
Índia), gema de ovo caseira e ketchup comercial, marca Auchan.
Todos os outros reagentes utilizados foram de grau analítico.
3.1.2
Equipamento
Os ensaios espectrofotométricos foram realizados num espectrofotómetro modelo UV-1800 da marca
MAPADA. As amostras foram processadas num banho termostatizado GD120 da marca GRANT, e o
pH foi medido num medidor de pH Metrohm, modelo 691. Em algumas situações foi ainda utilizado
um banho termostatizado com ultra-sons S 60 H Elmasonic da marca Elma.
Nos ensaios que envolveram tecido foi utilizado um espectrofotómetro UV-vis com esfera de
integração, modelo Lambda 35 da marca PerkinElmer na leitura das amostras e um banho
termostatizado com agitação da marca Grant, modelo OLS200, no seu processamento. Utilizou-se a
esfera em modo de reflectância, para a leitura da intensidade de cor dos tecidos. A intensidade da cor
foi medida pelas coordenadas de cor L *, a *, b *, com base na teoria que a cor é percebida pelo preto
- branco (L * = luminosidade), vermelho - verde (a *) e amarelo - azul (b *) e pelo K/S, em que o K/S
(Kubelka-Munk) é a relação entre o coeficiente de absorção (k) e o coeficiente de dispersão da luz.
Esta relação é aplicada a têxteis com a suposição de que a dispersão de luz é devido às fibras,
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ISEC, 2011
CAPÍTULO 3
MATERIAL E MÉTODOS
enquanto a absorção da luz é devido ao corante. Usou-se o padrão iluminante D65/10º, que simula a
luz solar. Em cada amostra foram efectuadas três medições em diferentes posições do tecido.
A equação de Kubelka-Munk (K/S) é definida na Equação (14):
K = %1 − R&
S
2R
(14)
As análises de morfologia foram efectuadas recorrendo ao Microscópio Electrónico Stereoscan 260
(Leica), usando o sistema de análise de imagem Quantimet 500 (Leica). Previamente à análise, as
amostras foram revestidas a ouro no metalizador Bio-rad SC502. As amostras foram adquiridas com
a ampliação de 1000x.
3.2
3.2.1
Métodos
Determinação da concentração de proteína total em solução
A concentração total de proteína foi determinada a partir do método colorimétrico de Bradford
(Bradford 1976) com Coomassie Brilliant Blue G-250.
O reagente de Bradford foi preparado dissolvendo 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250 em
50 mL de etanol a 95 %. Adicionou-se lentamente 100 mL de ácido fosfórico a 85 %, e agitou-se até a
dissolução completa do corante. Posteriormente diluiu-se com água destilada até perfazer 1 L e
filtrou-se a solução.
A amostras de 100 µL de solução proteica adicionaram-se 5 mL de reagente de Bradford, e leu-se a
absorvância a 595 nm, usando um branco preparado de igual modo, mas com 100 µL de água
destilada. A curva de calibração foi obtida a partir do padrão de BSA.
Na Figura 3.1 está representada a curva de calibração obtida, utilizada para a determinação da
proteína total da enzima.
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35
CAPÍTULO 3
MATERIAL E MÉTODOS
Absorvância (595 nm)
0.3
0.2
0.1
Abs=0.4952±0.01098×Conc+0.008956±0.002872
R2 =0.9966
0.0
0.0
0.2
0.4
0.6
Concentração (mg/mL)
Figura 3.1. Representação gráfica da curva de calibração das proteínas e respectiva equação.
3.2.2
Determinação da actividade enzimática
A actividade da protease foi determinada usando como substrato uma solução de caseína a 0,65 %
(p/v) preparada em tampão fosfato 100 mM a pH 7,5. Num banho termostatizado a 37 °C, colocou-se
5 mL da solução de caseína, adicionando-se 1 mL de solução enzimática diluída em tampão acetato
de sódio 10 mM e acetato de cálcio 5 mM a pH 7,5. Incubou-se a solução durante exactamente 10
minutos, parando-se a reacção com 5 mL de ácido tricloroacético (TCA) 110 mM. Esperou-se cerca
de 30 minutos e filtrou-se a solução. O branco é efectuado de modo semelhante, à excepção da
adição da solução enzimática, que apenas é adicionada depois da adição do TCA.
A 2 mL do filtrado anterior foram adicionados 5 mL de uma solução de carbonato de sódio 500 mM e
1 mL de reagente de Folin&Ciocalteaus numa diluição de 1:2. Incubaram-se as amostras durante 30
minutos a 37 °C para o desenvolvimento da cor. Depo is as absorvâncias foram lidas a 660 nm.
Na Figura 3.2 encontra-se a curva de calibração efectuada com o padrão de aminoácidos L-tirosina.
Esta curva foi fixada, sendo seguida com carta de controlo de duplicados de amostra (Ver anexo A Figura 7.1).
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ISEC, 2011
CAPÍTULO 3
MATERIAL E MÉTODOS
Absorvância (660 nm)
2.0
1.5
1.0
0.5
Abs=1.4985±0.0040961×Conc+0.047598±0.0019414
R2=0.99996
0.0
0.0
0.5
1.0
Concentração (µmol L-tirosina)
1.5
Figura 3.2. Representação gráfica da curva de calibração para a actividade enzimática a 37 °C e pH 7,5 e respectiva equação.
3.2.3
Estudos cinéticos
A enzima Alcalase foi estudada na sua forma livre, tendo-se efectuado diversos estudos cinéticos por
forma a se perceber melhor as suas características físico-químicas.
3.2.4
Saturação enzimática
De modo a avaliar-se qual a melhor concentração de enzima, para assegurar condições não
limitantes de substrato, prepararam-se diversas diluições da solução enzimática a partir de uma
solução-mãe e procedeu-se de modo similar ao descrito na subsecção 3.2.2.
3.2.4.1
Efeito da temperatura
A temperatura óptima e o efeito da temperatura na actividade enzimática foram determinados
avaliando a actividade enzimática numa gama de temperaturas de 20 a 100 °C, mantendo todas as
outras condições constantes. Para determinação da actividade enzimática procedeu-se como descrito
na subsecção 3.2.2.
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CAPÍTULO 3
MATERIAL E MÉTODOS
3.2.4.2
Efeito do pH
O pH óptimo da enzima Alcalase foi determinado como descrito na subsecção 3.2.2. A única
excepção foi o tampão no qual foi preparada a solução de caseína. Para este estudo cinético utilizouse o tampão Britton-Robinson, por possuir uma força iónica constante, para uma gama de pH de 4 a
12, mantendo todas as outras condições constantes. O tampão Britton-Robinson foi preparado
misturando 100 mL de uma solução de ácido bórico a 0,04 mM, com 100 mL de uma solução de
ácido acético a 0,04 mM e 100 mL de uma solução de ácido fosfórico a 0,04 mM. Para se ajustar o
pH desejado foram adicionadas as quantidades necessárias de hidróxido de sódio a 0,2 M (Britton
1952).
3.2.4.3
Estabilidade ao armazenamento e condições processuais
Para o estudo do efeito das condições de armazenamento na actividade enzimática colocaram-se
amostras da mesma solução enzimática diluída 1:1000, a temperaturas diferentes, nomeadamente a
4 °C (no frigorifico) e a 20 °C (à temperatura ambi ente). Foram recolhidas amostras ao longo do
tempo (para a amostra a 4 °C, de 15 em 15 dias e pa ra a amostra a 20 °C, de 2 em 2 dias) e a
actividade enzimática residual foi determinada.
Para o estudo do efeito das condições processuais na actividade enzimática colocaram-se amostras
da mesma solução enzimática diluída 1:1000, a duas temperaturas processuais diferentes,
nomeadamente a 37 °C (numa incubadora) e a 60 °C (n uma estufa), tendo sido igualmente recolhidas
amostras ao longo do tempo para determinação da actividade residual (de 24 em 24 horas para a
amostra a 37 °C e de hora a hora, para a amostra a 60 °C). A determinação da actividade enzimática
foi feita como descrito na subsecção 3.2.2.
3.2.4.4
Inibição enzimática
Com o objectivo de se avaliar a possível inibição da enzima Alcalase, foram testadas algumas
substâncias com reportadas capacidades inibitórias sobre a enzima, como o EDTA e detergente
SKIP, bem como o efeito do cloreto de cálcio. Para tal, foram dissolvidas diferentes quantidades de
cada uma das substâncias no tampão fosfato. De seguida preparou-se a solução de caseína nos
tampões anteriores e mediu-se a actividade enzimática como descrito na subsecção 3.2.2. Foi ainda
preparada uma solução controlo, não contendo qualquer substância inibidora.
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CAPÍTULO 3
MATERIAL E MÉTODOS
3.2.4.5
Degradação de outras enzimas
Foram preparadas soluções enzimáticas contendo duas enzimas distintas, uma celulase e uma
amilase, com a mesma quantidade de Alcalase, mas com a outra enzima em diferentes quantidades,
e também foi preparada uma solução controlo, que não continha nenhuma das duas enzimas em
estudo. A actividade enzimática foi determinada do mesmo modo que anteriormente descrito na
subsecção 3.2.2.
3.2.4.6
Parâmetros cinéticos Km e vmáx
Para a determinação das constantes cinéticas (Constante de Michaelis-Menten e velocidade máxima
da reacção), foram preparadas diluições sucessivas de uma solução-mãe de caseína, numa gama de
0,65 mg/mL até 6,5 mg/mL, mantendo todas as outras condições constantes. De seguida, procedeuse à determinação da actividade enzimática como descrito na subsecção 3.2.2.
3.3
Imobilização da Alcalase ao algodão
De forma a desenvolver um método viável de imobilização da enzima no tecido, procedeu-se a uma
série de estudos e imobilizações diferentes, para se perceber a interacção da enzima com o tecido.
3.3.1
Imobilização da enzima usando glioxal como agente ligante
Para se efectuar a ligação covalente entre a enzima e o algodão, utilizou-se um pedaço de tecido de
algodão com 20X25 cm, pesando cerca de 2,5 g. Este tecido foi mergulhado em 100 mL de água
destilada contendo 250 µL de glioxal (para promover a ligação) e posteriormente adicionou-se 1,0 mL
de enzima. Colocou-se em banho termostatizado a 40 °C com agitação a 100 rpm, durante 20
minutos. Passado este tempo retirou-se do banho e deixou-se secar. Cortou-se metade do tecido,
lavou-se e deixou-se secar novamente.
Fizeram-se amostras de 5X5 cm, uma para controlo, de algodão sem qualquer tratamento, uma de
tecido com enzima imobilizada e uma outra do tecido lavado com a enzima imobilizada (lavagem com
10 mL de água destilada a 40ºC, 100 rpm, durante 1ºmin).
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CAPÍTULO 3
MATERIAL E MÉTODOS
3.3.2
Imobilização da enzima usando plasma químico como agente ligante
Neste método, procedeu-se à imobilização da enzima usando um pré-tratamento plasmático à
pressão atmosférica. O tratamento por plasma foi realizado à temperatura ambiente com uma
-1
potência de 9 kW em que a velocidade do rolo foi de 10 m.min . O gás de arraste utilizado foi o Argon
e, juntamente com este, dois tipos de gases reactivos, o O2 ou o N2, usados separadamente. Após
este tratamento por plasma o tecido foi colocado, imediatamente, na solução contendo a enzima.
Mergulharam-se 4 g de tecido, após tratamento no plasma por O2 ou N2, em 125 mL de tampão
acetato a pH 5 e 5 mL da Alcalase no banho durante 1 hora, a 30 °C com agitação de 100 rpm.
Posteriormente colocaram-se os tecidos a secar à temperatura ambiente.
3.3.3
Degradação de caseína pela enzima imobilizada
Com o objectivo de avaliar a capacidade da enzima imobilizada na degradação de caseína, efectuouse o teste seguinte: mergulharam-se dois pedaços de tecido (um sendo tecido lavado com enzima
imobilizada conforme descrito na subsecção 3.3.1 e o outro um tecido de algodão virgem, ou seja,
sem qualquer tipo de tratamento), com cerca de 1 g cada, em solução de caseína a 0,65 %,
preparada em tampão fosfato de sódio a pH 7,5. Colocaram-se no banho termostatizado a 40 °C com
agitação de 100 rpm, e foram retiradas amostras da solução de caseína ao longo do tempo.
Para a medição da actividade enzimática foram retirados 500 µL de solução de caseína e diluídos a
2 mL em água destilada. Depois parou-se a reacção com 500 µL de ácido trifluoracético 110 mM. Da
solução anterior retiraram-se mais 500 µL e voltou-se a diluir a 2 mL, adicionaram-se 5 mL de
carbonato de sódio 500 mM e 1 mL de solução de Folin&Ciocalteaus, levando-se as amostras
novamente a incubar no banho termostatizado durante mais 30 minutos, deixando-se arrefecer e
lendo-se as absorvâncias a 660 nm.
A Figura 3.3 representa a curva de calibração feita para este ensaio. Esta curva de calibração foi
determinada do mesmo modo descrito na subsecção 3.2.2, com a diferença de se ter utilizado o ácido
vanilíco como padrão em vez de L-tirosina, e uma temperatura de 40 °C.
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ISEC, 2011
CAPÍTULO 3
MATERIAL E MÉTODOS
Absorvância (660 nm)
2.0
1.5
1.0
0.5
Abs=1.615±0.01800×Conc-0.01617±0.008530
R2=0.9994
0.0
0.0
0.5
1.0
Concentração (µmol ácido vanilíco)
1.5
Figura 3.3. Representação gráfica da curva de calibração para a actividade enzimática da protease a 40 °C e pH 7,5.
3.3.3.1 Parâmetros cinéticos Km e vmáx
Para a determinação dos parâmetros cinéticos para a enzima imobilizada procedeu-se de modo
semelhante ao descrito anteriormente. Preparam-se soluções de caseína com concentrações
crescentes, de 0,13 mg/mL até 6,5 mg/mL, mantendo todas as outras condições constantes. De
seguida, procedeu-se à determinação da actividade enzimática como descrito na subsecção 3.2.2,
com a excepção que se utilizou 0,1g de tecido de algodão contendo a enzima imobilizada.
A amostra controlo foi preparada de igual modo, apenas se parou a reacção com TCA antes da
colocação do algodão com a enzima imobilizada.
3.3.3.2 Reutilização da enzima imobilizada
O objectivo deste ensaio era saber se a enzima imobilizada numa amostra de tecido poderia ser
reutilizada, ou seja, utilizada consecutivamente. Para tal, prepararam-se cinco copos com 5 mL de
solução de caseína a 0,65 %, e 1 mL de tampão fosfato, para perfazer o volume total.
Cortou-se uma amostra de tecido com enzima imobilizada de acordo com o método descrito em 3.3.2
com 0,1 g e colocou-se no primeiro copo já previamente colocado no banho termostatizado a 37 °C.
Incubou-se durante 10 minutos, retirou-se a amostra de tecido e colocou-se no segundo copo e assim
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CAPÍTULO 3
MATERIAL E MÉTODOS
sucessivamente. Ao fim dos 10 minutos de incubação em cada copo, a reacção foi parada com TCA
110 mM e deixou-se incubar durante 30 minutos adicionais.
Depois filtraram-se as amostras e procedeu-se ao desenvolvimento da cor, como descrito na
subsecção 3.2.2 para a leitura da actividade enzimática.
3.3.3.3 Solidez à lavagem
Pretendeu-se com este ensaio verificar a solidez que a enzima imobilizada no algodão apresentava
às lavagens, ou seja, determinar se a enzima perdia a sua actividade enzimática com lavagens
sucessivas.
Então colocou-se uma amostra de tecido com enzima imobilizada de acordo com o método 3.3.2,
com cerca de 15X20 cm, num copo com água destilada, no banho termostatizado a 40 °C e 100 rpm,
durante 30 minutos, para se proceder à sua lavagem. Deixou-se secar, retirou-se 0,1 g de tecido e
procedeu-se à determinação da actividade enzimática como descrito anteriormente na subsecção
3.2.2. Repetiu-se este procedimento para 3, 5 e 10 lavagens. Para a amostra de controlo procedeu-se
de modo semelhante.
3.4
Remoção de nódoas dos tecidos
Com o objectivo de verificar a capacidade de remoção de nódoas pelas enzimas ligadas (de forma
permanente ou não) ao tecido de algodão, foram efectuados uma série de testes, como descrito de
seguida.
3.4.1
Remoção de nódoas de ketchup
Neste estudo pretendeu-se avaliar a degradação de uma nódoa de ketchup pela enzima Alcalase.
Assim, cortaram-se vários pedaços de tecido, com dimensões de 10X10 cm correspondente a cerca
de 1,5 g de tecido. As amostras foram mergulhadas directamente na solução de protease, e
deixaram-se secar. Posteriormente foram colocados sobre os tecidos 100 µL de preparado de nódoa
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CAPÍTULO 3
MATERIAL E MÉTODOS
de ketchup com diversas diluições e deixaram-se secar. Foram feitos também controlos procedendose de igual modo na sua preparação, com a variante de o tecido não possuir enzima impregnada. As
reflectâncias foram lidas ao comprimento de onda mínimo de 421 nm, depois de feito um varrimento
entre os 400 e os 600 nm.
Depois de lidas as primeiras reflectâncias, todas as amostras e controlos foram pulverizados com
água destilada 5 vezes a cerca de 10 cm de distância do tecido. Deixaram-se secar e leram-se
novamente as reflectâncias ao mesmo comprimento de onda.
Numa última análise, as amostras e controlos foram mergulhados em 20 mL de água destilada e
colocadas num banho termostatizado a 40 °C e 100 rp m, durante cerca de 10 minutos. As
reflectâncias foram lidas uma última vez ao mesmo comprimento de onda mínimo.
3.4.2
Remoção de nódoas de gema de ovo - quantificação da proteína presente na solução
salina de gema de ovo
Este ensaio visou quantificar a quantidade de proteína presente numa solução de gema de ovo pelo
Método de adição-padrão, usando-se como padrão uma solução de BSA a 1 mg/mL. Em vez de
gema de ovo, foi utilizada uma solução salina de gema de ovo comercial, para que se tornasse mais
fácil e rigoroso o manuseamento da solução de modo a evitar um acréscimo de erros cometidos no
ensaio.
Foram preparadas amostras com volumes crescentes de padrão e sempre com o mesmo volume de
solução salina de gema de ovo, 5 mL, com uma diluição de 1:60. Utilizou-se o Método de Bradford
(Bradford 1976) na leitura das absorvâncias a 595 nm.
3.4.2.1 Remoção de nódoas de gema de ovo, pela enzima imobilizada com glioxal
O objectivo deste ensaio foi perceber até que ponto a enzima imobilizada no tecido com glioxal como
agente ligante teria capacidade de remover nódoas de gema de ovo.
Cortaram-se amostras de 10X10 cm, uma de tecido virgem, sem nenhum tipo de tratamento, o
controlo (CTR); uma de tecido lavado com enzima imobilizada de acordo com o método 3.3.1 (LAV); e
uma de tecido com enzima imobilizada pelo mesmo método, sem lavagem (ALC).
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CAPÍTULO 3
MATERIAL E MÉTODOS
Em cada um dos tecidos foram colocadas 3 nódoas de gema de ovo com 100 µL cada e deixou-se
secar cerca de 24 horas. Depois foram lidas as reflectâncias ao comprimento de onda mínimo de
455 nm.
Colocaram-se os tecidos numa solução de detergente SKIP 2 g/L, e levou-se ao banho
termostatizado a 40 °C com agitação a 100 rpm, dura nte 30 minutos, depois de se terem passados os
tecidos por água destilada, sem esfregar, e retirado o excesso de nódoa. Deixaram-se secar e leramse novamente as reflectâncias ao mesmo comprimento de onda.
Criou-se uma última situação em que se pulverizaram as amostras 3 vezes e deixou-se secar cerca
de 24 horas, findas as quais se pulverizaram mais 3 vezes, deixando-se secar novamente. As
reflectâncias foram lidas uma última vez nas mesmas condições.
3.4.2.2 Remoção de nódoas de gema de ovo, pela enzima imobilizada com plasma químico
O propósito deste ensaio foi perceber até que ponto a enzima imobilizada no tecido teria capacidade
de degradar nódoas de gema de ovo, usando plasma químico como agente ligante.
Cortaram-se amostras de 5X5 cm dos diferentes tecidos: tecido virgem, ou seja, sem nenhum tipo de
tratamento; tecido com enzima imobilizada por plasma usando N2 e tecido com enzima imobilizada
por plasma usando O2 (ver método de imobilização na subsecção 3.3.2). As amostras foram
colocadas num suporte, para ficarem bem esticadas, e foram pipetados 500 µL de solução salina de
gema de ovo com uma diluição de 1:9 no centro da amostra, deixando-se secar. Depois foram lidas
as reflectâncias ao comprimento de onda mínimo de 455 nm no espectrofotómetro UV-vis com esfera
de integração.
As amostras foram colocadas em banho termostatizado a 40 °C e 150 rpm, mergulhadas em água
destilada durante 30 minutos, numa simulação de máquina de lavar roupa. Deixaram-se secar e
foram lidas as reflectâncias novamente, ao mesmo comprimento de onda.
Procedeu-se a uma segunda lavagem, nas mesmas condições anteriores, deixando-se secar e lendose as reflectâncias uma última vez.
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44
ISEC, 2011
CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E
DISCUSSÃO
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ISEC, 2011
45
CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
4.
RESULTADOS EXPERIMENTAIS DISCUSSÃO
O desenvolvimento de têxteis com propriedades auto-limpantes é um processo complexo, onde o
principal problema encontrado foi o de manter a capacidade da enzima activa na ausência de água,
uma vez que se utilizou uma enzima solúvel. Assim, a imobilização da enzima ao substrato têxtil
surge de forma a melhorar e facilitar o desenvolvimento do estudo, oferecendo diversas vantagens
sobre a enzima livre.
Foram estudadas as propriedades físico-químicas da enzima livre, bem como algumas das
propriedades da enzima imobilizada. Pretendia-se também saber qual o método de imobilização mais
fiável para o efeito pretendido, portando procedeu-se a diversos modos de imobilização.
Assim, nesta secção encontram-se os resultados obtidos ao longo do desenvolvimento deste
trabalho, bem como a discussão dos mesmos.
4.1
Determinação da concentração de proteína total em solução
A concentração de proteína total das enzimas foi determinada pelo método de Bradford, um método
bastante popular, uma vez que é simples, rápido, bastante sensível e especifico para a detecção de
proteínas (Silva e Arruda 2006, Kruger s.d.). O método de Bradford baseia-se na ligação do corante
Coomassie Brilliant Blue à amostra de proteína, provocando uma mudança de cor de castanho para
azul, no máximo de absorção do corante de 465 para 595 nm, sendo este aumento monitorizado
(Bradford 1976). A Tabela 4.1 apresenta o resultado encontrado.
Tabela 4.1. Concentração total de proteína presente nas enzimas.
Enzima
Concentração de enzima (mg/mL)
Protease
17±1
Celulase
15±2
Amilase
1,9±0,6
A enzima protease apresenta uma maior concentração de proteína de 17±1 mg/mL, seguida da
celulase e da amilase, que apresenta uma concentração de proteína reduzida, de onde se pode
concluir que a protease é a enzima mais pura de entre as três enzimas estudadas.
Desenvolvimento de estruturas têxteis auto-limpantes usando enzimas
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46
ISEC, 2011
CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
4.2
4.2.1
Enzima Livre
Estudos cinéticos
No estudo da enzima Alcalase na sua forma livre foram efectuados diversos estudos cinéticos para
determinar as suas propriedades físico-químicas.
A actividade enzimática é medida seguindo ao longo do tempo o aparecimento de produtos ou o
desaparecimento do substrato. A actividade enzimática é, geralmente, expressa em Unidades de
actividade enzimática (U), onde uma unidade é definida como a quantidade de enzima que hidrolisa o
substrato para produzir cor equivalente a uma micromole (µmol) de produto num minuto, em
condições definidas de pH, temperatura e, concentração de substrato (Silva, et al. 2006).
4.2.1.1
Saturação enzimática
Para garantir a não saturação da enzima, deve-se garantir que o substrato não se torne limitante na
reacção enzimática, ou seja, deve-se trabalhar com uma concentração adequada de modo a que o
substrato esteja sempre em excesso permitindo assim a determinação da actividade enzimática com
rigor no tempo estabelecido.
Para tal, efectuou-se um estudo fazendo variar a concentração da enzima em função da sua
actividade enzimática, medida a 37 °C e pH 7,5, com o mostrado na Figura 4.1. Trabalhando-se
abaixo do limite máximo dessa gama, garante-se a não saturação da enzima.
Através da representação gráfica verifica-se que a concentração de enzima não deve ser superior a
0,03±0,01 mg/mL, isto é, uma diluição de 1:600, portanto escolheu-se uma concentração de
0,02±0,01 mg/mL isto é, uma diluição de 1:1000. Esta concentração foi escolhida por se encontrar
abaixo do limite da gama escolhida, onde no gráfico fica sensivelmente a meio da zona linear
permitindo que não ocorra saturação da enzima, ou seja, existe a garantia de que nesta zona há
substrato em excesso, onde a velocidade inicial da reacção enzimática é sensivelmente metade da
velocidade máxima de reacção (Carneiro 2003).
Desenvolvimento de estruturas têxteis auto-limpantes usando enzimas
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47
CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
Actividade relativa (%)
100
50
0
0.00
0.05
0.10
0.15
Concentração de enzima (mg/mL)
0.20
Figura 4.1. Representação gráfica da concentração de enzima em função da actividade enzimática.
4.2.1.2
Efeito da temperatura
O efeito da temperatura sobre a enzima Alcalase foi estudado numa gama entre os 20 e os 100 °C. A
Figura 4.2 representa a variação da actividade enzimática em função do aumento da temperatura.
Actividade relativa (%)
100
80
60
40
20
0
20
40
60
80
Temperatura (°C)
100
Figura 4.2. Representação gráfica da variação da actividade enzimática em função do aumento da temperatura.
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48
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CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
É notório que a protease possui a sua actividade enzimática máxima aos 60 °C, tal como revelado em
estudos anteriores (Banerjee, Sani e Soni 1999, Espósito, et al. 2009, www.novozymes.com 2010).
Até esta temperatura a actividade enzimática aumenta gradualmente até atingir a temperatura óptima,
e a partir dos 60 °C existe um rápido decréscimo da actividade enzimática até à desnaturação da
enzima.
4.2.1.3
Efeito do pH
A influência do pH na actividade enzimática da protease foi avaliada numa gama dos 4 aos 12,
usando tampão Britton-Robinson, de modo a encontrar-se o pH óptimo da enzima. Este tampão foi
escolhido por ser um tampão universal de força iónica constante (Britton 1952). A Figura 4.3
demonstra a variação da actividade enzimática com o aumento de pH.
Actividade relativa (%)
100
80
60
40
20
0
4
6
8
pH
10
12
Figura 4.3. Representação gráfica da variação da actividade enzimática em função do aumento de pH.
Verifica-se que abaixo do pH 5 não existe qualquer actividade por parte da enzima, aumentando
rapidamente até pH 11, onde atinge o máximo de pH e portanto este é o valor do pH óptimo para esta
protease. Entre o pH 11 e 12 existe um ligeiro decréscimo de actividade, como previsto, dado a
Alcalase ser uma protease alcalina, a enzima mantém uma maior actividade enzimática nesta região
(Banerjee, Sani e Soni 1999, Banik e Prakash 2004, Espósito, et al. 2009).
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49
CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
4.2.1.4
Estabilidade ao armazenamento e condições processuais
O propósito deste ensaio foi avaliar até que ponto a enzima se mantinha estável durante o
armazenamento, isto é, avaliar a capacidade da enzima armazenada em manter a sua actividade
enzimática ao longo do tempo. Adicionalmente pretendeu-se avaliar as melhores condições
processuais, ou seja, a melhor temperatura para se proceder a operações com esta enzima.
A avaliação da estabilidade foi determinada para condições diferentes, para tal determinou-se o
tempo de meia vida da enzima (t1/2), ou seja, o tempo necessário para que a enzima atingisse metade
da sua actividade enzimática inicial, o que sob o ponto de vista comercial é um aspecto bastante
importante.
Estabilidade 4 ºC
Estabilidade 20 ºC
100
Actividade relativa (%)
Actividade relativa (%)
100
80
60
40
20
0
0
50
100
tempo (dias)
150
80
60
40
20
0
200
0
10
30
40
Estabilidade 60 ºC
Estabilidade 37 ºC
100
Actividade relativa (%)
100
Actividade relativa (%)
20
tempo (dias)
80
60
40
20
80
60
40
20
0
0
0
5
10
tempo (dias)
15
20
0
2
4
6
tempo (h)
8
10
Figura 4.4. Representações gráficas das determinações efectuadas para a estabilidade ao armazenamento e condições
processuais às temperaturas de 4, 20, 37 e 60 °C.
O tempo de meia vida foi estimado através de uma regressão hiperbólica, como demonstrado na
Figura 4.4, mas para se ter uma melhor percepção da variação do t1/2, os resultados são colocados
na Tabela 4.2.
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CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
Tabela 4.2. Comparação entre os t1/2 para cada uma das temperaturas utilizadas para a avaliação da enzima.
Temperatura
t1/2
4 °C (frigorifico)
45,600±0,002 dias
20 °C (temperatura ambiente)
37,38±0,02 dias
37 °C (incubadora)
11,0±0,3 horas
60 °C (estufa)
1,01±0,08 horas
Como pode ser visto na tabela acima, a enzima mantém durante mais tempo a sua actividade
enzimática se armazenada no frigorífico, a 4 °C, do que quando guardada à temperatura ambiente, (a
cerca de 20 °C) reduzindo o seu tempo de meia vida de cerca de 46 para 37 dias. No entanto, esta
redução não é significativa, se o tempo de permanência da enzima em armazém for de poucos dias,
não justificando a aquisição de um sistema refrigerado para armazenamento em exclusivo da enzima.
Para tempos longos de armazenamento, este parâmetro torna-se significativo.
Do ponto de vista comercial a estabilidade às condições processuais é um dos factores mais
importantes para a aplicação de biocatalisadores (Silva, et al. 2006). Para se operar com esta enzima
a 60 °C, tem-se cerca de 1 hora para realizar a ope ração, porque depois desse período a enzima só
detém metade da sua actividade e a partir das 8 horas a esta temperatura apenas 20 % da enzima se
mantém activa. Quando se opera com a enzima a uma temperatura de 37 °C, esta perde metade da
sua actividade em cerca de 11 horas, permitindo portanto processos mais longos.
4.2.1.5
Inibição enzimática
O grau de inibição da protease foi avaliado testando vários inibidores de características diferentes,
sendo possível ver os resultados obtidos na Figura 4.5. O primeiro inibidor testado foi o EDTA, um
inibidor normalmente utilizado e recomendado para proteases, onde a percentagem de actividade
deveria diminuir proporcionalmente com o aumento da concentração de EDTA. Verifica-se que com a
adição de 10 g/L deste agente quelante a enzima ainda mantém cerca de 80 % da sua actividade.
Comparando com estudos feitos anteriormente com diferentes proteases, para a mesma
concentração de inibidor, a actividade enzimática deveria ser muito inferior (Banerjee, Sani e Soni
1999, Fu, et al. 2005).
O detergente SKIP foi também um dos inibidores testados, uma vez que se pretende imobilizar esta
enzima num substrato têxtil. Pode-se verificar que a percentagem de actividade enzimática diminui
drasticamente com o aumento da concentração de detergente até 2,5 g/L, mantendo-se
aproximadamente constante a partir desta concentração, ou seja, a partir deste ponto a actividade
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51
CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
enzimática torna-se independente da concentração de detergente. Estudos demonstram que
independentemente da marca e da constituição do detergente, este possui um grande efeito inibidor
sobre as enzimas, facto que se tenta ultrapassar de modo a tornar compatíveis os detergentes com
as enzimas (Banik e Prakash 2004, Espósito, et al. 2009).
O CaCl2 é um conhecido activador de enzimas proteoliticas, pelo que a sua interacção com a
protease estudada foi também avaliada. É notório que a percentagem de actividade diminui, até uma
concentração de CaCl2 de 2,5 g/L e depois existe um ligeiro aumento na percentagem de actividade.
Para este ensaio com CaCl2 esperava-se exactamente o contrário, ou seja, era esperado que este
composto melhorasse a performance da enzima, aumentando ou mantendo a actividade enzimática
da Alcalase mesmo na presença de inibidores como o EDTA, por exemplo (Banerjee, Sani e Soni
1999, Fu, et al. 2005), quando comparando esta substância com as restantes estudadas.
100
Actividade relativa (%)
Actividade relativa (%)
100
80
60
40
20
0
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
Concentração de inibidor (EDTA) (g/L)
10
0
2
4
6
8
Concentração de inibidor (SKIP) (g/L)
10
Actividade relativa (%)
100
80
60
40
20
0
0
1
2
3
4
Concentração de inibidor (CaCl2) (g/L)
5
Figura 4.5. Representação gráfica das percentagens de inibição dos diversos inibidores estudados.
Pode-se verificar que para a concentração mais baixa de inibidor utilizada, 0,1 mg/mL, todas as
substâncias inibem a enzima na mesma ordem de grandeza, e para concentrações mais elevadas
observa-se que o detergente SKIP é o inibidor mais eficaz. Este facto pode ser explicado devido ao
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CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
detergente possuir perfumes, surfactantes, inibidores de corrosão, entre muitos outros constituintes,
que também interagem com a enzima limitando a sua actividade enzimática (Banik e Prakash 2004,
Espósito, et al. 2009).
4.2.1.6
Degradação de outras enzimas
A nível de enzimas foi testada a interacção entre a protease e as enzimas celulase e amílase. Este
estudo é importante no desenvolvimento do trabalho sob um ponto de vista futuro, uma vez que se
pretende saber se as outras enzimas inibem de algum modo a actividade enzimática da Alcalase, ou
se existe degradação das enzimas por parte da Alcalase, de modo a perceber se futuramente se
conseguirá ou não imobilizar varias enzimas no mesmo substrato têxtil, dado que cada enzima tem
afinidade para uma substância específica. Os resultados estão apresentados na Figura 4.6.
200
Actividade relativa (%)
Actividade relativa (%)
200
150
100
50
0
0.00
0.05
0.10
0.15
Concentração de celulase (g/L)
0.20
150
100
50
0
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
Concentração de amilase (g/L)
0.025
Figura 4.6. Representações gráficas das percentagens de actividade enzimática da Alcalase na presença de outras enzimas.
Verificou-se que as enzimas interagem entre si de modo diferente. No ensaio com a enzima celulase
há um aumento da actividade enzimática o que indica que esta é degradada pela Alcalase e no
ensaio com a enzima amilase existe um decréscimo da actividade. Uma possível explicação para os
resultados obtidos, é a constituição de cada uma das enzimas, uma vez que foi determinada a
quantidade de proteína em cada enzima. No caso da celulase, a Alcalase possui mais proteína
disponível para degradação, não fazendo distinção entre esta e o substrato, a caseína, enquanto a
amilase possui muito pouca proteína na sua constituição, dado que foram usados os mesmos
volumes de soluções comerciais, mas a solução comercial de amilase é mais diluída do que a de
celulase, logo possuía menos proteína, não sendo possível ver o efeito da degradação por parte da
protease.
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53
CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
4.2.1.7
Parâmetros cinéticos Km e vmáx
A actividade catalítica da enzima livre foi estudada, usando como substrato a caseína, visto ser um
substrato típico na detecção de proteínas, através da cinética de Michaelis-Menten e posteriores
linearizações para outras cinéticas, determinando-se os seus parâmetros, a constante de MichaelisMenten e a velocidade máxima de reacção. Os parâmetros cinéticos foram determinados através da
variação da concentração do substrato em função da actividade enzimática.
A representação gráfica presente na Figura 4.7 foi linearizada através da equação de LineweaverBurk, da equação de Eadie-Hofstee e ainda da equação de Hanes-Woolf, onde se obtiveram as
representações gráficas presentes na Figura 4.8.
A partir das representações gráficas descritas anteriormente determinaram-se os parâmetros
cinéticos, para os quais se encontraram os valores presentes na Tabela 4.3.
Actividade (U/mL)
600
400
200
0
0
2
4
Concentração caseína (mg/mL)
6
Figura 4.7. Representação gráfica da actividade enzimática em função da concentração de substrato para a enzima livre –
Cinética de Michaelis-Menten.
Como se pode verificar os valores das constantes cinéticas são mais ou menos constantes para as
diferentes linearizações, com excepção da linearização pela equação de Lineweaver-Burk onde os
valores das constantes são um pouco mais elevados, apesar de ser a equação com melhor ajuste à
recta.
Estudos efectuados para avaliar a capacidade de equações lineares produziram parâmetros de
Michaelis-Menten confiáveis, e referem que um ajuste linear usando a equação de Lineweaver-Burk é
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54
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CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
menos confiável do ponto de vista estatístico do que as restantes equações obtidas pela modificação
da equação de Michaelis-Menten, não produzindo valores confiáveis para os parâmetros cinéticos,
acontecendo o mesmo com a equação de Eadie-Hofstee que também não produz bons valores para
os parâmetros cinéticos, apesar de o seu uso ser mais simples, uma vez, que os coeficientes angular
e linear fornecem directamente os valores dos parâmetros cinéticos.
A equação de Hanes-Woolf pode ser empregue através do ajuste linear, uma vez que os resultados
são bastante similares aos obtidos através do ajuste não linear, neste caso hiperbólico, à equação de
Michaelis-Menten para diferentes conjunto de dados, o que não acontece nas restantes equações
que apresentam oscilações significativas (Atkins e Nimmo 1975).
Lineweaver-Burk
Eadie-Hofstee
600
Actividade (U/mL)
Actividade (U/mL)
0.015
0.010
0.005
0.000
0.0
0.5
1.0
1.5
Concentração caseína (mg/mL)
2.0
400
200
0
60
80
100
120
Concentração caseína (mg/mL)
140
Hanes-Woolf
Actividade (U/mL)
0.015
0.010
0.005
0.000
0
2
4
6
Concentração caseína (mg/mL)
8
Figura 4.8. Representações gráficas das linearizações efectuadas através das equações de Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee e
Hanes-Woolf, para a enzima livre.
Tabela 4.3. Comparação das constantes cinéticas determinadas pelas diferentes linearizações, para a enzima livre.
Linearização
R
Michaelis-Menten
2
Km (mg/mL)
vmáx (U/mL)
0,9704
5,1±0,9
927±91
Lineweaver-Burk
0,9946
12,9696±0,0002
1768,65936±0,00009
Eadie-Hofstee
0,8198
11±1
1530±161
Hanes-Woolf
0,8903
11,4321±0,0003
1629,19518±0,00007
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55
CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
4.3
Enzima Imobilizada
A imobilização de proteases em suportes sólidos através de ligação covalente pode oferecer diversas
vantagens sobre a enzima livre, incluindo o fácil manuseamento, recuperação após a reacção e
reutilização e/ou operações em reactores contínuos. As proteases têm vindo a ser imobilizadas
usando uma ampla gama de métodos, como deposição ou precipitação em suportes porosos e
ligação covalente a suportes activos pré-existentes (Ferreira, et al. 2003), entre outros.
Estudos recentes relatam que a imobilização por plasma é cada vez mais utilizada para melhorar a
imobilização de biomoléculas, inserindo grupos funcionais, como OH e NH2, à superfície do substrato
ou apenas modificando a rugosidade do mesmo, gerando radicais livres disponíveis para criar outras
ligações, pois a ligação das biomoléculas à superfície dos substratos gera um problema analítico
difícil de resolver (R., et al. 2004, Martínez-Gómez, Young e Denes 2010).
No estudo da enzima Alcalase na sua forma imobilizada foram efectuados alguns estudos para
determinar a sua cinética de Michaelis-Menten, e foram efectuadas também vários tipos de
imobilizações para se verificar qual a mais adequada ao trabalho em estudo.
4.3.1
4.3.1.1
Imobilização da enzima usando glioxal como agente ligante
Degradação da caseína pela enzima imobilizada
A degradação da caseína por parte da enzima imobilizada de acordo com o método 3.3.3 foi avaliada
ao longo de 24 horas, através da medição da actividade enzimática residual, como mostra a Figura
4.9.
Actividade relativa (%)
100
80
60
40
20
0
0
500
1000
Tempo (min)
1500
Figura 4.9. Representação gráfica da variação da actividade enzimática da protease imobilizada ao longo do tempo.
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56
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CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
Este ensaio foi efectuado com o intuito de se perceber se ao imobilizar a enzima, esta perderia ou
não a sua actividade, e se esta era capaz de degradar um substrato macromolecular como a caseína,
estando o seu centro activo disponível, pois com a imobilização poderia deixar de estar.
Observa-se que a actividade enzimática começa por aumentar, até atingir o máximo aos 210 minutos,
começando a diminuir até atingir o mínimo, cerca de 60 % da sua actividade, ao fim de 24 horas
(1440 min), revelando que a enzima imobilizada se mantém activa como seria de esperar (Ferreira, et
al. 2003, Silva, et al. 2006, Cardoso, Cass e Moraes 2009). Este é um resultado bastante positivo no
estudo pois leva a crer que esta enzima, para além de muito usada em detergentes, pode também
ser usada em tecidos para proporcionar características de self-clean.
4.3.2
4.3.2.1
Imobilização da enzima usando plasma químico como agente ligante
Parâmetros cinéticos Km e vmáx
Na determinação dos parâmetros cinéticos para a enzima imobilizada, procedeu-se ao mesmo
tratamento de dados efectuado para a enzima livre. Assim fez-se variar a actividade enzimática da
Alcalase imobilizada no algodão (usando plasma como agente ligante - subsecção 3.3.2) em função
da concentração de substrato presente em solução, Figura 4.10.
Posteriormente a Cinética de Michaelis-Menten para a enzima imobilizada foi linearizada através da
equação de Lineweaver-Burk, de Eadie-Hofstee e ainda de Hanes-Woolf, onde se obtiveram as
representações gráficas presentes na Figura 4.11 e a partir destas determinaram-se os parâmetros
cinéticos para a enzima imobilizada, para os quais se encontraram os valores de velocidade máxima
da reacção e da constante de Michaelis-Menten presentes na Tabela 4.4.
Actividade (U/g)
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
2
4
6
Concentração caseína (mg/mL)
8
Figura 4.10. Representação gráfica da actividade enzimática em função da concentração de substrato para a enzima
imobilizada – Cinética de Michaelis-Menten.
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57
CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
Tabela 4.4. Comparação das constantes cinéticas determinadas pelas diferentes linearizações, para a enzima imobilizada.
Linearização
R
Michaelis-Menten
2
Km (mg/mL)
vmáx (U/g)
0,9428
0,5±0,1
0,58±0,03
Lineweaver-Burk
0,9858
0,5±0,1
0,60±0,09
Eadie-Hofstee
0,9766
0,6±0,6
0,6±0,1
Hanes-Woolf
0,8866
0,52±0,09
0,59±0,03
Lineweaver-Burk
Eadie-Hofstee
0.8
Actividade (U/g)
Actividade (U/g)
6
4
2
0
0
1
2
3
4
Concentração caseína (mg/mL)
5
0.6
0.4
0.2
0.0
0.0
0.2
0.4
0.6
Concentração caseína (mg/mL)
0.8
Hanes-Woolf
Actividade (U/g)
15
10
5
0
0
2
4
6
Concentração caseína (mg/mL)
8
Figura 4.11. Representação gráfica das linearizações efectuadas através das equações de Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee e
Hanes-Woolf, para a enzima imobilizada.
Os parâmetros cinéticos quer da enzima livre, quer da enzima imobilizada, foram determinados
usando como substrato a caseína. Pode-se verificar que os valores das constantes cinéticas da
enzima livre são mais ou menos constantes para as diferentes linearizações com excepção da
linearização pela equação de Lineweaver-Burk onde os valores das constantes são um pouco mais
elevados. O mesmo padrão acontece para a enzima imobilizada, apesar de apresentar valores
bastantes mais baixos, 0,46±0,15 mg/mL em relação a 5,1±0,9 mg/mL da enzima livre, como é visível
Desenvolvimento de estruturas têxteis auto-limpantes usando enzimas
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58
ISEC, 2011
CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
na Figura 4.12, revelando uma maior afinidade para com a caseína, ou seja, a enzima imobilizada
alcança mais rapidamente metade da sua velocidade máxima de reacção. Esta diferença na
constante cinética pode ser explicada por efeitos de partição do substrato na imobilização da enzima
relativamente à enzima livre e também pela perda de flexibilidade necessária para a ligação entre a
enzima e o substrato (Ferreira, et al. 2003, Silva, et al. 2006, Quintas, Freira e Halpern 2008).
Actividade relativa (%)
100
50
0
0
2
4
6
Concentração de caseína (mg/mL)
8
% enzima livre
% enzima imobilizada
Figura 4.12. Comparação entre a equação de Michaelis-Menten para a enzima livre e imobilizada.
4.3.2.2
Reutilização da enzima imobilizada
Um importante objectivo para o desenvolvimento de têxteis auto-limpantes, do ponto de vista
industrial para a diminuição dos custos de operação, é o facto de se poder utilizar o mesmo tecido
vezes sem conta. Com esse intuito este ensaio permitiu verificar se tal é possível. A Figura 4.13
mostra os resultados obtidos.
Actividade relativa (%)
100
50
0
1
2
3
Amostra
4
5
Figura 4.13. Representação gráfica da variação da actividade enzimática em função de sucessivas utilizações.
Desenvolvimento de estruturas têxteis auto-limpantes usando enzimas
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ISEC, 2011
59
CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
Como se pode verificar, a amostra de enzima imobilizada usando plasma químico como agente
ligante vai perdendo a sua actividade enzimática ao longo de utilizações sucessivas, mantendo cerca
de 10 % de actividade após 5 ciclos de reutilização. Demonstra-se ainda que a enzima ficou
imobilizada permanentemente ao algodão, no entanto este método precisa de ser optimizado, para se
obter melhores resultados, uma vez que no final de 5 ciclos de lavagens, a enzima perde muita da
sua actividade enzimática e a ideia principal deste ensaio é permitir não só a reutilização da enzima
no maior número possível de lavagens, mas também que ela se torne resistente a abrasão do tecido.
4.3.2.3
Solidez à lavagem
No seguimento do pensamento do ensaio anterior, é igualmente importante que a enzima imobilizada
resista a lavagens sucessivas, quando estas são necessárias. Assim, a Figura 4.14, mostra a
actividade relativa para diversas lavagens da enzima imobilizada usando plasma químico como
agente ligante.
Actividade relativa (%)
150
100
50
0
0
2
4
6
Nº de Lavagens
8
10
Figura 4.14. Representação gráfica da percentagem de rendimento obtido para diversas lavagens da amostra.
Verifica-se que a partir da terceira lavagem a enzima não tem qualquer actividade enzimática. As
imagens SEM da Figura 4.15 mostram as diferenças na imobilização após as diversas lavagens.
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ISEC, 2011
CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
A
D
C
B
E
Figura 4.15. Imagens SEM da amostra de algodão com Alcalase imobilizada por plasma com O2 (ampliação de 1000 vezes): A
– Sem lavagens; B – Com uma lavagem; C – Com três lavagens; D – Com cinco lavagens; E - Com dez lavagens.
Como se pode observar a enzima não ficou imobilizada uniformemente pelo algodão não se
conseguindo perceber onde existe mais ou menos enzima imobilizada, apesar das imagens
mostrarem diferentes lavagens, independentemente dos resultados analíticos obtidos, uma vez que
em qualquer uma das lavagens existia enzima imobilizada, mostrando a não estabilidade da enzima.
Este é também um processo que necessita de optimização de forma a se conseguir imobilizar a
enzima de modo uniforme pelo tecido, para que em todo ele permaneçam as mesmas características.
4.4
4.4.1
Remoção de nódoas dos tecidos
Remoção de nódoas de ketchup
A remoção das nódoas de ketchup foi efectuada no algodão onde apenas se tinha impregnado a
enzima, como método de imobilização temporário e não permanente, de forma a se poder verificar o
melhor progresso no trabalho.
Através da reflectância é possível verificar a evolução da intensidade das nódoas, sendo depois
também possível a sua quantificação através da teoria de Kubelka-Munk, onde a intensidade da cor
varia inversamente com a reflectância, ou seja, quanto maior a percentagem de reflectância, menor é
a intensidade da cor, que neste estudo era o factor principal: saber se a intensidade da cor diminuía
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ISEC, 2011
61
CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
com o avançar do mesmo, primeiro colocando as nódoas de ketchup no tecido com a enzima
impregnada, depois saber se o K/S diminuía após pulverizadas as nódoas e por fim quando as
amostras foram lavadas, como se mostra na Figura 4.16.
O objectivo de se impregnar o tecido com Alcalase e colocar-lhe nódoas de ketchup, era desenvolver
um método temporário para se avaliar a capacidade da enzima na degradação de nódoas de
ketchup, concluindo-se que a enzima adsorvida no algodão foi capaz de degradar a nódoa.
À medida que aumenta a concentração de ketchup diminui a percentagem de reflectância, (Ver anexo
B – Figura 7.2 e Figura 7.3), assim como aumenta o valor do K/S, ou seja, aumenta a intensidade da
cor da nódoa, o que está de acordo com o esperado uma vez que são respostas inversamente
proporcionais, e quanto mais concentrada está a nódoa mais cor tem.
Após as cinco pulverizações a percentagem de reflectância manteve-se nas amostras de controlo,
enquanto as amostras contendo enzima adsorvida apresentaram maiores percentagens de
reflectância, o que significa que a intensidade da cor diminuiu (Ver Anexo B – Figura 7.4 e Figura
7.5).
Depois de os tecidos terem sido lavados em 20 mL de água destilada, a 40 °C com agitação de
100 rpm, a percentagem de reflectância aumentou bastante, levando a uma diminuição significativa
da intensidade da nódoa, indicando que a enzima adsorvida no tecido degrada a nódoa de ketchup
(Ver Anexo B – Figura 7.6 e Figura 7.7).
Conclui-se então que os valores de ∆K/S das amostras diminuem com o avançar do estudo, ou seja,
apresentam valores superiores para as amostras que não foram lavadas, valores mais baixos depois
das amostras terem sido pulverizadas e valores bastante inferiores depois de lavadas as amostras.
Estes resultados são expectáveis dado que este é apenas um método temporário onde a enzima
estava adsorvida ao algodão e aquando da lavagem das amostras pode ter ocorrido também a
lavagem da enzima para a solução, o que levou a um aumento da sua actividade, tendo em conta
que esta é uma enzima hidrolítica. É de salientar que a nódoa de ketchup é uma nódoa difícil de tratar
por ser composta por muitos componentes sendo uma possível nódoa a estudar com uma mistura de
enzimas imobilizadas.
3
2
2
∆K/S
∆K/S
3
1
1
0
0.0
0.1
0.2 0.4 0.6 0.8
Concentração (v/v)
0.9
1.0
Amostras sem lavagens
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62
0
0.0
0.1
0.2 0.4 0.6 0.8
Concentração (v/v)
0.9
1.0
Amostras pulverizadas
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CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
3
∆K/S
2
1
0
0.0
0.1
0.2 0.4 0.6 0.8
Concentração (v/v)
0.9
1.0
Amostras lavadas
Figura 4.16. Representações gráficas da variação do ∆K/S em função da concentração de ketchup, para as três etapas do
ensaio.
4.4.2
Remoção de nódoas de gema de ovo - Quantificação do teor proteico da solução salina
de gema de ovo
A quantificação da proteína presente nas nódoas de gema de ovo foi feita com uma solução salina de
gema de ovo, devido ao seu fácil manuseamento e também para evitar um acréscimo de erros
provenientes do manuseamento da gema de ovo propriamente dita. Escolheu-se o método de adiçãopadrão, por ser um método simples, de fácil aplicabilidade e também por dar resultados directos, para
amostras complexas e de baixa concentração, fazendo com que o valor da absorvância lida caia
dentro dos limites de maior precisão. Para além disso, este método permite eliminar todo o tipo de
interferências que fazem com que o coeficiente de proporcionalidade entre a absorvância e o volume
de solução padrão seja diferente, e que se torna constante pela adição de quantidades idênticas de
solução salina de gema de ovo às amostras com o padrão (Gonçalves 2001, Araújo e Bruns 1991,
Ribani, et al. 2004)
Na Figura 4.17 encontra-se representado a variação da absorvância medida em função do volume de
padrão adicionado.
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CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
Absorvância (595 nm)
0.6
0.4
0.2
Abs=0.1010±0.002931×Vol BSA+0.2816±0.004117
R2=0.9843
0.0
0
1
2
Volume de padrão (BSA) (mL)
3
Figura 4.17. Representação gráfica da absorvância em função do volume de padrão adicionado a cada amostra.
Através da representação gráfica é possível verificar que a concentração de proteína na solução
salina de gema de ovo é de 0,101±0,003 mg/mL, aplicando as diluições efectuadas passa-se a ter
18,2±0,5 mg/mL no total. Este resultado é baseado no método de adição-padrão que consiste em se
adicionar quantidades conhecidas de substância a analisar, a amostras com uma solução padrão
incorporada em diferentes concentrações, obtendo-se uma curva de calibração das próprias amostras
padrão, cujo declive é a concentração desconhecida da substância.
4.4.2.1
Remoção de nódoas de gema de ovo pela enzima imobilizada usando o glioxal como
agente ligante
A remoção de nódoas de gema de ovo no tecido com a enzima imobilizada pelo método descrito em
3.3.1 foi medida de três modos diferentes e em três amostras de tecido diferentes, os tecidos CTR,
ALC e LAV. O primeiro ensaio foi efectuado apenas colocando as nódoas nos tecidos (Ensaio 1), o
segundo colocando as amostras de tecidos anteriores numa solução de detergente SKIP 2 g/L
(Ensaio 2) e o terceiro ensaio efectuado foi a pulverização das amostras anteriores com água
destilada (Ensaio 3). Os resultados obtidos estão presentes na Tabela 4.5 onde se analisa amostra a
amostra.
Verifica-se que as amostras ALC são as que possuem, no geral, menores percentagens de
reflectâncias (Ver Anexo C – Figura 7.11), logo maiores valores de K/S, onde era de esperar o
oposto, uma vez que o tecido tinha a enzima imobilizada e não tinha sido lavado, ou seja, podia ainda
conter enzima apenas adsorvida. Entre as amostras CTR e LAV, não se consegue ainda retirar
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CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
conclusões específicas, dado que as reflectâncias variam quase de modo aleatório (Ver Anexo C –
Figura 7.12).
Verifica-se que este ensaio não foi de todo bem-sucedido, uma vez que não se conseguiram obter
resultados concretos de modo a se conseguir retirar alguma conclusão. Este facto pode dever-se à
dificuldade de tratamento da nódoa durante a realização do ensaio e também à própria constituição
da gema de ovo, visto esta apresentar na sua composição apenas 16-17 % de proteínas (Sarcinelli,
Venturini e Silva 2007).
Tabela 4.5. Valores médios de K/S nos diversos ensaios efectuados e para as diferentes amostras de tecido.
Amostras de tecido
4.4.2.2
Ensaio
CTR
LAV
ALC
1
8±3
8±3
9±2
2
1,7±0,2
1,7±0,6
1,1±0,2
3
1,3±0,4
1,1±0,3
1,1±0,4
Remoção de nódoas de gema de ovo pela enzima imobilizada usando o plasma
químico como agente ligante
A detecção de nódoas de gema de ovo no tecido com a enzima imobilizada usando o plasma químico
como agente ligante foi medida também de três modos diferentes, o primeiro sem lavagens, o
segundo com uma lavagem, e o terceiro com duas lavagens das amostras. De modo a facilitar a
visualização e compreensão dos resultados, apenas se apresentam aqui as comparações feitas entre
os diferentes ensaios, tanto para as percentagens de reflectâncias, Figura 4.18, Figura 4.19 e Figura
4.20, como para os valores de K/S, Tabela 4.6.
Como é notório em todas as amostras a percentagem de reflectância aumenta com o aumento das
lavagens, enquanto a intensidade da cor das nódoas diminui como era de esperar, uma vez que
estas grandezas são inversamente proporcionais. Existe uma diferença significativa e compreensível
entre as reflectâncias das amostras de controlo e as restantes amostras, reflectida também nos
valores de K/S, devido ao facto de as amostras de controlo não possuírem enzima imobilizada, assim
a variação dos seus valores deve-se inteiramente às lavagens efectuadas.
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CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
Figura 4.18. Comparação entre a percentagem de reflectância de todas as amostras com nódoas de gema de ovo, sem
lavagens.
Figura 4.19. Comparação entre a percentagem de reflectância de todas as amostras com nódoas de gema de ovo, após uma
lavagem.
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66
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CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
Figura 4.20. Comparação entre a percentagem de reflectância de todas as amostras com nódoas de gema de ovo, após duas
lavagens.
Tabela 4.6. Resultados obtidos dos valores de K/S nas diferentes situações testadas na detecção de nódoas de gema de ovo.
Amostra
0 lavagens
1 lavagem
2 lavagens
Controlo
Controlo com
mancha de gema de
ovo
Tecido N2 com
mancha de gema de
ovo
Tecido O2 com
mancha de gema de
ovo
0,542
0,509
0,824
1,412
1,067
0,654
0,982
0,933
0,596
1,139
0,997
0,604
Pode-se concluir através dos resultados apresentados na Tabela 4.6 que entre as imobilizações com
plasma químico, usando dois gases de arraste diferentes, não existe uma diferença significativa entre
eles, podendo qualquer um deles ser utilizado para o efeito pretendido, dando-se preferência aquele
que possuir menos custos associados ao seu uso.
A nível do aumento de lavagens conclui-se que a intensidade da cor da nódoa diminuiu, como era
esperado, uma vez que a enzima em questão pertence à classe das hidrolases, esta necessita de
moléculas de água para quebrar as ligações. Comparando as amostras de tecido com enzima
imobilizada com as amostras de controlo, nota-se que apenas com a baixa humidade natural do
tecido estas degradam uma pequena parte da nódoa, sendo um resultado optimista, dado que este
era um dos objectivos principais do trabalho, sendo possível efectuar a catálise enzimática na
ausência de água optimizando este método (Affleck, et al. 1992, Lind, et al. 2004).
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CAPÍTULO 4
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
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CAPÍTULO 5
CONCLUSÕES GERAIS E TRABALHOS FUTUROS
CAPÍTULO 5
CONCLUSÕES GERAIS E TRABALHOS
FUTUROS
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CAPÍTULO 5
CONCLUSÕES E TRABALHOS FUTUROS
5.
CONCLUSÕES GERAIS E TRABALHOS FUTUROS
5.1
Síntese do Trabalho e Conclusões Gerais
Com este trabalho pretendeu-se iniciar o estudo para o desenvolvimento de têxteis auto-limpantes
recorrendo a tratamento enzimático. Foi objecto de estudo a cinética da enzima na sua forma livre e
também na sua forma imobilizada, nomeadamente a determinação das constantes cinéticas da
equação de Michaelis-Menten. Estudou-se ainda dentro da cinética enzimática, a temperatura e pH
óptimos, a estabilidade ao armazenamento e alguns inibidores enzimáticos.
Foram testadas três diferentes técnicas de imobilização, a impregnação como método temporário e a
imobilização da enzima usando dois agentes ligantes diferentes: o glioxal e o plasma químico.
Atendendo a estas técnicas, efectuaram-se ainda outros estudos, distinguindo-se a detecção de
nódoas de gema de ovo, a reutilização da enzima imobilizada e ainda a solidez da enzima a lavagens
sucessivas.
Os resultados obtidos neste trabalho provam ser possível utilizar as enzimas modificadas atendendo
aos métodos de imobilização referidos anteriormente, principalmente a imobilização usando o plasma
químico como agente ligante na ligação covalente, que pode vir a ser um método promissor nesta
área.
No entanto existem alguns aspectos e algumas conclusões que se distinguiram neste trabalho:
- a determinação das constantes cinéticas de Michaelis-Menten da enzima imobilizada, que
apresentam valores consideravelmente inferiores aos da enzima livre, 0,46±0,15 mg/mL e
5,1±0,9 mg/mL, respectivamente, provando que desta forma a primeira tem uma maior afinidade para
com a caseína, provando ser exequível prosseguir com esta enzima para o desenvolvimento de
tecidos self-cleaning;
- conclui-se que as condições óptimas de operação da enzima são a uma temperatura de 60 °C e a
um pH de 11. Conclui-se também que a enzima apresenta maior estabilidade ao armazenamento à
baixa temperatura, cerca de 4°C e maior estabilidad e de operação a 37 °C;
- observou-se que a enzima é inibida pelas substâncias estudadas, EDTA, detergente SKIP e
também pelo CaCl2, e que degrada outras enzimas como celulases;
- a capacidade que a enzima apresentou para a degradação de nódoas de gema de ovo, onde se
verificaram resultados bastante positivos do ponto de vista da investigação, uma vez que se
conseguiu manter a enzima imobilizada ao tecido activa;
- a possibilidade de reutilização da enzima para posteriores tratamentos, o que conduz a uma
diminuição significativa de custos.
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ISEC, 2011
CAPÍTULO 5
CONCLUSÕES GERAIS E TRABALHOS FUTUROS
De um modo geral pode-se afirmar que os ensaios efectuados foram bem-sucedidos, dado que se
conseguiu imobilizar uma enzima hidrolítica (uma protease) a um tecido de algodão, apesar de o
processo de imobilização não estar ainda optimizado e apresentar baixa solidez à lavagem, sendo
este um requisito que é importante cumprir.
Por outro lado, conseguiu-se detectar a diminuição da intensidade da cor das nódoas testadas nos
tecidos contendo enzima imobilizada em relação ao controlo, levando a prever a possibilidade de
operar com a enzima imobilizada em condições com baixo teor de água (usando apenas a humidade
natural dos substratos). Contudo este processo necessita de um estudo mais aprofundado, de modo
a ser melhor caracterizado e optimizado.
5.2
Prosseguimento de Trabalhos Futuros
Estudos posteriores permitirão um conhecimento mais aprofundado sobre este tema e que têxteis
auto-limpantes se tornem realidade num futuro próximo. Este desenvolvimento, para além de diminuir
a utilização de detergentes e água, tornando-se assim num substrato mais amigo do ambiente, irá
permitir a auto-limpeza do vestuário, sendo esta uma funcionalidade muito requerida pelos
consumidores modernos, cada vez mais ávido de soluções práticas e rápidas para as tarefas que tem
que desempenhar no seu dia-a-dia.
Sendo assim, sugere-se para o prosseguimento de trabalhos futuros:
- o conhecimento completo da cinética da enzima imobilizada, percebendo assim melhor as
características finais da enzima;
- o estudo mais aprofundado de técnicas de imobilização, de modo a poder inovar ou até mesmo
melhorar o estudo efectuado;
- a utilização de enzimas diferentes e/ou junção de várias enzimas numa só imobilização, permitindo
assim a degradação de nódoas de diferentes origens;
- a utilização de outros substratos têxteis;
No final do trabalho pode-se afirmar que os objectivos propostos foram alcançados com sucesso e
que este pode ser um projecto com continuação de desenvolvimento no futuro, apresentando
resultados promissores.
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CAPÍTULO 5
CONCLUSÕES E TRABALHOS FUTUROS
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CAPÍTULO 6
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
CAPÍTULO 6
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
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ISEC, 2011
73
CAPÍTULO 6
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
6.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
Affleck, Rhett, Zu-Feng Xu, Valerie Suzawa, Kathleen Focht, e Douglas S. Clark. “Enzymatic catalysis
and dynamics in low-water environments.” Biochemistry, 1992: 1100-1104.
Araújo, Mário C. C. de, e Roy E. Bruns. “O método generalizado das adições-padrão e a eliminação
de interferências em análise multicomponente.” Química Nova, 1991: 104-108.
Atkins, Gordon L., e Ian A. Nimmo. “A comparation of seven methods for fitting the Michaelis-Menten
Equation.” Biochemistry Journal, 1975: 775-777.
Banerjee, U. C., R. K. Sani, e R. Soni. “Thermostable alkaline protease from Bacillus brevis and its
characterization as a laundry detergent additive.” Process Biochemistry, 1999: 213-219.
Banik, Rathindra Mohan, e Monika Prakash. “Laundry detergent compatibility of the alkalina protease
from Bacillus cereus.” Microbiological Research, 2004: 135-140.
Basto, Carlos Filipe Dias. “Interacção de ultra-sons com sistemas enzimáticos para aplicações
têxteis.” In Universidade do Minho, de Escola de Engenharia. Guimarães, 2007.
Bon, Elba P. S., Maria Antonieta Ferrara, e Maria Luísa Corvo. Enzimas em Biotecnologia: Produção,
Aplicações e Mercado. Rio de Janeiro: Editora Interciência, 2008.
Boyer, Rodney. Concepts in Biochemistry. USA: John Wiley & Sons, Inc., 2005.
Bradford, Marion M. “A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein
utilizing the principle of protein-dye binding.” (elsevier) 72 (1976): 248-254.
Britton, H. T. S. Hydrogen Ions. Vol. 4. Londres: Chapman and Hall, 1952.
Cabral, M. S. Joaquim, Maria Raquel Aires-Barros, e Miguel Gama. Engenharia Enzimática. Lisboa:
LIDEL-edições técnicas, Lda, 2003.
Cardoso, Carmen Lúcia, Quezia B. Cass, e Marcela C. de Moraes. “Imobilização de enzimas em
suportes cromatográficos: uma ferramenta na busca por substâncias bioactivas.” Química
Nova, 2009.
Carneiro, Ana Filipa Gonçalves da Costa. “Estabilização de enzimas para modificação de fibras
sintéticas.” In Escola de Engenharia; Universidade do Minho. Guimarães, 2003.
Carvalho, Nakédia M. F., et al. “Uso de equações lineares na determinação dos parâmetros de
Michaelis-Menten.” Quimica Nova, 2010: 1607-1611.
Cavaco Paulo, Artur M. “Influência da Agitação Mecânica e da Composição enzimática no tratamento
do algodão com celulases.” In Escola de Engenharia, Universidade do Minho. Braga, 1995.
Chibata, I. Immobilized enzymes. Nova Iorque: John Wiley & Sons, 1978.
Desenvolvimento de estruturas têxteis auto-limpantes usando enzimas
Ana Lúcia Godinho de Jesus
74
ISEC, 2011
CAPÍTULO 6
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
Dubois, J. “Louis Pasteur: Free Lance of Science, Gollancz.” In K. L. Manchester, de J. Dubois.
Manchester, 1995.
Espósito, Talita S., Ian P. G. Amaral, Diego S. Buarque, Givanildo B. Oliveira, Jr. Luiz B. Carvalho, e
Ranilson S. Bezerra. “Fish processing waste as a source of alkaline proteases for laundry
detergent.” Food Chemistry, 2009: 125-130.
Ferreira, L., M. A. Ramos, J. S. Dordick, e M. H. Gil. “Influence of different silica derivaties in the
immobilization and stabilization of a Bacillus licheniformis protease (Subtilisin Carlsberg).”
Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2003: 189-199.
Fu, Xue-yan, Chang-hu Xue, Ben-chun Miao, Zhao-jie Li, Xin Gao, e Wen-ge Yang. “Characterization
of proteases from the digestive tract of sea cucumber (Stichopus japonicus): Highalkaline
protease activity.” Aquaculture, 2005: 321-329.
Garrett, Reginald H., e Charles M. Grisham. Biochemistry. USA: Thomson Brooks/Cole, 2005.
Gonçalves, Maria de Lurdes Sadler Simões. Métodos instrumentais para análise de soluções. Lisboa:
Fundação Calouste Gulenkian, 2001.
Jr., Michael J. Pelczar, E. C. S. Chan, e Noel R. Krieg. “Microbiologia: Conceitos e aplicações.” In 2ª
edição, de Volume I. São Paulo: Makron Books, 1996.
Kruger, Nicholas J. “The protein protocols handbook.” The Bradford method for protein quantitation,
s.d.
Kumar, C. Ganesh, e Hiroshi Takagi. “Microbial alkaline proteases: From a bioindustrial viewpoint .”
Biotechnilogy Advances, 1999: 561-594.
Lind, Penelope, A., Roy M. Daniel, Colin Monk, e Rachael V. Dunn. “Esterase catalysis of substrate
vapour: enzyme activity occurs at very low hydration.” Biochimica et Biophysica Acta, 2004:
103-110.
Martínez-Gómez, Manolache Sorin O., Raymond A. Young, e Ferencz Denes. “Surface
functionalization and biomolecule immobilization using plasma-generated free radicals on
polypropylene.” Springer-Verlag, 2010: 293-308.
Nielsen, P. H., Zhou W. Kuilderd, e X. Lu. “Enzyme biotechnology for sustainable textiles.” Woodhead
Publishing Limited, s.d.
Quintas, Alexandre, Ana Ponces Freira, e Manuel J. Halpern. “Bioquímica: Organização molecular da
vida.” In 1ª Edição. Lisboa: LIDEL - Edições técnicas, 2008.
R., Sipehia, Chawla A. S., Daka J., e Chang T. M. S. “Immobilization of enzymes on polypropylene
bead surfaces by anhydrous ammonia gaseous plasma technique.” Journal of Biomedical
Materials Research, Setembro 2004: 417-422.
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CAPÍTULO 6
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
Ramos, Manuel Carlos Andrade. Imobilização de lipases. Lisboa: Universidade Técnica de Lisboa,
1991.
Ribani, Marcelo, Carla Beatriz Grespan Bottoli, Carol H. Collins, Isabel Cristina Sales Fontes Jardim, e
Lúcio Flávio Costa Melo. “Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos.” Química
Nova 27 (2004): 771-780.
Sarcinelli, Miryelle Freire, Katiani Silva Venturini, e Luís César Silva. “Caracteristicas dos ovos.”
Boletim Técnico, 2007.
Silva, Carla J. S. M., Qinghua Zhang, Jinsong Shen, e Artur Cavaco-Paulo. “Immobilization of
proteases with a water soluble-insoluble reversible polymer for treatment of wool.” Enzyme
and Microbial Tecnology (Elsevier), 2006: 634-640.
Silva, Carla Joana dos Santos Marinho da. “Enzymatic Treatment of Wool with modified proteases.”
De Universidade do Minho e Escola de Engenharia. Guimarães, 2005.
Silva, Marcelo Anselmo Oseas da, e Marco Aurélio Zezzi Arruda. “Analytical Biochemistry.”
Mechanization of the Bradford reaction for the spectrophotometric determination of total
proteins, 2006, 351 ed.
Soares, Graça Maria Barbosa. “Aplicação de sistemas enzimáticos à degradação de corantes
Têxteis.” In Escola de Engenharia; Universidade do Minho. Guimarães, 2000.
Vasconcelos, Andreia Joana da Costa. “Obtenção de Tecidos de Poliéster de Baixo Peso por
Tratamento enzimático.” In Escola de Engenharia; Universidade do Minho. Guimarães, 2005.
www.genencor.com. 2010.
www.novozymes.com. 2010.
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CAPÍTULO 7
ANEXOS
CAPÍTULO 7
ANEXOS
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CAPÍTULO 7
ANEXOS
7.
ANEXOS
Anexo A: Carta de Controlo de Duplicados das amostras para a Curva de
Calibração da actividade enzimática
0.690
0.680
Absorvância (660 nm)
0.670
0.660
0.650
0.640
0.630
0.620
0.610
0.600
Limite superior de controlo
Limite superior de aviso
Linha central
Limite inferior de aviso
Limite inferior de controlo
Figura 7.1. Representação gráfica da carta de controlo de duplicados efectuada para a curva de calibração da actividade
enzimática.
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CAPÍTULO 7
ANEXOS
Anexo B: Remoção de nódoas de ketchup
Figura 7.2. Percentagem de reflectâncias para as amostras de controlo com nódoas de ketchup.
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ANEXOS
Figura 7.3. Percentagem de reflectâncias para as amostras com nódoas de ketchup.
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ANEXOS
Figura 7.4. Percentagem de reflectâncias para as amostras de controlo com nódoas de ketchup, após cinco pulverizações.
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ANEXOS
Figura 7.5. Percentagem de reflectâncias para as amostras com nódoas de ketchup, após cinco pulverizações.
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CAPÍTULO 7
ANEXOS
Figura 7.6. Percentagem de reflectâncias para as amostras de controlo com nódoas de ketchup, após o banho termostatizado
a 40 °C e 100 rpm.
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ANEXOS
Figura 7.7. Percentagem de reflectâncias para as amostras com nódoas de ketchup, após o banho termostatizado a 40 °C e
100 rpm.
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ANEXOS
Figura 7.8.Comparação entre a percentagem de reflectância das amostras de controlo e as amostras com nódoas de ketchup.
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CAPÍTULO 7
ANEXOS
Anexo C: Remoção de nódoas de gema de ovo pela enzima imobilizada usando
glioxal como agente ligante
Figura 7.9. Percentagem de reflectâncias para amostras CTR com nódoas de gema de ovo.
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ANEXOS
Figura 7.10. Percentagem de reflectâncias para amostras LAV com nódoas de gema de ovo.
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ANEXOS
Figura 7.11. Percentagem de reflectâncias para amostras ALC com nódoas de gema de ovo.
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ANEXOS
Figura 7.12. Comparação entre a percentagem de reflectância dos CTR e os LAV com nódoas de gema de ovo.
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ANEXOS
Figura 7.13. Percentagem de reflectâncias para amostras CTR com nódoas de gema de ovo, depois de colocadas na solução
de SKIP 2,0 g/L.
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ANEXOS
Figura 7.14. Percentagem de reflectâncias para amostras ALC com nódoas de gema de ovo, depois de colocadas na solução
de SKIP 2,0 g/L.
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ANEXOS
Figura 7.15. Percentagem de reflectâncias para amostras CTR com nódoas de gema de ovo, depois das seis pulverizações.
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ANEXOS
Figura 7.16. Percentagem de reflectâncias para amostras LAV com nódoas de gema de ovo, depois das seis pulverizações.
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ANEXOS
Figura 7.17. Percentagem de reflectâncias para amostras ALC com nódoas de gema de ovo, depois das seis pulverizações.
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ANEXOS
Figura 7.18. Comparação entre a percentagem de reflectância das amostras CTR e LAV com nódoas de gema de ovo, depois
das seis pulverizações.
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