Rui Manuel de Medeiros Melo Silva Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização DISSERTAÇÃO DE CANDIDATURA AO GRAU DE DOUTOR APRESENTADA À FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO PORTO Faculdade de Medicina da Universidade do Porto 2002 Artigo 48º, § 3º - A Faculdade não responde pelas doutrinas expendidas na dissertação. (Regulamento da Faculdade de Medicina do Porto-Decreto de Lei n.º 19337, de 29 de Janeiro de 1931). | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Corpo Catedrático da Faculdade de Medicina do Porto Professores Efectivos- Catedráticos José Augusto Fleming Torrinha Serafim Correia Pinto Guimarães Manuel Miranda Guimarães Alexandre Alberto Guerra Sousa Pinto Eduardo Jorge Cunha Rodrigues Pereira Manuel Augusto Cardoso De Oliveira Manuel Maria Paula Barbosa Manuel Machado Rodrigues Gomes Manuel Alberto Coimbra Sobrinho Simões Francisco José Zarco Carneiro Chaves Jorge Manuel Mergulhão Castro Tavares Maria Isabel Amorim de Azevedo Maria Amélia Duarte Pereira José Agostinho Marques Lopes Patrício Manuel Vieira Araújo Soares da Silva Daniel Filipe de Lima Moura Belmiro dos Santos Patrício Alberto Manuel Barros da Silva José Manuel Lopes Teixeira Amarante José Henrique Dias Pinto de Barros Maria de Fátima Machado Henriques Carneiro Isabel Maria Amorim Pereira Ramos | 3 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Deolinda Maria Valente Alves Lima Teixeira Maria Dulce Cordeiro Madeira Cassiano Pena de Abreu e Lima Altamiro Manuel Rodrigues Costa Pereira Rui Manuel Almeida Mota Cardoso António Carlos Freitas Ribeiro Saraiva Álvaro Jerónimo Leal Machado de Aguiar Professores Jubilados António Augusto Lopes Vaz António Carvalho Almeida Coimbra António Fernandes da Fonseca António Fernandes Oliveira Barbosa Ribeiro Braga António Germano Pina Silva Leal António Luís Tomé da Rocha Ribeiro António Manuel Sampaio da Araújo Teixeira Cândido Alves Hipólito Reis Daniel Santos Pinto Serrão Fernando de Carvalho Cerqueira Magro Ferreira Henrique José Ferreira Gonçalves Lecour de Menezes João Silva Carvalho Joaquim Oliveira Costa Maia José Carvalho de Oliveira José Fernando Barros Castro Correia José Pinto de Barros Levi Eugénio Ribeiro Guerra Luis António M. P. Cunha Soares Moura Pereira Leite Manuel Teixeira Amarante Júnior Maria da Conceição Fernandes Marques Magalhães Mário José Cerqueira Gomes Braga Valdemar Miguel Botelho dos Santos Cardoso 4 | | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica AGRADECIMENTOS Ao Professor Carlos Lopes, orientador deste trabalho, o meu mais sincero agradecimento por todo o estímulo, apoio e orientação científica e pedagógica. Aos revisores e editores das revistas, meus co-orientadores invisíveis (mas sempre incisivos e implacáveis) pelos comentários e observações, que quando construtivas, foram de grande utilidade na interpretação dos trabalhos até à sua aceitação para publicação. Ao Centro Regional do Norte da Liga Portuguesa Contra o Cancro (em particular ao Dr. José Cardoso da Silva e Dr. Vitor Veloso) pelo apoio concedido para o desenvolvimento dos trabalhos. Ao Conselho de Administração do Centro Regional do Instituto Português de Oncologia de Francisco Gentil, que nas pessoas dos seus Directores, actuais e anteriores, sempre demonstraram apoio e compreensão pelo papel que este Instituto deve ter com investigação própria ou em associação, muito para além da sua função como centro de assistência hospitalar. Aos co-autores das publicações incluídas nesta dissertação agradeço a sua colaboração. Aos colegas do Laboratório (André Vasconcelos, Daniela Pinto, Sandra Costa) grandes entusiastas da ciência e da investigação, por acreditarem (como eu) que é possível fazer investigação em Portugal apesar dos poucos recursos disponíveis para nós e das dificuldades crescentes. | 5 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | A todos os funcionários do IPO-Porto que pelo seu esforço e capacidade prestam um serviço público altamente diferenciado e de altíssima qualidade. Um agradecimento particular ao pessoal da Biblioteca onde encontrei nos últimos meses um refúgio imprescindível para a conclusão desta dissertação. À Fundação para a Ciência e Tecnologia e ao Programa PRAXIS XXI que pela concessão de financiamento permitiu o arranque inicial deste projecto de investigação. Aos meus Pais, Ana e João, pela oportunidade que me proporcionaram de determinar o meu próprio rumo e de ter chegado até aqui, em particular ao meu pai que recentemente se tornou mais um dos atingidos por esta doença insidiosa. Aos meus filhos que durante as fases da Licenciatura (Nuno Miguel), Mestrado (Maria Inês) e Doutoramento (Ana Margarida) ajudaram a complementar a minha vida com a sua alegria e a crescer como ser humano e como indivíduo. À minha companheira da vida, Guida por me aturar e me ajudar a dar sentido ao que é verdadeiramente importante. 6 | | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Ao abrigo do Art8º do Decreto-Lei nº388/70 fazem parte integrante desta dissertação os seguintes trabalhos já publicados ou em publicação: – Medeiros R, Morais A, Vasconcelos A, Costa S, Pinto D, Oliveira J, Carvalho R, Lopes C (2002a). Linkage between Polymorphisms in the Prostate-Specific Antigen ARE1 Gene Region, Prostate Cancer Risk, and Circulating Tumour Cells”. Prostate (aceite para publicação). – Medeiros R, Morais A, Vasconcelos A, Costa S, Pinto D, Oliveira J, Lopes C (2002b). The Role of Vitamin D Receptor Gene Polymorphisms in the Susceptibility to Prostate Cancer of a Southern Europe Population”. J Hum Genet (aceite para publicação). – Medeiros R, Morais A, Vasconcelos A, Costa S, Pinto D, Oliveira J, Lopes C (2002c). Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene Polymorphisms and Genetic Susceptibility to Prostate Cancer. Eur J Cancer Prev (aceite para publicação). – Medeiros R, Morais A, Vasconcelos A, Costa S, Carrilho S, Oliveira J, Lopes C (2002d). Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms and the shedding of circulating tumour cells in the blood of prostate cancer patients”. Cancer Lett, 2002 (aceite para publicação). – Medeiros R, Morais A, Oliveira J, Vasconcelos A, Carrilho S, Costa S, Campos C, Carvalho R, Lopes C (2001). Diagnóstico molecular das micrometástases em doentes com adenocarcinoma da próstata. Arquiv Med 15: 5-6 | 7 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | – Lopes C, Medeiros R (1999). Molecular diagnosis of prostate adenocarcinoma with emphasis on screening programs. Rev Esp Patol 32 (3): 372-374 Em cumprimento do disposto no Decreto-Lei nº 388/70 declara que participou activamente na recolha e estudo do material incluído em todos os trabalhos, tendo redigido os textos com activa colaboração dos outros autores. A dissertação inclui também resultados ainda não enviados para publicação. 8 | | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica ÍNDICE Abreviaturas 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 15 1.1 CANCRO DA PRÓSTATA .................................................................................................... 16 1.1.1. Incidência ................................................................................................................ 16 1.1.2. Mortalidade............................................................................................................. 18 1.1.3. Factores de Risco ..................................................................................................... 19 1.1.4. Diagnóstico Precoce/Rastreio ................................................................................... 21 1.1.5. Diagnóstico, Grau Histológico e Estadiamento ......................................................... 22 1.1.6. Lesões Precursoras ................................................................................................... 25 1.1.7. Prevenção e Quimioprevenção ................................................................................. 25 1.2. POLIMORFISMOS GENÉTICOS E SUSCEPTIBILIDADE PARA CANCRO DA PRÓSTATA ......... 26 1.2.1. Variabilidade Genética e Cancro da Próstata ............................................................ 26 1.2.2. Polimorfismos no Gene que codifica o Antigénio Específico da Próstata (PSA) .......... 28 1.2.3. Exposição ao Sol, Polimorfismos no Gene que Codifica o Receptor da Vitamina D e Susceptibilidade para Cancro da Próstata ............................................ 29 1.2.4. Óxido Nítrico, Sintetases do Óxido Nítrico (ecNOS) e Cancro da Próstata .................. 32 1.2.5. Polimorfismos Genéticos associados ao Metabolismo: Polimorfismos nos Genes que codificam as Enzimas Glutationa S-transferases ....................................... 33 1.3. METÁSTASES E MICROMETASTIZAÇÃO ............................................................................ 35 1.3.1. Mecanismos de metastização .................................................................................. 35 1.3.2. Micrometastização e células epiteliais circulantes no sangue periférico ..................... 36 2. OBJECTIVOS ............................................................................................................................ 41 | 9 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | 3. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................................... 45 4. RESULTADOS ........................................................................................................................... 49 4.1. Determinação dos Genótipos ARE1 do Gene PSA por PCR-RFLP ...................................... 49 4.2 Exposição à Radiação Solar, Vitamina D e Cancro da Próstata .......................................... 52 4.2.1. Insolação e Cancro da Próstata ................................................................................ 52 4.2.2. Polimorfismos no Gene VDR por PCR-RFLP ............................................................... 54 4.3. Detecção de Polimorfismos Genéticos nas Enzimas ecNOS por PCR-RFLP ........................ 57 4.4. Detecção de Polimorfismos nos Genes GSTM1, GSTT1 e GSTM3 ..................................... 62 4.5. Detecção de Presença de Células Epiteliais de Origem Prostática no Sangue Periférico .. 64 4.6. Polimorfismos Genéticos e Risco de Micrometastização .................................................. 65 5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................. 71 5.1 Polimorfismos Genéticos e Susceptibilidade para Cancro da Próstata ............................... 71 5.1.1. Polimorfismo PSA ARE1 ........................................................................................... 71 5.1.2. Polimorfismo VDR Taq I............................................................................................ 72 5.1.3. Polimorfismos nos Genes ecNOS .............................................................................. 74 5.1.4. Polimorfismos nos Genes GSTM1, M3 e GSTT1 ........................................................ 75 5.2. Micrometastização, Células Tumorais Circulantes e Polimorfismos Genéticos ................. 77 5.2.1. Células Epiteliais de Origem Prostática no Sangue Periférico ..................................... 77 5.2.2. Polimorfismos Genéticos Células Epiteliais de Origem Prostática no Sangue Periférico ..................................................................................................... 79 6. CONCLUSÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS ................................................................. 85 7. REFERÊNCIAS .......................................................................................................................... 91 8. RESUMO................................................................................................................................ 111 9. SUMMARY ............................................................................................................................ 115 10. ARTIGOS ............................................................................................................................ 117 10 | Abreviaturas ARE – androgen response element 1 bp – base pair (s) CI – confidence interval DNA – deoxyribonucleic acid cDNA – complementary DNA ecNOS – endothelial cell nitric oxide synthase EDTA – ethylenediaminetetracetic acic GST – glutathione S-transferase mRNA – messenger RNA NOx – NO2- + NO3NO – nitric oxide OR – odds ratio PCR – polymerase chain reaction PSA – prostate specific antigen PSMA – prostate specific membrane antigen RT-PCR – reverse transcriptase- polymerase chain reaction RNA – ribonucleic acid VDR – vitamin D receptor 1. Introdução | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica 1. INTRODUÇÃO O conhecimento das taxas de incidência de cancro é factor importante no desenvolvimento e planificação de estratégias de Saúde Pública, constituindo forte motivação para o investimento na investigação deste campo científico. Além das implicações directas de intervenção sobre o tratamento da doença, existem parâmetros económicos e de disponibilidade dos recursos que poderão ser optimizados com um melhor conhecimento dos factores envolvidos na etiopatologia do cancro. A prevenção, a detecção precoce e o rastreio estão entre as estratégias mais eficazes na luta contra o cancro (Franco e Rohan 2002). A epidemiologia estuda as variações da incidência da doença entre os grupos de populações humanas e os factores que os influenciam. O principal objectivo da epidemiologia será identificar os factores envolvidos na causalidade da doença tendo em vista o desenvolvimento de estratégias para a sua prevenção. As neoplasias constituem um importante grupo de doenças. Todos os anos são detectados cerca de oito milhões e cem mil novos casos no mundo inteiro (Parkin 1998). A distribuição da incidência de algumas destas neoplasias é diferente com a localização geográfica das populações estudadas e com alguns hábitos e atitudes dessas mesmas populações. Pela observação dos diferentes padrões de incidência de cancro é possível a formulação de hipóteses que poderão ser testadas em estudos especificamente desenhados para o efeito (Franco 1997). O cancro engloba um grupo complexo de doenças com variadas causas, que incluem carcinogénios químicos, radiações, hormonas, agentes infecciosos e o “stress” oxidativo. O modelo mais aceite na definição de um processo de carcinogénese envolve três fases: iniciação, promoção e progressão. A iniciação é a interacção irreversível de um carcinogénio com Introdução | 15 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | o DNA tecidual. Esta lesão do DNA é necessária mas não o suficiente para a tumorigénese uma vez que são necessários outros eventos. Esta lesão inicial não pode ser detectada patologicamente mas ocorre a produção de células que são precursoras de um tumor futuro. Em contraste com a iniciação tumoral, a progressão é um processo reversível que facilita a expressão das células iniciadas levando ao aparecimento de lesões precursoras e tumores benignos. A progressão é o processo em que as lesões precursoras ou os tumores benignos se tornam malignos. A acumulação de múltiplas alterações genéticas conduz à transformação progressiva das células em células de elevada malignidade. Os estudos moleculares demonstraram que se acumulam alterações nos oncogenes e genes supressores tumorais durante a progressão tumoral sendo a principal característica desta fase da carcinogénese a instabilidade genómica (Santella 2002). Alguns factores de risco têm sido fortemente associados ao desenvolvimento de algumas neoplasias como são os casos do fumo do cigarro no cancro do pulmão e do HPV (papilomavirus humano) no cancro do colo do útero (Franco 1997). No que diz respeito ao cancro da próstata a informação que nos é dada pela epidemiologia apresenta diversas controvérsias no que diz respeito à definição de factores de risco importantes para o desenvolvimento desta neoplasia. A compreensão do papel de vários factores genéticos na susceptibilidade para cancro poderá contribuir para um melhor esclarecimento das questões existentes sobre a oncogénese do cancro da próstata. 1.1. CANCRO DA PRÓSTATA 1.1.1. Incidência O cancro da próstata é uma das neoplasias mais comuns no homem e a segunda causa de morte por cancro em todo o Mundo constituindo um grande problema de saúde pública em particular nas sociedades ocidentais (Parkin 1998). Esta neoplasia apresenta enormes variações nas taxas de incidência e mortalidade a nível mundial. No continente Asiático, em países como o Japão e a China as taxas de incidência por 100.000 habitantes de 11,05 e 1,74, são muito baixas relativamente aos Estados Unidos em que o valor deste parâmetro 16 | Introdução | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica atingiu 104,3 por cada 100.000 habitantes no ano 2000 (Ferlay et al, 2001). A incidência mais elevada encontra-se nos indivíduos norte-americanos de raça negra sendo 66% mais comum do que nos indivíduos norte-americanos de raça branca (Chan et al, 1998). Em contraste, os indivíduos de raça negra em África apresentam taxas de incidência quatro vezes mais baixas do que os norte-americanos (Chan et al, 1998; Hsing et al, 2000; Ferlay et al, 2001). Existe alguma controvérsia acerca das verdadeiras taxas de incidência de cancro da próstata nos indivíduos de raça negra a residir em países africanos, sendo referido que factores como o sob-diagnóstico, a ausência de diagnóstico precoce ou rastreio, a mortalidade elevada e um tempo de esperança de vida mais curto, poderão influenciar as taxas de incidência conhecidas em África. Alguns estudos recentes apresentam elevadas taxas de incidência de cancro da próstata na Nigéria (Osegbe 1997; Ogunbiyi et al, 1999). Outra hipótese propõe que os recentes aumentos descritos em países africanos poderão corresponder a um aumento real da taxa de incidência de cancro da próstata provocado pela crescente ocidentalização dos hábitos de vida dos africanos (Echimane et al, 2000). Ao encontro desta controvérsia, sobre as taxas de incidência, vêm as elevadas taxas descritas para indivíduos de raça negra nas Caraíbas, em particular na Jamaica com uma taxa de incidência de 304 casos por 100 000 habitantes (Glover et al,1998). Na Europa a incidência do cancro da próstata apresenta uma disparidade Norte-Sul bem evidenciada pela incidência anual muito elevada em países escandinavos como a Suécia e a Finlândia (69,99 e 72,91 por 100 000, respectivamente) sendo três vezes mais elevada do que na Itália, Espanha e Grécia (24,89, 24,23 e 20.17 por 100 000, respectivamente) e cerca de duas vezes mais elevada que em Portugal (36,69 por 100 000) (Ferlay et al, 2001). No Norte de Portugal a incidência do carcinoma da próstata tem vindo a aumentar sendo o seu valor de 39,7 na faixa etária dos 40 aos 69 anos e de 250,0 na faixa etária dos homens com mais de 70 anos (RORENO 1994). Após uma observação atenta das taxas de incidência para cancro da próstata é evidente que existem claras diferenças entre alguns grupos populacionais de diferentes etnias e raças embora seja possível pensar que a prevalência dos tumores prostáticos microscópicos e latentes seja semelhante entre muitas destas populações. Os estudos descritivos, examinando a incidência e a mortalidade, poderão fornecer informações fundamentais para a compreensão da epidemiologia do cancro da próstata (Hsing e Devesa 2001). Introdução | 17 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | 1.1.2. Mortalidade A taxa de mortalidade atribuível ao cancro da próstata apresenta grandes variações geográficas e populacionais como acontece para as taxas de incidência. Em geral nos países ocidentais e para um homem de 50 anos, o risco de desenvolver ao longo da vida um cancro da próstata é de cerca de 42%, e o risco de vir a morrer da doença é de 2.9% (Boring et al, 1993). As taxas de mortalidade mais elevadas são registadas nas Caraíbas (55,3 por 100000 nos Barbados e 33, 2 por 100 000 nas Bahamas) (Ferlay et al, 2001). Nos Estados Unidos (com uma taxa de incidência de 104,3 por 100000) temos uma taxa de mortalidade (17,9 por 100000) quase idêntica às taxas de mortalidade (17,8 e 15,04 por 100000) registadas em países com taxas de incidência muito mais baixas como Portugal e Espanha (36,9 e 24,2 por 100000) (Ferlay et al, 2001). Em Portugal, o cancro da próstata é dos tumores malignos que mais afecta os homens, correspondendo a 12% das mortes devidas a cancro (INE 2000). Quadro 1.1.1. Apresentação das taxas de mortalidade para alguns dos principais tipos de cancro que afectam a população portuguesa,do sexo masculino, dados relativos ao ano de 1998 (Fonte: Instituto Nacional de Estatística) Tipo de cancro Homens N.º mortes Taxa(1) ASR (W)(2) Testículo 13 0,3 0,2 Nasofaringe 42 0.9 0.7 Melanoma 75 1.6 1.0 Fígado 235 4.9 3.1 Recto 445 9.3 5.6 Bexiga 447 9.3 5.4 Pâncreas 451 9.4 5.9 Cólon 1075 22.4 13.4 Estômago 1534 32.0 19.7 Próstata 1653 34.4 18.8 (3) Pulmão 2355 49.1 31.2 (1) Taxa de Mortalidade Anual expressa por cada 100.000 pessoas. ASR (W) (age-specific rate) Padronização da taxa de mortalidade consoante a idade, por cada 100 000 pessoas. (3) 17,8 por 100 000 segundo o GLOBOCAN 2000 – International Agency for Research on Cancer (Ferlay et al, 2001) (2) 18 | Introdução | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica 1.1.3. Factores de Risco A idade constitui o maior factor de risco do cancro da próstata. Estimativas realizadas a partir estudos realizados em autópsias indicam que 30% dos homens com idade superior a 50 anos têm cancro da próstata, e que a prevalência da doença aumenta de 12% nos homens na década dos quarenta anos para 43% nos homens na década dos oitenta (Franks 1973, Holund 1980). Uma das explicações para o aumento da incidência do cancro da próstata envolve a tendência actual que favorece o envelhecimento das populações (Levi et al, 2000). Os doentes com sintomatologia de hipertrofia benigna da próstata (HBP) não correm maior risco de cancro da próstata do que o homem comum (Bostwick et al, 1992; Gu et al, 1994) Outros factores de risco para o desenvolvimento de cancro da próstata são ainda pouco conhecidos, no entanto, factores como a etnia, condições sócio-económicas, predisposição genética, influências ambientais, alimentares e níveis hormonais, têm sido apontados como sendo factores preponderantes no desenvolvimento da neoplasia (Chan et al, 1998; Hsing e Devessa 2001) Estudos recentes têm demonstrado que o aumento dos níveis de testosterona poderá estar directamente relacionado com as diferenças raciais observadas na incidência do cancro da próstata explicando porque a incidência de cancro da próstata é mais elevada nos negros americanos, que têm tendência para desenvolver tumores mais agressivos e que apresentam mais elevadas taxas de mortalidade pela doença (Chan et al, 1998; Hsing e Devessa 2001). O papel do meio ambiente, da dieta alimentar e dos hábitos sociais tem sido também amplamente estudados, tendo-se observado que nos indivíduos que migram de países com uma baixa incidência neste tipo de patologia para um país com maior incidência, a taxa de incidência e de mortalidade para o cancro da próstata está aumentada. Nos japoneses que imigraram para os Estados Unidos, a incidência do cancro da próstata aproxima-se dos outros americanos (Giovannuci 1996; Hsing et al, 2001) A ingestão de elevadas quantidades de gorduras tem sido referida como uma das causas associadas a um aumento do risco para cancro (Giovannucci et al, 1993; Chan et al, 1998; Fradet et al, 1999; Hsing e Devessa 2001). A investigação epidemiológica e os estudos Introdução | 19 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | sobre migração das populações indicam uma associação entre a dieta rica em gorduras e cancro da próstata, mas não está esclarecido o papel deste factor no cancro da próstata. O efeito desta gordura pode ser mediado através das hormonas endógenas. Uma dieta pobre em gorduras tem demonstrado afectar o metabolismo hormonal do sexo masculino ao diminuir a circulação de testosterona. Esta é necessária ao crescimento normal do epitélio da próstata. As gorduras e produtos de origem animal constituem mais de 40% da ingestão calórica total na população americana norte-americana em que esta neoplasia é mais frequente. No mundo oriental onde a dieta é em geral pobre em gorduras e produtos de origem animal, mas rica em fibras e outros constituintes de origem vegetal, a mortalidade em consequência da doença é significativamente mais baixa (Fradet et al, 1999). Foi assim proposta a hipótese de existirem constituintes na dieta oriental capazes de atrasar ou inibir o processo da carcinogénese ou de progressão da doença. Os compostos do grupo dos isoflavonóides presentes em produtos de origem vegetal como os frutos, todos os grãos e soja, são metabolizados pela microflora intestinal, aumentando componentes tais como as enterolactonas, daizeína e genisteína (fitoestrógéneos) que são estrogéneos fracos (Denis et al, 1999). Reforçando o papel da dieta no risco para cancro da próstata tem sido referido o papel do licopeno, existente no tomate e na melancia, como factor de protecção (Giovannucci et al, 1995; DiMascio et al, 1996; Chan et al, 1998). O consumo de algumas variedades de peixe parece também ter um efeito protector contra o desenvolvimento do cancro da próstata (Norrish et al, 1999; Terry et al, 2001). Os níveis baixos de vitamina D têm sido implicados no desenvolvimento de cancro da próstata. Os homens que vivem em latitudes ao norte (na Suécia, por exemplo), que tem uma baixa exposição ao sol, produzem pouca vitamina D e apresentam uma elevada incidência de cancro da próstata (Schwarz e Hulka 1990; Peehl 1999). A existência de história familiar de cancro da próstata constitui um factor de risco desta doença (Narod 1998). Os homens com pais, irmãos e tios com uma elevada penetrância de cancro da próstata têm uma probabilidade duas vezes maior de vir a desenvolver a doença. Cerca de 10% de todos os cancros da próstata poderão ter uma característica familiar embora o cancro da próstata hereditário apresente grandes semelhanças com o cancro da próstata não hereditário em termos de idade de diagnóstico, apresentação histopatológica e grau histológico (Narod 1998). 20 | Introdução | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica 1.1.4. Diagnóstico Precoce/Rastreio As três metodologias de avaliação mais utilizadas no diagnóstico precoce do cancro da próstata são o toque rectal (DRE: digital rectal examination), a ecografia transrectal da próstata (TRUS: trans rectal ultrasonography) e o antigénio específico da próstata (PSA: prostate-specific antigen). Actualmente, a biópsia em sextante associada ao doseamento sérico do PSA constituem os dois principais meios de diagnóstico de carcinoma da próstata em fase assintomática. A biópsia em sextante é obtida de um modo normalizado por agulha de 18G em seis áreas distintas da próstata sob controlo imagiológico e tem progressivamente vindo a substituir o toque rectal e em particular a clássica biópsia sob toque rectal e a biópsia aspirativa da próstata (Lopes et al, 2000) A descoberta do antigénio específico da próstata (PSA: prostate-specific antigen) veio dar um grande impulso aos programas de rastreio e detecção precoce (Wang et al, 1979; Catalona et al, 1991; Helzlouer et al, 1992; Oesterling et al, 1991,1993; Schroder et al, 1995; Partin et al, 1997; Schroder et al, 2000). O PSA é uma glicoproteína com peso molecular de 33KD sendo uma protease serínica da família das Calicreínas (Lilja e Abrahamsson 1988; Armbruster et al 1993). Este antigénio é um dos três produtos do gene das Calicreínas glandulares humanas situado no braço longo do cromossoma 19 (Lilja e Abrahamsson 1988, Armbruster et al, 1993). O PSA é secretado pela próstata, pensando-se que a sua síntese se dá no sistema reticuloendotelial com armazenagem nos vacúolos e vesículas e libertando-se por exocitose para o lúmen glandular. A vida média desta proteína oscila entre 2,2 e 3,2 dias (Lilja e Abrahamsson 1988, Armbruster et al, 1993; Pereira Miguel e Carneiro de Moura 2000). O PSA tem uma intensa actividade proteolítica, clivando rapidamente a semenogelina, principal proteína estrutural do coágulo seminal, levando à sua liquefacção (Heidenreich et al, 1997). Esta característica determina que o PSA circule quase totalmente complexado (cerca de 90%) de forma irreversível com os inibidores das proteases séricas, sobretudo com a alfa-1 antiquimiotripsina (PSA-ACT), mas também com a alfa-2 macroglobulina (PSA-AMG) e em menor quantidade com outras proteínas de fase aguda (Armbruster 1993). Em relação aos indivíduos que não foram submetidos a rastreio, os homens em que o cancro foi detectado através da determinação de PSA apresentam uma maior probabilidade Introdução | 21 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | de na altura do diagnóstico terem uma doença no estádio inicial (Albertsen et al, 1995, 1996). Os indivíduos que na altura do diagnóstico apresentam tumores localizados têm uma sobrevivência mais prolongada do que os que têm uma doença num estádio mais avançado. No entanto, apesar da sua aparente utilidade, o rastreio de rotina do cancro da próstata, através da determinação do PSA, é um aspecto de alguma controvérsia (Albertsen, 1996; Shröder, 1997; Hoedemaeker et al, 2001). Por outro lado é geralmente aceite que o PSA é o melhor marcador tumoral no rastreio do cancro da próstata, bem como na monitorização da resposta terapêutica. 1.1.5. Diagnóstico, Grau Histológico e Estadiamento O adenocarcinoma, também designado por adenocarcinoma “acinar” é a forma mais comum, sendo diagnosticado em 95% dos cancros da próstata. Os restantes incluem o adenocarcinoma, mucinosos, carcinoma fusocelular, carcinoma de pequenas células, carcinoma espinocelular, carcinoma adenoescamoso, carcinoma de células em anel e carcinomas endometrióides (Lopes et al, 2000). O comportamento biológico do cancro da próstata apresenta grande variabilidade, no entanto existem certas características que ajudam à sua definição: tamanho (volume relativo ou absoluto do tumor), grau histológico, extensão local (atingimento da cápsula e/ou das vesículas seminais), e disseminação à distância (metastização). O volume tumoral constitui um importante factor de previsão da sobrevivência, mas antes da cirurgia é dificil avaliar com rigor o volume. O valor sérico de PSA constitui um bom marcador do volume do tumor. Quanto mais elevado for este nível, maior a probabilidade de doença extrapróstática. Na avaliação do grau histológico o esquema de classificação de Gleason ou grau de Gleason (Gleason 1992) verifica o grau de diferenciação glandular e o padrão de crescimento do tumor relativamente ao estroma prostático atribuindo um número de 1 a 5. Posteriormente somam-se estes números de modo a fornecer uma pontuação que, para cada tumor, se situa entre 2 e 10. Uma pontuação de 2, 3 ou 4 indica a presença de um cancro bem diferenciado; uma pontuação de 5, ou 6 de cancro moderadamente diferenciado e uma pontuação de 8, 9 ou 10, de cancro pouco diferenciado. Uma pontuação de 7 indica 22 | Introdução | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica um tumor mais agressivo que um cancro moderadamente diferenciado mas menos letal, que uma lesão pouco diferenciada. Os tumores pouco diferenciados são muito agressivos e metastizam com frequência. O estadiamento clínico constitui um dos passos mais importantes na classificação da doença oncológica após o diagnóstico. O primeiro sistema clínico de estadiamento foi introduzido por Whitmore e Jewett. Posteriormente foi introduzido o sistema TNM pelo “Committee of the International Union Against Cancer” (U.I.C.C.) e recomendado pela “American Joint Commission on Cancer (A.J.C.C.)”. Este sistema tem como base a descrição anatómica da doença, e baseia-se na valorização de três componentes: T – extensão do Tumor primário; N – ausência ou presença de metástases nos gânglios linfáticos regionais; M – ausência ou presença de metástases à distância. O quadro 1.1.2 descreve a classificação TNM (UICC) para o cancro da próstata. Na classificação T1, a doença é assintomática, sendo suspeita no exame rectal digital e encontrada incidentalmente ao exame patológico do tecido ressecado da próstata, no momento de diagnóstico da hipertrofia prostática. A classificação T1 está subdividida em T1a, que corresponde a tumor incidental, bem diferenciado e graduado patologicamente ou tumor focal, representando 5% ou menos do tecido ressecado, e em T1b, que corresponde a um tumor incidental pouco ou moderadamente diferenciado e existe envolvimento de mais de 5% da ressecção. O tumor pode ainda ser classificado como T1c correspondendo a um tumor incidental identificado por biópsia em sextante. Na classificação T2, a doença caracteriza-se por tumor palpável confinado à próstata. Este grupo subdivide-se em T2a, em que a doença apresenta uma lesão focal num só lado da próstata, e em T2b, que corresponde a doença em ambos os lados da próstata. No estádio T2, o cancro da próstata pode ser assintomático. A extensão do tumor através da cápsula prostática (extracapsular) caracteriza a classificação T3, sendo definido como T3a o tumor com extensão extracapsular para o tecido extraprostático, e como T3b se existir invasão das vesículas seminais. Neste estádio, existem os sintomas irritativos locais que incluem disúria, poliaquiúria e hematúria. A classificação T4 corresponde à presença de tumor fixo ou que invade estruturas adjacentes (excepto vesículas seminais): colo vesical, esfíncter externo, recto, elevador do ânus e/ou fixo à parede pélvica. Introdução | 23 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Quadro 1.1.2. Sistema de Estadiamento do Cancro da Próstata (Sistema TNM: revisão de 1997) Descrição Tumor Primitivo T Sem evidência de tumor primitivo To O Tumor é uma descoberta histológica acidental. Tumor clinicamente inaparente, não pálpavel nem visivel por imagiologia T1 - Tumor descoberto incidentalmente após RTU em ≤ 5% do tecido T1a - Tumor descoberto incidentalmente após RTU em > 5% do tecido T1b - Tumor descoberto incidentalmente após biópsia com agulha T1c Tumor clinicamente palpável, confinado à próstata T2 - Tumor num lado da próstata T2a - Tumor em ambos os lados da próstata T2b Extensão extraprostática T3 - Extensão do tumor para o tecido periprostático T3a - Invasão das vesiculas seminais em um ou nos dois lados T3b Tumor fixo ou que invade estruturas adjacentes: ex. colo vesical Tumor metastático T4 N-M Envolvimento gânglios linfáticos regionais: NX- sem avaliação, NX, N0, N0-sem metástases, N1-metástase num gânglio (≤2 cm), N2-metástases num N1, N2, gânglio (2-5 cm) ou em múltiplos gânglios (≤5 cm), N3-Metástase >5cm N3 Metástases em qualquer dos seguintes órgãos: Osso, Nódulos linfáticos MX, M0, acima da bifurcação aórtica, e outros órgãos. MX- A presença de M1 metástases à distância não pode ser avaliada, M0- Sem metátases à distância, M1- Presença de metátases à distância Os tumores podem ser ainda classificados consoante a ausência (N0) ou presença (N1) de metástases nos gânglios linfáticos regionais. Em relação à presença de metástases à distância podemos classificar como M0 – sem evidência de metástases à distância, M1a – metástases em gânglios não regionais, M1b – metástases ósseas e M1c – metástases noutras localizações. 24 | Introdução | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Os sintomas associados à doença avançada podem incluir disúria, poliaquiúria, hematúria, dores ósseas nas costas ou articulações, perda de peso e fadiga. A disseminação do cancro da próstata faz-se por invasão directa às vesículas seminais e estruturas contíguas, bexiga, membrana da uretra e paredes lateropélvicas. Encontra-se frequentemente a disseminação linfática nos nódulos pélvicos ou a deposição hematogénea óssea. 1.1.6. Lesões Precursoras A alteração histopatológica geralmente aceite como lesão precursora ou pré-maligna do adenocarcinoma da próstata é designada como Neoplasia Intra-epitelial Prostática de alto grau ou HG-PIN (de “high grade-prostatic intraepithelial neoplasia) (Bostwick 1993). A HGPIN pode ser descrita como uma alteração citológica e arquitectural do epitélio glandular (Brawer 1992; Bostwick 1993). A detecção de HG-PIN tem um valor altamente predictivo como biomarcador de adenocarcinoma da próstata (Bostwick 2000). O único método de detecção é através de biópsia e a sua identificação requer a repetição da biópsia para detectar a existência de adenocarcinoma invasivo simultâneo (Bostwick 2000). A prevalência das lesões HG-PIN tem sido descrita em 4 a 14% dos casos após biópsia com agulha (Zlotta e Schulman 1999). Alguns estudos demonstraram que existe desenvolvimento de adenocarcinoma da próstata em cerca de 55% dos casos após o diagnóstico inicial de HG-PIN (Algaba 1999). Em populações mediterrânicas a prevalência de HG-PIN de 4,4% e uma incidência de cancro da próstata 28,7% dos casos em que na biópsia inicial foi diagnosticado HG-PIN (Algaba 1999). As lesões PIN não elevam significativamente as concentrações séricas de PSA e a terapia de bloqueio dos androgénios diminui a prevalência e a extensão da PIN, o que sugere que a deteção precoce deste tipo de lesões poderá ser importante na quimioprevenção (Bostwick 2000; Marshall 2001). 1.1.7. Prevenção e Quimioprevenção Os factores de risco como a obesidade, consumo de gorduras de origem animal e de carnes vermelhas e os factores de protecção como o consumo de certos vegetais, cereais e a vitamina D são informações que irão permitir a modificação de certos hábitos de modos ajudar à prevenção do cancro da próstata. Introdução | 25 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | A quimioprevenção é a administração de agentes que vão inibir ou atrasar a formação de tumores ou a sua progressão (Kellof et al, 1999). No caso do cancro da próstata a utilização de estratégias de quimioprevenção com sucesso requer uma boa caracterização dos agentes a utilizar, de estudos de coorte bem desenhados, e a existência de biomarcadores tumorais fiáveis que permitam uma avaliação da eficácia da quimioprevenção. Para a utilização de um determinado agente são necessários dados epidemiológicos ou experimentais demonstrando uma eficácia na quimioprevenção, segurança em administração crónica, e um racional mecanístico para a actividade quimiopreventiva observada. Os agente mais promissores a utilizar na quimioprevenção do cancro da próstata incluem os retinóides, anti-androgénos, anti-estrógenos, inibidores da aromatase dos esteróides, inibidores da 5areductase, vitaminas D e E, Selénio, licopeno e a 2-fluorometilornitina (Kellof et al, 1999). Com a evolução dos biomarcadores, e em particular os marcadores genéticos de susceptibilidade para cancro, poderemos por a hipótese que futuramente será possível a identificação de indivíduos com probabilidade elevada de desenvolver cancro e definir estratégias de prevenção ou quimioprevenção de modo a atrasar o aparecimento de cancro ou atrasar a progressão precoce da doença maligna. 1.2 POLIMORFISMOS GENÉTICOS E SUSCEPTIBILIDADE PARA CANCRO DA PRÓSTATA 1.2.1. Variabilidade Genética e Cancro da Próstata A fundamentação de que existe uma base genética para o cancro decorre de observações em vários traços genéticos que se associam a risco aumentado para cancro. A variabilidade genética de cada indivíduo pode condicionar uma maior ou menor susceptibilidade desse indivíduo para o desenvolvimento de uma determinada neoplasia. Numerosas alterações genéticas têm sido descritas como importantes não só no desenvolvimento do processo de carcinogénese, como no prognóstico dessa mesma neoplasia. Muitos dos genes associados a estas alterações estão envolvidos no controlo da proliferação celular e da diferenciação, na reparação do DNA e manutenção da integridade genómica, e no metabolismo de algumas 26 | Introdução | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica moléculas. As alterações mais referidas incluem perda de heterozigotia, sobre-expressão e amplificação genómica, a configuração de vários perfis de mutações genéticas e a existência de polimorfismos genéticos. Inúmeras investigações apresentam suporte científico para a provável base genética do cancro da próstata. Embora se observe uma ligação com o historial familiar não foram detectadas anomalias cromossómicas específicas directamente associadas ao cancro da próstata. No entanto, os cromossomas 7, 8, 10, 16, 17 e 18 têm sido referidos como potenciais localizações de genes associados com alterações que possam levar ao aparecimento desta neoplasia e algumas destas alterações genéticas podem ter importância no progn]óstico (Jenkins et al, 1998; Nupponen e Visakorpi 1999; Ichikawa et al, 2000; Nwosu et al, 2001). O desenvolvimento das metodologias de análise genética tem permitido a introdução de novos factores de análise de risco com grande potencial nos estudos epidemiológicos. A epidemiologia molecular surge assim como a ciência que analisa a contribuição dos potenciais factores de risco genéticos e ambientais, identificados ao nível molecular, para a etiologia, distribuição e prevenção de doença ao nível das populações. Muitos estudos têm indicado que a variação genética interindividual poderá constituir um dos factores importantes na caracterização da susceptibilidade para o desenvolvimento de cancro. Alguns autores (Shield e Harris 1991) têm sugerido que poderemos considerar dois tipos de genes envolvidos na susceptibilidade para cancro de acordo com a penetrância desses mesmos genes. O grupo dos genes de susceptibilidade com elevada penetrância como o caso dos genes BRCA1 e BRCA2, e o grupo dos genes de susceptibilidade com baixa penetrância que são genes comuns com uma interação gene-ambiente e associação geralmente a doença esporádica. Os genes de susceptibilidade de baixa penetrância agregam com a doença e muitas vezes interagem com outros genes para aumentar o risco para cancro (Knudsen et al, 2001) As variantes genéticas dos genes de susceptibilidade poderão expressar diferenças fenotípicas das variantes heterozigóticas ou homozigóticas em comparação dos portadores da forma selvagem (“wild-type”). A definição mais corrente de polimorfismo genético é caracterizada por alterações na sequência nucleotídica (mutações) que estão presentes em pelo menos 1% da população (Caporaso e Goldstein 1995; Knudsen et al, 2001) Cada indivíduo é portador de um vasto grupo de diferentes polimorfismos genéticos. Introdução | 27 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Estas alterações na estrutura do DNA são geralmente neutras quando ocorrem nas longas sequências de DNA que existem fora dos genes, e são muitas vezes benignas quando afectam a função de genes como a cor do cabelo dos nossos filhos. Um polimorfismo é uma característica monogénica relativamente comum que existe numa população pelo menos em 2 formas. Os genes são considerados funcionalmente polimórficos quando as variantes alélicas existem estavelmente na população e uma ou mais alteram a actividade da proteína. Em muitos casos, o polimorfismo genético está associado com uma actividade reduzida da proteína, mas algumas variantes podem também codificar proteínas com elevada actividade. A avaliação do risco relativo (RR) estima a magnitude de uma associação entre o factor de exposição (ou o polimorfismo) e a doença e indica a probabilidade de desenvolvimento da doença no grupo portador de uma das variantes desse polimorfismo em comparação com as restantes. A maioria dos estudos realizados são estudos caso-controlo (comparação de um grupo de doente com um grupo normal) em que o risco relativo pode ser avaliado pela determinação do quociente OR (“odds ratio”). O OR representa a magnitude desta associação e fornece informação que poderá ser importante no julgamento da causalidade e na definição do risco atribuível, ou seja, a proporção de todos os casos da doença atribuível ao factor de risco (Boffetta e Pearce 1999; Knudsen et al, 2001). No nosso estudo procuramos esclarecer o papel de alguns polimorfismos genéticos na susceptibilidade para o desenvolvimento do cancro da próstata de modo a ser avaliado um perfil genético de cada doente. 1.2.2. Polimorfismos no Gene que codifica o Antigénio Específico da Próstata (PSA) e Susceptibilidade para Cancro da Próstata A determinação da concentração sérica do antigénio específico da próstata (PSA) tem sido largamente utilizada no rastreio do cancro da próstata e também como marcador da progressão tumoral (Armbruster 1993; Smith et al, 1996). A sua combinação com o estadiamento e com o grau de Gleason tem sido sugerida como um factor predictivo da probabilidade de invasão tumoral: doença confinada ao órgão, penetração da cápsula, envolvimento das vesículas seminais e invasão dos gânglios pélvicos (Partin et al, 1997). Para além do referido, níveis elevados de PSA tem sido associados a progressão tumoral e ao 28 | Introdução | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica processo de metastização (Chybowsky et al, 1991). Cerca de 71% de doentes que na fase pré-tratamento apresentavam níveis de PSA superiores a 100 ng/ml tinham cintilogramas ósseos indicando metastização óssea do cancro da próstata (Chybowsky et al, 1991). O gene PSA codifica uma serina protease, uma glicoproteína com 240 aminoácidos (33kDa) e pode ser encontrado no soro como um monómero de 33kDa, como um complexo de 100kDa com α1-antiquimotripsina ou como um complexo de 800kDa com α2-macroglobulina (Armbruster 1993). O gene PSA é controlado pelas hormonas esteroides. Estudos prévios indicam que este gene é regulado pelo receptor de androgéneos (AR), que medeia a transcrição por se ligar a uma sequência próxima do promotor nas posições –154 e –394 do gene PSA. Esta sequência é designada como elemento de resposta aos androgéneos (ARE – “androgen response element”) e encontra-se localizada na posição –4200 (20). Com uma localização 170bp a montante do ponto de transcrição encontra-se o ARE1, sendo o mais proximal dos três AREs existentes no gene PSA. Foi descrito um polimorfismo caracterizado por uma substituição G/A no promotor do PSA na região ARE1 (Xue et al, 2000). O ARE1 possui duas variantes alélicas: AACAnnnAGTACT e AGAACAnnnAGTGCT (Xue et al, 2000). Foi proposta a hipótese de que o AR se liga a estes dois alelos com diferentes afinidades, produzindo assim diferenças significativas na expressão de mRNA (Xue et al, 2000, 2001). 1.2.3. Exposição ao sol, Polimorfismos no Gene que codifica o Receptor da Vitamina D e Susceptibilidade para Cancro da Próstata Alguns estudos epidemiológicos evidenciaram a importância dos factores ambientais e a existência de associação entre radiação ultravioleta, vitamina D e desenvolvimento de cancro da próstata (Schwartz and Hylka 1990; Hanchete and Schwartz 1992; Metttlin 1997; Chan et al, 1998; Ekmam et al, 1999). Níveis elevados de vitamina D no sangue são referidos como factor de protecção. Segundo o estudo de Corder et al (1993) uma associação forte foi verificada entre a presença de níveis séricos elevados da forma mais activa da vitamina D [1,25(OH)2 D3] e o risco diminuído para cancro da próstata. Foi também demonstrado que a vitamina D tem efeitos inibiIntrodução | 29 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | tórios da proliferação das células tumorais, efeitos indutores da diferenciação e influencia a progressão tumoral (Studzinski et al, 1995; Haussler et al, 1998; McCarty 2000). Os efeitos anti-proliferativos da 1,25(OH)2 D3 requerem a expressão do receptor nuclear da vitamina D (VDR do seu acrónimo em língua inglesa “vitamin D receptor”) (Hedlund et al, 1996a,b). A principal fonte de vitamina D no ser humano é a transformação do 7-dehidrocolesterol em vitamina D que acontece na pele sob a acção da luz solar. Numa menor quantidade o aporte de vitamina D tem origem na dieta (leite, peixe, etc.). Figura 1. Diagrama representativo da síntese da vitamina D O VDR pertence à superfamília dos receptores nucleares que inclui um vasto número de factores de transcrição que são regulados por ligandos hormonais, de características lipofílicas, entre os quais temos os esteróides, retinóides, vitamina D e hormonas da tiróide. O gene que codifica o VDR está localizado no cromossoma 12, em 12cen-q12 (Taymans et al, 1999), contém 14 exões que se espalham ao longo de 75 Kb de DNA genómico (Miyamoto et al, 1997; Crofts et al, 1998). Foram descritos dois grupos de polimorfismos para o gene VDR, um no terminal 3’ envolvendo uma série de zonas polimórficas (Morrison et al, 1994) e o outro grupo no 30 | Introdução | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica terminal 5’ afectando o codão “START” do gene (Gross et al, 1996). Alguns alelos do gene VDR têm sido associados com níveis mais elevados de vitamina D no sangue uma maior actividade do VDR (Morrison et al, 1994). Os estudos epidemiológicos com o objectivo de demonstrarem associação entre os polimorfismos do VDR e susceptibilidade genética para cancro da próstata apresentam resultados controversos. A complexidade dos mecanismos envolvidos na carcinogénese poderá influenciar os resultados obtidos. A contribuição da vitamina D para o risco de cancro da próstata poderá depender das características genéticas da população, assim como de factores ambientais e de dieta que influenciam essa população em estudo. Poderá então ser sugerida a hipótese de que é necessário para cada grupo populacional uma avaliação do seu perfil genético de risco para cancro, sendo assim ponto de partida para o aprofundamento da compreensão das diferenças geográficas e raciais observadas na incidência e mortalidade do cancro da próstata. No contexto europeu as populações do sul da Europa apresentam taxas de incidência e mortalidade, por cancro da próstata, mais baixas em comparação com o norte da Europa (Parkin 1998; Ferlay et al, 1999, Levi et al, 2000). Por outro lado, os habitantes do sul da Europa apresentam de um modo geral um padrão de pele mais escuro, são expostos mais tempo a radiações solares e existem algumas diferenças na dieta alimentares. Os resultados apresentados por Taylor et al (1996) indicam que os homens portadores do alelo T, do polimorfismo Taq I do VDR, tem um risco três vezes superior de desenvolverem cancro da próstata. Este alelo T corresponde à forma menos activa do receptor e associada a níveis mais baixos de vitamina D no sangue. Relativamente a populações do sul da Europa não está ainda estudado o papel do polimorfismo do VDR na susceptibilidade aumentada para cancro da próstata. Considerando assim que o cancro da próstata é uma doença multifactorial com o envolvimento de factores genéticos e ambientais e que o papel destes factores pode ser condicionado pela localização geográfica e características das populações, foi objectivo deste estudo a avaliação da associação entre a insolação, a incidência do cancro da próstata e a caracterização dos polimorfismos no gene que codifica o receptor da vitamina D (VDR) e sua associação com o risco para cancro. Introdução | 31 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | 1.2.4. Óxido Nítrico, Sintetases do Óxido Nítrico e Cancro da Próstata Desde a identificação do óxido nítrico (NO) como um factor importante no endotélio existe um aumento na quantidade de informação sobre a função do NO na fisiopatologia animal, e é indicado o seu papel no crescimento neoplásico e na regulação da angiogénese. A produção endógena de NO provoca lesões oxidativas no DNA como resultado dos fluxos estequiométricos de NO e do superóxido que originam a formação de peroxinitritos (Kennedy et al, 1997; Wink et al, 1996). A produção de NO pode modificar o DNA directamente, ou pode inibir actividades de reparação do DNA como são casos da acção da glicosilase da timina-DNA, que foi demonstrado ter acção reparadora dos desemparelhamentos G:T nos dinucleotídeo CpG (Sibghat-Ullah et al, 1996). Isto é consistente com a hipótese de que poderá existir sinergia entre a capacidade do NO de provocar lesões no DNA pela formação de peroxinitritos e a capacidade de inibir a reparação dessas lesões. Após a sua síntese, a molécula de NO é libertada e rapidamente auto-oxidiza formando NO2-, que interage com a hemoglobina para formar NO3- (Ignarro et al, 1993). Os iões nitrato e nitrito (NO2- e NO3-), também referidos como NOx, são relativamente estáveis no sangue e a concentração de NOx plasmático pode ser um bom indicador da formação de NO (Rhodes et al, 1995). As enzimas sintetases do óxido nítrico (NOS de “nitric oxide synthases”) são responsáveis pela produção do óxido nítrico (NO) a partir do aminoácido L-arginina. O NO e os seus compostos derivados podem causar directamente lesões no DNA e desempenhar um papel no processo de carcinogénese (Murata et al, 1997). A via do NO está envolvida em numerosos processos fisiopatológicos. São conhecidas três isoformas destas enzimas (ecNOS, nNOS, iNOS) que são codificadas por três genes distintos localizados nos cromossomas 7, 12 e 17, respectivamente (Fortermann et al,1998; Dimitrov et al, 1997). Estudos anteriores demonstraram que as enzimas NOS desempenham um papel importante na fisiopatologia da glândula prostática (Gradini et al, 1999; Hayek et al, 1999; Klotz et al, 1999). O gene que codifica a enzima ecNOS (“endothelial cell-specific NO synthase”) está localizada em 7q35-q36 e poderá desempenhar um papel importante no desenvolvimento vascular, na manutenção do tónus muscular e no crescimento tumoral do carcinoma da próstata (Grande et al, 2000). Foram descritas por vários autores alterações genéticas 32 | Introdução | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica e cromossómicas no cromossoma 7 em células neoplásicas de origem prostática. (Nihei et al, 1999; Qian et al, 1999; Karashima et al, 2000). Um polimorfismo genético que ocorre no intrão 4 do gene ecNOS tem sido associado com algumas doenças e parece ser responsável pelas alterações no controle genético dos níveis de NO nos plasma sanguíneo (Miyahara et al, 1994; Tsukada et al, 1998). Recentemente, uma mutação pontual de uma Guanina (G) para Timina (T) na posição do nucleotídeo 1917, no gene que codifica a ecNOS (polimorfismo Glu-Asp298 no exão 7) foi descrito (Wang et al, 1996). O significado destes polimorfismos no carcinoma da próstata ainda não está esclarecido. O objectivo do nosso estudo foi avaliar o papel dos polimorfismos no gene ecNOS na susceptibilidade para cancro da próstata. 1.2.5. Polimorfismos Genéticos Associados ao Metabolismo: Polimorfismos nos Genes que Codificam as Enzimas Glutatião S-Transferases A observação de que as taxas de incidência do cancro da próstata estão alteradas em populações migrantes, e que populações etnicamente similares, residindo em diferentes localizações geográficas, apresentam taxas de incidência diferentes, claramente indica que factores ambientais podem influenciar o risco para o desenvolvimento deste cancro. A dieta é um factor de exposição que está alterado entre diferentes áreas geográficas e pode ser fortemente alterada em populações migrantes. A dieta aparece também como factor de risco, particularmente no que diz respeito ao elevado consumo de gorduras e proteínas (Giovannucci et al, 1993; Chan et al, 1998; Fradet et al, 1999; Hsing e Devessa 2001). O estudo das gorduras animais presentes na dieta humana têm demonstrado que afectam vários processos fisiológicos e celulares que podem influenciar positivamente ou negativamente o desenvolvimento do cancro da próstata. A regulação da proliferação celular na presença de lesões do DNA e os processos associados de reparação do DNA e apoptose são elementos chave na carcinogénese, afectando todos os aspectos relacionados com a iniciação, promoção e progressão dos tumores. A formação de radicais oxidativos é apontada como estando associada ao cancro. Os ácidos gordos poli-insaturados são um alvo vulnerável para vários radicais oxidativos formando radicais lipídicos e hidroperóxidos que poderão originar radicais livres de oxigénio e lesões do DNA. A exposição aos carcinogénios Introdução | 33 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | presentes na dieta tem sido associada com o risco aumentado de alguns tipos de cancro. As enzimas do citocromo P450 são um grupo de enzimas oxidativas com um papel fundamental no metabolismo de vários xenobióticos, incluindo carcinogénicos e drogas terapêuticas (Metabolismo Fase I). Diversos grupos de compostos endógenos tais como hormonas esteróides, ácido araquidónico e ácidos gordos são igualmente metabolizados por formas específicas de P450. As enzimas glutatião S-transferases são um grupo associados à posterior metabolização (Metabolismo Fase II) de compostos inicialmente biotransformados pelas enzimas do citocromo P450. A conjugação do Glutatião com substratos electrofílicos facilita assim a excreção destas, protegendo os componentes celulares dos efeitos tóxicos de vários compostos exógenos e endógenos, muitos deles resultantes da acção das enzimas do citocromo P450 (Strange et al, 2001). Os genes que codificam as enzimas glutatião S-transferases (GSTs) apresentam polimorfismos dos quais se destaca os da família GST mu (GSTM1-M5) e GST theta (GSTT1). Os genes GSTM1 a M5 estão localizados em tandem no braço curto do cromossoma 1 (1p13) (Seidegard et al, 1988; Zhong et al, 1993; Pearson et al, 1993; Ross et al, 1993 Strange et al, 2001). A expressão da enzima GSTM1 está directamente correlacionada com a presença do gene intacto (genótipo GSTM1 “wild-type”). A ausência de actividade das enzimas GSTM1 encontra-se associada a delecção genómica (genótipo GSTM1 “null”) (Seidegard et al, 1988). Alterações nos níveis de expressão da enzima GSTM3 têm sido referidas por alguns autores (Suzuki et al, 1987; Campbell et al, 1990; Strange et al, 1992; Nakajima et al, 1995). Está descrito um polimorfismo no gene GSTM3 correspondendo à existência de dois alelos GSTM3*A e GSTM3*B (Inskip et al, 1995; Yengi et al, 1996; Strange et al, 2001). A variante GSTM3*B tem uma deleção de três bases no intrão 6 (Inskip et al, 1995). Embora a diferença entre os alelos GSTM3*A e GSTM3*B seja intrónica, no alelo GSTM3*B temos a formação de uma sequência de reconhecimento (-aagata-) para o factor de transcrição Yin Yang 1 (YY1) (Inskip et al, 1995; Shi et al, 1997). O gene que codifica a enzima GSTT1 encontra-se localizado no cromossoma 22 (22q11.2) e apresenta também um polimorfismo de delecção genómica como no caso da GSTM1 e designado por genótipo GSTT1 “null” (Strange et al, 1994). Alguns estudos, embora com resultados controversos, têm sido publicados analizando o papel da delecção homozigótica nos genes GSTM1 e GSTT1 na susceptibilidade para cancro da próstata (Murata et al, 1998; 34 | Introdução | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Rebbeck et al, 1999; Autrup et al, 1999). Os indivíduos portadores de delecção nestes genes não têm a equivalente enzima glutatião S-transferase e eliminam com maior dificuldade os carcinogénio electrofílicos o que pode aumentar o risco de mutações somáticas levando à formação de tumores. Foi objectivo do nosso estudo a análise de polimorfismos em alguns genes envolvidos no metabolismo de substratos electrofílicos (GSTM1, GSTM3 e GSTT1), e avaliação do seu papel na susceptibilidade para o desenvolvimento de cancro da próstata. 1.3. METÁSTASES E MICROMETASTIZAÇÃO 1.3.1. Mecanismos de Metastização A metastização é definida como a formação de um foco secundário de um tumor numa localização diferente da do tumor primário. As metástases podem ser formadas após a invasão dos tecidos adjacentes e a disseminação das células neoplásicas pelo sistema linfático e ou vasos sanguineos. Durante o transporte as células viajam individualmente ou agrupadas em êmbolos compostos só por células tumorais ou conjuntamente com células normais do hospedeiro. Na localização secundária, as células ou os êmbolos ficam retidas devido ao seu tamanho físico ou por adesão a moléculas específicas em determinados órgãos ou tecidos (Fidler 1987, Welch et al, 1999). Então as células tumorais podem proliferar nomeadamente após o extravasamento para os tecidos circundantes. Para formar metástases macroscópicas e clinicamente detectáveis, os focos metastáticos precisam de abastecimento sanguineo suplementar o que conseguem pela formação de novos vasos (neovascularização) ou pelo recrutamento dos vasos do hospedeiro (Folkman 1997, Holash et al, 1999). A metastização das células neoplásicas é um processo que apresenta uma elevada ineficiência a nível experimental. Nos modelos experimentais, menos de 0,1% das células injectadas na circulação sanguínea provocam tumores secundários (Fidler, 1990; Welch et al, 1999). Uma das características principais para a formação de metástases é a capacidade de as células neoplásicas proliferarem na localização de acolhimento (Mac Donald e Steeg, 1993). Introdução | 35 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Figura 2. Esquema resumindo as etapas sequenciais no processo de metastização das células neoplásicas. 1.3.2. Micrometastização e Células Epiteliais Circulantes no Sangue Periférico Os tumores malignos dos tecidos epiteliais são a forma mais comum de cancro e são responsáveis pela maioria das mortes por cancro nos países ocidentais. Devido aos grandes progressos no tratamento cirúrgico destes tumores, actualmente a mortalidade está cada vez mais associada à existência de metastização precoce, que muitas vezes se encontra oculta na altura do diagnóstico do tumor primário. Nos doentes sem evidências clínicas de metastização os parâmetros para o estadiamento clínico são determinados, e o tratamento depende desta avaliação. A presença de micrometastases não detectadas poderá contribuir para a falência do tratamento primário e aumento da mortalidade. O adenocarcinoma da próstata representa uma doença heterogénea com variados graus de comportamento, agressividade, diferentes padrões de metastização e diferente comportamentos face à terapia. Embora existam grandes avanços no diagnóstico e tratamento do adenocarcinoma da próstata, cerca de metade de todos os novos casos diagnosticados apresentam doença com metastização. O tratamento do adenocarcinoma da próstata quando a doença se encontra confinada à próstata tem sucesso num número elevado de doentes com uma sobre36 | Introdução | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica vivência prolongada. Mas com a evidência de doença extraprostática a progressão da doença apresenta-se como dificíl de controlar. A existência de metastização à distância é geralmente de mau prognóstico e os procedimentos terapêuticos existentes não têm demonstrado eficácia no tratamento de estadios com doença disseminada. Alguns estudos realizados mostram que as taxas de sobrevida aos 5 anos para doentes com cancro da próstata variam de 88% em doentes com doença localizada para 29% naqueles com doença metastizada (Scardino et al, 1992; Shekhar et al, 1993). O mecanismo de disseminação metastática não está totalmente esclarecido. A metastização hematogénea poderá ser um acontecimento relativamente precoce no decorrer da sequência de eventos que acontecem aquando da disseminação do cancro da próstata. A entrada de células neoplásicas da próstata na corrente sanguínea e vasos linfáticos parece ser um pré-requisito para a ocorrência de metastização para os nódulos linfáticos e ossos. Este facto parece também estar relacionado com a agressividade tumoral. Assim, a disseminação para o sangue parece estar implicada na progressão do adenocarcinoma da próstata (Ware 1994, Rusciano e Burger 1993; Shekhar et al, 1993). Os meios disponíveis para a detecção de extensão extraprostática da doença incluem a medição dos níveis de PSA sérico, estudos de R.M.N. e T.A.C e excisão dos gânglios linfáticos por cirurgia e observação por histologia (Foster e Abel 1992). Os doentes com cintilograma negativo, PSA sérico menor que 20 mg/L e ausência de infiltração tumoral nos nódulos linfáticos (detecção por microscopia), são estadiados como adenocarcinoma da próstata com doença confinada ao orgão sem invasão local. Estes doentes podem então ser submetidos a tratamento cirúrgico (prostatectomia), considerando que a prostatectomia radical irá curar o doente. Infelizmente, após o tratamento cirúrgico verifica-se que em alguns destes doentes (a literatura indica valores que vão até aos 40%) vem a ser detectada invasão local ou metastização indicando que existe subestadiamento de muitos destes doentes (Carducci et al, 1996). Alguns cálculos baseados em evidências experimentais, indicam que uma simples metástase óssea de adenocarcinoma da próstata seria originada por 10 000 células circulantes (2 células/ml sangue). A detecção de um número tão baixo de células circulantes requer metodologia muito sensível e igualmente a utilização de marcadores específicos de células de origem prostática circulantes ou micrometastização (Hamdy et al, 1992; Moreno et al, 1992; Israeli et al, 1994). Introdução | 37 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Alguns estudos recentes sugerem a utilização da metodologia de RT-PCR (“reverse transcriptase-polymerase chain reaction”) na pesquisa de micrometástases hematogéneas de células prostáticas. Esta pesquisa é efectuada no sangue periférico pela detecção da presença de RNA transcrito pelos genes PSA, “prostate specific antigen” (RNA-PSA) e PSMA, “prostate specific membrane antigen” (RNA-PSMA). A metodologia envolve o isolamento do RNA mensageiro das células nucleadas, sua conversão em DNA complementar e amplificação deste DNA por PCR (Hamdy et al, 1992; Moreno et al, 1992; Israeli et al, 1994). A introdução da metodologia RT-PCR de micrometástases hematogéneas de células prostáticas, poderá ser importante devido à sua grande sensibilidade e pelas perspectivas que poderá abrir na detecção precoce de metastização, quer na monitorização do adenocarcinoma da próstata (Moreno et al, 1992 ; Hamdy et al, 1992; Israeli et al, 1994a; Ghossein et al, 1995; Katz et al, 1995; Olsson et al, 1996; Edelstein et al, 1996; Fadlon et al, 1996; Deguchi et al, 1997; Albers et al, 2000; Llanes et al, 2002; Hara et al, 2002). Apesar da variedade de métodos disponíveis para o rastreio do adenocarcinoma da próstata, muitos doentes já são encontrados com doença metastizada aquando do esvaziamento ganglionar pélvico ou da prostatectomia radical. É urgente, assim, o aperfeiçoamento de métodos que possam ser utilizados na caracterização de doença prostática potencialmente “curável”, cirurgicamente confinada ao orgão. São objectivos deste estudo, a pesquisa de marcadores genéticos que permitam a detecção de presença de células epiteliais de origem prostática no sangue periférico, utilizando a metodologia de RT-PCR pela pesquisa da presença de RNA mensageiro. Procura-se assim, pela detecção destas células epiteliais determinar um grupo de doentes com risco de metastização. 38 | Introdução 2. Objectivos | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica 2. OBJECTIVOS No presente trabalho selecionamos os seguintes polimorfismos genéticos PSA ARE1, VDR TaqI, ecNOS (ecNOS4 a/b e Glu-Asp298), GSTM1, GSTM3 e GSTT1 que apresentam potencial interesse na investigação em cancro da próstata de acordo com a literatura e dando ênfase à procura de resposta para três questões principais: – Será a determinação de polimorfismos genéticos útil na definição de um perfil genético de susceptibilidade para cancro da próstata? – A detecção de células tumorais circulantes no sangue periférico em homens com cancro da próstata está associada a risco de progressão e metastização da doença? – De que modo alguns polimorfismos genéticos influenciam a libertação de células tumorais para o sangue periférico? É também nosso objectivo integrar a informação derivada dos estudos realizados na tentativa de contribuir para a caracterização do cancro da próstata permitindo uma visão global destes marcadores biomoleculares na susceptibilidade para cancro da próstata e no risco de metastização. Objectivos | 41 3. Material e Métodos | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica 3. MATERIAL E MÉTODOS Por opção editorial este capítulo não é apresentado, uma vez que está descrito nos artigos em anexo. Material e Métodos | 45 4. Resultados | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica 4. RESULTADOS 4.1. Determinação dos Genótipos ARE1 do Gene PSA por PCR-RFLP Neste estudo, a determinação de polimorfismos ARE1 no gene PSA foi efectuada em 151 amostras de DNA isolado do sangue periférico de doentes com cancro da próstata e de 127 indivíduos sem qualquer patologia oncológica conhecida. A distribuição das frequências dos genótipos ARE1 nos casos e controlos é apresentada no Quadro 4.1.1. A frequência encontrada dos genótipos GG, AG e AA foi 25.2%, 44.9% e 30.7% no grupo de controlos e 18.5%, 43.1% e 38.4% no grupo dos casos. O grupo dos casos de doentes com cancro da próstata, apresentou uma maior frequência para o genótipo AA, com homozigotia para o alelo A, (OR=1.65, 95%CI 0.81-3.33). Quando se procede à análise estratificada de acordo com a mediana das idades verificase que no grupo de homens com idade inferior a 67 anos e portadores do genótipo AA (25.3% nos controlos e 42.6% nos casos) existe um risco aumentado para cancro da próstata (OR=2.92, 95%CI 1.10-7.86). A distribuição das frequências genotípicas está de acordo com o esperado segundo os princípios de Hardy-Weinberg para populações em equilíbrio. Aquando da realização da análise estatística recorrendo ao teste estatístico de tendência linear tendo em conta a presença de nenhum, um ou dois alelos A e o risco aumentado para cancro verificou-se a presença de significância estatística evidente para homens com uma idade inferior a 67 anos (p=0.013) como se pode observar no Quadro 4.1.1. Foi então efectuada a comparação das frequências alélicas (Quadro 4.1.2) e observou-se que a presença Resultados | 49 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | do alelo A foi mais frequente nos homens com cancro da próstata, associando-se a risco em cancro em homens com menos de 67 anos (OR=1.81, 95%CI 1.13-2.92, p=0.009). A distribuição dos genótipos ARE1 do PSA e a sua associação com as características clinicopatológicas dos doentes estão descritas no Quadro 4.1.3. Podemos observar que existe uma associação entre o genótipo AA e níveis mais elevados de PSA sérico no momento do diagnóstico dos doentes com cancro da próstata (186.1±91.6 ng/ml vs 26.6±5.8 ng/ml; p=0.027). No Quadro 4.1.4. é apresentada a comparação das frequências genotípicas para o polimorfismo ARE1 do gene PSA em diferentes populações. Quadro 4.1.1. Frequências dos genótipos do polimorfismo ARE1 do gene PSA na população controlo e no grupo de doentes com cancro da próstata. Controlos Genótipo n % Casos n % OR* 95%CI* P** Todas as idades GG 31 25.2 28 18.5 1.00 referência AG 57 44.9 65 43.1 1.26 0.65-2.47 AA 39 30.7 58 38.4 1.65 0.81-3.33 GG 23 27.7 12 16.1 1.00 referência AG 39 47.0 31 41.3 1.52 0.61-3.86 AA 21 25.3 32 42.6 2.92 1.10-7.86 GG 8 18.2 16 21.0 1.00 referência AG 18 40.9 34 44.7 0.94 0.30-2.94 AA 18 40.9 26 34.2 0.72 0.22-2.30 0.126 Idade < 67 anos 0.013 Idade ≥ 67 anos *OR, odds ratio; CI, intervalo de confiança ** Análise da tendência linear para a presença de nenhum (GG), um (AG) ou dois alelos A (AA). 50 | Resultados 0.493 | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Quadro 4.1.2. Frequências alélicas num total 556 cromossomas relativamente ao alelo A e ao alelo G. Controlos Genótipo Casos n % n % OR* 95%CI* P Alelo A 135 53.1 181 59.9 1.32 0.93-1.87 0.107 Alelo G 119 46.9 121 40.1 Alelo A 81 48.8 95 63.3 1.81 1.13-2.92 0.009 Alelo G 85 51.2 55 36.7 Alelo A 54 61.4 86 56.5 0.82 0.46-1.45 0.468 Alelo G 34 38.6 66 43.5 Todos Idade < 67 anos Idade ≥ 67 years *OR, odds ratio; CI - intervalo de confiança Quadro 4.1.3. Principais características clinico-patológicas dos doentes e associação com os genótipos PSA ARE1. AA AG/GG P 186.1 ± 91.6 26.6 ± 5.8 0.027 6.3 ± 0.24 5.9 ± 0.17 0.249 Localizado 30 53 0.527 Avançado 28 40 PSA (ng/ml)* Grau de Gleason* Estado da doença *média ± erro padrão ** Análise da tendência linear para a presença de nenhum (GG), um (AG) ou dois alelos A (AA). Resultados | 51 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Quadro 4.1.4. Comparação das frequências genotípicas para o polimorfismo ARE1 do gene PSA em diferentes populações. Genótipo PSA ARE1 População GG AG AA Total n (%) n (%) n (%) P* Referência Afro- Americana 100 24 (24) 48 (48) 28 (28) 0.877 Xue et al, 2000 Japonesa-Americana 99 63(64) 31 (31) 5 (5) <0.001 Xue et al, 2000 Caucasiana- Americana 113 33 (29) 52 (46) 28 (25) 0.525 Xue et al, 2000 Caucasiana- Americana 156 40 (26) 77 (49) 39 (25) 0.525 Xue et al, 2001 Caucasiana- Europeia 127 31 (25) 57 (45) 39 (30) referência Este estudo * Teste do Qui quadrado comparando as várias populações com a população portuguesa 4.2 Exposição à Radiação Solar, Vitamina D e Cancro da Próstata 4.2.1. Insolação e Cancro da Próstata Relativamente a populações europeias investigamos a associação entre a insolação, definida como a quantidade de radiação solar avaliada em kWh/m2/dia, e a incidência de cancro da próstata em diversos paises europeus. Obtiveram-se os dados sobre a insolação a partir da base de dados da NASA dos Estados Unidos (http://earthobservatory.nasa.gov/) e os dados sobre a incidência de cancro a partir da base de dados Globocan da International Agency for Research on Cancer (http://www-dep.iarc.fr/). 52 | Resultados | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Figura 4.2.1. Representação gráfica mostrando a comparação, em vários paises europeus, entre os níveis de insolação (linha contínua) e a incidência de cancro da próstata (linha tracejada). Na Figura 4.2.1 encontra-se representada a relação entre as médias de insolação referentes a 10 anos e as taxas de cancro da próstata padronizadas para a idade (população mundial) para cada 100 000 homens em 12 paises europeus. Posteriormente fizemos o estudo de correlação entre estas variáveis e observou-se que valores mais altos de insolação estão fortemente associados a uma diminuição da taxa de incidência de cancro da próstata (r2=0,756, P= 0,0002) (Figura 4.2.2). Resultados | 53 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Figura 4.2.2. Relação entre as médias de insolação a 10 anos e taxas de cancro da próstata padronizadas para a idade (população mundial) para cada 100 000 homens em 12 paises europeus (A – Austria, C – Croácia, E – Espanha, F – Finlândia, G – Grécia, In – Inglaterra, Ir – Irlanda, Is – Islândia, It – Itália, N –Noruega, P – Portugal, S – Suécia). Estes indicadores em populações caucasianas europeias reforçam a suspeita do envolvimento da radiação solar na fisiopatologia do cancro da próstata, sendo motivação suficiente para um estudo mais aprofundado dos vários mecanismos envolvidos entre o quais se encontra a vitamina D e seu receptor (VDR). 4.2.2. Detecção de Polimorfismos no Gene VDR por PCR-RFLP A determinação do polimorfismo VDR TaqI foi efectuada utilizando a metodologia de PCR-RFLP (polymerase chain reaction – restriction fragment length polymorphism) a partir de DNA isolado do sangue periférico de 163 indivíduos com CaP e 211 indivíduos normais utilizando protocolos previamente publicados (Hutchinson et al, 2000). 54 | Resultados | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica A distribuição dos genótipos correspondentes ao polimorfismo VDR TaqI no grupo dos casos e no grupo dos controlos pode ser observada no Quadro 4.2.1. A frequência dos genótipos TT, Tt e tt foi de 35.5%, 45.0% e 19.9% no grupo controlo e 32.5%, 55.8% e 11.7% nos casos com carcinoma da próstata. Foi observado que a frequência do alelo T (representado pelos genótipos TT e Tt do gene VDR) está aumentada no grupo de doentes com cancro da próstata estando associado a risco para cancro (OR=1.82, 95%CI 1.01-3.28; p=0.042). Esta associação foi confirmada utilizando a metodologia de análise multivariada por regressão logística (OR= 2.11, 95%CI 1.15-3.88; p=0.015) sendo o alelo T factor de risco em particular para homens com mais de 66 anos (OR=2.26, 95%CI 1.05-5.29; p=0.036). Não foram observadas diferenças significativas relativamente à associação dos genótipos VDR Taq1 e Grau histológico de Gleason (Gleason < 7 versus Gleason ≥ 7, p=0.606), estádio da doença (avançada versus localizada, p=0.510) e o risco de progressão da doença (alto risco versus baixo risco, p=0.215) como está apresentado no Quadro 4.2.2. Quadro 4.2.1. Distribuição dos genótipos VDR Taq I no grupo de homens com cancro da próstata (casos) e a sua comparação com o grupo controlo. VDR Taq I (%) TT Tt OR tt TT/Tt vs tt aORa TT/Tt vs tt Todos Controlos (n=206) 73 (35,4) 92 (44,7) 41 (19,9) OR=1,87; p=0,035 OR=2,11; p=0,015 Casos (n=162) 52 (32,1) 91 (56,2) 19 (11,7) (95%CI, 1,02-3,37) (95%CI, 1,15-3,88) Controlos (n=125) 48 (38,4) 57 (45,6) 20 (16,0) OR=1,64; p=0,262 OR=2,12; p=0,117 Casos (n=77) 30 (39,0) 39 (50,6) 8 (10,4) (95%CI, 0,68-3,93) (95%CI, 0,82-5,47) Controlos (n=81) 25 (30,9) 35 (43,2) 21 (25,9) OR=2,35; p=0,034 OR=2,36; p=0,036 Casos (n=85) 22 (25,9) 52 (61,2) 11 (12,9) (95%CI, 1,05-5,27) (95%CI, 1,05-5,29) Idade < 66 Idade ≥ 66 a odds ratio (OR) após ajuste para a idade (análise de regressão logistica) Resultados | 55 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Quadro 4.2.2. Análise mulrivariada da associação entre a presença de genótipo VDR contendo o alelo T com o risco para cancro da próstata, risco de cancro da próstata após a idade de 66 anos, agressividade tumoral (Gleason ≥ 7), presença de doença avançada (T3/T4) e o risco de progressão da doença. Risco aumentado para ORa 95%CI P Cancro 2,11 1,15-3,88 0,015 Cancro após os 66 anos 2,36 1,05-5,29 0,036 Gleason ≥ 7 1,55 0,72-3,35 0,260 Doença avançada 1,36 0,64-2,90 0,411 Progressão da doença 1,30 0,67-2,53 0,429 a Valor para o odds ratio (OR) após ajustamento para a idade. As distribuições apresentadas para os genótipos VDR TaqI nos grupos controlo e nos casos estão de acordo com o esperado com populações em equilíbrio segundo o principio de Hardy-Weinberg. No Quadro 4.2.3 é apresentada a comparação das frequências genotípicas em diferentes populações. Para o grupo de casos com cancro da próstata a proporção de todos os casos de doença atribuível à influência do alelo T (Risco Atribuível) é de 44%. Mais ainda, o Risco Atribuível a este factor de risco na faixa etária de mais de sessenta e seis anos é de 50.5%. 56 | Resultados | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Quadro 4.2.3. Comparação das frequências para o genótipo VDR TaqI em diferentes populações de diversas localizações geográficas. VDR Taq I RFLP TT Tt Tt População Total n (%) n (%) n (%) P* Referência Caucasiana-Americana 162 53 (33,0) 73 (45,0) 36 (22,0) 0,755 Taylor et al, 1996 Caucasiana-Americana 41 15 (36,5) 18 (43,9) 8 (19,5) 0,998 Kibel et al, 1998 Japonesa 202 160 (79,2) 36 (17,8) 6 (3,0) <0,001 Watanabe et al, 1999 Japonesa 128 96 (75,0) 30 (23,4) 2 (1,6) <0,001 Caucasiana-Europeia (UK) 93 39 (41,9) 41 (44,1) 13 (14,0) 0,407 Hutchinson et al, 2000, Caucasiana-Europeia (UK) 154 57 (37,0) 67 (43,5) 30 (19,5) 0,951 Luscombe et al, 2001 211 75 (35,5) 95 (45,0) 41 (19,5) referência Este estudo, 2002 Habuchi et al, 2000 Caucasiana-Europeia (Portugal) * Comparação pelo teste do Qui- quadrado. 4.3. Detecção de Polimorfismos Genéticos nas Enzimas ecNOS por PCR-RFLP A determinação de polimorfismos no gene ecNOS foi efectuada utilizando a tecnologia PCR-RFLP a partir de DNA isolado do sangue periférico de 125 indivíduos com cancro da próstata confirmado histologicamente e de 153 indivíduos sem qualquer patologia oncológica conhecida (controlos normais). A distribuição dos genótipos Glu-Asp298 e ecNOS4a/b nos casos de doentes com cancro da próstata e nos controlos normais podem ser observada no Quadro 4.3.1. As distribuições apresentadas estão de acordo com o esperado para populações em equilíbrio segundo o princípio de Hardy-Weinberg. Para o polimorfismo Glu-Asp298 (genótipos GG, GT e TT) não foram observadas diferenças entre o grupo controlo e o grupo de homens com cancro da próstata. Em relação ao polimorfismo ecNOS4a/b, foi observado que o genótipo aa está associado a uma susceptibilidade duas vezes aumentada para o desenvolvimento de cancro da próstata (OR= 2.0; 95%CI, 0.42-9.7), embora sem existir significância estatística. Resultados | 57 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Quadro 4.3.1. Distribuição das frequências dos genótipos Glu-Asp298 e ecNOS4a/b no grupo controlo e no grupo de casos com cancro da próstata. Genótipo No. de Controlos (%) No. de Casos (%) OR (95%CI) ORa (95%CI) Glu-Asp298 GG 70 (46) 49 (39) 1,00 (referência) 1,00 (referência) GT 65 (42) 61 (49) 1,34 (0,78-2,29) 1,47 (0,87-2,47) TT 18 (12) 15 (12) 1,19 (0,51-2,71) 1,31 (0,79-2,18) 153 (100) 125 (100) b/b 121 (79) 87 (70) 1,00 (referência) 1,00 (referência) a/b 29 (19) 32 (25) 1,53 (0,83-2,83) 1,61 (0,90-2,89) a/a 3 (2) 6 (5) 153 (100) 125 (100) Total ecNOS4a/b Total 2,78 (0,60-14,00) 2,00 (0,42-9,70) a ajustado para a idade após análise estatística por regressão logística O Quadro 4.3.2 apresenta a distribuição dos genótipos Glu-Asp298 com as características clinico-patológicas do grupo de doentes com cancro da próstata. Observamos que o grupo de homens com cancro da próstata avançado apresenta uma frequência mais elevada do genótipo GG em comparação com os homens com doença localizada (59.2% vs 40.8%, p=0.001). Após a estratificação dos resultados segundo o grau histológico de Gleason (7), não foram observadas diferenças entre o grupo com grau de Gleason mais alto (Gleason ≥ 7 vs Gleason < 7). A associação dos genótipos ecNOS 4a/b com as características clinico-patológicas dos casos com cancro da próstata é também apresentada no Quadro 4.3.2. Não foram observadas diferenças entre as frequências dos genótipos estudados e a idade na altura do diagnóstico e o estado da doença (avançada ou localizada). No entanto verifica-se que o genótipo bb (61.7 vs 38.3%) é mais frequente no grupo de casos com grau histológico mais baixo (Gleason < 7), enquanto que os genótipos aa e ab foram encontrados mais frequentemente (59.4 vs 40.6%) nos casos com grau histológico mais elevado (Gleason ≥ 7) e nos casos que apresentavam maior risco de progressão da doença (76.3 vs 23.7%; p=0.010). 58 | Resultados | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Quadro 4.3.2. Associação dos polimorfismos com as características clinico-patológicas dos casos estudados Genótipos Glu-Asp298 Genótipos ecNOS4a/b GG GT/TT P aa/ab bb Pa 68,9 ± 7,7 65,9 ± 8,5 0,037 68,7 ± 8,8 67,3 ± 8,2 0,616 Gleason < 7 23 (53,5%) 40 (57,1 %) 0,542 13 (40,6%) 50 (61,7 %) 0,041 Gleason ≥ 7 20 (46,5%) () 30 (42,9 %) Avançada 29 (59,2 %) 23 (30,3%) Localizada 20 (40,8%) 53 (69,7%) Alto risco 33 (67,3%) 41 (47,6%) Baixo risco 16 (32,7) 35 (52,4%) Idade, média ± sd a Grau tumoral 19 (59,4 %) 31 (38,3 %) Estado da doença 0,001b 19 (50,0 %) 33 (37,9 %) 0,210c 19 (50,0 %) 54 (62,1 %) Progressão da doença 0,136 29 (76,3 %) 45 (51,7%) 9 (23,7 %) 42 (48,3%) 0010 a Teste t de Student para variáveis contínuas; Teste do Qui quadrado para variáveis categóricas. p=0,05 and cp=0,360 utilizando a análise estatística de regressão logística após ajustamento para a idade. b Foi também estudada a associação dos genótipos ecNOS com a susceptibilidade aumentada para o desenvolvimento de cancro da próstata, cancro da próstata antes dos 67 anos e desenvolvimento de cancro da próstata com alto risco de progressão (Quadro 4.3.3). Os resultados demonstraram que os homens portadores dos genótipos aa ou ab (polimorfismo ecNOS4 a/b) têm susceptibilidade aumentada para cancro da próstata (OR=1,75; 95%CI 1,01-3,97), em particular após a idade de 67 anos (OR=1,80; 95%CI 1,04-3,13), e susceptibilidade aumentada de desenvolverem cancro da próstata com maior risco de progressão da doença (OR=2,82; 95%CI 1,18-6,75). Estas associações não foram observadas para o caso do polimorfismo Glu-Asp. Seguidamente estudou-se o efeito da combinação dos genótipos Glu-Asp298 e ecNOS 4a/b (Quadro 4.3.4). Os resultados indicam que os indivíduos portadores da combinação do alelo a (ecNOS4 a/b) e T (Glu-Asp298) apresentam uma susceptibilidade três vezes aumentada para o desenvolvimento de cancro da próstata (OR=3.13; 95%CI 1.41-6.91, p<0.05). A influência do alelo a é bem demonstrada no Quadro 4.3.5 em que este alelo é associado a risco para cancro (OR=1,83; 95%CI 1,06-3,17; p=0,029), a grau histológico elevado Resultados | 59 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | (OR=2,18; 95%CI 0,95-4,98; p=0,062) e a risco de progressão da doença (OR=2,85; 95%CI 1,19-6,82; p=0,018). Quadro 4.3.3. Avaliação da susceptibilidade (risco) para cancro da próstata pela determinação do OR (odds ratio). Glu-Asp298 Risco para GT/TT GG ecNOS4a/b a OR OR aj. (95%CI) (95%CI) aa/ab OR OR aj.a (95%CI) (95%CI) 1,65 1,75 bb Cancro Casos/controlos 76/83 49/70 1,31 1,59 (0,79-2,18) (0,96-2.63) 38/32 87/121 (0,92-2,95) (1,01-3,07) Cancro em idade ≥ 67 Casos/controlos 34/34 31/29 1,07 1,50 (0,50-2,27) (0,91-2,45) 23/12 42/51 2,33 1,80 (0,97-5,66) (1,04-3,13) Alto risco progressão Casos/controlos 41/83 33/70 1,05 0,63 (0,58-1,90) (0,29-1,39) 29/32 45/121 2,44 2,82 (1,27-4,68) (1,18-6,75) a ajustado para a idade após análise estatística por regressão logística Quadro 4.3.4. Efeito da combinação dos genótipos Glu-Asp298 e ecNOS 4a/b na susceptibilidade para cancro Controlos Casos Glu-Asp298 n (%) n (%) OR (95%CI) bb GG 49 (32,0) 32 (25,6) 1,00 (referência) bb Alelo T 72 (47,1) 55 (44,0) 1,17 (0,64-2,15) 1,06 (1,02-1,07) aa/ab GG 21 (13,7) 17 (13,6) 1,24 (0,53-2,90) 1,11 (0,56-2,19) aa/ab Alelo T 11 (7,2) 21 (16,8) 2,92 (1,15-7,53) 3,13 (1,41-6,91) ecNOS4a/b a alelo T: genótipos GT eTT. b ajustado para a idade após análise estatística por regressão logística. 60 | Resultados OR aj.b (95%CI) | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Quadro 4.3.5. Associação entre a presença do alelo a (polimorfismo ecNOS), a susceptibilidade para cancro e o risco de desenvolvimento de tumor agressivo e de progressão da doença. Risco aumentado para Alelo a P Cancro 1,83 (1,06-3,17)a 0,029 Tumor com Gleason ≥ 7 2,18 (0,95-4,98)a 0,062 a 0,018 Progressão da doença 2,85 (1,19-6,82) a ajustado para a idade após análise estatística por regressão logística No Quadro 4.3.6. podemos observar a comparação das frequências dos genótipos GluAsp298 e ecNOS4a/b em populações normais localizadas em diferentes regiões do mundo. Posteriormente efectuamos a análise de haplótipos utilizando o sofware EH. Este programa informático avalia as frequências dos haplótipos assumindo que não existe associação entre os alelos (H0), ou que existe associação entre os alelos,as não com a doença (H1), ou ainda que existe associação com a doença e entre os alelos (H2). A análise utilizando o sofware EH para o par de genótipos Glu-Asp298 (alelos T e G) e ecNOS 4a/b (alelos a e b) demonstrou uma associação muito forte entre os marcadores (H1χ2 15.42; p<0.001) e também confirmou a associação da combinação dos alelos com a doença (H2-H1χ2 24.67; p<0.001). O resultado mais expressivo foi obtido para o haplótipo a/T em que a frequência estimada foi de 0,00015 para o grupo controlo normal e de 0.02 para o grupo com cancro da próstata. Resultados | 61 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Quadro 4.3.6. Estudo comparativo das freqüências dos genótipos Glu-Asp298 e ecNOS4a/b em populações normais localizadas em diferentes regiões do mundo. Genótipo Glu-Asp298 Grupo em estudo Total GG GT TT n (%) n (%) n (%) Autor (Ref) Yokohama, Japão 357 295 (82,6) 62 (17,4) 0 Hibi (15) Paris, França 290 123 (42,5) 123 (42,5) 44 (15,0) Lacolley (44) Porto, Portugal 153 70 (45,8) 65 (42,4) 18 (11,8) Neste estudo Genótipo ecNOS4a/b bb ab aa Grupo em estudo Total n (%) n (%) n (%) Autor (Ref) Yokohama, Japão 357 284 (79,6) 68 (19,0) 5 (1,4) Hibi (15) Tokyo, Japão 413 336 (81,4) 70 (16,9) 7 (1,7) Tsukada (13) Porto, Portugal 153 121 (79,1) 29 (18,9) 3 (1,9) Neste estudo 4.4. Detecção de Polimorfismos nos Genes GSTM1, GSTT1 e GSTM3 Foi efectuado o estudo de polimorfismos por técnicas de PCR Multiplex nos genes GSTM1 e GSTM3 (da família glutatião S-transferase mu) e GSTT1 (glutatião S-transferase theta), Esta metodologia foi aplicada no estudo do genoma de doentes com adenocarcinoma da próstata (145 amostras) comparando com homens sem qualquer patologia oncológica conhecida (184 amostras). No Quadro 4.4.1 podemos observar a distribuição das frequências dos diferentes genótipos GSTM1, GSTM3 e GSTT1 na população controlo e no grupo de doentes com cancro da próstata. Nos doentes com adenocarcinoma da próstata o genótipo GSTM1 “null” foi detectado em 53,8% dos casos e o genótipo GSTT1 “null” em 21,3% dos casos. Por outro lado, nos grupo dos indivíduos sem qualquer patologia conhecida a frequência obtida foi de 47,1% para o genótipo GSTM1 “null” e de 23,9% para o genótipo GSTT1 “null”. A comparação das distribuições de frequência não apresentou diferenças significativas entre os casos e o grupo controlo. 62 | Resultados | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Quadro 4.4.1. Frequências dos diferentes genótipos GSTM1, GSTM3 e GSTT1 na população controlo e no grupo de doentes com cancro da próstata. Genótipo Controlos Casos OR* 95%CI* P** GSTM1 Wild type (n %) 92 58,6 65 41,4 1,00 referência Null (n %) 91 54,2 77 45,8 1,20 0,75-1,90 Wild type (n %) 140 55,1 114 44,9 1.00 referência Null (n %) 44 58,7 31 41.3 0,87 0,50-1,51 AA (n %) 119 52,8 106 47,2 1.00 referência AB (n %) 48 58,3 34 41,7 1,26 0,73-2,17 0,379 BB (n %) 2 18,2 9 81,8 5,05 0,99-34,6 0,024 167 54,9 137 45,1 1.00 referência 2 18,2 9 81,8 5,50 1,2-25,8 0,420 GSTT1 0,550 GSTM3 Modelo recessivo AA/AB (n %) BB (n %) 0,016a *OR, odds ratio; CI, intervalo de confiança, ** Teste do Qui quadrado a P=0,0312 utilizando a metodologia de análise por regressão logística No Quadro 4.4.2 é apresentada a associação dos polimorfismos com as características clinico-patológicas dos casos estudados. Quando se efectua a análise estatística tendo em conta a presença de doença localizada à próstata ou avançada (extraprostática), observamos que a frequência do genótipo GSTT “null” mais elevada nos casos com doença avançada (15,0% versus 29,2%, p=0,0038). Relativamente ao polimorfismo no gene GSTM3 verificamos que a frequência dos homens portadores do genótipo BB é mais elevada no grupo com cancro da próstata (OR= 5,5 95%CI 1,2-25,8). Resultados | 63 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Quadro 4.4.2. Associação dos polimorfismos com as características clínico-patológicas dos casos estudados. GSTM1 Null Wild type GSTT1 P Null a Idade ± sd 68,0±8,5 67,5±8,3 0,724 Wild type GSTM3 P AA/AB a 68,7±9,1 67,3±8.2 0,370 BB P 67,4±8,5 68,3±7,4 0,763a Estado da doença Localizada n (%) 38 (48,7) 40 (51,3) 0,146b 12 (15,0) 68 (85,0) 0,038b 81 (94,2) 5 (5,8) 0,833b Avançada n (%) 39 (60,9) 25 (39,1) 19 (29,2) 89 (81,7) 56 (93,2) Ausência n (%) 60 (56,1) 47 (43,9) 0,545b 20 (18,3) 89 (66,7) 0,068b 103 (92,0) 9 (8,0) 0,098b Presença n (%) 16 (50,0) 16 (50,0) 11 (33,3) 22 (66,7) 32 (100,0) 0 (0,0) 4 (6,8) Metastização a Teste T de Student; b Teste do Qui quadrado 4.5. Detecção da Presença de Células Epiteliais de Origem Prostática no Sangue Periférico No Quadro 4.5.1 podemos observar a associação da idade à altura do diagnóstico, grau histológico de Gleason e estado da doença com a pesquisa de células tumorais circulantes (CTCs) pela detecção da presença de ARN mensageiro codificado pelos genes PSA e PSMA (mRNA do PSA e mRNA do PSMA) no sangue periférico de doentes com cancro da próstata. Foram estudados 61 doentes com adenocarcinoma da próstata e destes 45,9% (28/61) dos casos apresentavam doença avançada. Foi detectada no sangue periférico a presença de células com expressão de mRNA do PSA em 11,5% (7/61) dos casos e de mRNA do PSMA em 31,1% (19/61) dos casos. A presença de PSA mRNA e PSMA mRNA pela metodologia de “nested RT-PCR” não foi detectada nas 56 amostras de sangue periférico obtidas de indivíduos saudáveis e em 6 amostras de sangue de doentes submetidos a cistoprostatectomia por Carcinoma Transicional da Bexiga. 64 | Resultados | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica A presença do mRNA do PSA só foi detectada nos casos de doentes com doença avançada (extracapsular) quando comparando com casos com doença localizada à próstata (7/28 versus 0/33, p=002). Mais ainda, a detecção no sangue periférico de células tumorais circulantes com expressão do mRNA do PSA está associada a um grau histológico de gleason mais elevado (7,2 ± 0,5 versus 5,4 ± 1,8; p=0,002). Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas relativamente aos mesmos parâmetros e a presença no sangue periférico de células tumorais circulantes com expressão do mRNA do PSMA (Quadro 4.5.1). Quadro 4.5.1. Pesquisa de células tumorais circulantes (CTCs) pela detecção da presença de mRNA do PSA e mRNA do PSMA no sangue periférico de doentes com cancro da próstata utilizando a metodologia de RT-PCR PSA mRNA PSMA mRNA negativo positivo p negativo positivo p Idade 70,6±8,7 76,1±10,2 0,104 70,1±8,9 73,6±9,1 0,153 Gleason 5,4±1,8 7,2±1,1 0,024 5,5±1,7 5,9±2,1 0,410 Localizado 33 (100,0 %) 0 (0,0%) 0,002 22 (66,6%) 11 (33,4%) 0,689 Avançado 21 (77,4%) 7 (22,6%) 20 (71,4%) 8 (28,6%) Estado da doença PSA: prostate specific antigen PSMA: prostate specific membrane antigen 4.6. Polimorfismos Genéticos e Risco de Micrometastização No Quadro 4.6.1 são apresentados os resultados relativos à deteção da presença de células neoplásicas no sangue de doentes com cancro da próstata comparados com a distribuição dos genótipos realizando a avaliação de um modelo recessivo de análise destes resultados. Dos casos de doentes em que foi detectada presença de células neoplásicas circulantes, 85.6% (6/7) apresentam o genótipo PSA ARE1 AA enquanto que entre os casos em que não foi detectada a presença de células neoplásicas circulantes somente 38.8% (21/54) apresentam o genótipo AA. Esta diferença é estatisticamente significativa (p=0.018). Resultados | 65 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Quadro 4.6.1. Genótipos PSA ARE1 e detecção de células tumorais circulantes (CTCs) no sangue periférico de homens com cancro da próstata. CTCs com expressão do mRNA do PSA Ausência (%) Presença (%) GG 9 (16,7) 1 (14,4) AG 24 (44,4) 0 AA 21 (38,9) 6 (85,6) AG+GG 33 (61,1) 1 (14,4) AA 21 (39,9) 6 (85,6) Total 54 (100) 7 (100) P Genótipos PSA 0,045 Modelo recessivo 0,018 No Quadro 4.6.2. podemos observar a distribuição dos genótipos ecNOS4a/b e Glu Asp298 e associação com a presença de células tumorais circulantes (CTCs) que expressam mRNA do PSMA no sangue periférico de homens com cancro da próstata. A análise dos resultados após a estratificação de acordo com a idade mediana no diagnóstico (67 anos) mostra que são detectadas células positivas para o mRNA do PSMA em 19,2% (5 de 26) casos de homens com idade inferior a 67 anos e em 40,0% (14 of 35) após a idade de 67 anos. Relativamente ao estado da doença, a presença de CTCs é detectada em 33,3% (11 de 33) dos casos com doença localizada e em 28,8% (8 de 28) dos casos com doença avançada. Quando são analisados os resultados de acordo com o polimorfismo ecNOSa/b (Quadro 4.6.2) verificamos que os homens com cancro da próstata e portadores do genótipo bb (71.4%) eram o grupo mais frequente nos casos negativos para o mRNA do PSMA, enquanto que nos casos positivos para o mRNA do PSA os genótipos contendo o alelo a (ab and aa) eram o grupo mais frequente (52,6%). 66 | Resultados | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica O Quadro 4.6.3 apresenta a associação entre a presença de células prostáticas com expressão de mRNA do PSMA no sangue periférico e os genótipos ecNOS4a/b com a idade ao diagnóstico e o estado da doença (bb versus ab/aa). Verificamos que a presença de CTCs é mais frequente em homens portadores de genótipos com o alelo a (ab and aa) com cancro da próstata em idade inferior a 67 anos (p=0,003) ou com cancro da próstata localizado (p=0,012). Quadro 4.6.2. Distribuição dos genótipos ecNOS4a/b e Glu Asp298 e associação com a presença de células tumorais circulantes (CTCs) que expressam mRNA do PSMA no sangue periférico de homens com cancro da próstata. CTCs com expressão do mRNA do PSMA Total (%) Negativo (%) Positivo (%) P 0,134 ecNOS4a/b bb 39 (63,9) 30 (71,4) 9 (47,4) ab 19 (31,2) 11 (26,2) 8 (42,1) aa 3 (4,9) 1 (2,4) 2 (10,5) bb 39 (63,9) 30 (71,4) 9 (47,4) ab/aa 22 (36,1) 12 (28,6) 10 (52,6) GG 26 (42,6) 19 (45,2) 7 (36,8) GT 31 (50,8) 21 (50,0) 10 (52,6) TT 4 (6,6) 2 (4,8) 2 (10,5) GG 26 (42,6) 19 (45,2) 7 (36,8) GT/TT 35 (57,4) 23 (54,8) 12 (53,2) Modelo recessivo 0,069 Glu-Asp298 0,639 Modelo recessivo 0,530 Não encontramos associação estatística entre os genótipos referentes ao polimorfismo Glu-Asp298 e a presença de CTCs. Resultados | 67 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Quadro 4.6.3. Associação entre a presença de células prostáticas com expressão de mRNA do PSMA no sangue periférico e os genótipos ecNOS4a/b com a idade ao diagnóstico e o estado da doença. PSMA mRNA Genótipo Idade ≤ 67 >67 Negativo (%) Positivo (%) P bb 18 (85,7) 1 (20,0) 0,003 ab/aa 3 (14,3) 4 (80,0) ecNOS4a/b bb 12 (57,1) 8 (57,1) ab/aa 9 (42,9) 6 (42,9) bb 19 (86,4) 5 (45,4) ab/aa 3 (13,6) 6 (54,6) bb 11 (55,0) 4 (50,0) ab/aa 9 (45,0) 4 (50,0) 1,0 Estado da doença localizado avançado 68 | Resultados 0,012 0,811 5. Discussão | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica 5. DISCUSSÃO 5.1. Susceptibilidade para Cancro da Próstata 5.1.1 Polimorfismo PSA ARE1 Os resultados obtidos neste estudo sugerem que os indivíduos portadores do genótipo PSA AA têm maior susceptibilidade para o desenvolvimento de cancro da próstata em idades inferiores a 67 anos (OR=2,92, 95%CI 1,10-7,86; p=0,013). O estudo das frequências alélicas corroborou o resultado anterior indicando que o alelo A se encontra envolvido no risco para cancro da próstata (p=0.009). Encontrou-se também uma associação entre a existência de homozigotia para o alelo A e níveis séricos mais elevados de PSA no sangue (p=0.027). Estes resultados vão ao encontro da hipótese de que o genótipo AA se encontra associado a uma elevada transcrição do gene PSA. O envolvimento entre o polimorfismo no gene PSA e o CP avaliado neste estudo encontra-se de acordo com o descrito por outros autores (Xue et al, 2000; Yang et al, 2001). Os nossos resultados sugerem que homens com idade inferior a 67 anos e homozigóticos para o alelo A possuem um risco elevado para cancro da próstata. Mais ainda, a associação do genótipo AA com uma maior quantidade de PSA circulante no sangue periférico é consistente com um estudo recente (Xue et al, 2001) que demonstra que os níveis de PSA são mais elevados em homens com o genótipo PSA AA do que com os genótipos AG ou GG (p=0.02). Embora os nossos resultados que evidenciam a associação entre a homozigotia do alelo A e níveis séricos de PSA elevados serem consistentes com os resultados de Xue et al (2001), a associação do alelo A com risco para cancro da próstata, é discordante de um estudo anteDiscussão | 71 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | rior publicado pelo mesmo autor (Xue et al, 2000), o qual sugere que seria o genótipo GG a promover o desenvolvimento de cancro da próstata, comparando 57 doentes caucasianos não-hispânicos com 169 controlos caucasianos não-hispânicos. Uma possível explicação baseia-se no facto que diferentes populações estão sujeitas a diferentes factores ambientais (dieta, estilo de vida, etc.), diferentes níveis de variação genética e padrões diferentes de interações entre o genótipo e o meio ambiente. Esta pode ser uma das razões da disparidade dos resultados dos dois estudos. Uma outra razão possível poderá ser a estimativa imprecisa das frequências genotípicas devido ao pequeno número de amostras analisadas no referido estudo. Poderemos igualmente considerar a existência de desequilíbro de ligação entre os alelos G e A do PSA com outros polimorfismos funcionalmente relevantes. A frequência do genótipo AA na população normal portuguesa (30%) é consistente com o padrão descrito para uma população caucasiana americana (25%) e afro-americana (28%) sendo muito mais baixa nas populações de origem japonesa (5%) segundo o referido por estudos anteriores (Xue et al, 2001). Esta comparação é tanto mais interessante quanto foi o genótipo AA o factor de susceptibilidade encontrado na nossa população caucasiana europeia e a incidência e mortalidade do cancro da próstata ser muito mais baixa nas populações japonesas. O processo de carcinogénese da próstata pode ser influenciado por factores genéticos, que por sua vez podem afectar as taxas de incidência e a progressão do tumor. Os resultados obtidos neste estudo corroboram a existência de um factor genético envolvendo o PSA no desenvolvimento do cancro da próstata. Em conclusão os nossos resultados indicam que um polimorfismo na região promotora do gene PSA poderá ser um importante biomarcador de susceptibilidade para o aparecimento mais precoce de cancro na próstata no homem. 5.1.2. Polimorfismo VDR Taq I Entre as características principais do cancro da próstata encontra-se uma forte associação com idade avançada, localização geográfica e com a raça. A conversão sob acção da luz solar do 7-dehidrocolesterol em 1,25(OH)2 D3 é inversamente proporcional ao grau de pigmentação da pele (Clemens et al, 1982). Mais ainda, os dados epidemiológicos relacionados com a 72 | Discussão | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica exposição ao sol e a análise dos níveis de vitamina D no soro indicam um papel significativo para a vitamina D no desenvolvimento do cancro da próstata (Hanchete and Schwartz 1992; Corder et al, 1993; Ahonen et al, 2000). Os efeitos antiproliferativos e de indução da diferenciação estão descritos para o 1,25(OH)2 D3, metabolito mais activo da vitamina D (Hedlund et al, 1996a; Hedlund et al, 1996b; Miller et al, 1992; Skowronski et al,1993). Os nossos resultados reforçam a hipótese de uma associação entre a exposição ao sol e o cancro da próstata em populações caucasianas. A maior produção de vitamina D estabelece a ligação entre os dois fenómenos, sendo que a actividade da vitamina D é condicionada pelo seu receptor (VDR). Os polimorfismos no terminal 3´ (Gross et al, 1996) podem ser caracterizados pelas enzimas de restrição BsmI, ApaI and TaqI e um microsatélite poly-A. Estes polimorfismos estão todos em desequilíbrio de ligação (Peehl 1999). O papel dos polimorfismos no gene VDR e a susceptibilidade para cancro da próstata em diferentes populações têm sido objecto de alguma controvérsia (Kibel et al, 1998; Correa-Cerro et al, 1999; Watanabe et al, 1999; Blazer et al, 2000; Boussema et al, 2000; Habuchi et al, 2000; Chokkalingam et al, 2001; Luscombe et al, 2001). Além dos resultados de Taylor et al, com um risco três vezes mais elevado para os portadores do alelo T, Ingles et al encontraram um risco 4,6 vezes mais elevado para desenvolver cancro da próstata nos portadores do alelo L VDR do microsatélite poly-A. Os nossos resultados indicam que o alelo T do polimorfismo VDR Taq1 tem maior importância como factor de risco em populações mais idosas. Esta observação é consistente com a informação de que com o envelhecimento existe uma deficiência em vitamina D devido a uma menor exposição a radiações ultravioleta e uma diminuição na capacidade de sintetizar 1,25 (OH)2D3 (Peehl, 1999). Assim, os portadores do alelo T como já têm à partida níveis circulantes de vitamina D mais baixos, com o avançar da idade estarão em maior risco de desenvolvimento de cancro da próstata. Quando comparamos a frequência dos genótipos do polimorfismo VDR TaqI na população normal portuguesa (Quadro 4.2.3) com outras populações, observamos que o padrão é semelhante ao descrito para as frequências genotípicas nas populações caucasianas europeias e americanas. No entanto na comparação com a população Japonesa verificamos que a frequência do alelo de risco (alelo T) é maior do que na população portuguesa (p<0.001). Uma possível explicação para este aparente paradoxo poderá residir no facto de existirem Discussão | 73 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | diferentes factores genéticos envolvidos no risco para cancro na população japonesa e esta população ser menos influenciada por factores ambientais de risco para cancro da próstata. (Oishi et al, 1995; Habuchi et al, 2000). Outra explicação envolverá o facto de a dieta ser considerada como factor de risco para cancro da próstata e a relativamente mais baixa incidência do cancro da próstata nos japoneses estar relacionada com a dieta tradicional geralmente muito rica em peixes do tipo gorduroso que são muito ricos em vitamina D (Peehl 1999). Assim, este factor protector iria corrigir a relevância do VDR na determinação do risco para cancro. Este factor também se torna preponderante em populações do sul da Europa com uma dieta do tipo mediterrânico que é caracterizada por uma elevada ingestão de determinados tipos de peixe, reforçando assim o aporte em vitamina D além da produção resultante da exposição à radiação solar. A associação encontrada entre cancro da próstata e o alelo VDR com menor actividade (T) é consistente com o envolvimento da vitamina D no risco para cancro da próstata em particular num país do sul da Europa com elevados índices de exposição solar reforçando a hipótese de que o papel do VDR no risco para cancro da próstata poderá ser influenciado pelo balanço entre os factores intrínsecos e extrínsecos característicos para cada população em cada localização geográfica. 5.1.3. Polimorfismos ecNOS A importância das enzimas NOS na fisiopatologia da glândula prostática está bem demonstrada (Gradini et al, 1999; Hayek et al, 1999; Klotz et al, 1999). Klotz et al descreveram que existe uma expressão selectiva da iNOS no carcinoma da próstata (Klotz et al, 2000) e a actividade das enzimas NOS encontra-se influenciada pelos androgénios (Chamness et al, 1995). Neste estudo demonstramos que a frequência dos genótipos ecNOS4a/b na população saudável portuguesa é semelhante à frequência descrita para a população japonesa (Hibi et al, 1998; Tsukada et al, 1998). Em relação aos genótipos Glu-Asp 298 os nossos resultados são consistentes com as frequências alélicas descritas para outra população europeia (Lacolley et al, 1998). No entanto, diferenças significativas são observadas no que diz respeito à frequência dos genótipos GT e TT no nosso estudo (42.4 and 11.8%) e o estudo de La74 | Discussão | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica colley et al (42.5 and 15.0%), quando comparadas com o estudo japonês descrito por Hibi et al que apresenta frequências bastante mais baixas (17.4 and 0%). Os nossos resultados demonstraram também que existe uma forte associação do haplótipo a/T e uma susceptibilidade três vezes mais elevada para cancro da próstata. A incidência do cancro da próstata é bastante mais elevada nas populações europeias do que nas populações japonesas. Assim poderemos formular a hipótese de que a frequência mais baixa dos genótipos GT e TT detectada na população japonesa em comparação com a população europeia, levando a uma frequência mais baixa do haplótipo a/T, poderá ser um dos factores que contribui para as discrepâncias na incidência do cancro da próstata entre as duas populações. As consequências biológicas dos polimorfismos no gene ecNOS não são bem conhecidas. Foi descrito por Tsukada et al que os níveis NOx plasmático em indivíduos portadores do alelo a (ecNOS4a/b) são significativamente mais baixos do que os restantes. O polimorfismo Glu-Asp 298 no exão 7 (894 G→T), resulta numa substituição de um aminoácido e está associado a aumento dos níveis plasmáticos de NOx (Yoon et al, 2000). Os resultados destes estudos indicam que o locus ecNOS poderá ser responsável por alterações no controlo genético do NOx plasmático. No entanto investigações futuras ajudarão a esclarecer de que modo estes polimorfismos influenciam os níveis de NOx no plasma sanguíneo. Em conclusão, no nosso estudo identificamos um possível factor de risco genético para o desenvolvimento de cancro da próstata. Os nossos resultados evidenciam uma forte associação entre os polimorfismos no ecNOS e cancro, sendo que os indivíduos portadores de um perfil genético que inclui o haplótipo a/T têm uma susceptibilidade três vezes aumentada para desenvolverem cancro da próstata. Estudos posteriores em larga escala poderão incrementar a importância destes resultados e ajudar a caracterizar os mecanismos moleculares envolvidos na etiopatogénese do cancro da próstata. 5.1.4 Polimorfismos nos Genes GSTM1, GSTM3 e GSTT1 Os estudos epidemiológicos ao demonstrarem a importância da ingestão de gorduras na dieta como factor de risco para o desenvolvimento do cancro da próstata sugerem um papel das gorduras ou seus derivados na carcinogénese desta neoplasia. Entre os vários Discussão | 75 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | mecanismos propostos a formação de radicais oxidativos tem sido descrita como uma das vias possíveis para a carcinogénese. A conjugação do glutatião, pela acção das GSTs, com substratos electrofílicos facilita assim a excreção destas, protegendo os componentes celulares dos efeitos tóxicos da vários compostos exógenos e endógenos. As enzimas glutatião S-transferases apresentam polimorfismos genéticos que vão condicionar a sua actividade funcional e no caso dos genótipos GSTM1 “null” e GSTT1 “null” resultam na total ausência da enzima. Os nossos resultados não demonstraram um associação directa entre a presença dos genótipos GSTM1 “null” e GSTT1 “null” e a presença de cancro da próstata, indicando que provavelmente estes genótipos não serão importantes nos mecanismos de iniciação e promoção desta neoplasia na nossa população. Esta conclusão é consistente com os resultados obtidos em outras populações no que diz respeito aos genótipos GSTM1 “null” mas divergente no que diz respeito ao genótipo GSTT1 “null”, em que existem alguns resultados controversos (Murata et al, 1998; Rebbeck et al, 1999; Autrup et al, 1998). No que diz respeito ao polimorfismo no gene GSTM3 verificamos que na nossa população os homens portadores do genótipo GSTM3 BB apresentam um risco maior do que os restantes para o desenvolvimento de cancro da próstata (OR= 5,5, 95%CI 1,2-25,8). Embora não tivéssemos encontrado na literatura outros estudos relativamente aos genótipos GSTM3, verificamos que os indivíduos com o alelo GSTM3 * B apresentam maior susceptibilidade individual para cancro colorectal (Loktionov A et al, 2001). Foi observada maior frequência do genótipo GSTT1 “null” nos casos com neoplasia extraprostática (avançado) em comparação com neoplasia intraprostática (localizado) sendo esta diferença estatisticamente significativa (p=0,038). Desempenhando o glutatião um importante papel na eliminação de radicais livres e lipidoperóxidos resultantes da ingestão de gorduras animais, os nossos resultados parecem sugerir que as enzimas GSTM3 e GSTT1 poderão de algum modo influenciar os mecanismos de progressão desta neoplasia. Este resultado parece estar de acordo com a hipótese proposta por alguns autores em que sugerem que os dados epidemiológicos e laboratoriais evidenciam pontos que indicam um papel das gorduras na promoção e progressão, mais do que na iniciação desta neoplasia (West et al, 1991; Giovannucci et al, 1993; Whittemore et al, 1995; Fradet et al, 1999; Hayes et al, 1999). 76 | Discussão | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Estudos futuros poderão ajudar a esclarecer o papel e as interacções entre as gorduras, as enzimas glutatião S-transferases e outros factores de risco para o cancro da próstata. 5.2. Micrometastização, Células Tumorais Circulantes e Polimorfismos Genéticos 5.2.1 Células Epiteliais de Origem Prostática no Sangue Periférico No indivíduo normal do sexo masculino, a transcrição do mRNA do PSA e mRNA do PSMA deveria estar restricta às células epiteliais da próstata (Stamey et al, 1989) estando assim a sua detecção confinadas aos tecidos prostáticos embora estejam descritas algumas excepções em particular no cancro da mama (Diamandis 2000). Assim, a detecção de presença destes mRNA no sangue periférico pode ser indicativa da presença de células epiteliais prostáticas em circulação o que poderá ser considerado como sugestivo da existência de micrometastases circulantes (Moreno et al, 1992; Hamdy et al, 1992; Israeli et al, 1994a; Ghossein et al, 1995; Katz et al, 1995; Olsson et al, 1996; Edelstein et al, 1996; Fadlon et al, 1996; Deguchi et al, 1997; Albers et al, 2000; Llanes et al, 2002; Hara et al, 2002). A aplicação da metodologia de RT-PCR para a detecção de células prostáticas como indicador de micrometastização foi primeiramente descrita por Moreno et al (1992) utilizando a PCR convencional na detecção de PSA mRNA. No estudo presente foi utilizada uma metodologia de “nested RT-PCR” altamente sensível sendo capaz de detectar uma célula prostática num total de um milhão de células (Israeli et al, 1994a). O facto de não termos encontrado qualquer amostra positiva no sangue periférico dos indivíduos saudáveis confirma a especificidade do método como havia sido previamente descrito (Moreno et al, 1992; Israeli et al, 1994). No caso dos doentes com carcinomas da próstata, a detecção de PSA mRNA em 11,4% (7 em 61) e de PSM mRNA em 31,1% (19 em 61) poderá indicar a presença de células prostáticas circulantes no sangue periférico destes doentes. No entanto, a detecção simultânea destes mRNA só aconteceu em um caso de entre os sete casos positivos para o PSA mRNA. Discussão | 77 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | No homem, o PSA é um marcador tumoral produzido quase exclusivamente pelas células prostáticas (Stamey et al, 1989). Por outro lado o PSMA está descrito como sendo expresso nas células anaplásicas, células hormono-resistentes e metástases ósseas (Israeli et al, 1994b), Assim, os nossos resultados poderão sugerir a existência de dois diferentes tipos de células prostáticas circulantes no sangue periférico, as células que expressam o PSA mRNA e as que expressam o PSMA mRNA, potencialmente diferentes no seu significado clínico e patológico. No entanto, somente o seguimento destes doentes poderá fornecer pistas para a existência real de duas populações celulares com diferentes comportamentos biológicos. Os resultados na literatura não apresentam concordância sobre a utilidade na clínica urológica da pesquisa de células epiteliais de origem prostática como biomarcadores de metastização precoce sendo necessário incrementar a investigação para a optimização e padronização dos protocolos a utilizar (Moreno et al, 1992; Hamdy et al, 1992; Israeli et al, 1994a; Ghossein et al, 1995; Katz et al, 1995; Olsson et al, 1996; Edelstein et al, 1996; Fadlon et al, 1996; Deguchi et al, 1997; Albers et al, 2000; Llanes et al, 2002; Hara et al, 2002). O aumento da incidência do carcinoma da próstata em todo mundo e também em Portugal levanta alguns problemas práticos de diagnóstico, tratamento e seguimento dos doentes com este tumor, cuja solução é facilitada pelo facto de se tratar de uma neoplasia com um “marcador” relativamente especifíco, o antigéneo específico da próstata (PSA), que pode ser pesquisado nas células ou no soro. No essencial, os problemas que se levantam podem ser equacionados do seguinte modo: 1) diagnóstico diferencial entre doença localizada à próstata ou doença com repercurssão à distância; 2) tratamento adequado para cada uma destas situações, nomeadamente o lugar da prostatectomia radical. O doseamento sérico do PSA, que é um método de rastreio de qualidade comprovada, não permite, contudo, dizer se existem ou não células neoplásicas em circulação, isto é, se a doença é exclusivamente intraprostática (localizada) ou se já há indícios de desenvolvimento extraprostático (avançada). O trabalho que se desenvolveu tem como objectivo resolver esta questão, isto é, detectar precocemente a presença de células prostáticas circulantes através de técnicas de biologia molecular em que o PSA é procurado através do seu RNA mensageiro em células circulantes no sangue periférico. A utilização de outros transcritos de RNA mensageiro poderá ser um factor importante de modo a aumentar o grau de especificidade e sensibilidade da metodologia de RT-PCR. 78 | Discussão | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica O gene que codifica o PSA (hKLK-3) é um dos três genes da calicreína glandular humana (hKLK de “human kallikrein”) estando o seu locus localizado no cromossoma 19 (Young et al, 1996). Dois outros genes estão localizados nesta região: hKLK-1 que codifica a calicreína-1 (ou hK1) com 62% de identidade estrutural com o PSA e expresso em vários tecidos humanos, e o hKLK-2 que codifica uma calicreína (hK2) com 80% de identidade estrutural com o PSA, sendo que nunca foi detectada a sua expressão em tecidos humanos e fluídos corporais não prostáticos. A expressão da hK2 é, tal como o PSA, sujeita a regulação pelos androgéneos e está restrita às células prostáticas. A detecção de RNA transcrito pelo hKLK-2 (RNA-hKLK2) por RT-PCR poderá ser um dado importante na detecção de células prostáticas circulantes (Young et al, 1996; Herrala et al, 1997). 5.2.2. Polimorfismos Genéticos e Células Epiteliais de Origem Prostática no Sangue Periférico 5.2.2.1. PSA ARE1 O PSA sérico é um dos biomarcadores tumorais mais utilizados na detecção e monitorização do cancro da próstata. A sua combinação com o estadiamento e com o grau de Gleason tem sido sugerida como um factor predictivo da probabilidade de invasão tumoral: doença confinada ao órgão, penetração da cápsula, envolvimento das vesículas seminais e invasão dos gânglios pélvicos (Partin et al, 1997). Para além do referido, a níveis elevados de PSA tem sido associado a progressão tumoral e metastização, e 71% de doentes que na fase pré-tratamento apresentavam níveis de PSA superiores a 100 ng/ml tinham cintilogramas ósseos indicando metastização óssea do cancro da próstata (Chybowski et al, 1991). Os nossos resultados indicam uma associação entre a detecção do genótipo PSA ARE1 AA e a presença na corrente sanguínea de células tumorais que expressam mRNA do PSA em doentes com cancro da próstata (p=0,018) e com níveis de PSA sérico mais elevados (p=0,027). Uma das explicações possíveis para este achado poderá ter a ver com a actividade enzimática do PSA uma vez favorece a desadesivação celular e degrada as proteínas da matriz extracelular e a laminina, resultando assim no seu envolvimento na progressão tumoral e na metastização (Killian et al, 1993; Webber et al, 1995). Mais ainda, o aumento Discussão | 79 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | dos níveis de PSA sérico poderá não ser resultante do aumento de produção pelas células neoplásicas mas poderá também resultar da sua libertação precoce para os vasos sanguíneos no carcinoma invasor. Alguns estudos têm sugerido que a produção do PSA por cada célula poderá até ser menor do que na célula normal (Hakalahti et al, 1993; Magklara et al, 2000). O regulador principal da expressão do PSA é o androgénio que forma ligação na região ARE (androgen response element). Os genótipos do PSA e do AR (androgen receptor) poderão interagir de modo a influenciarem os níveis séricos de PSA (Xue et al, 2001). O PSA em conjunto com a uroquinase (u-PA), que é outra protease secretada pelo epitélio da prostata, poderão estar envolvidos numa cascata proteolítica durante o processo de invasão e metastização do cancro da próstata (Webber et al, 1995). Podemos colocar a hipótese que os alelos PSA ARE 1 se encontram em ligação de equilíbrio com outros genes importantes envolvidos na libertação das células neoplásicas para a corrente sanguinea e no processo de metastização ou com elementos reguladores que afectam a eficiência da transcrição. Aumentos nos níveis séricos do PSA são observados tão cedo como 6 anos antes da detecção do cancro da próstata por exame rectal e um elevado número de doentes com cancro da próstata já apresenta doença disseminada na altura do diagnóstico inicial (Helzlouer et al, 1992). Foi postulado que uma vez que o epitélio da próstata secreta a uroquinase e o PSA, as células nas lesões prostáticas pré-invasoras poderão ter uma capacidade inata para a invasão e metastização (Yang et al, 2000). Assim, a associação do genótipo PSA ARE1 AA com níveis mais elevados de PSA sérico poderá facilitar a libertação precoce de células tumorais para os capilares sanguineos o que também poderá explicar a associação deste genótipo com um diagnóstico de cancro da próstata em idade mais precoce 5.2.2.2. ecNOS No nosso estudo encontramos uma associação entre a detecção da presença dos genótipos ecNOS4a/b contendo o alelo a (genótipos aa e ab) com a presença no sangue periférico de células epiteliais de origem prostática em homens com cancro da próstata com idade inferior a 67 anos (p=0,003) e com doença localizada (p=0,012). A maioria da células tumorais que entram na circulação sanguínea morrem rapidamente (Fidler, 1970; Glaves, 1983; Weiss, 1992). A morte destas células pode ser atribuída a vá80 | Discussão | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica rias características das células tumorais como a deformalibilidade (Sato and Suzuki, 1976), agregação (Fidler, 1973; Liotta et al, 1976), e presença de moléculas de adesão à superfície das células (Karpatkin et al, 1988). Factores do hospedeiro como a turbulência sanguínea (Weiss, 1992), presença de células “natural killer” (Gorelik, 1987; Herberman, 1989), macrófagos (Fidler, 1985), e plaquetas (Tanaka, et al, 1986; Tsuruo et al, 1986), influenciam todos a sobrevivência no sangue das células isoladas ou dos seus agrupamentos. Mais ainda, a passagem das células tumorais através dos capilares poderá por si só provocar a lise celular pelo efeito de forças mecânicas simples (Weiss, 1992) ou pela acção do óxido nítrico produzido pelas células endoteliais activadas pelas citoquinas (Li et al, 1991a,b). O óxido nítrico produz múltiplos efeitos e pode influenciar a evolução de uma doença avançada e a metastização. Especificamente, o NO tem função reguladora na vasodilatação e na agregação plaquetária, que irão afectar o aprisionamento das células tumorais nos vasos capilares (Fidler, 1970). O NO é o principal mediador citotóxico secretado pelos macrófagos activados, e pelas células endotelias, e foi demonstrado ser o responsável pela destruição das células tumorais na sua passagem pelos vasos capilares (Dong et al, 1993; Hibbs et al, 1987; Nathan, 1992; Stuehr and Nathan, 1989). A produção de NO endógeno está também associada com os mecanismos de apoptose das células tumorais (Dong et al, 1994; Salvucci et al, 2001). Assim, toda esta informação sugere que a produção NO endogeno poderá ser prejudicial para a sobrevivência das células neoplásicas (Wang et al, 2001a,b; WangH et al, 2000). O tratamento in vitro das células tumorais com citoquinas, como o caso da TNF-α, IL1, e IFN-γ, induz a produção de NO e posteriormente a apoptose e ambas as consequências podem ser evitadas fazendo a inibição específica da produção do NO (Dong et al, 1994). Estes resultados sugerem que um dos factores que poderá contribuir para a morte das células epiteliais circulantes é a produção de NO, e que os níveis de NO plasmático poderão contribuir para o controlo da progressão da neoplasia. Os nossos resultados sugerem que nos indivíduos portadores de um perfil genético com o alelo a dos genótipos ecNOS4 a/b poderá ser facilitada a sobrevivência das células neoplásicas em circulação no sangue periférico. Discussão | 81 6. Conclusões Finais e Perspectivas Futuras | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica 6. CONCLUSÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS O cancro da próstata é uma das neoplasias mais comuns no homem e a segunda causa de morte por cancro em todo o Mundo constituindo um grande problema de saúde pública em particular nas sociedades ocidentais. Esta neoplasia apresenta enormes variações nas taxas de incidência e mortalidade a nível mundial. A compreensão do papel de vários factores genéticos na susceptibilidade para cancro poderá contribuir para um melhor esclarecimento das questões existentes sobre a oncogénese do cancro da próstata. Cada indivíduo é portador de um vasto grupo de diferentes polimorfismos genéticos. No presente trabalho selecionamos alguns polimorfismos nos genes PSA ARE1, VDR TaqI, ecNOS (ecNOS4 a/b e Glu-Asp298), GSTM1, GSTM3 e GSTT1 que apresentavam um potencial interesse na investigação em cancro da próstata e dando ênfase à procura de resposta para três questões principais: – Será a determinação de polimorfismos genéticos útil na definição de um perfil genético de susceptibilidade para cancro da próstata? – A detecção de células tumorais circulantes no sangue periférico em homens com cancro da próstata está associada a risco de progressão e metastização da doença? – De que modo alguns polimorfismos genéticos influenciam a libertação de células tumorais para o sangue periférico? Os nossos resultados indicam que existem algumas variantes genéticas que poderão conferir aos indivíduos portadores uma predisposição genética para o desenvolvimento de cancro da próstata. Na primeira linha de investigação desenvolvida verificamos que indivíduos portadores do genótipo PSA ARE1 AA tem uma susceptibilidade quase três vezes maior para Conclusões Finais e Perspectivas Futuras | 85 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | o desenvolvimento de cancro da próstata em idades inferiores a 67 anos (OR=2,92, 95%CI 1,10-7,86; p=0,013). Outra linha de investigação reforça a hipótese de uma associação entre a exposição ao sol e o cancro da próstata em populações caucasianas europeias. O estudo demonstrou existir correlação entre os níveis de insolação mais elevados (médias de insolação referentes a 10 anos) e uma diminuição da taxa de incidência de cancro da próstata (r2=0,756, P= 0,0002). A maior produção de vitamina D estabelece a ligação entre os dois fenómenos, sendo que a actividade da vitamina D é condicionada pelo seu receptor (VDR). Observamos também que os portadores do genótipo VDR contendo o alelo T têm uma susceptibilidade duas vezes superior de desenvolvimento de cancro da próstata (OR= 2,11, 95%CI 1,15-3,88; p=0,015) em particular para homens com mais de 66 anos (OR=2,26, 95%CI 1,05-5,29; p=0,036). Numa terceira linha de investigação, estudou-se o efeito da combinação dos genótipos Glu-Asp298 e ecNOS 4a/b resultantes de polimorfismos nos genes que codificam a ecNOS. Os resultados indicam que os indivíduos portadores da combinação do alelo a (ecNOS4 a/b) e T (Glu-Asp298), ou seja o haplótipo a/T apresentam uma susceptibilidade três vezes aumentada para o desenvolvimento de cancro da próstata (OR=3,13; 95%CI 1,41691, p<0.05). A influência do alelo a (polimorfismo ecNOS4 a/b) é ainda associada a grau histológico elevado (OR=2,18; 95%CI 0,95-4,98; p=0,062) e a risco de progressão da doença (OR=2,85; 95%CI 1,19-6,82; p=0,018). A quarta linha de investigação desenvolvida indicanos que homens portadores do genótipo GSTM3 BB têm susceptibilidade acrescida para o desenvolvimento desta neoplasia (OR= 5,5 95%CI 1,2-25,8) e que o genótipo GSTT1 “null” está associado à presença de doença avançada (p=0,0038). A presença de células tumorais circulantes no sangue periférico em homens com cancro da próstata só foi detectada, utilizando a metodologia de RT-PCR para o mRNA do PSA, nos casos de doentes com doença avançada extraprostática (p=0,024) e está associada a um grau histológico de Gleason mais elevado (p=0,002). Os nossos resultados indicam uma associação entre a deteção do genótipo PSA ARE1 AA e a presença na corrente sanguínea de células tumorais que expressam mRNA do PSA em doentes com cancro da próstata (p=0,018) e com níveis de PSA sérico mais elevados (p=0,027). Os nossos resultados sugerem também que nos indivíduos portadores de um perfil genético com o alelo a dos genótipos ecNOS4 a/b poderá ser facilitada a sobrevivência das células neoplásicas em circulação no sangue periférico. 86 | Conclusões Finais e Perspectivas Futuras | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica A determinação de um perfil genético de susceptibilidade para o cancro da próstata poderá ter aplicações importantes no âmbito do rastreio e prevenção do cancro. A caracterização de subgrupos de risco acrescido para cancro poderá levar a uma optimização dos rastreios organizados direcionando os recursos para determinados grupos populacionais que precisam de uma vigilância mais apertada. O conhecimento dos mecanismos fisiológicos associados aos genótipos de susceptibilidade poderá ajudar a definir estratégias de prevenção. O cancro da próstata, devido à sua longa latência e elevada incidência, apresenta todas as características de um bom modelo alvo para o desenvolvimento de estudos de quimioprevenção em que uma primeira fase poderá ser efectuada nos subgrupos mais adequados. A repercussão da detecção precoce de células circulantes no sistema de cuidados de saúde poderá ser de grande importância e se futuramente for, utilizada na rotina, irá permitir subdividir os doentes com carcinoma de crescimento intraprostático nos seguintes grupos: 1) doentes com neoplasia intraprostática mas sem células neoplásicas circulantes; 2) doentes com neoplasia intraprostática e com células neoplásicas circulantes. Os doentes do primeiro grupo poderão ser tratados apenas com cirurgia enquanto que os do segundo grupo poderão ter necessidade de terapêutica adjuvante. Uma outra área de repercussão do método que se propõe no sistema de cuidados de saúde é o de permitir estudar melhor os doentes com níveis séricos elevados de PSA e nos quais não é possível demonstrar a existência de carcinoma da próstata. Nestes casos se houver células prostáticas circulantes é de crer que se trate de um carcinoma, pelo que se deverá investir mais na realização de biópsias diagnósticas. Se não se detectarem células prostáticas circulantes, o aumento do PSA sérico poderá não ser devido a uma neoplasia. O facto de alguns polimorfismos genéticos poderem influenciar a presença de células tumorais circulantes no sangue periférico poderá também ajudar na definição de grupos de risco de metastização direcionando a pesquisa de células tumorais circulantes e permitindo uma melhor compreensão dos mecanismos biológicos envolvidos na progressão e metastização do cancro da próstata. Os nossos resultados sugerem novas questões e indicam alguns percursos na investigação a realizar no que diz respeito ao papel dos polimorfismos genéticos na susceptibilidade para cancro da próstata e o seu papel nos processos de progressão e metastização. Em Conclusões Finais e Perspectivas Futuras | 87 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | estudos que já estão em curso e outros estudos futuros a avaliação de outros polimorfismos genéticos será importante para a caracterização do perfil genético do cancro da próstata. Resultados recentes do nosso grupo apresentam os polimorfismos nos genes que codificam os receptores hormonais com elevado potencial na caracterização do risco de progressão tumoral e metastização (Medeiros et al, 2002e, Vasconcelos et al, 2002). Os polimorfismos em genes envolvidos na biossíntese e metabolismo das hormonas são também foco de interesse da nossa investigação. Outros estudos envolvendo polimorfismos em genes que codificam proteínas do ciclo celular estão em curso. É também nosso objectivo optimizar a metodologia de detecção de células tumorais circulantes no sangue periférico recorrendo a alterações na tecnologia utilizada ou efectuando a pesquisa de outros RNA mensageiros que permitem aumentar o valor clínico desta técnica. O nosso objectivo último foi o de integrar a informação derivada dos estudos anteriormente descritos na tentativa de contribuir para a caracterização do cancro da próstata permitindo uma visão global destes marcadores biomoleculares na susceptibilidade para cancro da próstata e no risco de metastização. 88 | Conclusões Finais e Perspectivas Futuras 7. Referências Bibliográficas | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS A Ahonen MH, Tenkanen L, Teppo L, et al (2000). Prostate cancer risk and prediagnostic serum 25hydroxyvitamin D levels (Finland). Cancer Causes Control. 11(9): 847-52. Albers P, Ko Y, Wardelmann E, et al (2000). Limitations of detection of bone-marrow micrometastasis in prostate carcinoma patients by CK18/PSA immunocytochemistry and PSA RT-PCR. Anticancer Res 20 (3B): 2107-2111. Albertsen PC, Fryback DG, Storer BE, et al (1995). Long term survival among men with conservatively treated localized prostate cancer. JAMA 274: 626-631. Albertsen PC (1996). Screening for prostate cancer is neither appropriate nor cost effective. Urol Clin North Am 23: 521-4. Algaba F (1999). Evolution of isolated high-grade prostate intraepithelial neoplasia in a Mediterranean patient population. Eur Urol 35: 496-497. Altman DG (1990). Practical Statistics for Medical Research. Chapman and Hall, Londres. Ambrosone C, Thompson P (1998). Molecular epidemiology of epithelial tumors. Curr Opinion Oncol 10: 467-474. Anttila S, Luostarinen L, Hirvonen A, et al (1995). Pulmonary expression of glutathione S-transferase M3 in lung cancer patients: association with GSTM1 polymorphism, smoking and asbestos exposure. Cancer Res 55: 3305-3309. Armbruster DA (1993). Prostate specific antigen: biochemistry, analytical methods and clinical application. Clin Chem 39: 181-195. Autrup JL, Thomassen LH, Olsen JH, et al (1999), Glutathione-transferases as a risk factor in prostate cancer. Eur J Cancer Prev 8: 525-532. Referências Bibliográficas | 91 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | B Bell D, Taylor J, Paulson D, et al (1993). Genetic risk and carcinogenic exposure: A common inherited defect of the carcinogen-metabolism gene glutathione S-transferase M1 (GSTM1) that increase susceptibility to bladder cancer. J Natl Cancer Inst 85: 1159- 1164. Blazer DG, Umbach DM, Bostick RM, et al (2000). Vitamin D receptor polymorphisms and prostate cancer. Mol Carcinog 27: 18-21. Boffetta P, Pearce N (1999) Chapter 10. Epidemiological studies on genetic polymorphism: study design issues and measures of occurrence and association. IARC Sci Publ 148: 97-108. Boring CC, Squires TS, Tong T, et al (1993). Cancer Statistics. Ca Cancer J Clin 43: 7-26 Bostwick DG, Cooner WH, Denis L, et al (1992). The association of benign prostatic hyperplasia and cancer of the prostate. Cancer 70 (S1): 291-301 Bostwick DG, Amin MB, Dundore P, et al (1993) Architectural patterns of high-grade prostatic intraepithelial neoplasia. Hum Pathol 24: 298-310. Bousema JT, Bussemakers MJ, van Houwelingen KP, et al (2000). Polymorphisms in the vitamin D receptor gene and the androgen receptor gene and the risk of benign prostatic hyperplasia. Eur Urol 37(2): 234-8. Brawer MK (1992). Prostatic intraepithelial neoplasia: a premalignant lesion. J Cell Biochem 16G: 171-174. Brennan P (2002). Gene-environment interaction and aetiology of cancer: what does it mean and how can we measure it? Carcinogenesis 23 (3): 381-387. Brockmöller J, Kerb R, Drakoulis N, et al (1994). Glutathione S-transferse M1 and its variants A and B as host factors of blader cancer susceptibily: a case-control study. Cancer Res 54: 4103-4111. C Campbell E, Takahahi Y, abramovitz M, et al (1990). A distinct human testis and brain class-mu glutathione S-transferase: molecular cloning and characterization of a form present even in indivuduals lacking hepatic type-mu isoenzymes. J Biol Chem 265: 9188-9193. Carducci M, DeWeese T, Nelson W, et al (1996).. Postate Cancer Treatment Strategies Based on Tumor-Specific Biological Principles: Future Directions. Sem Oncol 23: 56-62 Catalona WJ, Smith DS, Ratcliff TL, et al (1991). Measurement of serum prostate specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. N Engl J Med 324; 1156-1161. Ciatto S (2000). Screening for prostate cancer by PSA determination: a time for caution. Int J Biol Markers 15 (4): 285-28. Chamness SL, Ricker DD, Crone JK, et al. (1995). The effect of androgen on nitric oxide synthase in the male reproductive tract of the rat. Fertil Steril 63: 1101-1107. 92 | Referências Bibliográficas | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Chan MJ, Stampfer MJ, Giovannuci EL (1998) .What causes prostate cancer? A brief summary of the epidemiology. Sem Cancer Biol 8: 263-273. Chen C, Liu Q, Relling MV (1996). Simultaneous characterization of glutathione S-transferase M1 and T1 polymorphisms by polymerase chain reaction in American whites and blacks. Pharmacogenetics 6: 187-191. Chokkalingam AP, McGlynn KA, Gao YT, et al (2001). Vitamin D receptor gene polymorphisms, insulin-like growth factors, and prostate cancer risk: a population-based case-control study in China. Cancer Res 61(11): 4333-6 . Chomczynski P, Sachi N (1987). Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162: 156-159. Chybowski FM, Keller JJ, Bergstralh EJ, et al (1991). Predicting radionuclide bone scan findings in patients with newly diagnosed, untreated prostate cancer: prostate specific antigen is superior to all other clinical parameters. J Urol 145: 313-8. Clemens TL, Adams JS, Henderson SL, et al (1982). Increased skin pigment reduces the capacity of the skin to sinthesize vitamin D3. Lancet 1(8263): 74-6. Cleutjens KBJM, van der Korput HAGM, van Eekelen CCEM, et al (1997): An androgen response element in a far upstream enhancer region is essential for high, androgen-regulated activity of the prostate-specific antigen promoter. Mol Endocrinol 11: 148-161. Corder EH, Guess HA, Hulka BS, et al N (1993). Vitamin D and prostate cancer: a prediagnostic study with stored sera. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2(5): 467-72. Correa-Cerro L, Berthon P, Haussler J, et al (1999). Vitamin D receptor polymorphisms as markers in prostate cancer. Hum Genet 105(3): 281-7. Crawford ED (1999). The utility of prostate-specif antigen as a surrogate marker for identification of high-risk cohorts and assessing response in chemoprevention trials. Eur Urol 35: 511-514. Crofts LA, Hancock MS, Morrison NA, et al (1998). Multiple promoters direct the tissue-specific expression of novel N-terminal variant human vitamin D receptor gene transcripts. Proc Natl Acad Sci 95(18): 10529-34. D Deguchi T, Yang M, Kawada Y (1997). Micrometastasis of prostate cancer to Lymph Nodes: Detection by Means of Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction. J Nat Cancer Inst 89 (20); 1471-1472. Denis L, Morton MS, Griffiths K (1999). Diet and its preventive role in prostatic disease. Eur Urol 35: 377-387. Diamandis E (2000). Elevated serum prostate-specific antigen levels in a women with metastatic breast cancer. N Engl J Med 343: 890-1. Referências Bibliográficas | 93 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | DiMascio P, Kaiser S, Sie H (1989). Lycopene as the most effective biological carotenoid singlet oxygen quencher. Arch Biochem Biophys 274: 1-7. Dimitrov Y, Petitjean P and Hannedouche T (1997). Kidney and nitric oxide. Nephrologie 18(2): 41-46. Dong Z, Qi Z, Xie K and Fidler IJ (1993). Protein tyrosinase kinase inhibitors decrease induction of nitric oxide synthase activity in LPS-responsive and LPS-nonresponsive murine macrophages. J Immunol 151: 2717-2722. Dong Z, Staroselsky AH, Zi X, et al(1994). Inverse correlation between expression of inducible nitric oxide synthase activity and production of metastasis in K-1735 murine melanoma cells. Cancer Res 54: 789-793. E Echimane AK, Ahnoux AA, Adoubi I, et al. Cancer incidence in Abidjan, Ivory Coast: first results from the cancer registry.1995-1997. Cancer 89: 653-63, 2000. Edelstein RA, Zietman AL, de las Morenas A, et al (1996). Implications of prostate micrometastases in pelvic lymph nodes: an archival tissue study. Urology 47(3): 370-375. Ekmam P (1999). Genetic and environmental factors in prostate cancer genesis: identifying highrisk cohorts. Eur Urol 35(5-6): 362-369 F Fadlon EJ, Rees RC, McIntyre C, et al (1996). Detection of circulating prostate-specific antigen-positive cells in patients with prostate cancer by flow cytometry and reverse transcription polymerase chain reaction. Br. J. Cancer 74(3): 400-405. Ferlay J, Bray F, Sankila R et al (1999). EUCAN: cancer incidence, mortality and prevalence in the European Union 1996, version 3.1. IARC Cancer Base No. 4. Lyon: IARC 1999. Limited version available from URL: http://www-dep.iarc.fr/eucan/eucan.htm Ferlay J, Bray F, Pisani P et al (2001). GLOBOCAN 2000: Cancer incidence, mortality and prevalence Worldwide, Version 1.0. IARC CancerBase No.5, IARC Press, Lyon. Fidler IJ (1970). Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor emboli labelled with 125 I-5-iodod-2-deoxyuridine. J Natl Cancer Inst 45: 773-775. Fidler IJ (1973). The relationship of embolic homogeneity, number, size and viability to the incidence of experimental metastasis. Eur J Cancer 9: 223-228. Fidler IJ (1985). Macrophages and metastasis: a biological approach to cancer therapy: presidential address. Cancer Res 45: 4714-4719. 94 | Referências Bibliográficas | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Fidler IJ (1987). Review: biologic heterogeneity of cancer metastases. Breast Cancer Res Treat 9: 17-26. Foster C, Abel P (1992). Clinical and molecular techniques for diagnosis and monitoring of prostatic cancer. Hum Pathol 23: 395-401. Foster C, McLoughlin J, Bashir I, et al (1992). Markers of the metastatic phenotype in prostate cancer. Hum Pathol 23: 381-394. Forstermann U, Boissel JP, Kleinert H (1998). Expressional control of the constitutive isoforms of nitric oxide synthase (NOS I and NOS III). FASEB J 12(10): 773-790. Franco E (1997). Epidemiology in the study of cancer. In: Bertino J (ed.) Encyclopedia of cancer. Academic Press, San Diego, pp 621-641. Franco E e Rohan T (2002). Cancer Precursors: Epidemiology, Detection, and Prevention. Spinger Verlag New York. Fradet Y, Meyer F, Bairati I, et al (1999). Dietary fat and prostate cancer progression and survival. Eur Urol 35: 388-391. Franks LM (1973). Proceedins: Etiology, epidemiology, and pathology of prostatic cancer. Cancer 32: 1092-95 Furberg AH, Ambrosone C (2001). Molecular epidemiology, biomarkers and cancer prevention. Trends Mol Medicine 7(11): 517-521. G Gala JL, Heusterspreute M, Loric S, et al (1998). Expression of prostate-specific antigen and prostate-specific membrane antigen transcripts in blood cells: implications for the detection of hematogenous prostate cells and standardization. Clin Chem 44: 472-481. George D, Shepard T, Ma J, et al (2001). PTEN polymorphism (IVS4) is not associated with risk of prostate cancer. Cancer Epidem Biomarkers Prev 10: 411-412. Ghossein RA, Scher HI, Gerald WL, et al (1995). Detection of circulating tumor cells in patients with localized and metastatic prostatic carcinoma: clinical implications. J Clin. Oncol 13: 1194-1200. Ghossein RA, Carusone L, Bhattacharya S ( 1998). Review: Polymerase chain reaction detection of micrometastases and circulating tumor cells: application to melanoma, prostate and thyroid carcinomas. Diag Mol Pathol 8: 165-175. Giovannnucci E, Rimm EB, Colditz GA, et al (1993). A prospective study of dietary fat and risk of prostate cancer. J Natl Cancer Inst 85: 1571-1579. Giovannucci E, Ascherio A, Rimm E, et al (1995). Intake of carotenoids and retinal in relation to risk of prostate cancer. J Natl Cancer Inst 87: 1767-76. Referências Bibliográficas | 95 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Giovannucci E (1996). How is individual risk for prostate cancer assessed. Hematol Oncol Clin North Am 10: 537-48 Glaves D (1983). Correlation between circulation cancer cells and incidence of metastases. Br J Cancer 48: 665-668. Gleason DF (1990). Histological grading of prostatic carcinoma. In: Bostwick DG (ed) Pathology of the prostate. Churchill Livingstone, New York, pp 83-93. Gleason DF. Histologic grading of prostate cancer: a perspective. Hum Pathol 23: 73, 1992. Glover FE jr, Coffey DS, Douglas LL, et al (1998). The epidemiology of prostate cancer in Jamaica. J Urol 159: 1984-6. Gonzalez FJ (1995). Genetic polymorphism and cancer susceptibility: Fourteenth Sapporo Cancer Seminar. Cancer Res 55: 710-715 Gorelik E (1987). Augmentation of the antimetastatic effect of anticoagulant drugs by immunostimulation in mice. Cancer Res 47, 809-814. Gradini R, Realacci M, Ginepri A, et al (1999). Nitric oxide synthases in normal and benign hyperplastic human prostate: immunohistochemistry and molecular biology. J Pathol 189: 224-9. Grande M, Carlstrom K, Stege R, et al (2000). Estrogens increase the endothelial nitric oxide synthase (ecNOS) mRNA level in LNCaP human prostate carcinoma cells. Prostate 45: 232-7. Gross C, Eccleshall TR, Malloy PJ, Villa ML, Marcus R, Feldman D (1996). The presence of a polymorphism at the translation initiation site of the vitamin D receptor gene is associated with low bone mineral density in postmenopausal Mexican-American women. J Bone Miner Res 11(12): 1850-5. Gu FL, Xia TL, Kong XT (1994). Preliminary study of the frequency of benign prostatic hyperplasia and prostatic cancer in china. Urology 44(5): 688-91. H Habuchi T, Suzuki T, Sasaki R, et al (2000). Association of vitamin D receptor gene polymorphism with prostate cancer and benign prostatic hyperplasia in a Japanese population. Cancer Res 60(2): 305-8. Hakalahti L, Vihko P, Henttu P, et al (1993). Evaluation of PAP and PSA gene expression in prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma using northern-blot analyses, in situ hybridization and immunohistochemical stainings with monoclonal and bispecific antibodies. Int J Cancer 55: 590-7. Hamdy F, Lawry J, Anderson M (1992). Circulating prostate specific antigen positive cells correlate with metastatic prostate cancer. Br J Urol 69: 392-396. Hanchete CL and Schwartz GG (1992). Geographic patterns of prostate cancer mortality: evidence for a protective effect of ultraviolet radiation. Cancer 70: 2861-2861. 96 | Referências Bibliográficas | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Hara N, Kasahara T, Kawasaki T, et al (2002). Reverse transcription-polymerase chain reaction of prostate-specific antigen, and prostate stem cell antigen in one millilitre of peripheral blood: value for the staging of prostate cancer. Clin Cancer Res 8: 1794-1799. Haussler MR, Whitfield GK, Haussler CA, Hsieh JC, Thompson PD, Selznick SH, Dominguez CE, Jurutka PW (1998). The nuclear vitamin D receptor: biological and molecular regulatory properties revealed. J Bone Miner Res. 13(3): 325-49. Review. Hayek OR, Shabsigh A, Kaplan SA, et al (1999). Castration induces acute vasoconstriction of blood vessels in the rat prostate concomitant with a reduction of prostatic nitric oxide synthase activity. J Urol 162: 1527-1531. Hedlund TE, Moffatt KA, Miller GJ (1996a). Stable expression of the nuclear vitamin D receptor in the human prostatic carcinoma cell line JCA-1: evidence that the antiproliferative effects of 1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 are mediated exclusively through the genomic signaling pathway. Endocrinology 137(5): 1554-61. Hedlund TE, Moffatt KA, Miller GJ (1996b). Vitamin D receptor expression is required for growth modulation by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 in the human prostatic carcinoma cell line ALVA31. J Steroid Biochem Mol Biol 58(3): 277-88. Heidenreich A, Vorreuther R, Neubauer S, et al (1997). The influence of ejaculation on serum levels of prostate specific antigen. J Urol 157: 209-211. Helzlouer KJ, Newby J, Comstock GW(1992). Prostate-specific antigen levels and subsequent prostate cancer: potential for screening. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1: 537-540. Hemminki K, Shields PG (2002). Skilled use of DNA polymorphisms as a tool for polygenic cancers. Carcinogenesis 23 (2): 379-380. Herberman RB (1989). Natural killer cells. Prog Clin Biol Res 288: 161-166. Herrala A, Kurkela R, Porvari K, et al. Human Prostate-specific glandular kallikrein is expressed as an active and an inactive protein. Clin Chem 279-284. Hibi K, Ishigami T, Tamura K, et al (1998). Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene Polymorphism and acute myocardial infarction. Hypertension 32: 521-526. Hibbs JB, Taintor, RR Vavrin, Z (1987). Macrophage cytotoxicity: role for L-arginine deiminase activity and amino nitrogen to nitrate. Science 235: 473-478. Hoedemaeker RF, van der Kwast TH, Boer R, et al (2001). Pathologic features of prostate cancer found at population-based screening with a four-year interval. J Natl Cancer Inst 93: 1153-8 Holash J, Maisonpierre PC, Compton D, et al (1999). Vessel cooption, regression, and growth in tumors mediated by angiopoitins and VEGF. Science 284: 1995-98. Holund B (1980). Latent prostatic cancer in a consecutive autopsie series. Scand J Urol Nephrol, 14: 29-31. Hutchinson P, Osborne J, Lear J, et al (2000). Vitamin D receptor polymorphisms are associated with altered prognosis in patients with malignant melanoma. Clin Cancer Res 6: 498-504. Referências Bibliográficas | 97 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Hsing AW, Tsao L ; Devesa SS (2000). International trends and patterns of prostate cancer incidence and mortality. Int. J. Cancer 85: 60-67. Hsing AW, Devesa SS (2001). Trends and Patterns of Prostate Cancer: What do they suggest? Epidemiol Rev 23: 3-13, 2001. Hsing AW, Tsau L, Devesa SS (2002). International trends in prostate cancer incidence and mortality. Int J Cancer 85: 60-67. I Ichikawa T, Suzuki H, Ito H (2000). Role of chromosomal loss in the progression of prostate cancers. Int J Clin Oncol 5: 345-354. Ignarro LJ, Fukuto JM, Griscavage JM, et al (1993). Oxidation of nitric oxide in aqueous solution to nitrite but not nitrate: comparison with enzymatically formed nitric oxide from L-Arginine. Proc Natl Acad Sci USA 90: 8103-7. Ingles SA, Ross RK, Yu MC, et al (1997). Association of prostate cancer risk with genetic polymorphisms in vitamin D receptor and androgen receptor. J Natl Cancer Inst 89(2): 166-70. Inskip A, Elexperu-Camiruaga J, Buxton N, Dias PS et al (1995). Identification of polymorphism at the Glutathione S-transferase, GSTM3 locus: evidence for linkage with GSTM1*A. Biochem J 312: 713-716. Israeli R, Miller W, Sai S, et al (1994). Sensitive nested reverse transcription polymerase chain reaction detection of circulating prostatic tumor cells: comparison of prostate-specific membrane antigen and prostate-specific antigen-based assays. Cancer Res 1994;54: 6306-6310. J Jenkins R, Takahashi S, Delacey K, et al (1998). Prognostic significance of allelic imbalance of chromosome arms 7q, 8p, 16p, and 18q in stage T3N0M0 prostate cancer. Genes Cromosomes Cancer 21: 131-143. K Karashima T, Taguchi T, Yoshikawa C, et al (2000) Numerical chromosomal changes in metastatic prostate cancer following anti-androgen therapy: fluorescence in situ hybridization analysis of 5 Japanese cases. Cancer Genet Cytogenet 120:148-154 Karpatkin S, Pearlstein E, Ambrogio C and Coller BS (1988). Role of adhesive proteins in platelet tumor interaction in vitro and metastasis formation in vivo. J Clin Invest 81: 1012-1018. Katz AE ;Olsson CA; Raffo, AJ et al (1994). Molecular staging of prostate cancer with the use of an enhanced reverse transcriptase-PCR assay. Urology 43(6): 765-775. 98 | Referências Bibliográficas | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Katz AE, de Vries G, Begg MD, et al (1995). Enhanced reverse transcriptase-polymerase chain reaction for prostate specific antigen as an indicator of true pathologic stage in patients with prostate cancer. .Cancer 75(7): 1642-1648. Katz M (2001). Multivariate Analysis. Cambridge University Press, Cambridge, 2001. Kellof G, Lieberman R, Steele V, et al (1999). Chemoprevetion of prostate cancer: Concepts and strategies. Eur Urol 35: 342-350. Kennedy LJ, Moore K.Jr, Caulfield JL, et al (1997). Quantitation of 8-oxoguanine and strand breaks produced by four oxidizing agents. Chem Res Toxicol 10: 386-92. Kibel AS, Isaacs SD, Isaacs WB, Bova GS (1998). Vitamin D receptor polymorphisms and lethal prostate cancer. J Urology 160: 1405-1409. Killian CS, Corral CA, Kawinski E, et al (1993). Mitogenic response of osteoblast cells to prostatespecific antigen suggest an activation of latent TGF-β and a proteolytic modulation of cell adhesion receptors. Biochem Biophys Res Commun 192: 940-947 Knudsen L, Loft S, Autrup H (2001). Risk assessment: the importance of genetic polymorphisms in man. Mut Res 482: 83-88. Klotz T, Bloch W, Volberg C, et al (1998). Selective expression of inducible nitric oxide synthase in human prostate carcinoma. Cancer 82: 1897-1903. Klotz T, Mathers MJ, Bloch W, et al (1999). Nitric oxide based influence of nitrates on micturition in patients with benign prostatic hyperplasia. Int Urol Nephrol 31: 335-41. Krill D, DeFlavia P, Dhir R, Luo J, Becich MJ, Lehman E, Getzenberg RH (2001). Expression patterns of vitamin D receptor in human prostate. J Cell Biochem 82 (4): 566-72. L Lacolley P, Gautier S, Poirier O, et al (1998). Nitric oxide synthase gene polymorphisms, blood pressure and aortic stiffness in normotensive and hypertensive subjects. J Hypertens 16: 31-35. Levi F, La Vecchia L, Boyle P (2000). The rise and fall of prostate cancer. Eur J Cancer Prev 9: 381-385. Li L, Nicolson GL, Fidler IJ (1991). Direct in vitro lysis of metastatic tumor cells by cytokine-activated murine vascular endothelial cells. Cancer Res 51: 245-254. Li L, Kilbourn RG, Adams J , Fidler IJ (1991). Role of nitric oxide in lysis of tumor cells by citokine activated-activated endothelial cells. Cancer Res 51: 2531-2535. Liotta LA, Kleinerman J e Saidel GM (1976). The significance of hematogenous tumor cell clumps in the metastasis process. Cancer Res 36: 889-893. Lichtenstein P, Holm N, Verkasalo P, Iliadou A, Kaprio J, Koskenvuo M, Pukkala E, Skytthe A, Hemminki K (2000). Environmental and heritable factors in the causation of cancer. N Engl J Med 343: 78-85. Referências Bibliográficas | 99 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Lilja H, Abrahamsson PA (1988). Three predominant proteins secreted by the human prostate gland. Prostate 12: 29-38. Llanes L, Ferruelo A, Paez A, et al (2002). The clinical utility of the prostate specific membrane antigen reverse- transcription/ polymerase chain reaction to detect circulating prostate cells: an analysis in healthy men and women. BJU Int 89: 882-885. Lopes C, Medeiros R (1999). Molecular diagnosis of prostate adenocarcinoma with emphasis on screening programs. Rev Esp Patol 32 (3): 372-374. Lopes C, Medeiros R, Silva C, et al (2000). A biologia molecular no estudo do carcinoma da próstata: novos campos de intervenção. Uro 5(1): 42-47. Lopes C, Campos C, Brito MJ (2000). “Cancro da Próstata” Problemas do diagnóstico em biópsias e em peças de prostatectomia: Resultados, Certezas e Dúvidas. In: Calais da Silva F (ed.), Carcinoma da Próstata-Perspectiva Actual, p. 59-76. Lisboa. Luscombe CJ, Fryer A, French M, et al (2001a). Exposure to ultraviolet radiation: association with susceptibility and age at presentation with prostate cancer. Lancet 358: 641-642. Luscombe CJ, French ME, Liu S, et al (2001b). Prostate cancer risk: associations with ultraviolet radiation, tyrosinase and melanocortin-1 receptor genotypes. Br J Cancer 85(10): 1504-9. M MacDonald NJ, Steeg PS (1993). Molecular basis of tumour metastasis. Cancer Surv 16: 175-99. Magklara A, Scorilas A, Stephan C, et al (2000). Decreased concentrations of prostate-specific antigen and human glandular kallikrein 2 in malignant versus nonmalignant prostatic tissue. Urology 56: 527-32. McCarty MF (2000). Parathyroid hormone may be a cancer promoter- an explanation for the decrease in cancer risk associated with ultraviolet light, calcium and vitamin D. Med Hypoth 54: 475-482. Medeiros R, Morais A, Oliveira J, et al (2001). Diagnóstico molecular das micrometástases em doentes com adenocarcinoma da próstata. Arquiv Med 15: 5-6. Medeiros R, Morais A, Vasconcelos A, et al (2002a). Linkage between Polymorphisms in the Prostate-Specific Antigen ARE1 Gene Region, Prostate Cancer Risk, and Circulating Tumour Cells”. Prostate (aceite para publicação). Medeiros R, Morais A, Vasconcelos A, et al (2002b). The Role of Vitamin D Receptor Gene Polymorphisms in the Susceptibility to Prostate Cancer of a Southern Europe Population”. J Hum Genet (aceite para publicação). Medeiros R, Morais A, Vasconcelos A, et al (2002c). Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene Polymorphisms and Genetic Susceptibility to Prostate Cancer Eur J Cancer Prev (aceite para publicação). 100 | Referências Bibliográficas | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Medeiros R, Morais A, Vasconcelos A, et al (2002d). Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms and the shedding of circulating tumour cells in the blood of prostate cancer patients”. Cancer Lett (aceite para publicação). Medeiros R, Vasconcelos A, Costa S, et al (2002e). Steroid hormone genotypes ARStuI and ER325 are linked to the progression of human prostate cancer. Cancer Genet Cytogen (aceite para publicação). Meyskens FL (2000). Cancer population genetics and tumor prevention : an unfulfilled paradigm. Eur J Cancer 36: 1189-1192. Miller AS, Dykes DD, Polesky HF (1988). A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 16: 1215. Miller GJ, Stapleton GE, Ferrara JA, et al(1992). The human prostatic carcinoma cell line LNCaP expresses biologically active, specific receptors for 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3. Cancer Res 52(3): 515-20. Miyahara K, Kawamato T, Sase K, et al (1994). Cloning and structural characterization of the human endothelial nitric-oxide-synyhase. Eur J Biochem 223: 719-726. Miyamoto K, Kesterson RA, Yamamoto H, et al (1997). Structural organization of the human vitamin D receptor chromosomal gene and its promoter. Mol Endocrinol 11(8): 1165-79. Montie JE (1995). Staging of prostate cancer: current TNM classification and future prospects for pognostic factors. CA Cancer J Clin 5(S7): 1814-7. Moreno J, Croce C, Fischer R, et al (1992). Detection of hematogenous micrometatasis in patients with prostate cancer. Cancer Res 52: 6110-6112. Morrison NA, Qi JC, Tokita A, et al (1994). Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles. Nature 367(6460): 284-7. Morrison NA, Qi JC, Tokita A, et al (1994). Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles. Nature 367(6460): 284-7. Morton RA (1994). Racial differences in adenocarcinoma of the prostate in North American men. Urology 44: 637-638. Murata J, Tada M, Iggo RD, et al (1997). Nitric oxide as a carcinogen: analysis by yeast functional assay of inactivating p53 mutations induced by nitric oxide. Mut Res 379 (2): 211-218. N Nakajima T, Elovaara E, Anttila S, et al (1995). Expression and polymorphism of glutathione S-transferase in human lungs: risk factors in smoking-related lung cancer. Carcinogenesis16: 707-711. Narayan P (1995). “Neoplasms of the prostate gland”. In: Tanagho EA, Mc Aninch JW, (eds). “Smiths General Urology”, 14th ed. Norwalk, CT: Appleton & Lange, p. 392. Referências Bibliográficas | 101 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Narod S (1998). Genetic epidemiology of prostate cancer. Biochim Biophys Acta 1423: F1-F3. Nathan C (1992). Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J 6: 3051-3056. Nihei N, Ohta S, Kuramochi H, et al (1999). Metastasis suppressor gene(s) for rat prostate cancer on the long arm of human chromosome 7. Genes Chromosomes Cancer 24: 1-8. Norrish AE, Skeaff CM, Arribas GL, et al (1999). Prostate cancer risk and consumption of fish oils: a dietary biomarker-based case-control study. Brit J Cancer 81: 1238-1242. Nupponen N, Visakorpi T (1999). Molecular biology of progression of prostate cancer. Eur Urology 35: 351-354. Nwosu V, Carpten J, Trent J, et al (2001). Heterogeneity of genetic alterations in prostate cancer: evidence of the complex nature of the disease. Hum Mol Genet 10 (20): 2313-2318. O Oesterling JE, Jacobsen SJ, Chute CG, et al (1993). Serum prostate-specific antigen in a community based population of healthy men: Establishment of age specific reference ranges in serum as a screening JAMA 270: 860-864. Ogunbiyi JO, Shittu OB (1999). Increased incidence of prostate cancer in Nigerians. J Natl Med Assoc 91, 159-64. Oishi K, Yoshida O, and Schroeder FH (1995). The geography of prostate cancer and its treatment in Japan. Cancer Surv 23: 267-280. Olsson CA, de Vries GM, Benson MC, et al (1996). The use of RT-PCR for prostate-specific antigen assay to predict potential surgical failures before radical prostatectomy: molecular staging of prostate cancer. BrJ Urol 77(3); 411-417. Osegbe DN (1997). Prostate cancer in Nigerians: facts and non facts. J Urol 157: 1340-1343. P Pantel K, Cote RJ, Fodstad O (1999). Detection and clinical importance of micrometastatic disease. J Natl Cancer Inst 91: 113-1124 Parkin DM (1998). The Global Burden of Cancer. Sem Cancer Biology 8: 219-235. Partin AW, Kattan MW, Subong EN, et al (1997). Combination of prostate-specific antigen, clinical stage and Gleason score to predict pathological stage of localized prostate cancer. JAMA 277: 1445-1451. Pearson WR, Vorachek W, Xu S, et al (1993). Identifaction of class-mu glutathione S-transferase genes GSTM1-GSTM5 on chomosome 1p13. Am J Hum Genet 53: 220-233. Peehl DM (1999). Vitamin D and prostate cancer risk. Eur Urol 35: 392-394. 102 | Referências Bibliográficas | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Pereira Miguel MJ, Carneiro de Moura JL (2000). Antigéneo específico da próstata avaliação clínico laboratorial. In: Calais da Silva F (ed.), Carcinoma da Próstata-Perspectiva Actual, Lisboa pp. 4157. Perera F, Weinstein IB (2000). Molecular epidemiology: recent advances and future directions. Carcinogenesis 21 (3): 517-524. Pisansky TM, Kahn M, Rasp G, (1997). A multiple prognostic index predictive of disease outcome after irradiation for clinically localized prostate cancer. Cancer 79: 337-344. Q Qian J, Jenkins RB and Bostwick, DG (1999). Genetic and chromosomal alterations in prostatic intraepithelial neoplasia and carcinoma detected by fluorescence in situ hybridization. Eur Urol 35: 479-483. R Rebbeck TR, Walker AH, Jaffe JM, et al (1999). Glutathione S-Transferase in the etiology of prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 8: 283-287. Rhodes P, Leone AM, Francis PL, et al (1995). The L-arginine:nitric oxide pathway is the major source of plasma nitrite in fasted humana. Biochem Biophys Res Commun 209: 590-596. Ross VL, Board PG, Webb GC (1993). Chromosomal mapping of the human mu class glutathione S-transferases to 1p13. Genomics 18: 87-91. RORENO (1994). Registo Oncológico Regional da Região Norte. Editado pelo Instituto Português de Oncologia de Francisco Gentil, Porto. Rusciano D, Burger M (1993). Why do cancer cells metastasize into particular organs?. BioEssays 14; 185-194. S Santella R (2002). Mechanisms and biological markers of carcinogenesis. In: Franco E e Rohan T (eds) Cancer Precursors: Epidemiology, Detection, and Prevention. Spinger Verlag New York, Inc, pp 7-19. Salvucci O, Carsana M, Bersani I, et al (2001). Antiapoptotic role of endogenous nitric oxide in human melanoma cells. Cancer Res 61: 318-26. Sato H and Suzuki M (1976). Deformability and viability of tumor cells by transcapillary passage with reference to organ affinity in metastasis in cancer. In: Weiss L (ed) Fundamental aspects of metastasis. Amsterdam: North-Holland, pp 311-315. Scardino P, Weaver R, Hudson M (1992). Early detection of prostate cancer. Hum Pathol 23: 211-222. Referências Bibliográficas | 103 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | Schatzl G, Gsur A, Bernhofer G, et al (2001). Association of vitamin D receptor and 17 hydroxylase gene polymorphisms with benign prostatic hyperplasia and benign prostatic enlargement. Urology 57(3): 567-72. Schiffman M, Bauer H, Hoover R, et al (1993). Epidemiologic evidence showing that human papillomavirus infection causes most cervical intraepithelial neoplasia. J Natl Cancer Inst 85: 958-964. Schroeder FH, Denis LJ, Kirkels W, et al (1995). European randomized study of screening for prostate cancer: progress report of Antwerpmand Rotterdam studies. Cancer 76: 129-134. Schroder FH (1998). “Endocrine treatment of prostate cancer”. In: Walsh PC, Retik AB, Vaughan ED and Vine AJ (eds). “Campbell’s Urology”. Philadelphia: W. B. Saunders; 1998. pp. 2427-2644. Schroder FH, Cruijssen-Koeter I, Kranse R, et al (2000). Prostate cancer detection at low value of prostatic specific antigen (PSA). J Urol 163: 806-12. Schroder FH, Widhagen MF, et al (2001). Screening for prostate cancer: evidence and perspectives. BJU Int 88(8): 811-7. Schuur ER, Henderson GA, Kmetec LA, (1996). Prostate-specific antigen is regulated by an upstream enhancer. J Biol Chem 271: 7043-7051. Schwartz GG, Hylka BS (1990). Is vitamin D deficiency a risk factor for prostate cancer? (Hypothesis) Anticancer Res 10: 1307. Seidegard J, Voracheck WR, Pero RW, et al (1988). Hereditary differences in the expression of the human glutathione S-transferase activity on trans-stilbene oxide are due to a gene deletion. Proc Natl acad Sci USA 85: 7293-7297. Shekhar P, Aslakson C, Miller F (1993). Molecular events in metastatic progression. Sem Cancer Biol 4: 193-204. Shi Y, LeeJ-S and Galvin KM (1997). Everything you have ever wanted to know about Ying Yeng 1. Biochim Biophys Acta 1332: f49-f66. Shields PG, Harris CC (1991). Molecular epidemiology and the genetics of environmental cancer. JAMA 266: 681-686. Sibghat-Ullah, Garinari P, Xu YZ, et al (1996). Base analog and neighboring base effects on substrate specificity of recombinant human G:T mismatch specific thymine DNA glycosylase. Biochemistry 35: 12926-32. Skowronski RJ, Peehl DM, Feldman D (1993). Vitamin D and prostate cancer: 1,25 dihydroxyvitamin D3 receptors and actions in human prostate cancer cell lines. Endocrinology 132(5): 1952-1960. Smith DS, Catalona WJ, Herschman JD (1996). Longitudinal screening of prostate cancer with prostate specific antigen. JAMA 1996; 276: 1309-1315. Studzinski G, Moore D (1995). Sunlight-Can it prevent as well as cause cancer. Cancer Res 55: 4014-4022. 104 | Referências Bibliográficas | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Stuehr DJ, Nathan CF (1989). Nitric oxide, a macrophage product responsible for cytostasis and respiratory inhibition of tumor target cells. J Exp Med 169: 1543-1548. Strange RC and Fryer AA (1999). The glutathione S-transferases: influence of polymorphism on cancer susceptibility. In Vineis P, Malats N, Lang M, d’Errico A, Caporaso N, Cuzick J and Boffetta P (eds) Metabolic Polymorphisms and Susceptibility to Cancer. IARC Scientific Publications 148, Lyon,pp 231-249. Strange RC, Spiteri M, Ramachandran S et al (2001). Glutathione-S-transferase family of enzymes. Mut Res 482: 21-26. Suzuki T, Coggan M, Shaw DC, et al (1987). Electrphoretic and immunological analysis of human glutathione S-transferase isozymes. Ann Hum Genet 51: 95-106. T Tanaka NG, Tohgo A, Ogawa H (1986). Platelet-aggregating activities of metastasising tumor cells. V. In situ roles of platelets in hematogenous metastases. Invasion metastases 6: 209-24. Taylor JA, Hirvonen A, Watson M, et al (1996). Association of prostate cancer with vitamin D receptor gene polymorphism. Cancer Res. 56(18): 4108-10. Taymans SE, Pack S, Pak E, et al (1999). The human vitamin D receptor gene (VDR) is localized to region 12cen-q12 by fluorescent in situ hybridization and radiation hybrid mapping: genetic and physical VDR map. J Bone Miner Res 14(7): 1163-6. Terry P, Lichtenstein P, Feychting M, et al (2001). Fatty fish consumtion and risk of prostate cancer. Lancet 357: 1764-1766. Tsukada T, Yokoyama K, Arai T, et al. (1998). Evidence of association of the ecNOS gene polymorphism with plasma NO metabolite levels in humans. Biochem Biophys Res Com 245: 190-193. Tsuruo T, Kawabata H, Iida H and Yomori T (1986). Tumor-induced platelet aggregation and growth promoting factors as determinants for successful metastasis. Clin Exp Metastasis 7: 25-30. Tuohimaa P, Lyakhovich A, Aksenov N, et al (2001). Vitamin D and prostate cancer. J Steroid Biochem Mol Biol 76(1-5): 125-34. V Vasconcelos A, Medeiros R, Veiga I, et al (2002). Analysis of Estrogen Receptor Polymorphism in Codon 325 by PCR-SSCP in Breast Cancer: Association with Lymph Node Metastasis. Breast J (aceite para publicação). Vineis P (1997). Low-dose carcinogenesis and dietary exposures. Eur J Cancer Prev 6: 147-151 Referências Bibliográficas | 105 Polimorfismos Genéticos, Susceptibilidade para Cancro da Próstata e Risco de Metastização | W Wang B, Xiong Q, Shi Q, et al (2001). Intact nitric oxide synthase II gene is required for interferonbeta-mediated suppression of growth and metastasis of pancreatic adenocarcinoma. Cancer Res 61: 71-75. Wang B, Xiong Q, Shi Q, et al. (2001). Genetic disruption of host nitric oxide synthase II gene impairs melanoma-induced angiogenesis and suppresses pleural effusion. Int J Cancer 91: 607-611. Wang HH, McIntosh AR, Hasinoff BB, et al (2000). B16 melanoma cell arrest in the mouse liver induces nitric oxide release and sinusoidal cytotoxicity: a natural hepatic defense against metastasis. Cancer Res 60: 5862-5869. Wang MC, Valenzuela LA, Murphy GP, et al (1979). Purification of a human prostate specific antigen. Investig. Urol 17: 159-163. Wang XL, Sim AS, Badenhop RF, et al (1996). A smoking-dependent risk of coronary artery disease associated with a polymorphism of the endothelial nitric oxide synthase gene. Nat Med 2: 41-45. Ware J (1994). Prostate cancer progression; Implications of histopathology. Am J Pathol 145; 983-993. Watanabe M, Fukutome K, Murata M, et al (1999). Significance of vitamin D receptor gene polymorphism for prostate cancer risk in Japanese. Anticancer Res 19(5): 4511-4. Webber M, Waghray A, Bello D et al (1995). Prostate-specific antigen, a serine protease, facilitates human prostate cancer cell invasion. Clin Cancer Res 1: 1089-1094. Weiss L (1992). Biomechanical interactions of cancer cells with the microvasculature during hematogenous metastasis. Cancer Metastasis Rev 11: 227-230. Welch DR, Rinker-Schaeffer CW (1999). What defines a useful marker of metastasis in human cancer. J Natl Cancer Inst 91(16): 1351-3. Wink DA, Hanbauer I, Grisham MB, et al (1996). Chemical biologyof nitric oxide: regulation and protective and toxic mechanisms. Curr Top Cell Regul 34: 159-87. Winter J, Janssen P, Sleddens H, et al (1994). Androgen receptor status in localized and locally progressive hormone refractory human prostate cancer. Cancer Res 54; 6061-6064. X Xie X, and Ott J (1993). Testing linkage disequilibrium between a disease gene and a marker loci. Am J Hum Genet 53: 1107. Xue WM, Coetzee GA, Ross RK, et al (2001). Genetic determinants of serum prostate-specific antigen levels in healthy men from a multiethnic cohort. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 10, 575-9. Xue WM, Irvine R, Yu MC, et al (2000). Susceptibility to prostate cancer: interaction between genotypes at the androgen receptor and prostate-specific antigen loci. Cancer Res 60: 839-841. 106 | Referências Bibliográficas | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica Y Yang QF, Sakurai T, Shan L, et al (2000). Novel polymorphisms of prostate-specific antigen (PSA) gene associated with PSA mRNA expression in breast cancer. J Hum Genet 45: 363-366. Yang Q, Shan L, Segawa N, et al (2001). Novel polymorphisms in prostate specific antigen gene and its association with prostate cancer. Anticancer Res 21: 197-200. Yengi L, Inskip A, Gilford J et al (1996). Polymorphism at the glutathione S-transferase locus GSTM3: interactions with cytochrome P450 and glutathione S-transferase genotypes as risk factors for multiple cutaneous basal cell carcinoma. Cancer Res 56: 1974-1977. Yoon Y, Song J, Hong S, et al. (2000). Plasma nitric oxide concentrations and nitric oxide synthase gene polymorphisms in coronary artery disease. Clin Chem 46: 1626-1630. Young CY, Seay T, Hogen K, et al (1996). Prostate-specific human kallikrein (hK2) as a novel marker for prostate cancer. Prostate Suppl 7: 17-24. Z Zagars G, Eschenbach A, Ayala A (1993). Prognostic factors in prostate cancer. 72: 1709-1725. Zhong S, Howie AF, Ketterer B, et al (1991). Glutathione S-transferase mu locus: use of genotyping and phenotyping assays to assess association with lung cancer susceptibility. Carcinogenesis 12: 1533-1537. Zhong S, Wyllie AH, Barnes D, et al (1994). Relationship between GSTM1 genetic polymorphism and susceptibility to bladder, breast and colon cancer. Carcinogenesis 14: 1821-1824. Zlotta AR, Schulman CC (1999). Clinical evolution of prostatic intraepithelial neoplasia. Eur Urol 35: 498-503. Referências Bibliográficas | 107 8. Resumo | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica 8. RESUMO Foi objectivo deste estudo a análise de polimorfismos genéticos que possam influenciar o desenvolvimento do cancro da próstata, nos seguintes genes: PSA ARE1, VDR TaqI, ecNOS (ecNOS4 a/b e Glu-Asp298), GSTM1, GSTM3 e GSTT1. Foi realizado um estudo caso-controlo na população portuguesa. O DNA genómico foi isolado a partir do sangue periférico de 163 casos de homens con cancro da próstata e 211 controlos. A análise para os genótipos da frequência PSA ARE1, indicou que os individuos portadores de homozigotia para o alelo A apresentam um risco elevado para o desenvolvimento de cancro da próstata antes dos 67 anos (OR=2.92, 95%CI 1.10-7.86; p=0.013), níveis mais elevados de PSA sérico (p=0.027) e associação com a presença de células tumorais circulantes (p=0.018). Relativamente aos genótipos VDR TaqI observamos que o alelo T está associado com a susceptibilidade para cancro da próstata após os 66 anos de idade (OR=2.36, 95%CI 1.05-5.29; p=0.036). A análise dos polimorfismos ecNOS demonstrou que os portadores da combinação do alelo a (genótipos aa e ab da ecNOS4 a/b), com o alelo T (genótipos GT e TT from Glu-Asp298) apresentam um risco elevado para cancro da próstata (OR=3.13; 95%CI 1.416.91, p=0.004) e os genótipos ecNOS4 a/b com o alelo a estão associados com a presença de células tumorais circulantes em homens com cancro da próstata e idade abaixo dos 67 anos (p=0.003). A contribuição dos polimorfismos genéticos na susceptibilidade para cancro da próstata poderá depender da população em estudo e da sua localização geográfica. A definição de um perfil genético de risco poderá ser importante na definição de estratégias de quimioprevenção. Resumo | 111 9. Summary | A Epidemiologia Molecular no Caminho da Farmacogenómica 9. SUMMARY In this study we analysed genetic polymorphisms that may have influence the development of prostate cancer. We studied polymorphisms in the following genes: PSA ARE1, VDR TaqI, ecNOS (ecNOS4 a/b e Glu-Asp298), GSTM1, GSTM3 e GSTT1. We have conducted a case-control study in the portuguese population (Genomic DNA was extracted in a total number of blood samples:163 cases with prostate cancer and 211 controls. The analysis of the frequencies for PSA ARE1 genotypes from 556 alleles indicates that men carrying two A-alleles have increased risk for PC onset under the age of 67 (OR=2.92, 95%CI 1.10-7.86; p=0.013). Furthermore, the homozygozity for the A-allele was associated to higher serum PSA levels (p=0.027) and with the presence of circulating tumour cells (CTCs) in the blood of PC patients (p=0.018). Regarding VDR Taq I genotypes, we found that T allele is associated to risk of prostate cancer onset in men over the age of 66 (OR=2.36, 95%CI 1.05-5.29; p=0.036). Considering ecNOS genotypes, we found that carriers with the combination of the a-allele (aa and ab ecNOS4 a/b genotypes), and T-allele (GT and TT from Glu-Asp298) have a 3-fold increase in prostate cancer risk (OR=3.13; 95%CI 1.41-6.91, p=0.004). Genotypes presenting the a allele (ab/aa) were also associated to the presence of CTCs in the blood of PCa under the age of 67 years (p=0.003). The contribution of genetic polymorphism to prostate cancer susceptibility might depend on the population studied and its geographic localization. The definition of a genetic risk profile might me useful in the definition of strategies for chemoprevention. Summary | 115 10. Artigos Linkage Between Polymorphisms in the Prostate Specific Antigen AREI Gene Region, Prostate Cancer Risk, and Circulating Tumor Cells Rui Medeiros, António Morais, André Vasconcelos, Sandra Costa, Daniela Pinto, Jorge Oliveira, Rodrigo Carvalho and Carlos Lopes The Prostate 53: 88-94 (2002) The role of vitamin D receptor gene polymorphisms in the susceptibility to prostate cancer of a southern European population Rui Medeiros, António Morais, André Vasconcelos, Sandra Costa, Daniela Pinto, Jorge Oliveira and Carlos Lopes J Hum Genet (2002) 47: 413-418 Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms and genetic susceptibility to prostate cancer R Medeiros, A Morais, A Vasconcelos, S Costa, D Pinto, J Oliveira and C Lopes European Journal of Cancer Prevention 2002: 11, 343-350 Endohelial nitric oxide synthase gene polymorphisms and the shedding of circulating tumour cells in the blood of prostate cancer patients Rui Medeiros, António Morais, André Vasconcelos, Sandra Costa, Susana Carrilho, Jorge Oliveira and Carlos Lopes Molecular diagnosis of prostate adenocarcinoma with emphasis on screening programs C Lopes and R. Medeiros Rev Esp Patol Diagnóstico molecular das micrometástases em doentes com adenocarcinoma da próstata R Medeiros, A Morais, J Oliveira, A Vasconcelos, S Carrilho, S Costa, C Campos, R Carvalho, and C Lopes Arquivos de Medicina vol. 15, Supl. 1, 2001 Metabolic Susceptibility Genes and Prostate Cancer Risk in a Southern European Populations: The Role of Glutathione S-Transferases GSTMI, GSTM3, and GSTTI Genetic Polymorphisms Rui Medeiros, André Vasconcelos, Sandra Costa, Daniela Pinto, Paula Ferreira, Francisco Lobo, António Morais, Jorge Oliveira, and Carlos Lopes The Prostate 58: 414-420 (2004) Doutoramento bem Sucedido: A TESE DO COELHO Num dia lindo e solarengo o coelho saiu de sua toca com o computador portátil e pôs-se a trabalhar, bem concentrado. Pouco depois passou por ali a raposa e viu aquele suculento coelhinho tão distraído, que chegou a salivar. No entanto, ficou intrigada com a actividade do coelho e aproximou-se, curiosa: - Coelhinho, o que está aí a fazer, tão concentrado? - Estou a redigir a minha tese de doutoramento - disse o coelho, sem tirar os olhos do trabalho. - Hummmm... e qual é o tema da sua tese? - Ah, é uma teoria que prova que os coelhos são os verdadeiros predadores naturais das raposas. A raposa ficou indignada: - Ora!!! Isso é ridículo!!! Nós é que somos os predadores dos coelhos! - De forma nenhuma! Venha comigo à minha toca que eu apresento-lhe a minha demonstração experimental. O coelho e a raposa entram na toca. Poucos instantes depois ouvem-se alguns ruídos indecifráveis, alguns poucos grunhidos e por fim silêncio. Em seguida, o coelho regressa, sozinho, e mais uma vez retoma os trabalhos da sua tese, como se nada tivesse acontecido. Meia hora depois passa um lobo. Ao ver o apetitoso coelhinho, tão distraído, agradece mentalmente à cadeia alimentar por estar com o seu jantar garantido. No entanto, o lobo também acha muito curioso ver um coelho a trabalhar com aquela concentração toda. O lobo resolve então saber do que se trata aquilo tudo, antes de devorar o coelhinho: - Olá, jovem coelhinho! O que o faz trabalhar tão arduamente? - É a minha tese de doutoramento, senhor lobo. É uma teoria que tenho vindo a desenvolver há algum tempo e que prova que nós, coelhos, somos os grandes predadores naturais de vários animais carnívoros, inclusive dos lobos. O lobo não se contém e farfalha de risos com a petulância do coelho. - Ah, ah, ah, ah!!! Coelhinho! Apetitoso coelhinho! Isto é um despropósito. Nós, os lobos, é que somos os genuínos predadores naturais dos coelhos. Alias, chega de conversa... - Desculpe-me, mas se quiser eu posso-lhe apresentar a minha demonstração experimental. Gostaria de acompanhar-me à minha toca? O lobo não consegue acreditar na sua boa sorte. Ambos desaparecem toca adentro. Alguns instantes depois, ouvem-se uivos desesperados, ruídos de mastigação e ... silêncio. Mais uma vez, o coelho regressa sozinho, impassível, e volta ao trabalho de redacção da sua tese, como se nada tivesse acontecido. Dentro da toca do coelho, vê-se uma enorme pilha de ossos ensanguentados e pelancas de diversas ex-raposas e, ao lado desta, outra pilha ainda maior de ossos e restos mortais daquilo que um dia foram lobos. Ao centro das duas pilhas de ossos, vê-se um LEÃO enorme , satisfeito, bem alimentado, a palitar os dentes. MORAL DA HISTORIA: 1. não importa quão absurdo é o tema de sua tese; 2. não importa se você não tem o mínimo fundamento cientifico; 3. não importa se as seus experiências nunca chegarem a provar a sua teoria; 4. não importa nem mesmo se suas ideias vão contra o mais óbvio dos conceitos lógicos... 5. O que importa, mesmo, é QUEM É O SEU ORIENTADOR........