Caracterização de Proteínas Alergênicas de Ricinus Communis (mamona) Identificação de Epitopos Alergênicos Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos LQFPP/CBB/UENF Alérgenos de Mamona Podem ser encontrados no Pólen e nas sementes As plantas apresentam um período de floração longo; logo os alérgenos podem estar espalhados no ar por diversas épocas do ano Cultivo não controlado (dificilmente o plantio ficaria restrito a uma uma pequena área) CB-1A ou Albuminas 2S Proteínas de massa molecular ~12 kDa pI ~ 4,0 a 9,5 Alergia provocada por mamona – Hipersensibilidade do Tipo I Hipersensibilidade imediata ou anafilática A reação pode envolver a pele (urticária e eczema), olhos (conjuntivite), alergia respiratória, edema de glote A reação alérgica pode causar vários sintomas de menor inconveniência até a morte A reação normalmente ocorre 15 - 30 minutes após a exposição ao antígeno, podendo ocorrer até 10 - 12 horas após. Monitoramento do estado de saúde (presença de IgE anti albuminas 2S) dos trabalhadores rurais e das populações vizinhas às áreas de plantio e manipulação da torta Brasil “ Causos” ?????? Artigos Científicos abordando alérgenos de mamona- 25 artigos nos últimos 50 anos (Web of science, maio 2005). Marcelle, França - Thorpe e col., 1988 Índia - 9 a 43% - diferenças devido ao critério de escolha dos pacientes e tipo de teste realizado Singh et al. , 1989 Em Málaga, Espanha - 7.7% pacientes mostraram “prick test” positivo para alérgenos de mamona (pacientes com rinite, outros com rinite e asma e outros só com asma). García-González e col, 1999 Alérgenos de Ricinus communis Conjunto de alérgenos - CB1-A- Spies & Coulson, 1943 Albuminas 2S - Youle e Yang, 1978 Ric c 1 Li e colaboradores,1977 e Sharief & Li, 1982 RC-13 Trugo e col., 1984 albumina 2S - Ric c 2 - cristalóide 11S Thorpe e col., 1988 Antígeno 5.1 - Costa- Silva e col.,1991 Ric c 3 - Machado e Silva Jr, 1992 e Silva júnior et al, 1996 Ric c 3 i Marcondes, J A, 1997 Processamento do Precursor das Albuminas 2S Massa Molecular das Isoformas de Albuminas 2S SDS-PAGE SDS kDa 66 29 14 Por SDS-PAGE 12.000 e Pela composição em AA 11.235 Separação das isoformas de albuminas 2S PAGE-disc das frações de albumina 2S obtidas por PAGE-preparativa Grupos de isoformas de albuminas 2S de mamona Fraction R (relative mobility under native PAGE) Retention Time - C4-RP (min) Partial N-terminal Sequence II 0,68 many fractions N.D. (fraction not purified) III 0,52 0,54 0,56 10 9 15 DSKEEREGQQ - IV 0,52 10 ESKGEREGSSSQQCR V 0,40 10 and 12 VI 0,39 10 VII 0,27 10 and 22 ESKGEREGQQQQQCR GEREGSSSQQCR 1SKEESEGGQQXQQQQERQSQ17 18GEREGSSSQQCRQEVQRK35 VIII 0,26 15 N.D. (probably blocked) IX 0.14 0,26 5 15 N.D. (fraction not purified) X 0,14 5 PSSQQGCRGQIQEQQNLR Machado e col. 2003 A hipersensibilidade imediata é mediada por IgE. Os componentes celulares principais na hipersensibilidade são os mastócitos ou os basófilos. Indução e Mecanismos efetores de Hipersensibilidade do Tipo I Epitopos: contínuo e descontínuo Anticorpo A Epitopo descontínuo Epitopo contínuo Anticorpo B Verificação da presença de Epitos lineares Separação das cadeias de Albuminas 2s de Ric c1 e de Ric C-3 B A Cromatografia de fase reversa C18 – HPLC : A- Separação das cadeias de Ric c 1 e B - Separação das cadeias de Ric c 3 Verificação da alergenicidade por desgranulação de mastócitos A B Mastócitos íntegros. Mastócitos desgranulados C D Análise de frações que desgranulam mastócitos Fração Albuminas % desgranulação 74 Ric c 1 77 Ric c 3 80 Fração Ric c 1 Cadeia leve Ric c 1 cadeia pesada Ric c 3 Cadeia leve Ric c 3 cadeia pesada % desgranulação 77 67 73 68 2S albumin Precursor SFAYRRRITTIEIDESKGER 2 0 EGSSSQQCRQEVQRKDLSSC 4 0 ERYLRQSSSRRSTGEEVLRM 6 0 PGDENQQQESQQLQQCCNQV 8 0 KQVRDECQCEAIKYIAEDQI 100 QQGQLHGEESERVAQRAGEI 120 VSSCGVRCMRQTRTNPSQQG 140 CRGQIQEQQNLRQCQEYIKQ 160 QVSGQGPRRSDNQERSLRGC 180 CDHLKQMQSQCRCEGLRQAI 200 EQQQSQGQLQGQDVFEAFRT 220 AANLPSMCGVSPTSRF 237 Ric c 3 cadeia leve resíduos 18 a 50 Cadeia pesada resíduos 66 a 131 Ric c 1 cadeia leve resíduos 136 a 169 Cadeia pesada resíduos 173 a 237 Peptideos sintéticos % de desgranulação P1 - Resíduos 1 a 15 Ric c 3 leve 68 P2 - Resíduos 16 a 31. Ric c 3 leve 70 P5 - Resíduos 40 a 54. Ric c 3 pesada 69 P4 - Resíduos 20 a 39 Ric c 3 pesada 69 P3 - Resíduos 11 a 24. Ric c 1 leve 70 P0 - Resíduos 22 a 40. Ric c 1 pesada 70 Avaliação da resposta cruzada entre Alérgenos Alérgenos alimentares Alérgenos Inalantes Reações cruzadas entre substâncias alergênicas Alimento % Desranulação Alimento % Desranulação Aves 38.5 Morango 40.7 Camarão 53.8 Trigo 46.7 Carne bovina 31.5 Soja 62.5 Carne suína 40.3 Pimenta X Clara 40.5 Abacaxi 36.5 Tomate 41.3 Cacau 46.0 Gema 38.0 Cajú 34.4 Leite 47.0 Amendoim 51.4 Peixes 57.6 Laranja 39.1 Arroz 29.9 Limão 36.2 Glúten 43.7 Milho 46.0 Inantes % Desranulação Inantes % Desranulação Poeira domiciliar 51.4 Epitélio mix 44.0 Ácaros 35.4 Penas mix 33.8 Fungos do ar 46.7 Algodão 37.5 Lã 41.3 Crina 40.2 Gramínea 47.1 Capim 35.2 Flores 44.0 Linha 41.6 Tabaco 55.0 Macela 65.9 Epitélios de gato 41.0 Barata 32.8 Epitélio de cão 44.3 Pireto 36.3 Epitélio de eqüino 34.8 Seda 32.5 Epitélio bovino 44.0 Taboa 27.1 -Edital CT-AGRO/MCT/CNPq nº 08/2005 \Tema 2 – Utilização Econômica de Resíduos, Proc. No 551357/2005-3 -Determinação do perfil de IgE- dos trabalhadores que manipulam mamona FAPERJ APQ1 E-26/170.970/2004 Monitoramento dos níveis de albuminas 2S em amostras diversas de pólen em diversos períodos do ano ???? Identificação de Epitopos comuns em diversos alérgenos Medida dos níveis de IgE sorológicos dirigidos contra cada componente Seleção dos componentes “cross reactive” que possuem os principais IgEepitopos para a terapia Desenvolvimento de vacinas – Hipossensibilização com peptídeos ?????? Perspectivas Recursos 02 Bolsas tecnorte EMBRAPA MP1-Mamona-2005 Dr. José L. R. Ascheri X Obrigada ! Viviane Veiga do Nascimento Jucélia de Araújo Giuli Alexandra Martins S. Soares Thiago Freitas de Souza Fábio Maciel Shayany Pinto Felix Camila Carriello Gama Natália de Deus Hélio Rafaela Mayerhoffer Diego Medina Igor Dr. Renato A. Damatta [email protected]