GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO
SECRETARIA DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA E DESENVOLVIMENTO ECONÔMICO
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
Dissertação de Mestrado
BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL POR Candida
guilliermondii EM HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA:
ESTUDO DO EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO
Débora Danielle Virgínio da Silva
Lorena – SP - Brasil
2001
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL POR Candida
guilliermondii EM HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA:
ESTUDO DO EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO
Dissertação de Mestrado apresentada
como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em
Biotecnologia Industrial.
Banca Examinadora:
Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe, FAENQUIL (Presidente)
Dra. Rosa Helena Lucchese, UFRRJ
Dr. Ismael Maciel de Mancilha, FAENQUIL
Estudante:
Débora Danielle Virgínio da Silva
Lorena – SP - Brasil
2001
Ficha Catalográfica
Elaborada pela Biblioteca do Departamento de
Biotecnologia da FAENQUIL
SILVA, Débora Danielle Virgínio da
S586b
Bioconversão de xilose em xilitol por Candida guilliermondii
em hidrolisado de bagaço de cana: estudo do efeito do ácido
acético / Débora Danielle Virgínio da Silva. – Lorena, 2001.
73p.
Dissertação (mestrado) – Faculdade de Engenharia Química
de Lorena. Departamento de Biotecnologia.
Orientadora: Felipe, Maria das Graças de Almeida
1. Biotecnologia – 2. Candida guilliermondii – 3. Xilitol –
4. Ácido acético – 5. Bagaço de cana-de-açúcar I. Título
II. Felipe, Maria das Graças de Almeida, orientadora.
576.6
CDU
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL POR Candida
guilliermondii EM HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA:
ESTUDO DO EFEITO DO ÁCIDO ACÉTICO
Este exemplar corresponde à versão
final da Dissertação de Mestrado
aprovada pela banca examinadora
___________________________________________
Drª. Maria das Graças de Almeida Felipe
Orientadora e Presidente da Banca Examinadora
Lorena, - SP- Brasil
2001
AGRADECIMENTOS
À Profª. Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe pela confiança, amizade
e pela dedicação e paciência com as quais me orientou durante o
desenvolvimento deste trabalho.
Ao Departamento de Biotecnologia e à Faculdade de Engenharia Química
de Lorena.
À Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo
apoio financeiro.
A todos os professores e funcionários do Departamento de Biotecnologia
(DEBIQ), pela colaboração e agradável convivência.
À Rita de Cássia L. B. Rodrigues pela amizade e pelo grande auxílio
durante a realização dos experimentos.
A todos os amigos do DEBIQ pelo companheirismo, pelo incentivo e pelo
agradável convívio dentro e fora dos laboratórios.
À minha família pelo carinho e grande incentivo.
RESUMO
Bioconversão de Xilose em Xilitol por Candida guilliermondii em Hidrolisado
de Bagaço de Cana: Estudo do Efeito do Ácido Acético. Débora Danielle
Virgínio da Silva. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia, Faculdade de
Engenharia Química de Lorena. Orientadora: Dra. Maria das Graças de Almeida
Felipe (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, C.P.116, 12600-970, Lorena,
SP, Brasil). Banca Examinadora: Dra. Rosa Helena Luchese e Dr. Ismael Maciel
de Mancilha. Maio de 2001.
Um grande número de pesquisas sobre o aproveitamento do bagaço de
cana-de-açúcar visa o desenvolvimento de um processo biotecnológico de
obtenção de xilitol, adoçante não cariogênico, indicado para obesos e diabéticos.
Para a eficiência desse bioprocesso o hidrolisado de bagaço deve conter baixos
teores de compostos tóxicos, em particular de ácido acético, que inibe a atividade
microbiana dependendo do grau de sua concentração no meio. No presente
trabalho avaliou-se a influência do ácido acético na bioconversão de xilose em
xilitol por Candida guilliermondii FTI 20037 em hidrolisado hemicelulósico de
bagaço de cana-de-açúcar durante as várias fases de crescimento da levedura.
Inicialmente foram realizados ensaios experimentais, em frascos agitados, para a
melhoria do tratamento do hidrolisado visando a redução da concentração de
compostos tóxicos. Em seguida foi avaliada a forma de suplementação nutricional
do hidrolisado com farelo de arroz. De acordo com os resultados, o tratamento do
hidrolisado após sua concentração a vácuo favoreceu a formação do xilitol sendo
a produtividade máxima de xilitol de 0,51 g/L.h obtida após 54h. Concluiu-se que
a suplementação do meio com farelo de arroz deve ser feita autoclavando-se a
solução de farelo separadamente. Para o processo de fermentação foram
utilizados frascos sob agitação, nos quais foi colocado hidrolisado tratado e
suplementado com nutrientes. Nas diferentes fases do crescimento microbiano
adicionou-se ácido acético, até que sua concentração no meio atingisse cerca de
5,0g/L. Decorridas 54h de fermentação, verificou-se que com a adição de ácido
acético ao hidrolisado após as primeiras 12 horas (fase de maior atividade
metabólica da levedura) o rendimento, a produtividade do xilitol e o consumo de
ácido acético pela levedura diminuíram em 41,82%, 53,85%, 40,09%,
respectivamente. No entanto, a adição de ácido após 48h, bem como no início do
processo praticamente não interferiu na formação de xilitol. Por meio de
experimentos em que o hidrolisado foi substituído por meio semi-sintético
contendo os mesmos níveis de concentração de açúcares e de ácido acético
confirmou-se a hipótese de que o efeito do ácido acético sobre a bioconversão de
xilose em xilitol depende da fase de crescimento da levedura. Observou-se que é
possível a potencialização de sua toxicidade pela presença de outros compostos
tóxicos no hidrolisado. Verificou-se também que o cultivo do inóculo em meio com
elevada concentração de ácido acético favoreceu a bioconversão nas primeiras
12h de fermentação, em função do máximo valor de rendimento (0,70g/g) obtido.
iv
ABSTRACT
Xylose-Xylitol Bioconversion by Candida guilliermondii in Sugarcane
Bagasse Hydrolysate: Study of the Acetic Acid Effect
Xylitol is an anticariogenic sweetener suitable for diabetics and obese
people . A number of researches on xylitol bioconversion have been carried out
employing sugarcane bagasse as substract. An important requirement for the
efficiency of this bioprocess is a bagasse hydrolysate with low concentrations of
toxic compounds, mainly acetic acid, which inhibits the microbial activity when
highly concentrated. This study evaluates the influence of the acetic acid on the
xylose-xylitol bioconversion by Candida guilliermondii FTI 20037 in sugarcane
bagasse hemicellulosic hydrolysate during the various phases of the yeast growth.
Firstly, experimental assays were carried out in flasks under agitation, aiming to
find the best hydrolysate treatment to reduce the amount of toxic compounds.
Secondly, nutritional supplementation of the hydrolysate with rice bran were
evaluated. According to the results, the xylitol production was improved when the
hydrolysate was treated after its vacuum concentration. The maximum xylitol
productivity (0,51g/L.h) was obtained after 54h. It was concluded that the medium
should be supplemented with rice bran by autoclaving the bran solution separately
from the hydrolysate. For the fermentation process, flasks under agitation,
containing treated hydrolysate supplemented with nutrients were employed. Acetic
acid was added to the medium during the microbial growth, until reaching a
concentration of around 5.0g/L. After 54h of fermentation, it was observed that the
acetic acid addition to the hydrolysate after the first 12 hours (maximum metabolic
activity of the yeast), decreased the xylitol yield and productivity and the acetic
acid consumption by 41,82%, 53,85%, 40,09% respectively. However, the addition
of acid in the very beginning of the process and after 48h practically did not
interfere with the xylitol formation. Another experiment was performed replacing
the hydrolysate by synthetic medium, but using the same levels of sugars and
acetic acid concentration. The results of this experiment confirmed the hypothesis
that the effect of acetic acid on the xylose-xylitol bioconversion depends on the
yeast growth phases. They also suggested that the toxicity of the acetic acid can
be intensified by the presence of other toxic compounds in the hydrolysate.
Besides, the maximum yield (0.70g/g) attained after 12h of fermentation showed
that the bioconversion was improved by cultivating the inoculum previously in
medium with a high concentration of acetic acid.
v
CONTEÚDO
RESUMO............................................................................................................IV
ABSTRACT......... ...............................................................................................V
LISTA DE TABELAS.... ...................................................................................IX
LISTA DE FIGURAS..........................................................................................XI
1- INTRODUÇÃO....................................................................................................1
2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..............................................................................4
2.1- XILITOL: PROPRIEDADES E APLICAÇÕES .........................................................4
2.2- OBTENÇÃO DE XILITOL..............................................................................5
2.2.1- Via Química de Obtenção.........................................................................6
2.2.2- Via Microbiológica de Obtenção ...............................................................7
2.2.3- Fatores que Influenciam a Bioconversão de Xilose em Xilitol.................10
2.3-
FERMENTAÇÃO
DE
HIDROLISADOS
HEMICELULÓSICOS
PARA
OBTENÇÃO DE XILITOL ......................................................................................12
2.3.1- Inibidores do Metabolismo Microbiano ...................................................12
2.3.2- Toxicidade do Ácido Acético...................................................................13
2.4- MATÉRIAS-PRIMAS PARA A OBTENÇÃO MICROBIOLÓGICA DE XILITOL
..........................................................................................................................16
2.4.1- Bagaço de Cana-de-Açúcar....................................................................18
3- MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................19
3.1- OBTENÇÃO E PREPARO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE
BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR ....................................................................19
3.1.1- Hidrólise Ácida........................................................................................19
3.1.2- Caracterização, Tratamento e Concentração do Hidrolisado .................19
3.2- MICRORGANISMO E PREPARO DO INÓCULO .......................................20
3.3- MEIO E CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO...............................................21
3.3.1- Avaliação da Seqüência de Realização das Etapas de Tratamento e
Concentração do Hidrolisado............................................................................21
3.3.2- Avaliação da Forma de Suplementação Nutricional do Hidrolisado com
Farelo de Arroz .................................................................................................21
vi
3.3.3- Avaliação do Efeito do Ácido Acético Sobre Bioconversão de Xilose em
Xilitol em Hidrolisado de Bagaço ......................................................................22
3.3.4- Avaliação do Efeito do Ácido Acético Sobre a Bioconversão de Xilose em
Xilitol em Meio Simulando a Composição do Hidrolisado .................................22
3.3.5- Avaliação do Cultivo do Inóculo em Meio Contendo Concentrações
Crescentes de Ácido Acético Como Forma de Minimizar a Toxicidade do
Hidrolisado Durante a Fermentação .................................................................23
3.4- MÉTODOS ANALÍTICOS ...........................................................................24
3.4.1- Viabilidade e Pureza da Cultura .............................................................24
3.4.2- Determinação da Concentração Celular .................................................24
3.4.3- Determinação da Concentração de Açúcares e Ácido acético ...............24
3.4.4- Determinação da Concentração de Furfural e Hidroximetilfurfural .........25
3.4.5- Determinação da Concentração de Fenóis.............................................25
3.4.6- Determinação do pH ...............................................................................25
3.5- DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS FERMENTATIVOS .....................26
3.5.1- Fator de Conversão de D-xilose em Xilitol (Y p/s)....................................26
3.5.2- Produtividade Volumétrica de Xilitol (Qp) ................................................26
3.5.3- Eficiência de Conversão (η)....................................................................26
3.6- ANÁLISE ESTATÍSTICA.............................................................................26
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................27
4.1- CARACTERIZAÇÃO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO ..................27
4.2- AVALIAÇÃO DA SEQÜÊNCIA DE REALIZAÇÃO DAS ETAPAS DE
TRATAMENTO E CONCENTRAÇÃO DO HIDROLISADO ..............................28
4.3- AVALIAÇÃO DA FORMA DE SUPLEMENTAÇÃO NUTRICIONAL DO
HIDROLISADO COM FARELO DE ARROZ.......................................................34
4.4-
AVALIAÇÃO
DO
EFEITO
DO
ÁCIDO
ACÉTICO
SOBRE
A
BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL EM HIDROLISADO DE BAGAÇO 39
4.5-
AVALIAÇÃO
DO
EFEITO
DO
ÁCIDO
ACÉTICO
SOBRE
A
BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL EM MEIO SIMULANDO A
COMPOSIÇÃO DO HIDROLISADO ..................................................................47
4.6- AVALIAÇÃO DO CULTIVO DO INÓCULO EM MEIO CONTENDO
CONCENTRAÇÕES CRESCENTES DE ÁCIDO ACÉTICO COMO FORMA DE
vii
MINIMIZAR A TOXICIDADE DO HIDROLISADO DURANTE A FERMENTAÇÃO
..........................................................................................................................55
5- CONCLUSÕES.................................................................................................60
6- SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS...............................................62
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................63
viii
LISTA DE TABELAS
TABELA I- COMPARAÇÃO DOS VALORES DE RENDIMENTO (YP/S) E PRODUTIVIDADE (QP)
DO XILITOL DURANTE CULTIVO DE C. GUILLIERMONDII EM HIDROLISADO DE BAGAÇO DE
CANA-DE-AÇÚCAR .............................................................................................14
TABELA II- COMPOSIÇÃO DE VÁRIOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS .........................17
TABELA III- CARACTERÍSTICAS
DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE
CANA-DE-AÇÚCAR .............................................................................................27
TABELA IV- CARACTERÍSTICAS
DE HIDROLISADOS HEMICELULÓSICOS DE BAGAÇO DE
CANA-DE-AÇÚCAR OBTIDOS PELO MESMO PROCESSO DE HIDRÓLISE ÁCIDA EM
DIFERENTES TRABALHOS ...................................................................................28
TABELA V- CARACTERÍSTICAS DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANADE-AÇÚCAR APÓS AS ETAPAS DE TRATAMENTO E CONCENTRAÇÃO ........................29
TABELA VI- REMOÇÃO
ANTERIOR
(H1)
DE COMPOSTOS TÓXICOS
OU
POSTERIOR
(H2)
À
(%)
CONCENTRAÇÃO
HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
TABELA VII- CONCENTRAÇÃO (G/L)
EM FUNÇÃO DO TRATAMENTO
DO
HIDROLISADO
............................................30
E CONSUMO DE ARABINOSE
(%)
DURANTE AS
FERMENTAÇÕES DE HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR SUBMETIDO AO
TRATAMENTO ANTERIOR (H1) E POSTERIOR (H2) À CONCENTRAÇÃO A VÁCUO
.......32
TABELA VIII- CONSUMO DE ÁCIDO ACÉTICO (%) POR C. GUILLIERMONDII E VARIAÇÃO DE
PH DURANTE AS FERMENTAÇÕES DE HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
SUBMETIDO AO TRATAMENTO ANTERIOR (H1) E POSTERIOR
(H2) À CONCENTRAÇÃO A
VÁCUO .............................................................................................................33
TABELA IX- PARÂMETROS
POR
C.
FERMENTATIVOS NA BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL
GUILLIERMONDII EM HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA SUBMETIDO AO
TRATAMENTO ANTERIOR (H1) E POSTERIOR (H2) À CONCENTRAÇÃO A VÁCUO
.......33
TABELA X- CARACTERÍSTICAS DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANADE-AÇÚCAR APÓS A ADIÇÃO DE FARELO DE ARROZ AUTOCLAVADO SEPARADO (H2) OU
JUNTO (F2) DO HIDROLISADO .............................................................................35
TABELA XI- CONCENTRAÇÃO (G/L)
FERMENTAÇÕES POR
C.
E CONSUMO
(%)
DE ARABINOSE DURANTE AS
GUILLIERMONDII DE HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA-DE-
AÇÚCAR AUTOCLAVADO SEPARADO (H2) OU JUNTO (F2) DO FARELO DE ARROZ
ix
.....36
TABELA XII- CONSUMO
FERMENTAÇÕES POR
DE ÁCIDO ACÉTICO
C.
(%)
E VARIAÇÃO DE PH DURANTE AS
GUILLIERMONDII DE HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA-DE-
AÇÚCAR AUTOCLAVADO SEPARADO (H2) OU JUNTO (F2) DO FARELO DE ARROZ
.....37
TABELA XIII- PARÂMETROS FERMENTATIVOS DURANTE A BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM
XILITOL POR
C.
GUILLIERMONDII EM HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
AUTOCLAVADO SEPARADO (H2) OU JUNTO (F2) DO FARELO DE ARROZ ..................37
TABELA XIV- CONSUMO (%)
FERMENTAÇÃO DE
C.
DE ÁCIDO ACÉTICO E VARIAÇÃO DO PH DURANTE
GUILLIERMONDII EM HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA-DE-
AÇÚCAR COM ADIÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO
(2,0
G/L) EM DIFERENTES TEMPOS DE
CULTIVO ...........................................................................................................46
TABELA XV- CONSUMO (%)
FERMENTAÇÃO DE
C.
DE ÁCIDO ACÉTICO E VARIAÇÃO DE PH DURANTE
GUILLIERMONDII EM MEIO SIMULANDO A COMPOSIÇÃO DO
HIDROLISADO COM ADIÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO
(2,0 G/L) EM DIFERENTES TEMPOS DE
CULTIVO ...........................................................................................................53
TABELA XVI- PARÂMETROS FERMENTATIVOS DURANTE A BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM
XILITOL POR
C. GUILLIERMONDII EM HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA COM ADIÇÃO
DE ÁCIDO ACÉTICO
C2, C3)
(2,0G/L) APÓS 12H DE CULTIVO, EM FUNÇÃO DOS INÓCULOS (C1,
OBTIDOS DE CÉLULAS CULTIVADAS EM CONCENTRAÇÕES CRESCENTES DE
ÁCIDO ACÉTICO.................................................................................................58
TABELA XVII- CONSUMO
DE ÁCIDO ACÉTICO
(%)
E VARIAÇÃO DE PH DURANTE AS
FERMENTAÇÕES DE HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA POR
ADIÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO
INÓCULOS(C1,
C2, C3)
(2,0G/L)
APÓS
12H
C. GUILLIERMONDII COM
DE CULTIVO EM FUNÇÃO DOS
OBTIDOS DE CÉLULAS CULTIVADAS EM CONCENTRAÇÕES
CRESCENTES DE ÁCIDO ACÉTICO ........................................................................59
x
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - PRODUÇÃO DE XILOSE E XILITOL ..............................................................6
FIGURA 2 - VIAS DE UTILIZAÇÃO DE XILOSE POR BACTÉRIAS E LEVEDURAS ....................7
FIGURA 3 - METABOLISMO
DE XILOSE E GLICOSE EM LEVEDURAS FERMENTADORAS DE
XILOSE ...............................................................................................................9
FIGURA 4 - MECANISMO
DE ACIDIFICAÇÃO DO CITOPLASMA PELA FORMA NÃO
DISSOCIADA DO ÁCIDO ACÉTICO .......................................................................155
FIGURA 5 - CONSUMO
DE XILOSE
(%)
POR
C.
GUILLIERMONDII DURANTE AS
FERMENTAÇÕES DE HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA SUBMETIDO
AO TRATAMENTO ANTERIOR E POSTERIOR À CONCENTRAÇÃO A VÁCUO. .................31
FIGURA 6 - FORMAÇÃO
DE XILITOL
(G/L)
POR
C.
GUILLIERMONDII DURANTE AS
FERMENTAÇÕES DE HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA SUBMETIDO
AO TRATAMENTO ANTERIOR E POSTERIOR À CONCENTRAÇÃO A VÁCUO. .................31
FIGURA 7 - CONSUMO
DE XILOSE
(%)
POR
C.
GUILLIERMONDII DURANTE AS
FERMENTAÇÕES DE HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA AUTOCLAVADO SEPARADO OU
JUNTO DO FARELO DE ARROZ .............................................................................35
FIGURA 8 - FORMAÇÃO
DE XILITOL
(G/L)
POR
C.
GUILLIERMONDII DURANTE AS
FERMENTAÇÕES DE HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA AUTOCLAVADO SEPARADO OU
JUNTO DO FARELO DE ARROZ .............................................................................36
FIGURA 9 - CONCENTRAÇÃO
DE XILOSE
HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA POR
ACÉTICO E COM ADIÇÃO DE
DE FERMENTAÇÃO.
C.
DURANTE AS FERMENTAÇÕES DE
GUILLIERMONDII SEM ADIÇÃO DE ÁCIDO
2,0G/L DESTE NOS TEMPOS INICIAL, 12, 24 E 48 HORAS
...........................................................................................39
FIGURA 10 - CONCENTRAÇÃO
DE ARABINOSE (G/L) DURANTE AS FERMENTAÇÕES DE
HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA POR
ACÉTICO E COM ADIÇÃO DE
DE FERMENTAÇÃO.
(G/L)
C.
GUILLIERMONDII SEM ADIÇÃO DE ÁCIDO
2,0 G/L DESTE NOS TEMPOS INICIAL, 12, 24 E 48 HORAS
...........................................................................................41
FIGURA 11 - CRESCIMENTO CELULAR E FORMAÇÃO DE XILITOL NAS FERMENTAÇÕES DE
HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA POR
C.
GUILLIERMONDII SEM ADIÇÃO DE ÁCIDO
ACÉTICO E COM A ADIÇÃO DE 2,0G/L DESTE NOS TEMPOS INICIAL,
12, 24 E 48 HORAS
DE INCUBAÇÃO. ................................................................................................43
xi
FIGURA 12 - RENDIMENTO
PRODUTIVIDADE
E
HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA POR
ACÉTICO E COM ADIÇÃO DE
DE FERMENTAÇÃO.
C.
DE XILITOL NAS FERMENTAÇÕES DE
GUILLIERMONDII SEM ADIÇÃO DE ÁCIDO
2,0 G/L DESTE NOS TEMPOS INICIAL, 12, 24 E 48 HORAS
...........................................................................................44
FIGURA 13 - CONCENTRAÇÃO
DE XILOSE (G/L) DURANTE AS FERMENTAÇÕES DE MEIO
SIMULANDO A COMPOSIÇÃO DO HIDROLISADO POR C. GUILLIERMONDII SEM ADIÇÃO DE
ÁCIDO ACÉTICO E COM ADIÇÃO DE
2,0 G/L DESTE NOS TEMPOS INICIAL, 12, 24 E 48
HORAS DE FERMENTAÇÃO..................................................................................47
FIGURA 14 - CONCENTRAÇÃO
DE ARABINOSE
(G/L)
NAS FERMENTAÇÕES DE MEIO
SIMULANDO A COMPOSIÇÃO DO HIDROLISADO POR C. GUILLIERMONDII SEM ADIÇÃO DE
ÁCIDO ACÉTICO E COM ADIÇÃO DE
2,0 G/L DESTE NOS TEMPOS INICIAL, 12H (, 24H E
48H DE FERMENTAÇÃO......................................................................................48
FIGURA 15 - CRESCIMENTO CELULAR E FORMAÇÃO DE XILITOL NAS FERMENTAÇÕES DE
MEIO SIMULANDO A COMPOSIÇÃO DO HIDROLISADO POR
C.
GUILLIERMONDII SEM
ADIÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO E COM ADIÇÃO DE 2,0G/L DESTE NOS TEMPOS INICIAL,
12,
24 E 48 HORAS DE INCUBAÇÃO. .........................................................................50
FIGURA 16 - RENDIMENTO
E
PRODUTIVIDADE
DE XILITOL DURANTE AS FERMENTAÇÕES
DE MEIO SIMULANDO A COMPOSIÇÃO DO HIDROLISADO POR
C.
GUILLIERMONDII SEM
ADIÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO E COM ADIÇÃO DE 2,0G/L DESTE NOS TEMPOS INICIAL, 12,
24 E 48 HORAS DE FERMENTAÇÃO. ....................................................................51
FIGURA 17 - CONSUMO
HIDROLISADO
E
HIDROLISADO POR
DE ÁCIDO ACÉTICO E ARABINOSE NAS FERMENTAÇÕES DE
DE
C.
MEIO
SEMI-SINTÉTICO
SIMULANDO
A
COMPOSIÇÃO
GUILLIERMONDII COM ADIÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO
(2,0G/L)
DO
EM
DIFERENTES TEMPOS DE FERMENTAÇÃO. ............................................................52
FIGURA 18 - CONSUMO (%)
DE XILOSE E ARABINOSE NAS FERMENTAÇÕES DE
HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA POR
C.
GUILLIERMONDII COM ADIÇÃO DE ÁCIDO
ACÉTICO (2,0G/L) APÓS 12H DE FERMENTAÇÃO, EM FUNÇÃO DOS INÓCULOS OBTIDOS
DE CÉLULAS CULTIVADAS EM MEIO SINTÉTICO
HIDROLISADO COM
3,5G/L
DE ÁCIDO
(C1), DE C1 SEGUIDO DO CULTIVO EM
(C2),
E
C2
SEGUIDO DO CULTIVO EM
HIDROLISADO COM 5,0G/L DE ÁCIDO (C3)...........................................................55
FIGURA 19 - CRESCIMENTO CELULAR DURANTE AS FERMENTAÇÕES DE HIDROLISADO DE
BAGAÇO DE CANA POR
APÓS
12H
C. GUILLIERMONDII COM
ADIÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO
(2,0G/L)
DE FERMENTAÇÃO, EM FUNÇÃO DOS INÓCULOS OBTIDOS DE CÉLULAS
CULTIVADAS EM MEIO SINTÉTICO, DE
C1 SEGUIDO DO CULTIVO EM HIDROLISADO COM
xii
3,5G/L DE ÁCIDO (C2) E C2 SEGUIDO DO CULTIVO EM HIDROLISADO COM 5,0G/L DE
ÁCIDO (C3). .....................................................................................................56
FIGURA 20 - FORMAÇÃO
DE XILITOL NAS FERMENTAÇÕES DE HIDROLISADO DE BAGAÇO
DE CANA POR C. GUILLIERMONDII COM ADIÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO (2,0G/L) APÓS 12H
DE FERMENTAÇÃO, EM FUNÇÃO DOS INÓCULOS OBTIDOS DE CÉLULAS CULTIVADAS EM
MEIO SINTÉTICO
(C1), DE C1 SEGUIDO DO CULTIVO EM HIDROLISADO COM 3,5G/L DE
ÁCIDO (C2) E C2 SEGUIDO DO CULTIVO EM HIDROLISADO COM 5,0G/L DE ÁCIDO (C3).
.......................................................................................................................57
xiii
1
1- INTRODUÇÃO
As pesquisas relacionadas ao uso sustentável da biomassa vegetal
aumentam a cada dia, possivelmente em conseqüência do aumento populacional
que por sua vez acaba gerando muitos problemas ambientais, já que a
necessidade de alimentos e espaço é também crescente. A liberação de grande
quantidade de resíduos florestais e agro-industriais no meio ambiente é um dos
principais problemas a ser resolvido, uma vez que mesmo sendo estes, poluentes
biodegradáveis, vêm aumentando as dificuldades enfrentadas no processo de
reciclagem destes materiais. Isto tem contribuído para intensificar, por parte dos
cientistas, a busca do desenvolvimento de tecnologias capazes de gerar produtos
de alto valor agregado a partir destes materiais, evitando a destruição dos
ecossistemas.
O desenvolvimento de uma tecnologia alternativa para a produção de xilitol
vem ao encontro da preocupação com o uso sustentável dos recursos naturais. O
xilitol, já disponível no mercado brasileiro como insumo em creme dental,
pastilhas
e
gomas
de
mascar,
possui
propriedades
peculiares
como
anticariogenicidade e adoçante substituto de açúcares para obesos e diabéticos.
A sua produção comercial ocorre por via química, a partir da redução catalítica de
uma solução de xilose pura obtida da hidrólise ácida da fração hemicelulósica da
biomassa vegetal. Este processo é de custo elevado devido às várias etapas de
purificação da solução de xilose, sem as quais o processo catalítico é paralisado
irreversivelmente, e também da purificação do xilitol do meio de reação para a
separação do catalisador. Uma alternativa a este processo é a obtenção
biotecnológica de xilitol, já que microrganismos são capazes de converter a xilose
em xilitol sem a prévia purificação da xilose do hidrolisado hemicelulósico da
biomassa vegetal.
A obtenção biotecnológica de xilitol poderá contribuir para o fortalecimento
de vários segmentos industriais como o farmacêutico, odontológico e alimentício.
No entanto, para que este bioprocesso possa vir a ser competitivo ao processo
químico, são necessários alguns pré-requisitos, destacando-se a seleção de uma
linhagem microbiana fermentadora de xilose, o estabelecimento de condições
ideais de hidrólise da fração hemicelulósica da biomassa, o tratamento adequado
1
2
do hidrolisado de forma a propiciar a maior remoção de inibidores do metabolismo
microbiano, uma suplementação nutricional mínima do hidrolisado de forma a não
encarecer o meio de fermentação, bem como condições ideais de pH,
temperatura, disponibilidade de oxigênio e finalmente o estabelecimento de
técnicas eficazes para a máxima recuperação do xilitol do meio fermentado. Neste
sentido,
pesquisadores
do
DEBIQ/FAENQUIL
têm
se
empenhado
no
desenvolvimento de trabalhos para atender estes pré-requisitos. Durante as
pesquisas, a levedura Candida guilliermondii FTI 20037 destacou-se como
promissora para esta bioconversão tendo os estudos voltados principalmente para
o estabelecimento das condições de hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar,
palha de arroz, cavacos de eucalipto e palha de trigo, da concentração de xilose
nos hidrolisados, do pH, da temperatura, da disponibilidade de oxigênio e da
concentração do inóculo nas fermentações. Quanto às exigências nutricionais,
estas são específicas em função das características dos diferentes hidrolisados
empregados neste bioprocesso.
No decorrer destes trabalhos, os pesquisadores do DEBIQ/FAENQUIL vêm
constatando que a fermentabilidade dos hidrolisados é ainda baixa em relação à
observada em fermentações em meios sintéticos, principalmente quanto à
produtividade de xilitol. Tem sido observado que a toxicidade dos hidrolisados à
levedura é o principal fator responsável pelos baixos valores de produtividade
obtidos. Isto se deve à presença, nos hidrolisados, de compostos tóxicos
resultantes do procedimento de hidrólise ácida da biomassa vegetal para
liberação dos açúcares componentes da fração hemicelulósica, sendo a xilose
encontrada em maior proporção. Dentre estes compostos citam-se o furfural, o
hidroximetilfurfural, os fenóis e o ácido acético (presente em maior concentração).
A toxicidade do ácido acético à levedura está relacionada principalmente à
sua concentração e à forte acidez do meio. Para C. guilliermondii cultivada em
meio semi-sintético este ácido apresentou-se como estimulador da bioconversão
de xilose em xilitol quando presente em concentrações até 1,0g/L, enquanto que,
acima de 3,0g/L o processo fermentativo foi inibido, observando-se o
favorecimento da formação de células. Os resultados desses trabalhos também
têm evidenciado que esta inibição não é dependente apenas da concentração do
ácido mas da atuação sinergística entre este e outros compostos presentes em
baixas concentrações no hidrolisado. Outro fator a ser considerado é a
2
3
capacidade de detoxificação do hidrolisado por C. guilliermondii, uma vez que o
ácido é assimilado juntamente com a xilose. Nos diferentes trabalhos realizados
há evidências de que o metabolismo do ácido por esta levedura está relacionado
à diminuição da concentração de xilose do meio e à fase de crescimento da
levedura.
No intuito de contribuir com o desenvolvimento de uma tecnologia de
obtenção de xilitol por via biotecnológica, este trabalho teve como objetivos
principais avaliar o efeito do ácido acético sobre a bioconversão de xilose em
xilitol, bem como verificar a influência deste ácido quando presente no meio de
cultivo do inóculo. Também foi avaliada a seqüência dos procedimentos de
tratamento, concentração e suplementação do hidrolisado com farelo de arroz,
visando a melhoria de sua fermentabilidade.
3
4
2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1- XILITOL: Propriedades e Aplicações
O xilitol é um poliol (C5H12O5) de massa molar 152,15g/mol com poder
adoçante semelhante ao da sacarose e superior ao de polióis comuns, com valor
calórico reduzido (MANZ et al., 1973; HYVÖNEN et al., 1982, MÄKINEN, 1992).
Uma das propriedades mais destacadas do xilitol é a sua não
cariogenicidade, uma vez que não é utilizado pelos microrganismos da flora bucal,
principalmente pela bactéria Streptococcus mutans . A utilização deste adoçante
não proporciona a formação de ácidos que atacam o esmalte dos dentes
(anticariogênico), além de promover a remineralização do esmalte dos dentes,
revertendo lesões recém formadas ( MÄKINEN, 1992, WÄLER et al., 1992).
Estudos mais recentes indicam que o uso de doces e gomas de mascar contendo
xilitol por crianças em idade escolar é efetivo na prevenção de cárie dentária e na
manutenção da higiene-oral (ALANEN et al., 2000; MAKINEN et al., 2001).
Uma outra característica importante apresentada por este adoçante é o fato
de não ser metabolizado por vias insulino-dependentes, tornando-o um substituto
de outros açúcares na dieta de diabéticos (PEPPER, OLINGER, 1988). O fato do
xilitol causar leve aumento nos níveis de glicose e insulina na corrente sangüínea,
quando comparados com as alterações causadas por glicose ou sacarose, tornao aplicável em estados pós-traumáticos e pós-operatórios uma vez que a
excessiva secreção de hormônios do estresse (cortisol, catecolaminas, glucagon,
etc.) causa resistência à insulina e impede a utilização eficiente da D-glicose
(PARAJÓ et al., 1998a). Este adoçante também pode ser empregado no
tratamento de outras desordens metabólicas como a deficiência da enzima
glicose-6-fosfato desidrogenase e na dieta de obesos, uma vez que exerce
pequena contribuição para a formação de tecidos gordurosos quando comparado
a outros açúcares (MANZ et al., 1973, van EYS et al., 1974).
O xilitol também vem sendo utilizado na nutrição parenteral (TOUSTER,
1974, MÄKINEN, 1976) e no preparo de soluções parenterais contendo açúcar e
aminoácidos, já que não reage com aminoácidos tal como ocorre com a glicose
(FÖRSTER, 1974). Por não apresentar grupos aldeídicos ou cetônicos em sua
molécula o xilitol não participa de reações do tipo Maillard, responsáveis por
escurecimento e redução do valor nutricional de proteínas. Devido a esta
4
5
propriedade ele é aplicável também, na indústria alimentícia no processamento de
produtos em que estas reações não são desejáveis (MANZ et al., 1973).
O consumo de xilitol na forma de xarope ou goma de mascar por crianças,
foi considerado efetivo na prevenção de otites, diminuindo a necessidade de
antimicrobianos (UHARI et al., 1998; UHARI et al., 2000). Também existem
pesquisas indicando o uso de xilitol na dieta como forma de prevenir a
osteoporose (MATILLA et al., 1998a; MATILLA et al., 1998b). Alguns
pesquisadores relataram que o xilitol também pode prevenir a infecção pulmonar
em pacientes com fibrose cística, uma vez que pode dar forças ao sistema natural
de defesa, potencialmente atrasando ou prevenindo o estabelecimento das
infecções bacterianas, reduzindo a concentração salina do líquido que cobre as
células do revestimento interno dos pulmões, aumentando a atividade antibiótica
corpórea natural contra as bactérias (ZABNER et al., 2000).
Todas estas características apresentadas pelo xilitol têm garantido seu uso
com demanda crescente em indústrias alimentícia, farmacêutica e odontológica.
No Brasil a sua utilização está voltada principalmente a produtos como creme
dental, gomas de mascar e pastilhas.
2.2- OBTENÇÃO DE XILITOL
O xilitol é encontrado naturalmente em frutas e legumes, leveduras,
liquens, algas e pode ser recuperado destas fontes por extração sólido-líquido,
mas sua baixa proporção nestes materiais (900mg/100g) torna este processo de
obtenção economicamente inviável (HYVÖNEN et al., 1982; PEPPER, OLINGER,
1988).
Em escala comercial este adoçante é obtido por via química, porém,
pesquisas têm sido extensivamente conduzidas com o objetivo de desenvolver
uma via alternativa de obtenção microbiológica de xilitol. O interesse nestas
pesquisas ocorre uma vez que na via química é difícil alcançar alto rendimento
(50-60% baseado na xilana convertida) pela quantidade considerável de
subprodutos formada e pelo alto custo dos processos de recuperação e
purificação do xilitol. (WINKELHAUSEN et al., 1998; PARAJÓ et al., 1998a)
enquanto na produção microbiana de xilitol altos rendimentos são alcançados a
partir de xilose (65-85%) (WINKELHAUSEN et al., 1998).
5
6
2.2.1- Via Química de Obtenção
A partir da redução de D-xilose empregando amálgama de sódio, Fischer e
Bertrand, em 1891 obtiveram pela primeira vez, xilitol sob a forma de xarope. Em
1942, Wolfrom e Kohn obtiveram xilitol na forma cristalizada após a redução
catalítica sob alta pressão de uma solução de xilose altamente purificada. Porém,
somente a partir de 1964 grandes quantidades puras de xilitol tornaram-se
disponíveis, tendo sido empregadas no Japão e Alemanha principalmente em
casos clínicos de diabéticos (MANZ et al., 1973).
A Finnish Sugar Co. Ltd., Helsink, Finlândia, foi a precursora da produção
comercial de xilitol por via química, com uma capacidade de produção acima de
3.000ton./ano (HYVÖNEN et al., 1982).
De acordo com MELAJA, HÄMÄLÄINEN (1977), o processo comercial de
síntese química de xilitol inicia-se com a obtenção de xilose, a partir da hidrólise
ácida de materiais lignocelulósicos ricos em xilana. A xilose é separada do
hidrolisado por cromatografia e a solução de xilose pura sofre redução catalítica a
xilitol na presença de catalisador níquel. O xilitol passa então por processo de
cristalização que requer várias etapas de purificação para remoção de resíduos
tóxicos do catalisador e de subprodutos que venham a ser formados durante a
hidrogenação (Fig. 1).
Hidrólise da
biomassa
Solução de
pentoses
Troca
iônica
Purificação final
e remoção de cor
Hidrogenação
Solução
de xilitol
Xarope
de
pentose
Fracionamento
e Cristalização
Solução
de polióis
Fracionamento
e Cristalização
XILOSE
Xarope
de
polióis
XILITOL
FIGURA 1 - Produção de xilose e xilitol (MEJALA, HÄMÄLAÄINEN, 1977)
6
7
2.2.2- Via Microbiológica de Obtenção
A via microbiológica apresenta-se como uma alternativa à via química de
obtenção de xilitol a partir da utilização de microrganismos capazes de
metabolizar a xilose (Fig. 2).
xilose isomerase
XILOSE
XILULOSE
xiluloquinase
XILULOSE-5P
NAD(P)H+H
NADH+H
Via das
fosfopentoses
xilose
redutase
xilitol
desidrogenase
NAD+
+
Via Embden-Meyerhof-Parnas
ou Via Entner-Doudoroff
NAD(P)
Etanol
XILITOL
FIGURA 2 - Vias de utilização de xilose por bactérias e leveduras (ARISTIDOU,
PENTTILÄ, 2000)
O xilitol pode ser produzido por fermentação da xilose por diferentes
bactérias e fungos, sendo as leveduras consideradas como as melhores
produtoras (WINKELHAUSEN et al., 1998). Algumas das leveduras selecionadas
para a produção de xilitol são: Candida mogii (SIRISANSANEEYAKUL et al.,
1995); Candida tropicalis (SIRISANSANEEYAKUL et al., 1995); Candida
guilliermondii (BARBOSA et al., 1988; FELIPE et al., 1993; FELIPE et al., 1997a;
ROBERTO et al.; 1994, SILVA et al., 1996a), Debaryomyces hansenii
(VANDESKA et al., 1995a), Candida parapsilosis (SIRISANSANEEYAKUL et al.,
1995). Alguns trabalhos vêm sendo realizados com bactérias como a
Enterobacter liquefaciens (YOSHITAKE et al., 1976) e também com fungos
filamentosos como Petromyces albertensis (DAHIYA, 1991).
7
8
O metabolismo da xilose inicia-se com o seu transporte através da
membrana celular por diferentes mecanismos (WINKELHAUSEN et al., 1998).
Segundo KILIAN e van UDEN (1988), em Pichia stipitis o transporte de D-xilose
(simporte de prótons) ocorre através de um sistema de alta afinidade e outro de
baixa afinidade. O transporte de baixa afinidade é compartilhado por D-xilose e Dglicose, ao passo que o transporte de alta afinidade por D-xilose é inibido por Dglicose. Ao contrário da levedura P. stipitis, o transporte de D-xilose em Candida
shehatae ocorre tanto por simporte de prótons como também por difusão
facilitada.
Uma vez no interior da células, a xilose é reduzida em xilitol, em uma
reação catalisada pela enzima xilose redutase (E.C. 1.1.1.21) ligada a
nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfatada ou não, em sua forma reduzida
(NADPH/NADH). O xilitol é oxidado à xilulose pela enzima xilitol desidrogenase
(E.C.1.1.1.9) ligada à nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfatada ou não em
sua forma oxidada (NADP+/NAD+). A xilulose é fosforilada à xilulose-5-fosfato que
pode ser convertida em piruvato através da conexão da via das fosfopentoses
com a via Embden-Meyerhof-Parnas (HAHN-HÄGERDAL et al., 1994) (Fig. 3).
Dependendo da levedura, as enzimas xilose redutase (XR) e xilitol
desidrogenase (XDH) podem ter especificidade diferente em relação aos
cofatores oxidados e reduzidos. A enzima XR sintetizada por Candida utilis requer
como cofator NADPH, enquanto a XDH é dependente de NAD+. Porém, em P.
stipitis e Pachysolen tannophilus estas enzimas são específicas para ambos
cofatores reduzidos (NADPH/NADH) e oxidados (NAD+/NADP+) (BRUINENBERG
et al., 1984). Em C. guilliermondii FTI 20037 a enzima XR é NADPH-dependente
e a enzima XDH é NAD+ ou NADP+-dependente (SILVA et al. 1996b).
O acúmulo de xilitol na célula e sua posterior excreção para o meio estão
relacionados à regeneração de NADPH (BRUIENBERG et al., 1984; BARBOSA et
al., 1988). TAYLOR et al. (1990) observaram que a produção de xilitol é
favorecida pela excessiva produção de NADPH gerado durante o catabolismo de
xilose. Segundo GONG et al. (1983), a redução de xilose em xilitol e a ativação da
via das fosfopentoses em leveduras é controlada pela disponibilidade de NADP+ e
NADPH. A geração de NADP+ durante a redução de xilose pode estimular a
atividade da enzima glicose-6 fosfato-desidrogenase a qual estimula a ativação da
via das fosfopentoses.
8
9
XILOSE
GLICOSE
Consumo de Açúcares
GLICOSE
XILOSE
ATP
NAD(P)H+H
Xilose Redutase
NADP+
NAD(P)
+
ADP
NADPH+H
Glicose 6P
XILITOL
6 Fosfogluconato
NAD+
Xilitol
Desidrogenase
CO2
NADP+
NADH+H
Frutose 6P
NADPH+H
Xilulose
Ribulose 5P
Frutose 1,6-difosfato
Ribose 5P
Xilulose 5P
Gliceraldeído 3P
Sedoheptulose 7P
DihidroxiAcetona P
NADH+H
NAD+
NAD+
Eritrose 4P
Frutose 6P
Frutose 6P
NADH+H
Glicerol 3P
Glicerol
Gliceraldeído 3P
Piruvato
CO2
NAD+
CO2
NADH+H
Ciclo de
Krebs
Acetil CoA
Acetaldeído
NADH+H
NAD+
Cadeia
Respiratória
Etanol
Acetato
NADH+H
NAD+
NAD+
NADH+H
FIGURA 3 - Metabolismo de xilose e glicose em leveduras fermentadoras de
xilose proposto proposto por HAHN-HÄNGERDAL et al.( 1994)
9
10
2.2.3- Fatores que Influenciam a Bioconversão de Xilose em Xilitol
Muitos fatores estão envolvidos na regulação da via metabólica de
obtenção de xilitol a partir de xilose. Entre eles destacam-se: idade e
concentração inicial do inóculo (PFEIFER et al., 1996; FELIPE et al., 1997a),
temperatura (BARBOSA et al., 1988; SENE et al., 2000), concentração inicial de
D-xilose (PRIOR et al., 1989; NOLLEAU et al., 1993; PARAJÓ et al., 1998b),
suprimento de O2 (NOLLEAU et al., 1993; HAHN-HANGERDAL et al., 1994),
presença de D-glicose como co-substrato (FELIPE et al., 1993; LEE et al.,1996) e
pH (SILVA, 1994; FELIPE et al., 1997b).
Segundo PFEIFER et al. (1996) a utilização de inóculo de C. guilliermondii
obtido de células jovens (16-24h) favoreceu a produtividade do xilitol em meio
sintético, semelhante ao obtido por FELIPE et al. (1997a) em trabalhos
conduzidos com hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. Quanto à
concentração do inóculo, a bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii
foi favorecida com utilização de inóculo na faixa de 0,1 a 3,0g/L, sendo o nível do
inóculo dependente da concentração do substrato e aeração do meio (FELIPE et
al., 1997a).
BARBOSA et al. (1988) relataram que a produção de xilitol por C.
guilliermondii cultivada em meio sintético foi favorecida na faixa entre 30oC a
35oC. Segundo SENE et al. (2000) o rendimento em xilitol foi maior com o
aumento da temperatura de 25oC para 35oC quando esta levedura foi cultivada
em hidrolisado de bagaço de cana.
A concentração inicial de xilose no meio de fermentação também tem
grande influência na produção de xilitol por leveduras. Altas concentrações de
xilose no meio promovem seu consumo pelas leveduras e consequentemente
aumentam a produção de xilitol (SILVA et al., 1994). Segundo SILVA et al.
(1996b), em concentração inicial de xilose acima de 170g/L a levedura C.
guilliermondii 20037 estaria submetida à limitação de oxigênio dissolvido ou a um
aumento da pressão osmótica exercida pelo meio de cultura, o que prejudicaria, a
sua performance fermentativa.
Segundo VANDESKA et al. (1995a) a taxa de consumo de oxigênio
determina quando a xilose é utilizada em processos respiratórios ou
fermentativos. Sob condições aeróbias a xilose não pode ser assimilada, não pela
falta das enzimas específicas para o metabolismo da xilose, mas pelo fato de que
10
11
o NADH produzido não pode ser regenerado através da fosforilação oxidativa
(NOLLEAU et al., 1995). Sob condições de suprimento limitado de oxigênio ocorre
desequilíbrio entre as concentrações de NAD+ e NADH favorecendo a produção
de xilitol (VANDESKA et al., 1995b).
Um outro fator crítico que afeta a produção de xilitol é a presença de
hexoses, principalmente a glicose. Seu efeito inibitório está relacionado com a
proporção em que esta se encontra em relação à xilose, ocorrendo maior inibição
da formação de xilitol por C. guilliermondii com o aumento desta relação (FELIPE
et al. 1993). Segundo LEE et al. (1996) a utilização de xilose por C. guilliermondii
está sujeita à regulação por indução e repressão catabólica. Estes autores
encontraram que D-xilose e L-arabinose são os melhores indutores das atividades
de XR e XDH, enquanto que D-glicose reprime esta indução. Em Candida tenuis
também foi constatado que a síntese de XR e XDH é induzida por pentoses como
D- xilose e L-arabinose e é reprimida na presença de D-glicose (KERN et al.,
1997). Há também evidências de que quando a fermentação ocorre em meio
contendo uma mistura de xilose e glicose como fonte adicional de carbono, o
consumo de xilose e a produtividade de xilitol por C. guilliermondii são baixos
devido à formação de subprodutos tais como glicerol (YAHASHI et al., 1996) e
ribitol (PARAJÓ et al., 1998b). SILVA et al. (1996b) também encontraram que a
adição de glicose ao meio à base de xilose reduziu a produção de xilitol por esta
levedura. Segundo ROSA et al. (1998), a fermentação de mistura de xilose junto à
glicose resultou em diminuição das atividades destas enzimas com conseqüente
redução do rendimento e da produtividade de xilitol sendo este efeito inibitório
dependente da concentração de glicose no meio.
Um outro parâmetro que interfere na via metabólica de obtenção
microbiológica de xilitol é o pH, sendo que o ótimo pode variar em função do tipo
do meio e do microrganismo empregado no processo. O pH é um dos principais
parâmetros a ser considerado principalmente quando da utilização de meios
formulados à base de hidrolisados lignocelulósicos devido à presença, de ácido
acético, cuja toxicidade está relacionada à forte acidez do meio (FELIPE et al.,
1997a). Em fermentações de meio sintético, SILVA (1994) constatou que a
formação de xilitol por C. guilliermondii em pH inferior a 4,5. Por outro lado,
segundo FELIPE et al. (1997b) quando esta levedura foi cultivada em hidrolisado
de bagaço, a bioconversão de xilose em xilitol foi fortemente inibida nestas
11
12
condições de pH encontrando-se o favorecimento da formação de xilitol em
condições de pH próximo a 6,5. Resultados semelhantes foram obtidos por SENE
et al. (2000), também durante o cultivo de C. guilliermondii em hidrolisado de
bagaço.
2.3- FERMENTAÇÃO DE HIDROLISADOS HEMICELULÓSICOS PARA
OBTENÇÃO DE XILITOL
2.3.1- Inibidores do Metabolismo Microbiano
Resultados de diversas pesquisas têm evidenciado que leveduras que
fermentam eficientemente a xilose em meio sintético geralmente o fazem
pobremente em hidrolisados hemicelulósicos. Um problema associado com a
fermentação de hidrolisados é a presença de inibidores que afetam adversamente
o crescimento microbiano e a fermentação. Entre estes incluem-se o furfural, o
hidroximetilfurfural e o ácido acético, gerados à partir do processo de hidrólise
ácida da biomassa (LEE, McCASKEY, 1983; JEFFRIES et al., 1985), compostos
fenólicos originados da lignina e íons metálicos oriundos da corrosão de
equipamentos (CHUNG, LEE, 1985). RODRIGUES et al. (2001) caracterizaram o
hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar e constataram que o
ácido acético está presente em maior concentração (3,38g/L), estando presentes
também, em concentrações inferiores a 0,1g/L, furfural, hidroximetilfurfural, ácido
p-hidroxibenzóico, ácido vanilínico, ácido siríngico, e também enxofre, alumínio,
níquel, cromo, ferro, cálcio, potássio, manganês, magnésio, zinco, dentre outros.
Durante o processo de concentração do hidrolisado, necessário para
aumentar o teor de xilose do hidrolisado, os compostos voláteis presentes no
meio, tais como ácido acético e furfural, são parcialmente removidos, enquanto a
concentração de compostos não voláteis é proporcionalmente aumentada
(RODRIGUES, 1999). Com exceção do ácido acético, estes compostos não têm
sido
considerados
como
responsáveis
pela
baixa
fermentabilidade
dos
hidrolisados devido à sua baixa concentração nestes meios, por outro lado, o
ácido acético presente em altas concentrações nos hidrolisados tem sido
apontado como o principal inibidor da bioconversão de xilose em xilitol por C.
guilliermondii (FELIPE et al., 1997b). Apesar da sua toxicidade, muitas leveduras
e bactérias o utilizam como fonte de carbono (MEYER et al., 1992a; MEYER et
al., 1992b; FERRARI et al., 1992), tendo sido verificado o seu consumo também
12
13
por C. guilliermondii em meio sintético (FELIPE et al., 1995) e em hidrolisado de
bagaço de cana (FELIPE et al., 1997b, SENE et al., 2000). Tem sido constatado
ainda a formação de ácido acético juntamente à formação de xilitol e etanol
conforme resultados de pesquisas obtidos com Saccharomyces cerevisiae
expressando uma xilose isomerase ativa em meio sintético (WALFRIDSSON et
al., 1996).
2.3.2- Toxicidade do Ácido Acético
O efeito inibitório do ácido acético sobre a bioconversão de xilose em xilitol
está relacionado a vários fatores como: acidez do meio (NODA et al., 1982;
FELIPE et al., 1997a; RODRIGUES, 1999), à temperatura (PINTO et al., 1989), à
disponibilidade de oxigênio (van ZYL et al., 1991), à relação xilose/ácido acético
(du PREEZ et al., 1991) e principalmente à concentração deste ácido no meio
(FELIPE et al., 1995). A TABELA I apresenta diferenças nos valores de
rendimento e produtividade de xilitol por C. guilliermondii em função,
principalmente, de diferentes relações de xilose/ácido acético.
MAIORELLA et al. (1983) relataram que o ácido acético inibe o
metabolismo da levedura por interferência química com o transporte de fosfato na
membrana, que ocorre por transporte ativo dependente de ATP. Segundo estes
autores, a interferência deste ácido está relacionada ao aumento no requerimento
de ATP para manter esta função, bem como aos efeitos de interferência química
quando na presença de baixas concentrações do ácido, o que acarreta em
alteração da morfologia celular.
HERRERO et al. (1985) observaram durante fermentação com Clostridium
thermocellum que a presença de ácido acético reduziu o crescimento bacteriano.
Estes autores atribuíram este fato à grandes quantidades de ATP consumidas via
ATPase, a fim de manter o gradiente de prótons, e em conseqüência, menor
quantidade de energia disponível para a biossíntese. Segundo PAMPULHA et al.
(1990), a toxicidade do ácido acético pode também estar associada à sua entrada
na célula, onde se dissocia devido ao pH do citossol ser relativamente alto,
provocando um decréscimo do pH intracelular; este processo pode também
modificar o controle da glicólise por mecanismos de acidificação interna e
presença
química
deste
13
ácido
(Fig.
4).
TABELA I - Comparação dos valores de rendimento (YP/S) e produtividade (QP) do xilitol durante fermentações de
hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar por C. guilliermondii
xilose
(g/L)
xilose/ácido
60,0
ácido
Acético
(g/L)
1,0
YP/S
(g/g)
QP
(g/L.h)
sistema
fermentativo
Referência
60,0
0,82
0,57
descontínuo
FELIPE et al., 1995*
60,0
6,0
10,0
0,66
0,38
descontínuo
FELIPE et al., 1995*
45,0
5,8
7,76
0,63
0,64
descontínuo
ALVES, 1997
60,0
5,21
11,52
0,62
0,58
descontínuo
SENE, 1996**
60,0
0,0
-
0,57
0,71
descontínuo
ROSA et al., 1998*
40,0
4,3
9,30
0,75
0,57
descontínuo
FELIPE et al., 1997a
54,5
4,7
11,60
0,74
0,75
descontínuo
FELIPE et al., 1997b
45,0
7,5
6,0
0,92
0,46
descontínuo alimentado
RODRIGUES, 1997
46,2
3,82
12,09
0,56
0,43
descontínuo
RODRIGUES, 1999
51,7
5,0
10,34
0,75
0,66
descontínuo
SENE et al., 2000
53,6
4,93
10,87
0,79
0,56
descontínuo
MORITA et al., 2000a
51,0
4,4
11,59
0,58
0,70
contínuo
*meio sintético
MARTINEZ et al., 2000
**inóculo adaptado
14
15
FORA
(meio de cultivo)
DENTRO
(citoplasma celular)
MEMBRANA CELULAR
H+ + Ac-
HAc
HAc
H+ + Ac-
H+
pH = 7,4
FIGURA 4 - Mecanismo de acidificação do citoplasma pela forma não dissociada
do ácido acético (LAWFORD, ROUSSEAU 1993)
NOLLEAU et al. (1993), atribuíram a toxicidade do ácido à sua interferência
com o transporte de xilose através da membrana e também por inibir a atividade
ou biossíntese de xilose redutase, fundamental no metabolismo de xilose em
xilitol em leveduras. CASAL et al. (1998) observaram que o tipo de substrato
utilizado para o crescimento microbiano interfere no poder inibitório do ácido. Em
células de S. cerevisiae IGC 4072 crescendo em glicose, a entrada do ácido
ocorreu por sua difusão simples somente quando na sua forma não dissociada,
porém quando esta levedura foi cultivada em ácido acético, ácido láctico e etanol,
ocorreu a entrada de ácido sob sua forma dissociada (acetato), com a
participação de um sistema de transporte simporte com prótons.
Conforme já constatado em vários trabalhos com a levedura C.
guilliermondii (FELIPE et al., 1995; FELIPE et al., 1997b; ALVES et al., 1998;
RODRIGUES, 1999), a concentração do ácido acético é considerada alta nos
hidrolisados mesmo após os diferentes tratamentos destes, tendo sido observado
o desvio da formação de xilitol para crescimento celular. Porém, a produção de
xilitol por C. guilliermondii em meio semi-sintético foi favorecida quando este ácido
se encontrava em baixa concentração (1,0g/L) enquanto em concentrações
superiores a 3,0g/L esta produção foi inibida (FELIPE et al., 1995). Segundo estes
autores o ácido presente em baixa concentração entraria diretamente no ciclo de
Krebs via acetil-CoA, enquanto que em concentrações elevadas, parte seria
dirigida ao ciclo de Krebs e o restante utilizado por uma via metabólica que requer
16
energia, como o ciclo do Ácido Glioxílico. Isto resultaria em perda da energia para
a manutenção do metabolismo da célula acarretando redução do crescimento.
Em função da toxicidade dos hidrolisados, diferentes tratamentos têm sido
empregados antes de sua utilização como meio de cultura, destacando-se o
tratamento com bases e ácidos (ROBERTO et al., 1991; SILVA et al., 1991;
FELIPE et al., 1997b), e a combinação deste com carvão ativo (ALVES et al.,
1998; RODRIGUES, 1999). Normalmente estes tratamentos são feitos posterior à
concentração a vácuo do hidrolisado, que tem sido empregada para aumentar o
teor inicial de xilose. Segundo ALVES et al. (1998), o tratamento do hidrolisado de
bagaço pela alteração de pH com ácido (H3PO4) e base (CaO) combinada à
adição de carvão ativo (2,4%) como agente de adsorção, favoreceu a remoção do
ácido com conseqüente melhoria na bioconversão de xilose em xilitol por C.
guilliermondii.
Um outro meio de se contornar o problema da toxicidade dos hidrolisados é
a utilização de células adaptadas. Segundo SENE et al. (1998), a adaptação de
C. guilliermondii apresentou-se como uma técnica viável para de se promover
melhoria da fermentabilidade do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de canade-açúcar. Estes autores constataram aumento de 46% e 50% no rendimento e
produtividade de xilitol, respectivamente, por C. guilliermondii durante a
fermentação do hidrolisado quando da utilização de inóculo adaptado, ou seja,
células previamente cultivadas no próprio hidrolisado empregado como meio de
fermentação.
2.4- MATÉRIAS-PRIMAS PARA A OBTENÇÃO MICROBIOLÓGICA DE
XILITOL
O acúmulo de resíduos agro-industriais, aliado à escassez de reservas de
combustíveis fósseis e ao aumento dos problemas de poluição ambiental têm
levado muitos países ao uso de fontes renováveis, como os materiais
lignocelulósicos, os quais constituem cerca de 50% da biomassa formada no
mundo (KUHAD, SINGH, 1993).
Diferentes materiais lignocelulósicos podem ser utilizados para a produção
de combustíveis e outros produtos químicos e a sua composição pode variar
dependendo
da
fonte
da
biomassa
(TABELA
II).
TABELA II - Composição de vários materiais lignocelulósicos (adaptado de LEE,J.,1997)
SABUGO DE
PALHA DE
PALHA DE
CASCA DE
BAGAÇO DE
CAROÇO DE
MILHO
TRIGO
ARROZ
ARROZ
CANA
ALGODÃO
Carboidrato (%)
Glicose
39,0
36,6
41,0
36,1
38,1
20,0
Manose
0,3
0,8
1,8
3,0
ND
2,1
Galactose
0,8
2,4
0,4
0,1
1,1
0,1
Xilose
14,8
19,2
14,8
14,0
23,3
4,6
Arabinose
3,2
2,4
4,5
2,6
2,5
2,3
Lignina
15,1
14,5
9,9
19,4
18,4
17,6
Cinzas
4,3
9,6
12,4
20,1
2,8
14,8
Proteína
4,0
3,0
ND
ND
3,0
3,0
Não-carboidrato (%)
ND- não disponível
17
18
2.4.1- Bagaço de Cana-de-Açúcar
No Brasil, o maior resíduo agro-industrial é o bagaço de cana-de-açúcar
(ORLANDO FILHO et al., 1994) o que corresponde a aproximadamente 80
milhões de toneladas de bagaço (PROCKNOR, 2000) gerados a partir de cerca
de 335 milhões de toneladas de cana por ano (MENDES, SCOTONI, 2000). O
setor sucroalcooleiro produz cerca de 80% da eletricidade que consome através
do uso do bagaço de cana (PATUSCO, 1997), sendo este resíduo aproveitado
também para outros fins como na produção de polpa, papel e produtos
aglomerados (MITRANI et al., 1999). Segundo PROCKNOR (2000) há ainda um
grande excedente que acarreta graves problemas de estocagem e poluição
ambiental, principalmente porque quaisquer sistemas de estocagem costumam
ser proibitivamente caros.
As fibras do bagaço da cana contêm, como principais componentes, cerca
de 40% de celulose, 35% de hemicelulose e 15% de lignina. A celulose é um
polímero linear constituído por unidades de D-glucose unidas por ligações
glicosídicas
β-1→4.
A
hemicelulose
é
um
heteropolímero
composto
predominantemente por hexoses e pentoses com curtas ramificações tais como
D-xilose, D-glucose, L-arabinose e D-galactose. Enquanto a lignina é uma
macromolécula polifenólica constituída por unidades básicas de 3-5-dimetoxi-4hidroxi-fenilpropano, 3 metoxi-4-hidroxi-fenilpropano e 4-hidroxi-fenilpropano
(TSAO, 1986). A elevada concentração de xilose na fração hemicelulósica do
bagaço, o que corresponde em até 80% do total de açúcar nesta fração
(LADISCH et al., 1983) é um dos principais fatores que impulsionam o
aproveitamento do bagaço em diferentes processos de bioconversão. Para a
utilização do bagaço em bioprocessos é necessário a sua hidrólise para a
liberação de monossacarídeos fermentescíveis da fração hemicelulósica.
Segundo JEFFRIES (1983) a hidrólise da fração hemicelulósica é facilitada devido
à sua estrutura heterogênea e ao relativo baixo grau de polimerização. A hidrólise
ácida é o processo pelo qual tem-se obtido o hidrolisado hemicelulósico de
bagaço utilizando-se a temperatura de 121oC, por 10 minutos, empregando-se
100mg de H2SO4 por grama de matéria seca para uma relação sólido-líquido de
1:10 (PESSOA JUNIOR et al., 1997).
19
3- MATERIAL E MÉTODOS
3.1- OBTENÇÃO E PREPARO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE
BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
3.1.1- Hidrólise Ácida
Anterior à etapa de hidrólise foi feita a caracterização do bagaço de cana
quanto ao seu teor de umidade através de secagem em estufa a 100ºC, até peso
constante. Em seguida este foi hidrolisado na planta piloto de hidrólise ácida do
Departamento de Engenharia Química (DEQUI) da FAENQUIL, em reator de aço
inox AISI 316 com capacidade volumétrica total de 250 litros, equipado com
camisa de óleo térmico para aquecimento indireto por resistência elétrica. A
hidrólise foi realizada conforme metodologia estabelecida por PESSOA JUNIOR
et al. (1997), sob as seguintes condições: temperatura de 121oC, por 10 minutos,
empregando 100mg de H2SO4 por grama de matéria seca para uma relação
sólido-líquido de 1:10. O hidrolisado obtido foi primeiramente filtrado a vácuo em
filtro de porcelana com papel qualitativo, para remoção de massa residual de
sólidos (celulose, lignina), e armazenado em câmara fria para posterior
tratamento, concentração e caracterização.
3.1.2- Caracterização, Tratamento e Concentração do Hidrolisado
Após a hidrólise do bagaço o hidrolisado foi caracterizado quanto ao pH, à
concentração dos açúcares xilose, glicose e arabinose e à concentração dos
compostos tóxicos furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético e fenóis. Em seguida
foram preparados dois tipos de hidrolisado: H1 – hidrolisado tratado anterior à
concentração a vácuo e H2 – hidrolisado tratado posterior à concentração a
vácuo.
O tratamento foi feito segundo metodologia estabelecida por ALVES et al.
(1998), adicionando-se , ao hidrolisado, óxido de cálcio (CaO) até pH 7,0, seguido
da redução do pH para 5,5 com ácido fosfórico (H3PO4). Após esta etapa, 2,4%
de carvão ativo foi adicionado ao hidrolisado sendo a mistura submetida a
agitação em agitador tipo “Shaker” rotatório (New Brunswick, Scientific Co.) à
200rpm, à 30oC durante 1 hora. A cada etapa de alteração de pH e adição de
20
carvão o hidrolisado foi filtrado em papel de filtro qualitativo para remoção do
precipitado formado.
O fator de concentração do hidrolisado foi f=3, ou seja, correspondente a 3
vezes o seu teor inicial de açúcares com a finalidade de aumentar a concentração
de xilose e reduzir o teor de compostos tóxicos voláteis. Esta etapa foi realizada
em concentrador a vácuo com aquecimento por fluido térmico em banho
termostático, dotado de um sistema de condensação e coleta de frações. A
temperatura de concentração foi de 70oC e o pH 0,92 conforme estabelecido por
RODRIGUES (1999). Antes da concentração o pH do hidrolisado foi reajustado
para 0,92 com H2SO4, quando necessário.
Os hidrolisados concentrados posterior (H1) ou anterior (H2) ao tratamento
também foram autoclavados a 0,5atm por 15 minutos e novamente caracterizados
quanto ao pH, à concentração dos açúcares xilose, glicose e arabinose e à
concentração dos compostos tóxicos furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético e
fenóis.
3.2- MICRORGANISMO E PREPARO DO INÓCULO
Os experimentos foram conduzidos com a levedura Candida guilliermondii
FTI 20037, selecionada por BARBOSA et al. (1988), para a bioconversão de
xilose em xilitol. Foi utilizada uma cultura-estoque do DEBIQ, mantida em ágar
extrato de malte à 4oC.
O cultivo da levedura foi realizado em frascos Erlenmeyer de 125mL
contendo 50mL de meio semi-sintético composto de 30g/L de xilose, 2g/L de
sulfato de amônio, 0,1g/L de cloreto de cálcio e 20g/L de solução de extrato de
farelo de arroz. O cultivo foi feito em incubadora tipo “Shaker” rotatório (New
Brunswick, Scientific Co.) com agitação de 200rpm, a 30oC por 24 horas. Em
seguida as células foram recuperadas por centrifugação a 2000 x g (Cu-5000 –
Damon/IEC Division) e lavadas com água destilada esterilizada, centrifugadas
novamente e após o descarte do sobrenadante, foram utilizadas para preparar
uma suspensão de células a qual foi empregada como inóculo em uma
concentração inicial de 0,5g/L no meio.
21
3.3- MEIO E CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO
3.3.1- Avaliação da Seqüência de Realização das Etapas de Tratamento e
Concentração do Hidrolisado
Os
experimentos
foram
conduzidos
empregando-se
hidrolisados
preparados de duas formas: H1- tratamento anterior e H2- tratamento posterior à
concentração a vácuo conforme estabelecido no item 3.1.2. Estes hidrolisados
foram autoclavados a 111oC por 15min. e suplementados com os mesmos
nutrientes empregados no preparo do inóculo, exceto xilose (item 3.2).
As soluções estoque de (NH4)2SO4 e CaCl2.2H2O foram preparadas
separadamente nas concentrações de 250 e 50g/L, respectivamente, e
esterilizadas a 121oC por 20 minutos. A solução de extrato de farelo de arroz foi
preparada separadamente numa concentração de 200g/L (200g de farelo
acrescentado de 1,0L de H2O destilada) e autoclavada a 111°C por 15min,
seguida de centrifugação a 2000xg (Cu-5000 – Damon/IEC Division) para
remoção da parte sólida conforme metodologia empregada por FELIPE et al.
(1997a), SILVA et al. (1998), ALVES et al. (1998), RODRIGUES, (1999).
3.3.2- Avaliação da Forma de Suplementação Nutricional do Hidrolisado
com Farelo de Arroz
Nesta etapa empregou-se o hidrolisado tratado após o processo de
concentração (H2), suplementado com nutrientes, conforme descrito no item
anterior, exceto quanto a suplementação com a solução de extrato de farelo de
arroz o qual foi adicionada ao meio como fonte de vitaminas e aminoácidos
(MILLER, CHURCHILL, 1986). Esta suplementação foi feita de duas formas: a)
solução de extrato de farelo de arroz autoclavada separadamente do hidrolisado,
conforme estabelecido no item 3.3.1, o que foi designado como hidrolisado H2 e
b) farelo de arroz autoclavado junto do hidrolisado, numa concentração de 20g/L,
o que foi designado como hidrolisado F2. Neste caso, o hidrolisado, após ser
autoclavado foi centrifugado, assepticamente, a 2000 x g (Cu-5000 – Damon/IEC
Division) para remoção de partículas sólidas.
Os ensaios foram conduzidos em frascos Erlenmeyer de 125mL com 50mL
do meio de fermentação, em duplicata, a 30oC sob agitação de 200rpm em
incubadora tipo “Shaker” rotatório (New Brunswick, Scientific Co.) por 54 horas.
22
3.3.3- Avaliação do Efeito do Ácido Acético Sobre Bioconversão de
Xilose em Xilitol em Hidrolisado de Bagaço
Para avaliar o efeito do ácido acético sobre a bioconversão de xilose em
xilitol por C. guilliermondii os experimentos foram conduzidos empregando-se
hidrolisado tratado após o processo de concentração a vácuo e suplementado
com solução de extrato de farelo de arroz preparada separadamente do
hidrolisado (H2), conforme descrito no item 3.3.1.
Ácido acético em uma concentração de 2,0g/L foi adicionado ao hidrolisado
já contendo 3,5g/L deste ácido, nos tempos 0, 12, 24 e 48 horas de fermentação,
de forma a se avaliar o seu efeito em diferentes fases do crescimento da
levedura. Para cada tempo de adição de ácido foi preparada uma série de frascos
correspondentes ao tempos de amostragem, em duplicata. Experimento controle,
ou seja, fermentação sem adição de ácido ao hidrolisado foi também realizado. O
pH inicial de fermentação foi 5,5 para todas as condições, e quando necessário o
pH foi acertado com solução de NaOH-6N. As fermentações foram realizadas em
frascos Erlenmeyer de 125mL com 50mL do meio de fermentação, a 30°C, sob
agitação de 200rpm em incubadora tipo “Shaker” rotatório (New Brunswick,
Scientific Co.) por 54 horas.
3.3.4- Avaliação do Efeito do Ácido Acético Sobre a Bioconversão de
Xilose em Xilitol em Meio Simulando a Composição do Hidrolisado
Nesta etapa os experimentos foram realizados em meio semi-sintético
simulando a composição do hidrolisado hemicelulósico quanto à concentração de
açúcares e ácido acético.
O meio utilizado foi composto de: xilose (41,18g/L), glicose (1,94g/L),
arabinose (4,02g/L) e ácido acético (3,48g/L), cujas concentrações são
semelhantes às encontradas no hidrolisado. Ácido acético em uma concentração
de 2,0g/L foi adicionado ao meio nos tempos 0, 12, 24 e 48 horas de fermentação,
de forma a se avaliar o seu efeito em diferentes fases do crescimento da
levedura. Experimento controle, ou seja, fermentação sem adição de ácido ao
hidrolisado foi também realizado. O pH inicial de fermentação foi 5,5 para todas
as condições e quando necessário o pH foi acertado com solução de NaOH-1N.
Os ensaios foram realizados em frascos Erlenmeyer de 125mL com 50mL do
23
meio de fermentação, sob agitação de 200rpm em incubadora tipo “Shaker”
rotatório (New Brunswick, Scientific Co.) por 54 horas, a 30°C.
3.3.5- Avaliação do Cultivo do Inóculo em Meio Contendo Concentrações
Crescentes de Ácido Acético Como Forma de Minimizar a
Toxicidade do Hidrolisado Durante a Fermentação
Nesta etapa foi avaliado o efeito da adição do ácido acético após 12h de
cultivo de C. guilliermondii sobre a bioconversão de xilose em xilitol a partir de
inóculo obtido do cultivo de células de três formas diferentes: C1- inóculo
cultivado em meio semi-sintético ausente de ácido (item 3.2) durante 24h; C2células obtidas a partir de C1 foram transferidas para hidrolisado contendo cerca
de 3,5g/L de ácido acético (empregado como meio de fermentação) e incubadas
por 24h; C3- células obtidas a partir de C2 e transferidas para hidrolisado
contendo cerca de 5,0g/L de ácido acético (resultante da adição de 2,0g/L de
ácido) e incubadas por mais 24h.
Como meio de fermentação foi utilizado hidrolisado preparado como
descrito no item 3.3.3. Após 12h de cultivo foram adicionados 2,0g/L de ácido
acético ao meio, perfazendo uma concentração em torno de 5,0g/L. O pH inicial
de fermentação foi 5,5 (acertado com solução de NaOH-6N, quando necessário).
Os ensaios foram realizados em frascos Erlenmeyer de 125mL com 50mL do
meio de fermentação, a 30°C, sob agitação de 200rpm em incubadora tipo
“Shaker” rotatório (New Brunswick, Scientific Co.) por 54 horas.
3.4- MÉTODOS ANALÍTICOS
As análises foram feitas a partir de amostras correspondentes à retirada de
2 frascos em cada tempo, para verificação da viabilidade e pureza da cultura,
dosagem de glicose, xilose, arabinose, xilitol, glicerol, ácido acético, da
concentração celular e da variação do pH.
24
3.4.1- Viabilidade e Pureza da Cultura
A viabilidade da cultura foi verificada a partir de visualizações
microscópicas de lâminas preparadas a fresco onde as células foram coradas
pela adição de igual volume de uma solução 0,01% (p/v) de azul de metileno
dissolvido em citrato de sódio 2% (p/v) (ODUMERO et al., 1992), enquanto a
pureza foi verificada a partir de lâminas fixadas e coradas com fucsina. As
observações foram feitas em microscópio óptico Leitz.
3.4.2- Determinação da Concentração Celular
A concentração celular para o preparo do inóculo foi feita por turbidimetria
a 600nm, onde a concentração de células em g/L foi calculada por uma curva
padrão que correlaciona a absorbância a 600nm e o peso seco das células
obtidas do cultivo por 24 horas em meio sintético. O crescimento celular foi
acompanhado a partir de contagem de células em Câmara de Neubauer (1/400
mm2 x 1/10 mm).
3.4.3- Determinação da Concentração de Açúcares e Ácido acético
As concentrações dos açúcares D-glicose, D-xilose, L-arabinose, bem
como de xilitol, glicerol e ácido acético foram determinadas por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (WATERS 786), nas seguintes condições: coluna BIO
RAD Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm); temperatura da coluna, 45oC; detetor de
índice de refração WATERS 410; eluente H2SO4 0,01, fluxo de 0,6mL/min.;
volume da amostra injetada, 20 μL. As amostras, após devidamente diluídas,
foram filtradas em filtro Sep Pak C18 (MILLIPORE) e o eluente, filtrado a vácuo
em membrana HAWP 0,45μm de poro, 47mm de diâmetro (MILLIPORE) e
simultaneamente degaseificado em banho de ultra-som (THORTON) por 25
minutos.
3.4.4- Determinação da Concentração de Furfural e Hidroximetilfurfural
As concentrações de furfural e hidroximetilfurfural nos hidrolisados foram
determinadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (WATERS), nas
seguintes condições: coluna Hewlett-Packard RP 18 (200mm); temperatura da
coluna
25ºC;
detetor
de
ultravioleta
UV-2487;
eluente,
solução
de
acetonitrila/água (1:8) com 1% de ácido acético; volume da amostra injetada
25
20μL. Os hidrolisados foram devidamente diluídos e filtrados em filtros Swennex
em membrana Minisart 0,22 μm (MILLIPORE). Na composição do eluente, a água
bidestilada foi filtrada a vácuo empregando-se membrana HAWP 0,45μm
(MILLIPORE) e os outros componentes como ácido acético, acetonitrila foram
,nas proporções adequadas, adicionados à água devidamente filtrada. Em
seguida, o eluente foi desgaseificado em banho de ultra-som (THORNTON) por
15 minutos e deixado, antes de ser utilizado, em repouso por 10min.
3.4.5- Determinação da Concentração de Fenóis
A concentração dos fenóis foi determinada utilizando o método do
FeCl3.6H2O e K3Fe[CN]6, descrito por KIM e YOO (1996) e GUERRA (1998).
Preparou-se 1,5mL de amostra do hidrolisado diluída da adição de 0,1mL de
K3Fe[CN]6 8mM, seguida da adição imediata de 0,1mL de uma solução 0,1M de
FeCl3.6H2O em 0,1M de HCl. A absorbância da solução resultante foi lida após
5min a 700nm em um espectrofotômetro computadorizado BECKMAN DU 640 B
e comparada com uma curva de calibração, usando vanilina como padrão.
3.4.6- Determinação do pH
O pH das amostras foi determinado em pH-metro Micronal modelo B 474, o
qual executa leituras de temperatura através de uma sonda apropriada (tipo
Pt100) na faixa de –5,0 a +105oC.
26
3.5- DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS FERMENTATIVOS
3.5.1- Fator de Conversão de D-xilose em Xilitol (Y p/s)
O fator de conversão expressa: massa de xilitol produzido por massa de
xilose consumida, em gramas, e é calculado pela seguinte equação:
ΔP Pf − Pi
=
ΔS S f − S i
onde: Si e Sf correspondem às concentrações inicial e final de xilose (g/L);
YP S = −
Pi e Pf correspondem às concentrações inicial e final de xilitol (g/L).
3.5.2- Produtividade Volumétrica de Xilitol (Qp)
A produtividade volumétrica de xilitol expressa a concentração de xilitol
produzida (g/L) por tempo (h), e é calculada de acordo com a seguinte equação:
Δ P Pf − Pi
=
T f − Ti
Δt
onde: Pi e Pf correspondem às concentrações inicial e final de xilitol (g/L);
QP =
Ti e Tf correspondem aos tempos inicial e final de fermentação (h).
3.5.3- Eficiência de Conversão (η)
Este parâmetro fermentativo expresso em %, representa a razão entre o
fator de rendimento (Y
P/S)
obtido experimentalmente e o fator de rendimento
teórico de 0,917g/g calculado segundo BARBOSA et al., 1988.
3.6- ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados (originados a partir de duas observações) foram analisados
estatisticamente pelo Teste Estatístico t (Teste de Student) :
d
t=
s2
n
onde d = média das diferenças entre as observações,
s 2 = desvio-padrão,
n=número de observações. Se t calculado > t tabelado, existem diferenças
significativas entre os parâmetros analisados (VIEIRA, HOFFMAN, 1989).
27
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1- CARACTERIZAÇÃO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO
O hidrolisado hemicelulósico original (pH 1,47) resultante do processo de
hidrólise ácida do bagaço de cana-de-açúcar (PESSOA JUNIOR et al.,1997),
antes de ser preparado para posterior utilização nas fermentações, foi
caracterizado com relação ao teor dos principais açúcares e compostos tóxicos
presentes (Tabela III).
TABELA III- Características do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar
Componentes
Glicose
Xilose
Arabinose
Ácido Acético
Furfural
Hidroximetilfurfural
Fenóis Totais
Concentração (g/L)
0,85
16,21
1,50
2,62
0,092
0,008
0,936
De acordo com os resultados da TABELA III, a xilose é o açúcar
predominante (16,21g/L), seguido de arabinose (1,50g/L) e glicose (0,85g/L)
presentes em baixas concentrações. Além dos açúcares estão também presentes
compostos tóxicos aos microrganismos como ácido acético (2,62g/L), furfural
(0,092g/L), hidroximetilfurfural (0,008g/L) e fenóis totais (0,936g/L), originados
durante o processo de hidrólise da biomassa lignocelulósica (LEE, McCASKEY,
1983; CHUNG, LEE, 1985). Estes resultados são semelhantes aos encontrados
por outros autores durante a hidrólise ácida de bagaço de cana conforme
demonstrado na TABELA IV.
A presença de baixas concentrações de glicose no hidrolisado é um ponto
favorável ao processo fermentativo em estudo. Tal fato se deve a que em
presença de elevadas concentrações desta hexose, esta exerce repressão
catabólica sobre as enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase, principais
responsáveis pela bioconversão xilose-xilitol, (LEE et al., 1996). Segundo ROSA
et al. (1998), a fermentação de mistura de xilose junto à glicose resultou em
diminuição das atividades destas enzimas com conseqüente redução do
rendimento e da produtividade de xilitol sendo este efeito inibitório dependente da
28
concentração de glicose no meio. Além disto, LEE et al. (1996), LAWFORD,
ROSSEAU (1998) e SENE et al. (2000) verificaram uma tendência de consumo
preferencial de glicose em relação à xilose.
Na composição do hidrolisado também foi encontrado L-arabinose. Esta
pentose é capaz de induzir em torno de 92-94% a atividade das enzimas XR e
XDH comparado com D-xilose (LEE et al., 1996).
Quanto ao ácido acético, principal composto inibitório do metabolismo de
xilose por C. guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana
(FELIPE et al., 1997a, RODRIGUES, 1999), sua concentração (2,62g/L) é inferior
à encontrada em outros trabalhos, nas mesmas condições de hidrólise ácida
(TABELA IV), e está abaixo da considerada inibitória a este bioprocesso. Segundo
FELIPE et al. (1995), concentração de ácido superior a 3,0g/L foi inibitória à
formação de xilitol durante a fermentação de xilose em xilitol por C. guilliermondii
em meio semi-sintético. As concentrações dos demais compostos tóxicos: furfural,
hidroximetilfurfural são muito baixas, semelhante ao encontrado por outros
pesquisadores (TABELA IV).
TABELA IV- Características de hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de canade-açúcar obtidos pelo mesmo processo de hidrólise ácida em diferentes trabalhos
Este
trabalho
0,85
Glicose (g/L)
16,21
Xilose (g/L)
1,50
Arabinose (g/L)
2,62
Ác. Acético
(g/L)
0,092
Furfural (g/L)
0,008
HMF (g/L)
6,19
Xilose:ácido
1,47
pH
HMF:hidroximetilfurfural
ALVES et
al. (1998)
SENE
(2000)
MORITA et
al. (2000a)
RODRIGU
ES et al.
(2001)
1,20
18,24
1,71
3,38
2,1
15,7
2,3
3,9
1,7
18,8
1,6
3,2
1,30
18,92
1,94
3,05
0,06
0,05
4,02
0,90
n.d.
0,1
5,87
1,3
0,16
0,084
0,04
0,003
6,20
5,40
1,18
0,92
n.d.: não detectado
29
4.2- AVALIAÇÃO DA SEQÜÊNCIA DE REALIZAÇÃO DAS ETAPAS DE
TRATAMENTO E CONCENTRAÇÃO DO HIDROLISADO
Após a caracterização, os hidrolisados foram submetidos às etapas de
tratamento e concentração a vácuo, onde H1 refere-se ao tratamento anterior e
H2 ao tratamento posterior à etapa de concentração. O tratamento teve por
objetivo reduzir a concentração dos compostos tóxicos à levedura enquanto que a
concentração a vácuo possibilita o aumento do teor de xilose e favorecimento da
formação de xilitol (ALVES et al., 1998; SENE, 1996; FELIPE et al., 1997a). A
avaliação da seqüência de realização destas etapas está diretamente relacionada
ao fato de que durante a concentração a `vácuo não apenas os açúcares têm
suas
concentrações
aumentadas,
mas
também
os
compostos
tóxicos,
principalmente o ácido acético. A composição parcial destes hidrolisados está
apresentada na TABELA V.
TABELA V- Características do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar após as etapas de tratamento e concentração
Compostos (g/L)
H
0,85
Glicose
16,21
Xilose
1,50
Arabinose
2,62
Ácido Acético
0,092
Furfural
0,008
Hidroximetilfurfural
0,936
Fenóis Totais
H: hidrolisado original
H1: hidrolisado tratado anterior à concentração
H2: hidrolisado tratado posterior à concentração
H1
2,00
38,00
3,02
3,50
0,023
0,003
0,189
H2
2,83
42,38
3,94
3,52
0,002
n.d.
0,089
n.d.: não detectado
Observa-se que os açúcares e o ácido acético tiveram suas concentrações
aumentadas independente da seqüência de realização das etapas de tratamento
e concentração, diferente dos demais compostos tóxicos, que tiveram as suas
concentrações reduzidas. Nota-se também que, no hidrolisado em que o processo
de tratamento ocorreu posterior à concentração (H2) houve menor perda de
açúcares, proporcionando também a maior remoção de compostos tóxicos como
furfural, hidroximetilfurfural e fenóis totais.
30
Os resultados mostrados na TABELA VI permitem observar que a redução
da concentração destes compostos tóxicos foi influenciada pela seqüência em
que se realizaram as etapas de tratamento e concentração, exceto para o caso do
ácido acético, que teve a sua concentração semelhante para ambos os casos,
não observando-se diferença na sua concentração em função da seqüência de
realização destas etapas. Ao se considerar o teor dos compostos furfural,
hidroximetilfurfural e fenóis totais no hidrolisado tratado e concentrado, a escolha
pelo tratamento posterior à concentração (H2) corresponderia assim, a um
hidrolisado menos tóxico à levedura, o qual foi então empregado nos ensaios
experimentais seguintes.
TABELA VI- Remoção de compostos tóxicos (%) em função do tratamento
anterior (H1) ou posterior (H2) à concentração do hidrolisado hemicelulósico de
bagaço de cana-de-açúcar
Ácido Acético
Furfural
Hidroximetilfurfural
Fenóis Totais
H1
0%
75%
62,5%
79,80%
H2
0%
97,83%
100%
90,49%
Os resultados referentes ao consumo de xilose e formação de xilitol estão
representados nas FIGURAS 5 e 6. Verifica-se uma influência significativa da
condição de tratamento no consumo de xilose (Fig. 5) e produção de xilitol (Fig. 6)
por C. guilliermondii. O tratamento posterior à concentração (H2) favoreceu o
consumo de xilose, verificando-se após 54 horas de fermentação 94,19% de
consumo, o que correspondeu ao aumento de 24,41% em relação ao mesmo
tratamento realizado anterior ao procedimento de concentração (H1). Nestas
condições observou-se a formação de 27,56g/L de xilitol (Fig. 6), correspondendo
ao aumento de 112% em relação à condição de tratamento anterior à
concentração (H1). Este comportamento confirmou a hipótese de que a condição
de tratamento e concentração que proporcionasse a maior redução da
concentração de compostos tóxicos à levedura seria a que favoreceria a
bioconversão de xilose em xilitol.
31
100
90
80
Xilose (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
12
1
24
2
48
3
54
4
Tempo (h)
FIGURA 5 - Consumo de xilose (%) por C.
guilliermondii durante as fermentações de hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana submetido ao
tratamento anterior (H1 -ν) e posterior (H2 -) à
concentração a vácuo.
30
25
Xilitol (g/L)
20
15
10
5
0
12
1
24
2
48
3
54
4
T em po (h)
FIGURA 6 - Formação de xilitol (g/L) por C.
guilliermondii durante as fermentações de
hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana
submetido ao tratamento anterior (H1 -ν) e posterior
(H2 -) à concentração a vácuo.
Quanto à glicose , foi verificado para ambos os hidrolisados (H1 e H2), o
consumo total após 12 horas de fermentação em função de sua baixa
concentração no meio, 2,0 e 2,83g/L, respectivamente. Este rápido consumo
também foi constatado por FELIPE et al. (1997a) em trabalhos com esta mesma
32
levedura cultivada em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar.
Por outro lado, a arabinose foi lentamente assimilada (TABELA VII), verificandose em H2 o máximo consumo, 42,48%, após 54 horas de fermentação. Este
hidrolisado
correspondeu
à
melhor
condição
encontrada
também
para
assimilação de xilose e formação de xilitol, o que coincide com a condição em que
ocorreu
favorecimento
da
redução
dos
compostos
tóxicos
furfural,
hidroximetilfurfural e fenóis totais. A baixa assimilação de arabinose por C.
guilliermondii também foi constatada por outros pesquisadores em trabalhos
realizados com esta mesma levedura cultivada em hidrolisado hemicelulósico de
bagaço de cana (FELIPE et al., 1997a; FELIPE et al., 1997b; ALVES et al., 1998;
MORITA et al., 2000a; SENE et al., 2000). Segundo CARVALHO (2000) a
presença de xilose junto à arabinose no meio de cultivo poderia ser a responsável
pela baixa assimilação da arabinose por C. guilliermondii. O aumento verificado
após 24h de fermentação na concentração de arabinose em H1 (TABELA VII)
provavelmente não é real, e sim decorrente da sobreposição dos picos de
arabinose e arabitol no método utilizado para quantificar a arabinose. Segundo
MCMILLAN et al. (1994), em fermentações com leveduras a arabinose pode ser
convertida em arabitol, o que não foi possível confirmar para C. guilliermondii.
TABELAVII- Concentração (g/L) e consumo de arabinose (%) durante as
fermentações de hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar submetido ao
tratamento anterior (H1) e posterior (H2) à concentração a vácuo
H1
Tempo (h)
T0
T12
T24
T48
T54
Concentração
(g/L)
2,86
2,83
3,06
2,96
2,97
H2
Arabinose
Consumo
Concentração
(%)
(g/L)
3,39
1,04
3,25
0,0
3,18
0,0
2,69
0,0
1,95
Consumo
(%)
4,13
6,19
20,65
42,48
Semelhante ao ocorrido para o consumo de açúcares, foi também
observado para a assimilação de ácido acético (TABELA VIII), onde o máximo
consumo, 76,92% ocorreu em condição de tratamento posterior à concentração
(H2), enquanto 60,93% foi assimilado quando o hidrolisado foi tratado anterior à
concentração (H1). Este fato pode vir a contribuir com a idéia de que o efeito
33
inibitório à atividade microbiana exercido pelos compostos tóxicos presentes no
hidrolisado de bagaço está relacionado não apenas à concentração destes
compostos e dos seus efeitos individuais, mas também ao efeito sinergístico entre
eles, uma vez que a concentração do ácido acético é semelhante nos hidrolisados
H1 e H2 (TABELA V).
A assimilação do ácido foi acompanhada pelo aumento do pH do meio
(TABELA VIII). Comportamento semelhante foi observado em outros trabalhos
durante fermentações utilizando C. guilliermondii em meio sintético (FELIPE et al.,
1995) e em hidrolisado de bagaço (FELIPE et al., 1997b; SENE et al.,2000).
TABELA IIIIII- Consumo de ácido acético (%) por C. guilliermondii e variação de
pH durante as fermentações de hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar
submetido ao tratamento anterior (H1) e posterior (H2) à concentração a vácuo
Tempo (h)
T0
T12
T24
T48
T54
H1
Ácido Acético
(% consumo)
8,62%
19,54%
48,26%
60,63%
H2
Ácido Acético
(% consumo)
16,24%
34,76%
52,42%
76,92%
pH
5,33
5,30
5,34
5,50
5,55
pH
5,26
5,36
5,64
6,25
6,44
Os parâmetros fermentativos da bioconversão de xilose em xilitol por C.
guilliermondii em função do tratamento do hidrolisado anterior (H1) ou posterior
(H2) à etapa de concentração a vácuo estão apresentados na TABELA IX.
TABELA IX- Parâmetros fermentativos na bioconversão de xilose em xilitol por C.
guilliermondii em hidrolisado de bagaço de cana submetido ao tratamento anterior
(H1) e posterior (H2) à concentração a vácuo
YP/S (g/g)
QP (g/L.h)
η (%)
n° cel/mL
(x107)
T12
0,25
YP/S: rendimento
QP: produtividade volumétrica
η: eficiência de conversão
H1
Tempo (h)
T24
T48
0,46
0,20
50,16
2,30
5,13
T54
0,52
0,24
56,71
1,87
T12
1,60
H2
Tempo (h)
T24
T48
0,56
0,73
0,35
0,50
61,07 79,61
2,50
4,26
T54
0,77
0,51
83,97
1,63
T0=0,03x107cel/mL H1
T0=0,02x107cel/mL H2
34
Os resultados apresentados na TABELA IX confirmam o favorecimento da
formação de xilitol com o tratamento do hidrolisado posterior à concentração a
vácuo (H2). O máximo valor de rendimento (YP/S = 0,77g/g) e produtividade (QP =
0,51g/L/h) de xilitol foram obtidos nestas condições, o que corresponde ao
aumento de 48,08% e 113% respectivamente, em relação ao tratamento anterior
(H1). Tal comportamento pode ser decorrente da maior concentração de
compostos
tóxicos
à
levedura
presentes
neste
hidrolisado
(H1),
e
consequentemente maior inibição da conversão de xilose em xilitol. Observa-se
também uma tendência de favorecimento do aumento da concentração celular na
condição de desfavorecimento da formação de xilitol, ou seja, no hidrolisado
tratado anterior ao processo de concentração a vácuo (H1) (TABELA IX). Os
valores de rendimento e produtividade são semelhantes aos encontrados por
ALVES et al. (1998) que obtiveram, em pesquisas com C. guilliermondii durante
fermentação de hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar tratado posterior ao
processo de concentração os valores de produtividade, QP=0,52g/L/h e
rendimento, YP/S=0,79g/g após 45 e 63 horas de fermentação, respectivamente.
Para avaliar as diferenças entre H1 e H2 quanto à formação de xilitol, foi
realizado o teste estatístico de Student (teste t) onde constatou-se que existem
diferenças significativas entre H1 e H2, ao nível de confiança de 95%.
4.3- AVALIAÇÃO DA FORMA DE SUPLEMENTAÇÃO NUTRICIONAL DO
HIDROLISADO COM FARELO DE ARROZ
O hidrolisado tratado posterior à sua concentração a vácuo (H2) foi então
utilizado para se avaliar qual a melhor forma de sua suplementação com farelo de
arroz. O hidrolisado H2 correspondeu àquele em que o farelo foi autoclavado em
separado, na forma de uma solução, enquanto o F2 correspondeu àquele em que
o hidrolisado foi autoclavado junto com o farelo. Na TABELA X estão
apresentados os resultados referentes à composição dos hidrolisados H2 e F2.
Nestas duas condições, praticamente não existe diferença quanto ao teor dos
açúcares, principalmente xilose, bem como de ácido acético. No entanto, com
relação à concentração de furfural e fenóis totais, esta foi 4,5 e 6,7 vezes superior
quando o farelo foi autoclavado junto do hidrolisado (F2).
35
TABELA X- Características do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar após a adição de farelo de arroz autoclavado separado (H2) ou junto (F2)
do hidrolisado
Compostos (g/L)
Glicose
Xilose
Arabinose
Á Acético
Furfural
Hidroximetilfurfural
Fenóis Totais
H2
2,83
42,38
3,94
3,52
0,002
n.d.
0,089
F2
3,09
42,18
3,68
3,49
0,009
n.d.
0,595
Os resultados referentes às fermentações em meios formulados com os
hidrolisados (H2 e F2) confirmam o favorecimento do consumo de xilose (Fig. 7)
na condição de menor teor de compostos tóxicos (H2), sugerindo que não só o
ácido acético, mas também fenóis, mesmo que em baixas concentrações, podem
interferir na assimilação desta pentose.
100
Xilose (%)
80
60
40
20
0
12
1
48
3
24
2
54
4
Tempo (h)
FIGURA 7 - Consumo de xilose (%) por C.
guilliermondii durante as fermentações de hidrolisado
de bagaço de cana autoclavado separado (H2 -) ou
junto (F2 -ν) do farelo de arroz
Em relação à formação de xilitol, não se verificou influência significativa (ao
nível de 95% de confiança) em função da forma de suplementação do hidrolisado
com farelo de arroz (Fig. 8).
36
30
25
Xilitol (g/L)
20
15
10
5
0
24
2
12
1
48
3
54
4
Tempo (h)
FIGURA 8 - Formação de xilitol (g/L) por C.
guilliermondii durante as fermentações de
hidrolisado de bagaço de cana autoclavado
separado (H2 -) ou junto (F2 -ν) do farelo de arroz
Quanto ao consumo de glicose, este foi total para as duas condições
avaliadas, após 12 horas de fermentação. O rápido consumo de glicose foi
semelhante ao observado anteriormente (item 4.2), como também para a
assimilação de arabinose que foi parcial, observando-se maior consumo no final
da fermentação, o que corresponde à menor concentração de xilose no meio
(TABELA XI), não observando-se diferença significativa ao nível de 95% de
confiança para o consumo desta pentose entre H2 e F2.
TABELA XI- Concentração (g/L) e consumo (%) de arabinose durante as
fermentações por C. guilliermondii de hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar
autoclavado separado (H2) ou junto (F2) do farelo de arroz
H2
Tempo
(h)
T0
T12
T24
T48
T54
Concentração
(g/L)
3,39
3,25
3,18
2,69
1,95
F2
Arabinose
Consumo (%)
Concentração
(g/L)
3,25
4,13
3,77
6,19
3,16
20,65
2,46
42,48
1,02
Consumo
(%)
0,0
2,77
24,31
68,62
37
Quanto à assimilação do ácido acético, nota-se na TABELA XII o consumo
parcial deste e elevação do pH do meio para ambas as condições de preparo do
hidrolisado avaliadas (H2 e F2). Praticamente não houve nenhuma influência
destas condições na assimilação do ácido após 54h de fermentação.
TABELA XII- Consumo de ácido acético (%) e variação de pH durante as
fermentações por C. guilliermondii de hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar
autoclavado separado (H2) ou junto (F2) do farelo de arroz
H2
Ácido Acético
(% consumo)
16,24%
34,76%
52,42%
76,92%
Tempo (h)
T0
T12
T24
T48
T54
F2
Ácido Acético
(% consumo)
10,88%
21,15%
50,45%
79,76%
pH
5,26
5,36
5,64
6,25
6,44
pH
5,73
5,76
5,94
6,70
6,84
Na TABELA XIII encontram-se os valores dos parâmetros fermentativos
obtidos para as condições de autoclavagem do hidrolisado. Verifica-se que não é
possível estabelecer uma relação entre estas condições e o rendimento (YP/S) e a
produtividade (QP) de xilitol uma vez que não se observa diferenças significativas
(ao nível de confiança da 95%). O que se observa nitidamente na TABELA XIII é
o número máximo de células obtido quando o farelo foi autoclavado junto do
hidrolisado (F2).
TABELA XIII- Parâmetros fermentativos durante a bioconversão de xilose em
xilitol por C. guilliermondii em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar
autoclavado separado (H2) ou junto (F2) do farelo de arroz
YP/S (g/g)
QP (g/L.h)
η (%)
n° cel/mL
(x107)
T12
1,60
H2
Tempo (h)
T24
T48
0,56
0,73
0,35
0,50
61,07 79,61
2,50
4,26
YP/S: rendimento
QP: produtividade volumétrica
η: eficiência de conversão
T54
0,77
0,51
83,97
1,63
T12
6,09
F2
Tempo (h)
T24
T48
0,60
0,73
0,27
0,48
65,43 79,61
5,76
5,38
T54
0,84
0,55
91,60
7,66
T0=0,02x107cel/mL H2
T0=0,03x107cel/mL F2
38
Os valores de produtividade e rendimento de xilitol encontrados para o
hidrolisado autoclavado separado do farelo (H2) estão em conformidade com os
obtidos por outros autores em fermentação de hidrolisado hemicelulósico de
bagaço de cana suplementado com farelo nas mesmas condições por C.
guilliermondii (FELIPE et al., 1997a; ALVES et al., 1998; SENE et al., 2000).
Os experimentos contemplados nos itens 4.2 e 4.3 possibilitaram
estabelecer a melhor condição de tratamento e concentração do hidrolisado no
que se refere à ordem de execução das etapas, bem como à forma de
suplementação do hidrolisado com o farelo de arroz. Desta forma foi então
estabelecido o tratamento do hidrolisado posterior à etapa de concentração a
vácuo e a sua suplementação com farelo na forma de solução, ou seja, a
autoclavagem desta antes de ser adicionado ao hidrolisado. Estas condições
foram empregadas para a avaliação do efeito da adição de ácido acético em
diferentes fases do crescimento da levedura.
39
4.4-
AVALIAÇÃO
DO
EFEITO
DO
ÁCIDO
ACÉTICO
SOBRE
A
BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL EM HIDROLISADO DE
BAGAÇO
Para a avaliação do efeito do ácido acético nesta bioconversão, 2,0g/L
deste ácido foram adicionados ao hidrolisado já contendo 3,5g/L deste ácido,
perfazendo uma concentração final no meio em torno de 5,0g/L, concentração
esta considerada inibitória a este processo (FELIPE et al., 1995). A adição
ocorreu no início da fermentação, bem como nos tempos correspondentes a 12,
24 e 48 horas de fermentação, de forma a se avaliar se o seu efeito inibitório está
relacionado à fase de crescimento da levedura. Foi também conduzido
experimento controle, ou seja, fermentação sem adição de ácido ao hidrolisado.
Os resultados referentes à influência da adição de ácido sobre o consumo de
xilose estão apresentados na FIGURA 9.
45
40
35
Xilose (g/L)
30
25
20
15
10
5
0
0
12
24
36
48
60
Tempo (h)
FIGURA 9 - Concentração de xilose (g/L)
durante as fermentações de hidrolisado de
bagaço de cana por C. guilliermondii sem adição
de ácido acético () e com adição de 2,0g/L
deste nos tempos inicial ( ), 12 (), 24 (+) e 48
(x) horas de fermentação.
40
Estes resultados sugerem que a inibição do consumo de xilose exercida
pelo ácido acético é dependente da fase de crescimento da levedura.
Possivelmente, quando as células estão expostas ao maior teor de ácido o ATP
formado é requerido para manter o pH citoplasmático próximo ao neutro, já que a
entrada deste acarreta em acidificação do citoplasma (NODA et al., 1982;
HERRERO et al., 1985; PAMPULHA et al., 1989). Segundo HERRERO et al.
(1985) o ácido acético estaria funcionando como desacoplador da produção de
energia e do transporte de xilose. De fato, o período correspondente à adição de
ácido (12h) se refere à fase de máxima atividade celular, uma vez que após o
esgotamento da glicose (nas primeiras 12 horas), as células estariam se
preparando para a indução das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase,
responsáveis pelos passos iniciais de assimilação de xilose (HAHN-HÄNGERDAL
et al., 1994). ALVES (2001) constatou que o efeito inibitório do ácido acético
sobre a atividade das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase é também
dependente da presença de outros compostos no hidrolisado, como fenóis,
conforme resultados de fermentações em hidrolisado hemicelulósico de bagaço
de cana por C. guilliermondii.
Observando as curvas de consumo de xilose na FIGURA 9, nota-se que
tanto na condição onde não houve adição de ácido (controle), quanto na condição
de adição após 48h de cultivo, a xilose presente no meio foi totalmente consumida
após 54h de fermentação. Em todas as outras condições avaliadas o consumo de
xilose foi prejudicado pela adição de ácido acético durante o processo
fermentativo. A condição experimental em que a adição de ácido acético ocorreu
após 12h de fermentação é a que apresenta diferenças significativas (ao nível de
confiança de 95%) em relação à condição sem adição de ácido (controle). Nesta
condição verifica-se consumo de 76,78% de xilose, após 54h de fermentação,
representando uma redução de 23,22% no consumo deste açúcar, em relação à
condição onde não houve adição deste ácido.
Em relação à arabinose (Fig. 10), verifica-se que seu consumo ocorreu
lentamente junto com o consumo dos demais açúcares durante a fermentação,
conforme verificado anteriormente (itens 4.2 e 4.3). Verifica-se também que
comportamento semelhante ao ocorrido para o consumo de xilose ocorreu para a
arabinose, observando-se que a adição de ácido após 12h de fermentação
resultou em menor consumo desta pentose (4,13%), que corresponde a uma
41
redução de 84,54% em relação à condição sem adição de ácido, após 54h de
fermentação.
3,8
Arabinose (g/L)
3,6
3,4
3,2
3,0
2,8
2,6
0
12
24
36
48
60
Tempo (h)
FIGURA 10 - Concentração de arabinose (g/L)
durante as fermentações de hidrolisado de bagaço
de cana por C. guilliermondii sem adição de ácido
acético () e com adição de 2,0 g/L deste nos
tempos inicial ( ), 12 (), 24 (+) e 48 (x) horas de
fermentação.
FELIPE et al. (1997b) também observaram a inibição do consumo de xilose
e arabinose exercida pelo ácido acético na concentração em torno de 4,5g/L
quando o hidrolisado de bagaço de cana de açúcar foi utilizado por C.
guilliermondii .
Segundo van ZYL et al. (1991), na fermentação alcóolica empregando P.
stipitis em meio sintético com adição de ácido acético (10g/L) no início do
processo foi constatado redução (22%) da velocidade de utilização de xilose,
levando à diminuição dos valores de rendimento e produtividade de etanol.
Conforme observado anteriormente, a glicose foi totalmente consumida nas
primeiras 12h de cultivo para todos os tempos de adição de ácido testados. A não
existência de efeito inibitório do ácido na assimilação de glicose em função do
42
tempo de fermentação em que este foi adicionado pode estar relacionada ao fato
de que neste tempo de amostragem (12h) a glicose já havia sido totalmente
assimilada, dado à baixa concentração em que esta se encontrava no meio
(2,3g/L). Além disto, sendo as enzimas envolvidas na utilização desta hexose
constitutivas (DAWES, SUTHERLAND, 1992) e podendo o sistema de transporte
de glicose ser diferente ao de xilose, além deste mecanismo não ser ainda
totalmente esclarecido (WINKELHAUSEN et al., 1998), possivelmente o efeito
observado de maior inibição no tempo de adição de ácido de 12h poderia não ser
o mesmo para a glicose. Segundo LAWFORD, ROUSSEAU (1993), durante
fermentação de mistura de xilose e glicose por um recombinante Escherichia coli
B, o consumo de glicose se apresentou mais rápido em relação ao de xilose.
FELIPE et al. (1995) também relataram que a glicose presente no meio foi
inteiramente consumida indiferentemente da concentração de ácido utilizada, em
fermentações de meio semi-sintético por C. guilliermondii.
Além do consumo de xilose e arabinose terem sido influenciados pelo
tempo de adição do ácido, observou-se um maior efeito inibitório pela adição
deste, após 12h de fermentação. Observou-se também o efeito inibitório no
crescimento celular (Fig. 11), o que confirma a hipótese de que o efeito inibitório
causado pelo ácido acético não está relacionado apenas à sua concentração no
meio, mas à fase de crescimento da levedura. No entanto, diferente do observado
para o consumo de xilose e arabinose, o efeito tóxico do ácido sobre a formação
de biomassa foi observado para todas as condições avaliadas, independente do
tempo de adição do ácido na fermentação .
Segundo dados apresentados na FIGURA 11, observa-se que o menor
crescimento celular (4,83x107 cel/mL) após 48h de fermentação, ocorreu para a
condição em que a adição de ácido acético ocorreu após 12h de fermentação,
correspondendo a uma redução de 48,45% e 47,78% em relação ao experimento
controle e àquele em que a adição de ácido ocorreu no tempo inicial,
respectivamente.
Uma vez que o maior efeito inibitório do ácido quer na assimilação de
xilose quer na formação de células ocorreu na condição de adição de ácido após
12h de fermentação, observou-se também nestas condições o menor acúmulo de
xilitol no meio conforme apresentado na FIGURA 11.
43
25
A
10
20
7
Número de células (x10 cel/mL)
12
8
10
4
Xilitol (g/L)
15
6
5
2
0
0
12
24
36
0
60
48
Tempo (h)
25
10
20
7
7
20
C
8
6
2,0g/L
ácido acético
10
4
Xilitol (g/L)
15
5
2
0
0
12
24
36
48
0
60
8
15
6
10
4
2,0g/L
ácido acético
0
12
Tempo (h)
24
36
48
0
60
Tempo (h)
25
12
D
10
25
E
10
20
7
7
20
Número de células (x10 cel/mL)
12
8
6
10
4
5
2
2,0g/L
ácido acético
0
0
12
24
36
Tempo (h)
48
0
60
Xilitol (g/L)
15
8
2,0g/L
ácido acético
15
6
10
4
5
2
0
0
12
24
36
48
Tempo (h)
FIGURA 11 - Crescimento celular (…) e formação de xilitol ( ) nas fermentações de
hidrolisado de bagaço de cana por C. guilliermondii sem adição de ácido acético (A) e com
a adição de 2,0g/L deste nos tempos inicial (B), 12 (C), 24 (D) e 48 (E) horas de
incubação.
0
60
Xilitol (g/L)
Número de células (x10 cel/mL)
5
2
0
Xilitol (g/L)
Número de células (x10 cel/mL)
10
25
12
B
Número de células (x10 cel/mL)
12
44
Observa-se também na FIGURA 11 que, no tempo correspondente a 48h
de fermentação, encontram-se os maiores valores de produção de xilitol para
todas as condições avaliadas, verificando-se após este período, o decréscimo da
concentração deste açúcar. A redução na concentração de xilitol está relacionada
à sua utilização como fonte de carbono pela levedura em função do baixo teor de
xilose no meio, conforme já observado por SENE (1996). Semelhante ao ocorrido
para o consumo de xilose, a adição de ácido ao hidrolisado após 12h causou
maior efeito inibitório na bioconversão de xilose em xilitol, já que nesta condição,
menor quantidade de xilitol foi formada (9,47g/L), o que corresponde à redução de
55,29% e 52,56% em relação ao experimento em que o ácido não foi adicionado
(controle) e à condição de adição no início da fermentação, respectivamente.
Nas FIGURAS 12A e 12B estão apresentados os comportamentos dos
parâmetros fermentativos da bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii
em função da adição de ácido acético ao hidrolisado nos diferentes tempos de
fermentação.
0,7
0,5
A
B
0,6
0,4
QP (g/L.h)
YP/S (g/g)
0,5
0,4
0,3
0,3
0,2
0,2
0,1
0,1
0,0
0
12
24
36
Tempo (h)
48
60
0,0
0
12
24
36
48
Tempo (h)
FIGURA 12 - Rendimento (A) e Produtividade (B) de xilitol nas fermentações de hidrolisado
de bagaço de cana por C. guilliermondii sem adição de ácido acético () e com adição de
2,0 g/L deste nos tempos inicial ( ), 12 (), 24 (+) e 48 (x) horas de fermentação.
O máximo valor de rendimento (YP/S= 0,62g/g) e produtividade (QP=
0,46g/L.h) de xilitol foram obtidos, após 48h de fermentação, na condição
experimental onde não houve adição de ácido acético, indicando uma eficiência
de conversão (η) de 67,61%. Neste mesmo tempo de amostragem observa-se
que na condição em que adicionou-se ácido acético após 12h de cultivo
60
45
encontram-se os menores valores de rendimento (YP/S=0,39g/g) e produtividade
(QP= 0,22g/L.h) de xilitol, o que corresponde a uma redução de 37,10% e 52,17%,
respectivamente, em relação à condição sem adição de ácido. Segundo FELIPE
et al. (1995), durante a fermentação em meio semi-sintético contendo 60,0g/L de
xilose por C. guilliermondii foram constatadas reduções de 8,33% e 22,45% nos
valores de rendimento e produtividade em xilitol, respectivamente, quando 6,0g/L
de ácido foi adicionado ao meio no início da fermentação. Em pesquisas
conduzidas por MORITA et al. (2000b) durante fermentação empregando C.
guilliermondii em hidrolisado de bagaço de cana contendo em torno de 50,0g/L de
xilose e 4,9g/L de ácido acético, foram encontrados os valores de YP/s e QP de
0,61g/g e 0,38g/L.h respectivamente. Estes valores são próximos aos
encontrados neste trabalho para a condição de adição de ácido acético no tempo
inicial, onde YP/S=0,56g/g e QP=0,39g/L.h.
Esses resultados confirmam o efeito prejudicial do ácido acético após 12h
de fermentação sobre a bioconversão de xilose em xilitol, o que resultou não só
na interferência da capacidade de assimilação de xilose e conversão em xilitol
pela levedura (YP/S), mas também na velocidade de formação do produto (QP).
Semelhante ao observado nos experimentos anteriores, verifica-se o
consumo de ácido acético pela levedura com conseqüente aumento do pH do
meio para todas as condições avaliadas (TABELA XIV). De acordo com estes
resultados, menor assimilação deste ácido (30,58%) ocorreu na condição de sua
adição ao hidrolisado após 12h, o que sugere a interferência deste ácido não só
na via de assimilação de xilose e formação de xilitol, mas também no seu próprio
metabolismo.
TABELA XIV - Consumo (%) de ácido acético e variação do pH durante as fermentações de hidrolisado de bagaço de cana-deaçúcar por C. guilliermondii, com adição de ácido acético (2,0g/L) em diferentes tempos de fermentação
Tempo (h) de adição do ácido
Temp
o (h)
Controle*
ácido
acético (% pH
consumo)
T0
T12
ácido acético
(% consumo) pH
T24
ácido acético
(% consumo) pH
T48
ácido acético
(% consumo) pH
ácido acético
(% consumo) pH
T0
-
5,51
-
5,57
-
5,51
-
5,51
-
5,51
T12
6,31
5,58
12,72
5,47
11,11
4,85
9,61
5,57
9,91
5,57
T24
20,12
5,72
16,57
5,51
15,09
4,85
23,12
4,87
26,13
5,80
T48
43,84
6,16
36,61
6,09
22,961
5,05
35,88
4,95
49,25
4,80
42,00
6,28
30,58
5,00
40,06
5,00
49,86
4,84
51,05
6,27
T54
*sem adição de ácido acético
46
47
4.5-
AVALIAÇÃO
DO
EFEITO
DO
ÁCIDO
ACÉTICO
SOBRE
A
BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL EM MEIO SIMULANDO A
COMPOSIÇÃO DO HIDROLISADO
Tendo em vista que no hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar
encontram-se
compostos
presentes,
considerados
mesmo
que
inibitórios
em
ao
baixas
concentrações,
metabolismo
da
outros
levedura
e
consequentemente, à produção de xilitol, os ensaios fermentativos foram
realizados em meio simulando a composição do hidrolisado quanto ao teor de
glicose (1,94g/L), xilose (41,18g/L), arabinose (4,02g/L) e ácido acético (3,48g/L)
porém, sem a adição de furfural, hidroximetilfurfural, compostos fenólicos e outros
compostos presentes em baixas concentrações no hidrolisado (TABELA IV).
Desta forma, buscou-se avaliar o efeito prejudicial do ácido acético na
bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii quando de sua adição ao
meio de cultivo em diferentes tempos de fermentação (conforme realizado na
fermentação de hidrolisado).
45
40
35
Xilose (g/L)
30
25
20
15
10
5
0
0
12
24
36
48
60
Tempo (h)
FIGURA 13 - Concentração de xilose (g/L) durante
as fermentações de meio simulando a composição
do hidrolisado por C. guilliermondii sem adição de
ácido acético () e com adição de 2,0 g/L deste
nos tempos inicial ( ), 12 (), 24 (+) e 48 (x)
horas de fermentação.
48
Conforme os resultados apresentados na FIGURA 13, verifica-se que,
semelhante ao observado nos experimentos realizados em hidrolisado (Fig. 7), a
adição de ácido acético ao meio simulando a composição do hidrolisado também
resultou em assimilação mais lenta de xilose, sendo o maior efeito inibitório
observado quando a adição deste ácido ocorreu após 12h de fermentação. Nesta
condição verifica-se consumo de 63,92% de xilose, representando uma redução
de 36,08% em relação à condição sem adição de ácido, onde o consumo da
xilose foi total (Fig. 13).
A adição de ácido ao meio também prejudicou o consumo de arabinose
(Fig. 14), sendo que o maior efeito inibitório foi observado pela adição após 12h,
semelhante ao observado para a xilose, o que resultou em assimilação de 23,72%
de arabinose, significando redução de 69,11% em relação ao controle.
4,5
4,0
Arabinose (g/L)
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
12
24
36
48
60
Tempo (h)
FIGURA 14 - Concentração de arabinose (g/L) nas
fermentações de meio simulando a composição do
hidrolisado por C. guilliermondii sem adição de ácido
acético () e com adição de 2,0 g/L deste nos
tempos inicial ( ), 12h (), 24h (+) e 48h (x) de
fermentação.
Nota-se também na FIGURA 14, que no experimento sem a adição de
ácido ocorreu o maior consumo de arabinose (76,79%) após 54h de fermentação,
diferente do encontrado na fermentação de hidrolisado, onde apenas 26,72%
desta pentose foi consumida neste mesmo tempo (Fig. 10). Esta diferença no
49
consumo de arabinose pode ser decorrente do fato da toxicidade do ácido à
levedura ser potencializada pela presença dos outros compostos tóxicos,
principalmente fenóis.
Em relação ao consumo de glicose, semelhante ao ocorrido nos
experimentos anteriores, esta foi totalmente consumida nas primeiras 12h de
fermentação, para todas as condições avaliadas.
O crescimento celular e a formação de xilitol durante a fermentação de
meio simulando a composição do hidrolisado por C. guilliermondii com adição de
ácido acético em diferentes fases do crescimento da levedura estão apresentados
na FIGURA 15. Nota-se que a adição de ácido ao meio no tempo inicial de
fermentação prejudicou a formação de xilitol mas não a de células durante as
primeiras 12h de fermentação (Fig. 15B), provavelmente pela utilização da xilose,
neste período, para a obtenção de ATP e formação de biomassa. Quando este
ácido foi adicionado após 12h, verificou-se redução de 45,87% na população de
células, no período entre 12 e 48 horas de fermentação, em relação ao controle.
Além disto, observou-se que após a adição de ácido ao meio a formação de
células foi praticamente paralisada, não acontecendo o mesmo para a formação
de xilitol (Fig. 15 C).
Semelhante ao observado para o consumo de xilose, na condição de
adição de ácido após 48h de fermentação e no controle foi encontrado
concentração celular semelhante (Fig. 15). Além disto, a adição de ácido após 48
horas de fermentação não influenciou na formação de xilitol (Fig. 15 A-E).
Por outro lado, semelhante ao ocorrido para o hidrolisado, a condição de
adição de ácido após 12h prejudicou a formação de xilitol, reduzindo em 78,59% a
concentração deste em relação ao controle.
50
12
30
25
8
20
6
15
4
10
2
5
7
10
0
0
12
24
36
48
Xilitol (g/L)
Número de células (x10 cel/mL)
A
0
60
Tempo (h)
30
30
12
B
25
8
20
15
2,0g/L
ácido acético
4
10
2
Xilitol (g/L)
6
5
0
0
12
24
36
48
10
25
8
20
6
15
7
7
10
Número de células (x10 cel/mL)
C
10
4
2,0g/L
ácido acético
2
0
12
24
0
60
30
E
10
25
8
20
6
15
7
2,0g/L
ácido acético
20
15
4
10
2
5
0
36
Tempo (h)
48
0
60
2,0g/L
ácido acético
4
10
Xilitol (g/L)
6
24
Número de células (x10 cel/mL)
7
25
10
Xilitol (g/L)
Número de células (x10 cel/mL)
D
12
48
12
30
12
0
36
Tempo (h)
Tempo (h)
8
5
0
0
60
Xilitol (g/L)
Número de células (x10 cel/mL)
12
5
2
0
0
12
24
36
48
0
60
Tempo (h)
FIGURA 15 - Crescimento celular ({) e formação de xilitol () nas fermentações de meio
simulando a composição do hidrolisado por C. guilliermondii sem adição de ácido acético (A) e
com adição de 2,0g/l deste nos tempos inicial (B), 12 (C), 24 (D) e 48 (E) horas de incubação.
51
0,8
0,6
A
B
0,7
0,5
0,6
0,4
QP (g/L.h)
YP/S (g/g)
0,5
0,4
0,3
0,3
0,2
0,2
0,1
0,1
0,0
0,0
0
12
24
36
48
60
Tempo (h)
0
12
24
36
48
60
Tempo (h)
FIGURA 16 - Rendimento (A) e Produtividade (B) de xilitol durante as fermentações de meio
simulando a composição do hidrolisado por C. guilliermondii sem adição de ácido acético ()
e com adição de 2,0g/L deste nos tempos inicial ( ), 12 (), 24 (+) e 48 (x) horas de
fermentação.
Na FIGURA 16 encontram-se os valores referentes aos parâmetros
fermentativos avaliados, confirmando que a adição de ácido ao meio após 12h de
fermentação resultou em maior efeito inibitório sobre a bioconversão de xilose em
xilitol por C. guilliermondii.
Semelhante ao ocorrido no experimento utilizando-se hidrolisado, na
fermentação do meio simulado os máximos valores de rendimento (YP/S=0,74g/g)
e produtividade (QP=0,50g/L.h) de xilitol foram obtidos, após 48h de cultivo,
quando não houve adição de ácido acético (controle), indicando uma eficiência de
conversão (η) de 80,7%. Neste mesmo tempo de amostragem observa-se que na
condição em que se adicionou ácido acético após 12h de cultivo encontram-se os
menores valores de rendimento (YP/S=0,24g/g) e produtividade (QP=0,11g/L.h) de
xilitol, o que corresponde a uma redução de 67,57% e 78,0%, respectivamente,
em relação ao controle.
Observando-se as curvas de rendimento de xilitol referentes às condições
de adição de ácido no tempo inicial e após 12h de cultivo, verifica-se
comportamento semelhante, apesar da diferença de valores. Em ambas as
condições verifica-se que o rendimento em xilitol manteve-se praticamente
constante entre os tempos 24 e 54 horas de fermentação (Fig. 16).
Na fermentação em que o ácido foi adicionado ao meio após 48h ocorreu
comportamento semelhante ao controle, o que confirma o comentado para o
consumo de xilose e formação de xilitol.
52
Quanto ao consumo de ácido acético, semelhante ao observado nos
ensaios com hidrolisado, a adição deste ácido ao meio acarretou sua menor
assimilação pela levedura em todas as condições testadas. A menor assimilação
deste ácido (55,04%) ocorreu quando sua adição foi feita no início da
fermentação, representando redução de 30,94% em relação ao controle. Como já
esperado, a assimilação de ácido foi acompanhada pelo aumento do pH do meio
decorrente da sua assimilação pela levedura (TABELA XV).
Apesar do consumo de ácido acético ter sido menor nas condições em que
este foi adicionado ao meio, sua assimilação foi maior (em média 58%) nas
fermentações conduzidas em meio semi-sintético simulando a composição do
hidrolisado do que nas fermentações conduzidas com o próprio hidrolisado (Fig.
17A). Comportamento semelhante também é observado para o consumo de
arabinose, que foi em média 4 vezes maior nos experimentos em meio simulando
a composição do hidrolisado (Fig. 17B).
90
A
B
80
80
70
70
60
60
Arabinose (%)
Ácido acético (%)
90
50
40
30
50
40
30
20
20
10
10
0
sem
1
adição
T20
T312
T424
Tempos de adição de ácido (h)
T548
0
sem
1
adição
T20
T312
T424
T548
Tempos de adição de ácido (h)
FIGURA 17 - Consumo de ácido acético (A) e arabinose (B) nas fermentações de hidrolisado
(ν) e de meio semi-sintético simulando a composição do hidrolisado () por C. guilliermondii
com adição de ácido acético (2,0g/L) em diferentes tempos de fermentação.
Uma possível explicação para esse maior consumo de ácido acético e
arabinose seria o fato de que no meio simulando o hidrolisado não estão
presentes outros compostos inibitórios ao metabolismo da levedura, tais como:
furfural, hidroximetilfurfural e compostos fenólicos que, juntos com o ácido acético,
exercem
TABELA XV - Consumo (%) de ácido acético e variação de pH durante fermentação de meio simulando a composição do
hidrolisado por C. guilliermondii, com adição de ácido acético (2,0g/L) em diferentes tempos de fermentação
Tempo (h) de adição de ácido
Temp
o (h)
Controle*
ácido
acético (% pH
consumo)
T0
T12
ácido acético
(% consumo) pH
T24
ácido acético
(% consumo) pH
T48
ácido acético
(% consumo) pH
ácido acético
(% consumo) pH
T0
-
5,30
-
5,55
-
5,30
-
5,30
-
5,30
T12
22,69
5,33
25,37
5,62
25,97
4,28
28,36
5,33
31,94
5,34
T24
41,19
5,75
28,36
5,73
37,08
4,27
40,60
4,75
36,12
5,66
T48
70,15
6,77
46,08
5,90
57,68
4,34
63,38
4,84
70,75
4,77
55,04
6,00
59,99
4,36
63,66
4,93
74,19
4,80
79,70
6,87
T54
*sem adição de ácido acético
53
54
efeito sinergístico causando inibição da atividade fermentativa (VOGEL et al.,
1998). Isto sugere que o efeito tóxico do ácido acético à levedura pode ser
potencializado pelos outros compostos tóxicos, principalmente quando a adição
deste ao hidrolisado ou em meio simulando a composição deste foi após 12h.
A análise dos resultados indica que o efeito inibitório de alta concentração
de ácido acético sobre a bioconversão de xilose em xilitol é dependente da fase
de crescimento de C. guilliermondii. Alta concentração deste ácido provocou
efeito tóxico mais marcante quando este foi adicionado ao meio após 12h de
fermentação, período que corresponde, aproximadamente, à fase de crescimento
exponencial. Nesta condição observou-se menor consumo de açúcares e do
próprio ácido, bem como menor formação de xilitol e células.
55
4.6- AVALIAÇÃO DO CULTIVO DO INÓCULO EM MEIO CONTENDO
CONCENTRAÇÕES CRESCENTES DE ÁCIDO ACÉTICO COMO
FORMA DE MINIMIZAR A TOXICIDADE DO HIDROLISADO
DURANTE A FERMENTAÇÃO
Para este estudo as células de C. guilliermondii foram cultivadas em meio
sintético sem ácido acético (C1), de C1 seguido do cultivo em hidrolisado
contendo 3,5g/L de ácido (C2) e de C2 seguido do cultivo em hidrolisado
contendo 5,0g/L de ácido (C3), por períodos de 24h em cada meio, sendo as
fermentações realizadas em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar com a adição de 2,0g/L de ácido após 12h de fermentação, período
correspondente à condição de maior efeito inibitório do ácido acético sobre a
bioconversão de xilose em xilitol.
Os
resultados
apresentados
na
FIGURA
18
evidenciam
que
o
comportamento da fermentação do hidrolisado empregando-se inóculo obtido de
células cultivadas em ácido acético (C2 e C3) foi semelhante quanto ao consumo
de xilose e arabinose, enquanto que a condição de inóculo obtido de meio
sintético (C1) resultou em menor assimilação destes açúcares. O maior efeito foi
observado quanto ao consumo de arabinose que foi, após 54h, em torno de 80%
menor na condição de inóculo C1 em relação às condições C2 e C3.
90
C1
80
Xilose e Arabinose (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
12
20
30
24
40
50
48
60
70
54
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
80 0
C3
C2
80
60
40
20
10
12
20
30
24
40
50
48
60
70
54
0
80 0
10
12
20
30
24
40
50
48
60
70
54
Tempo (h)
FIGURA 18 - Consumo (%) de xilose (ν) e arabinose () nas fermentações de
hidrolisado de bagaço de cana por C. guilliermondii com adição de ácido acético
(2,0g/L) após 12h de fermentação, em função dos inóculos obtidos de células
cultivadas em meio sintético (C1), de C1 seguido do cultivo em hidrolisado com 3,5g/L
de ácido (C2), e C2 seguido do cultivo em hidrolisado com 5,0g/L de ácido (C3).
80
56
Semelhante ao ocorrido nos experimentos anteriores, toda glicose foi
consumida nas primeiras 12h de fermentação, independente da condição de
inóculo utilizada .
7
Número de células (x10 cel/mL)
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
12
24
36
48
60
Tempo (h)
FIGURA 19 - Crescimento celular durante as
fermentações de hidrolisado de bagaço de cana por C.
guilliermondii com adição de ácido acético (2,0g/L) após
12h de fermentação, em função dos inóculos obtidos de
células cultivadas em meio sintético (C1 ), de C1
seguido do cultivo em hidrolisado com 3,5g/L de ácido (C2
) e C2 seguido do cultivo em hidrolisado com 5,0g/L de
ácido (C3 ).
Na FIGURA 19 observa-se nas primeiras 12h um rápido aumento na
população de células, praticamente o mesmo comportamento para as diferentes
condições de inóculo empregadas. Entretanto, a partir deste tempo, ocorreram
variações, encontrando-se após 54h de fermentação, tempo correspondente a um
consumo de xilose superior a 80% para as condições de inóculo C2 e C3 (Fig.
18), um aumento da concentração de células de 23,2% para C1 e de 53,16% para
C3 em relação a C2, deixando evidente o favorecimento da formação de células
pelo cultivo prévio do inóculo em hidrolisado contendo a maior concentração de
ácido.
As
condições
de
favorecimento
do
crescimento
celular
também
correspondem àquelas para a maior formação de xilitol (Fig. 20). Observa-se
57
ainda na FIGURA 20 que no final da fermentação a menor concentração de xilitol
(9,47g/L) ocorreu quando o inóculo foi cultivado apenas em meio sintético (C1), e
a maior concentração de xilitol (13,13g/L) com inóculo obtido de C2 seguido do
cultivo em hidrolisado com 5,0g/L de ácido acético (C3). Tal comportamento
sugere que o prévio cultivo das células de C. guilliermondii em meio contendo
ácido acético pode contornar o problema da toxicidade causada por este ácido,
sendo este efeito dependente de sua concentração no meio.
16
14
Xilitol (g/L)
12
10
8
6
4
2
0
0
12
24
36
48
60
Tempo (h)
FIGURA 20 - Formação de xilitol nas fermentações
de hidrolisado de bagaço de cana por C.
guilliermondii com adição de ácido acético (2,0g/L)
após 12h de fermentação, em função dos inóculos
obtidos de células cultivadas em meio sintético (C1
), de C1 seguido do cultivo em hidrolisado com
3,5g/L de ácido (C2 ) e C2 seguido do cultivo em
hidrolisado com 5,0g/L de ácido (C3 ).
A presença de ácido acético durante o cultivo do inóculo parece interferir
na bioconversão de xilose em xilitol, já que ao se observar a FIGURA 20, quanto
maior a concentração de ácido no meio de cultivo do inóculo, maior a
concentração de xilitol obtida após 54h (Fig. 20), possivelmente devido a uma
maior tolerância das células a este ácido quando expostas a ele antes da
fermentação. O decréscimo da concentração de xilitol observado no final da
fermentação (Fig. 20) na condição de cultivo de inóculo em meio sintético pode
58
estar relacionado ao seu consumo conforme já constatado por GIRIO et al. (1990)
no cultivo de Debaryomyces hansenii, onde xilitol e etanol foram consumidos após
o esgotamento da xilose do meio e por CARVALHO (2000) em fermentação de C.
guilliermondii
em
hidrolisado
de
bagaço
de
cana-de-açúcar
quando
a
concentração de xilose apresentava valores próximos a 0g/L.
Na TABELA XVI estão apresentados os valores dos parâmetros
fermentativos referentes a esta bioconversão em função das diferentes condições
de inóculo avaliadas, durante fermentação em hidrolisado e com adição de ácido
acético após 12h de cultivo.
TABELA XVI- Parâmetros fermentativos durante a bioconversão de xilose em
xilitol por C. guilliermondii em hidrolisado de bagaço de cana com adição de ácido
acético (2,0g/L) após 12h de cultivo, em função dos inóculos (C1, C2, C3) obtidos
de células cultivadas em concentrações crescentes de ácido acético.
T12
C1
C2
C3
Tempo (h)
Tempo (h)
Tempo (h)
T24
T48
T54
T12
T24
T48
T54
T12
T24
T48
T54
YP/S (g/g) 0,32 0,26 0,39 0,32 0,41 0,25 0,37 0,38 0,70 0,36 0,40 0,38
QP (g/L.h) 0,19 0,15 0,22 0,18 0,16 0,17 0,23 0,24 0,37 0,27 0,27 0,24
η (%)
34,9 28,3 42,5 34,9 45,2 27,8 40,6 41,7 75,9 39,6 44,2 41,9
De acordo com os resultados apresentados nota-se que o cultivo de inóculo
em meio contendo ácido acético parece favorecer a bioconversão de xilose em
xilitol por C. guilliermondii no início do processo. Verifica-se que nas primeiras 12
horas esta condição de inóculo propiciou os máximos valores de rendimento
(0,70g/g) e produtividade (0,37g/L.h) de xilitol, correspondendo a um aumento de
118,75% e 94,74% nestes valores respectivamente, quando comparado ao
cultivado em meio sem ácido (C1).
Semelhante ao observado para o consumo de xilose e formação de xilitol, foi
também verificado para o consumo de ácido pela levedura, conforme observado
na TABELA XVII, confirmando que a adaptação da levedura aumentaria a sua
resistência aos compostos tóxicos presentes no hidrolisado.
59
TABELA IVVII- Consumo de ácido acético (%) e variação de pH durante as
fermentações de hidrolisado de bagaço de cana por C. guilliermondii com adição
de ácido acético (2,0g/L) após 12h de cultivo em função dos inóculos(C1, C2, C3)
obtidos de células cultivadas em concentrações crescentes de ácido acético
C1
Ác. Acético
(% consumo)
C2
pH
C3
Ác. Acético
(% consumo) pH
Ác. Acético
(% consumo) pH
T0
-
5,51
-
5,51
-
5,52
11,11
4,85
16,00
4,82
29,41
4,79
15,09
4,85
24,50
4,85
38,96
4,83
22,96
5,05
36,00
4,96
56,80
5,05
30,58
5,00
43,75
5,12
56,80
5,03
T12
T24
T48
T54
Cabe também relatar que foi constatada a presença de glicerol em todos os
ensaios experimentais sobre o efeito do ácido acético na bioconversão de xilose
em xilitol, porém em concentrações muito baixas. Desta forma não foi possível
avaliar a existência de uma relação entre a toxicidade do ácido acético à levedura
e a formação deste subproduto. De acordo com YAHASHI et al. (1996), a
formação de glicerol foi também constatada durante a formação de xilitol por C.
tropicalis em meio contendo mistura de xilose e glicose. RODRIGUES (1999)
verificou a formação de glicerol na fermentação de C. guilliermondii em
hidrolisado de bagaço de cana.
Observa-se ainda que para todos os ensaios foi constatada que a
viabilidade celular foi superior a 98%.
60
5- CONCLUSÕES
Em função dos resultados apresentados é possível concluir que:
•
A etapa de concentração do hidrolisado anterior ao seu tratamento (H2)
resultou em maior remoção de inibidores, favorecendo a assimilação de
xilose, o que proporcionou maiores valores de rendimento e
produtividade de xilitol em relação ao hidrolisado tratado anterior à sua
concentração (H1).
•
O preparo do farelo de arroz em separado do hidrolisado (H2)
proporcionou menor concentração de compostos tóxicos, menor perda
de xilose, e maior produtividade de xilitol em relação à condição em que
o farelo foi preparado juntamente com o hidrolisado (F2).
•
O efeito inibitório do ácido acético sobre a bioconversão de xilose em
xilitol por Candida guilliermondii foi dependente da fase de crescimento
da levedura, sendo este mais marcante quando o ácido se encontrava
em maior concentração no meio após 12 horas de cultivo, tempo
correspondente à máxima atividade metabólica da levedura.
•
O efeito tóxico do ácido acético à levedura parece ser potencializado
pela presença de outros compostos tóxicos no hidrolisado, tais como
furfural, hidroximetilfurfural e fenóis, uma vez que maiores valores de
rendimento e produtividade de xilitol foram obtidos com a utilização de
meio simulando a composição do hidrolisado, contendo apenas o ácido
acético como componente tóxico.
•
O favorecimento da formação de xilitol com a utilização de inóculo
obtido de células cultivadas em meio contendo concentrações
crescentes de ácido foi evidente nas primeiras 12h de fermentação,
onde se obteve o máximo valor de rendimento de xilitol (0,70g/g),
61
possivelmente pelo fato da adaptação ter possibilitado maior resistência
da levedura à presença deste ácido no meio.
•
A toxicidade do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar sobre a bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii, é
exercida principalmente pela alta concentração de ácido acético e pode
ser contornada pela adaptação do inóculo dependendo da fase de
crescimento em que as células são expostas ao maior teor de ácido.
•
A capacidade da levedura em detoxificar o meio ficou também
evidenciada, principalmente nos experimentos em que utilizou-se
inóculo obtido de células cultivadas em meio contendo concentrações
crescentes de ácido acético, observando-se uma relação direta entre o
aumento da concentração de ácido ao qual as células foram expostas,
com a assimilação deste durante todo o tempo de fermentação.
62
6- SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
•
Avaliar o efeito do ácido acético sobre a atividade das enzimas xilose
redutase e xilitol desidrogenase em função da adaptação ou não das
células de Candida guilliermondii.
•
Avaliar a influência da disponibilidade de oxigênio no meio de
fermentação, bem como da presença de outros compostos tóxicos sobre
a atividade das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase.
•
Avaliar o efeito da glicose presente nos hidrolisados hemicelulósicos, na
formação de xilitol e nas enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase.
• Iniciar estudos ao nível molecular da enzima xilose redutase de Candida
guilliermondii, com vistas ao melhoramento genético da levedura, a fim
de se conseguir melhoria da produtividade de xilitol.
63
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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APÊNDICES
APÊNDICE 1- Composição do farelo de arroz (MILLER, CHURCHILL, 1986)
Componentes principais
Aminoácidos(%)
Vitaminas (mg/Kg))
(%)
Matéria seca
91,0
Arginina
0,5
Lisina
0,5
Colina
1,254
Proteína
13,0
Cisteína
0,1
Metionina
0,2
Niacina
297,0
Carboidratos
45,0
Glicina
0,9
Fenilalanina
0,4
Ácido
23,1
Pantotênico
Gordura
13,0
Histidina
0,2
Treonina
0,4
Riboflavina
2,64
Fibra
14,0
Isoleucina
0,4
Triptofano
0,1
Tiamina
22,0
Cinzas
16,0
Leucina
0,6
Valina
0,6
APÊNDICE 2- Concentração de xilose durante as fermentações de hidrolisado de
bagaço de cana submetido ao tratamento anterior (H1) e posterior (H2) à
concentração por C. guilliermondii
Xilose (g/L)
Tempo (h)
H1
H2
35,04
37,88
T0
30,78
35,08
T12
29,38
23,08
T24
14,72
5,22
T48
10,09
2,20
T54
APÊNDICE 3- Concentração de xilitol durante as fermentações de hidrolisado de
bagaço de cana submetido ao tratamento anterior (H1) e posterior (H2) à
concentração por C. guilliermondii
Xilitol (g/L)
Tempo (h)
H1
H2
nd
nd
T0
nd
nd
T12
nd
8,32
T24
9,43
23,77
T48
13,00
27,56
T54
n.d.: não detectado
APÊNDICE 4- Concentração de ácido acético durante as fermentações de
hidrolisado de bagaço de cana submetido ao tratamento anterior (H1) e posterior
(H2) à concentração por C. guilliermondii
Ácido Acético (g/L)
Tempo (h)
H1
H2
3,48
3,51
T0
3,18
2,94
T12
2,80
2,29
T24
1,37
1,67
T48
nd
0,81
T54
n.d.: não detectado
APÊNDICE 5- Concentração de xilose durante as fermentações por C.
guilliermondii de hidrolisado de bagaço de cana autoclavado separado (H2) ou
junto (F2) com o farelo de arroz
Xilose (g/L)
Tempo (h)
H2
F2
37,88
39,32
T0
35,08
36,37
T12
23,08
28,47
T24
5,22
7,59
T48
2,20
4,02
T54
APÊNDICE 6- Concentração de xilitol durante as fermentações por C.
guilliermondii de hidrolisado de bagaço de cana autoclavado separado (H2) ou
junto (F2) com o farelo de arroz
Xilitol (g/L)
Tempo (h)
H2
F2
nd
nd
T0
nd
nd
T12
8,32
6,55
T24
23,77
23,03
T48
27,56
29,68
T54
n.d.: não detectado
APÊNDICE 7- Concentração de ácido acético durante as fermentações por C.
guilliermondii de hidrolisado de bagaço de cana autoclavado separado (H2) ou
junto (F2) com o farelo de arroz
Ácido acético (g/L)
Tempo (h)
H2
F2
3,51
3,31
T0
2,94
2,95
T12
2,29
2,61
T24
1,67
1,64
T48
0,81
0,67
T54
APÊNDICE 8- Concentração de xilose durante as fermentações de hidrolisado
de bagaço de cana por C. guilliermondii com adição de ácido acético (2,0g/L) em
diferentes tempos de cultivo
Xilose (g/L)
Tempos de adição de ácido
Tempo (h) Sem adição
T0
T12
T24
T48
38,46
38,75
38,46
38,46
38,46
T0
32,88
32,11
31,23
32,30
32,42
T12
20,33
22,85
24,32
19,79
19,34
T24
2,31
5,15
10,77
6,90
1,62
T48
nd
1,75
8,93
4,32
nd
T54
n.d.: não detectado
APÊNDICE 9- Concentração de arabinose durante as fermentações de
hidrolisado de bagaço de cana por C. guilliermondii com adição de ácido acético
(2,0g/L) em diferentes tempos de cultivo
Arabinose (g/L)
Tempos de adição de ácido
Tempo (h) Sem adição
T0
T12
T24
T48
3,63
3,66
3,63
3,63
3,63
T0
3,53
3,65
3,63
3,62
3,60
T12
3,56
3,58
3,60
3,61
3,54
T24
3,14
3,37
3,53
3,42
2,96
T48
2,66
3,06
3,48
3,41
2,83
T54
APÊNDICE 10- Concentração de xilitol durante as fermentações de hidrolisado
de bagaço de cana por C. guilliermondii com adição de ácido acético (2,0g/L) em
diferentes tempos de cultivo
Xilitol (g/L)
Tempos de adição de ácido
Tempo (h) Sem adição
T0
T12
T24
T48
nd
nd
nd
nd
nd
T0
2,26
1,85
2,33
2,37
2,28
T12
9,13
6,46
3,66
9,48
9,39
T24
22,25
18,73
10,72
14,01
21,26
T48
21,18
19,96
9,47
14,54
20,60
T54
n.d.: não detectado
APÊNDICE 11- Concentração celular durante as fermentações de hidrolisado de
bagaço de cana por C. guilliermondii com adição de ácido acético (2,0g/L) em
diferentes tempos de cultivo
Concentração celular ( x107 cel/mL)
Tempos de adição de ácido
Tempo (h) Sem adição
T0
T12
T24
T48
0,72
0,89
0,72
0,72
0,72
T0
5,34
3,98
4,38
4,51
5,19
T12
5,33
4,12
5,64
6,23
5,92
T24
9,37
9,25
4,83
8,15
11,1
T48
9,06
7,47
6,63
7,91
7,68
T54
APÊNDICE 12- Parâmetros fermentativos durante a bioconversão de xilose por C.
guilliermondii em hidrolisado de bagaço de cana com adição de ácido acético
(2,0g/L) em diferentes tempos de cultivo
YP/S (g/g)
QP (g/L.h)
Tempos de
Tempo (h)
Tempo (h)
adição de
T12
T24
T48
T54
T12
T24
T48
T54
ácido
0,41
0,50
0,62
0,55
0,19
0,38
0,46
0,39
sem adição
0,28
0,41
0,56
0,54
0,15
0,27
0,39
0,37
T0
0,32
0,26
0,39
0,32
0,19
0,15
0,22
0,18
T12
0,33
0,23
0,44
0,43
0,20
0,40
0,29
0,27
T24
0,33
0,49
0,58
0,54
0,19
0,39
0,44
0,38
T48
YP/S: rendimento
QP: produtividade volumétrica
APÊNDICE 13- Concentração de ácido acético durante as fermentações de
hidrolisado de bagaço de cana por C. guilliermondii com adição de ácido acético
(2,0g/L) em diferentes tempos de cultivo
Ácido acético (g/L)
Tempos de adição de ácido
Tempo (h) Sem adição
T12
T24
T48
T0
3,33
5,19
3,33
3,33
3,33
T0
3,12
4,53
4,52
3,01
3,00
T12
2,66
4,33
4,34
4,31
2,46
T24
1,87
3,29
4,00
3,76
3,28
T48
1,63
3,01
3,64
3,58
3,26
T54
APÊNDICE 14 - Concentração de xilose durante as fermentações de meio
simulando a composição do hidrolisado por C. guilliermondii com adição de
ácido acético (2,0g/L) em diferentes tempos de cultivo
Xilose (g/L)
Tempos de adição de ácido
Tempo (h) Sem adição
T0
T12
T24
T48
40,02
40,02
40,02
40,02
40,02
T0
33,08
37,92
34,66
32,61
32,12
T12
23,46
31,27
29,62
21,10
20,77
T24
7,46
16,48
18,19
7,69
2,15
T48
nd
10,44
14,44
5,17
nd
T54
n.d.: não detectado
APÊNDICE 15- Concentração de arabinose durante as fermentações de meio
simulando a composição do hidrolisado por C. guilliermondii com adição de
ácido acético (2,0g/L) em diferentes tempos de cultivo
Arabinose (g/L)
Tempos de adição de ácido
Tempo (h) Sem adição
T0
T12
T24
T48
3,92
3,92
3,92
3,92
3,92
T0
2,96
3,15
3,86
3,14
3,13
T12
2,87
3,01
3,85
2,89
3,00
T24
2,20
2,85
3,15
2,40
2,52
T48
0,91
2,82
2,99
2,31
2,33
T54
n.d.: não detectado
APÊNDICE 16- Concentração de arabinose durante as fermentações de meio
simulando a composição do hidrolisado por C. guilliermondii com adição de
ácido acético (2,0g/L) em diferentes tempos de cultivo
Xilitol (g/L)
Tempos de adição de ácido
Tempo (h) Sem adição
T0
T12
T24
T48
nd
nd
nd
nd
nd
T0
2,46
nd
0,71
2,67
2,62
T12
10,87
3,94
2,83
10,46
9,97
T24
24,15
10,05
5,17
13,38
25,25
T48
23,15
12,92
6,35
16,91
25,19
T54
n.d.: não detectado
APÊNDICE 17- Concentração celular durante as fermentações de meio
simulando a composição do hidrolisado por C. guilliermondii com adição de
ácido acético (2,0g/L) em diferentes tempos de cultivo
Concentração celular ( x107 cel/mL)
Tempos de adição de ácido
Tempo (h) Sem adição
T0
T12
T24
T48
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
T0
4,18
2,89
4,19
4,75
4,32
T12
6,15
3,27
4,07
3,67
4,87
T24
7,63
4,38
4,13
5,56
7,66
T48
9,76
4,20
4,68
6,23
8,94
T54
APÊNDICE 18- Parâmetros fermentativos durante a bioconversão de xilose por C.
guilliermondii em meio simulando a composição do hidrolisado com adição de
ácido acético (2,0g/L) em diferentes tempos de cultivo
YP/S (g/g)
QP (g/L.h)
Tempos de
Tempo (h)
Tempo (h)
adição de
T12
T24
T48
T54
T12
T24
T48
T54
ácido
0,53
0,66
0,74
0,58
0,21
0,45
0,50
0,43
sem adição
0,45
0,43
0,44
0,16
0,21
0,24
T0
0,13
0,27
0,24
0,25
0,06
0,12
0,11
0,12
T12
0,36
0,55
0,41
0,49
0,22
0,44
0,28
0,31
T24
0,33
0,52
0,67
0,63
0,22
0,42
0,53
0,47
T48
YP/S: rendimento
QP: produtividade volumétrica
APÊNDICE 19- Concentração de ácido acético durante as fermentações de
meio simulando a composição do hidrolisado por C. guilliermondii com adição de
ácido acético (2,0g/L) em diferentes tempos de cultivo
Ácido acético (g/L)
Tempos de adição de ácido
Tempo (h) Sem adição
T0
T12
T24
T48
3,35
5,36
3,35
3,35
3,35
T0
2,59
4,00
4,32
2,40
2,28
T12
1,97
3,84
3,84
3,60
2,14
T24
1,00
2,81
2,95
2,78
2,91
T48
0,68
2,41
2,85
2,77
2,81
T54
APÊNDICE 20- Concentração de xilose durante as fermentações de hidrolisado
de bagaço de cana por C. guilliermondii com adição de ácido acético (2,0g/L)
após 12h de cultivo em função da forma de obtenção do inóculo
Xilose (g/L)
Tempo (h)
C1
C2
C3
38,46
39,11
40,84
T0
31,23
34,38
34,43
T12
24,32
22,90
23,26
T24
10,77
9,81
9,38
T48
8,93
5,91
6,68
T54
C1: inóculo obtido de células cultivadas em meio sintético
C2: inóculo obtido de C1 seguido do cultivo em hidrolisado com 3,5g/L de ácido
C3: inóculo obtido de C2 seguido do cultivo em hidrolisado com 5,0g/L de ácido
acético
APÊNDICE 21- Concentração de arabinose durante as fermentações de
hidrolisado de bagaço de cana por C. guilliermondii com adição de ácido acético
(2,0g/L) após 12h de cultivo em função da forma de obtenção do inóculo
Arabinose (g/L)
Tempo (h)
C1
C2
C3
3,63
4,22
4,29
T0
3,63
4,21
4,22
T12
3,60
4,21
4,19
T24
3,53
3,69
3,63
T48
3,48
3,26
3,46
T54
C1: inóculo obtido de células cultivadas em meio sintético
C2: inóculo obtido de C1 seguido do cultivo em hidrolisado com 3,5g/L de ácido
C3: inóculo obtido de C2 seguido do cultivo em hidrolisado com 5,0g/L de ácido
acético
APÊNDICE 22- Concentração de xilitol durante as fermentações de hidrolisado de
bagaço de cana por C. guilliermondii com adição de ácido acético (2,0g/L) após
12h de cultivo em função da forma de obtenção do inóculo
Xilitol (g/L)
Tempo (h)
C1
C2
C3
nd
nd
nd
T0
2,33
1,96
4,46
T12
3,66
4,13
6,38
T24
10,72
10,92
12,74
T48
9,47
12,69
13,13
T54
C1: inóculo obtido de células cultivadas em meio sintético
C2: inóculo obtido de C1 seguido do cultivo em hidrolisado com 3,5g/L de ácido
C3: inóculo obtido de C2 seguido do cultivo em hidrolisado com 5,0g/L de ácido
acético
APÊNDICE 23- Concentração celular durante as fermentações de hidrolisado de
bagaço de cana por C. guilliermondii com adição de ácido acético (2,0g/L) após
12h de cultivo em função da forma de obtenção do inóculo
Concentração celular ( x107 cel/mL)
Tempo (h)
C1
C2
C3
0,72
0,85
0,70
T0
4,38
4,94
4,59
T12
5,64
4,68
3,70
T24
4,83
4,48
4,79
T48
6,63
5,38
8,24
T54
C1: inóculo obtido de células cultivadas em meio sintético
C2: inóculo obtido de C1 seguido do cultivo em hidrolisado com 3,5g/L de ácido
C3: inóculo obtido de C2 seguido do cultivo em hidrolisado com 5,0g/L de ácido
acético
APÊNDICE 24- Concentração de ácido acético durante as fermentações de
hidrolisado de bagaço de cana por C. guilliermondii com adição de ácido acético
(2,0g/L) após 12h de cultivo em função da forma de obtenção do inóculo
Ácido acético (g/L)
Tempo (h)
C1
C2
C3
3,33
3,25
3,74
T0
4,52
4,00
3,98
T12
4,34
3,66
3,60
T24
4,00
3,20
2,89
T48
3,64
2,89
2,89
T54
C1: inóculo obtido de células cultivadas em meio sintético
C2: inóculo obtido de C1 seguido do cultivo em hidrolisado com 3,5g/L de ácido
C3: inóculo obtido de C2 seguido do cultivo em hidrolisado com 5,0g/L de ácido
acético