UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CAMPUS DE ARARAQUARA
BOLORES DETERIORANTES EM QUEIJO PARMESÃO
JOSÉ SEBASTIÃO CORRÊA NETO
DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM ALIMENTOS E
NUTRIÇÃO
ÁREA DE CIÊNCIAS DOS ALIMENTOS
Orientador: Professor Dr. José Paschoal Batistuti
Co-orientador: Professora Dra. Maria José S. Mendes Gianinni
ARARAQUARA - SP
2005
2
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. José Paschoal Batistuti
(Orientador)
Dra. Marta Hiromi Taniwaki
(Membro)
Dra. Alice Tanaka
(Membro)
Araraquara, 30 de Setembro de 2005.
3
Vivo e trabalho todos os dias da minha vida para
ser uma pessoa comum num país desenvolvido ao
invés de um privilegiado em uma sociedade do terceiro
mundo.
A Renata, minha parceira no amor, na vida e neste trabalho.
4
Para Você, Elas e Ele.
Sol, luz.
A vida sempre brilha,
Brilha vida nossa.
É sol, é luz que passa, ultrapassa.
Que brilha de nós em nós.
Juntos,
Vidas a brilhar também conosco.
Vocês são sois,
Luzes,
São vidas que sempre brilharão.
A minha família, Renata,
Jordana, Claudia e Luiz
Henrique, pela competência de
me realizarem como marido e
pai.
5
Agradeço
A toda vida e energia do universo que sempre conspiram a nosso favor;
Ao Prof. Dr. José Paschoal Batistuti pela orientação e amizade durante a
realização deste trabalho e do curso de mestrado;
À Profa. Dra. Maria José S. Mendes Gianinni pela co-orientação, amizade e
abertura para a parte prática fosse realizada no laboratório de micologia;
Ao Laticínios Scala na figura dos seus Diretores, da Superintendência e da
Gerência da Garantia da Qualidade pelo apoio financeiro e pela confiança
depositada na realização deste trabalho;
Aos demais funcionários do Laticínios Scala que contribuíram para a
realização deste trabalho;
Aos membros da banca Dra. Marta Hiromi Taniwaki e Dra. Alice Tanaka ,
pelas correções e pelas presenças na banca examinadora;
À Elaine e Rosangela do laboratório de micologia pela disponibilidade e
orientação durante a parte prática do trabalho;
Aos colegas do laboratório de micologia pela cooperação e incentivo;
Aos meus pais, Luiz Fabiano e Carminha, pelas muitas acolhidas no
conforto de seu lar durante a realização do curso de mestrado;
Ao Sr. Rafael Lofrano pelo encaminhamento inicial na área de alimentos.
A todos, meus cordiais e sinceros agradecimentos.
6
Lista de Abreviaturas
% - porcentagem
o
C - grau centígrado
µL - microlitro
AA - ácido acético glacial
APHWW - American Publich Health of Water and Wastwater
APPCC - Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle
BPF - Boas Práticas de Fabricação
cm2 - centímetro quadrado
cm3 - centímetro cúbico
CREA - Agar Creatina Sacarose
CYA - Agar Czapek Extrato de Levedura
DG 18% - Agar Glicerol Dicloran 18%
DRBC - Dicloran Rosa Bengala Cloranfenicol
g - grama
kg - quilograma
m2 - metro quadrado
MEA - Agar Extrato de Malte
mL - mililitro
mm - milímetro
m/m - massa por massa
NSA - Agar Nitrato Sacarose
O2 - oxigênio
PCA - Agar Padrão de Contagem
PDA - Agar Batata Dextrose
PCC - Ponto Crítico de Controle
pH - potencial hidrogeniônico
PNQL - Programa Nacional de Melhoria da Qualidade do Leite
p/v - peso por volume
rpm - rotações por minuto
SAB - Agar Sabouraud Sacarose
UFC - unidade formadora de colônia
UFC/g - unidade formadora de colônia por grama
7
UFC/cm2 - unidade formadora de colônia por centímetro quadrado
UFC/cm3 - unidade formadora de colônia por centímetro cúbico
YESA - Agar Sacarose Extrato de Levedura
v/v - volume por volume
8
Lista de Figuras
Figura 1 – Fluxograma de produção do queijo parmesão.
30
Figura 2 – Comparação das contagens de bolores e leveduras nas amostras
de ar em relação ao padrão sugerido.
48
Figura 3 – Correlação entre o tempo de maturação e a presença de bolores
no queijo parmesão.
53
Figura 4 – Correlação entre o tempo de maturação e a presença de
Penicillum no queijo parmesão.
58
Figura 5 – Crescimento do agente deteriorante nos meios de cultura MEA,
CREA e CYEA.
59
Figura 6 – Crescimento do agente deteriorante nos meios de cultura NSA e
MEA + 0,5% AA.
60
Figura 7 – Características morfológicas microscópicas do agente deteriorante.
60
9
Lista de Quadros
Quadro 1 - Esquema dos tratamentos e coleta de amostras.
31
Quadro 2 - Quantidade de material amostrado e diluições aplicadas nos
respectivos tratamentos.
32
Quadro 3 - Temperatura e pH dos materiais amostrados.
76
10
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Comparação múltipla das médias do total de fungos no leite,
insumos, massa, nos queijos (resfriamento, salga e nas câmaras–frias de
maturação) em UFC/g.
42
Tabela 2 - Comparação múltipla das médias do total de fungos nas formas,
superfícies dos queijos em maturação e das luvas dos manipuladores em
UFC/cm2.
43
Tabela 3 - Comparação múltipla das médias do total de fungos nas amostras
de ar da fazenda, plataforma de recebimento de leite na fábrica, sala de
fabricação e câmaras-frias de maturação em UFC/m3.
44
Tabela 4 – Freqüência dos fungos isolados nas etapas de produção da
cadeia produtiva do queijo parmesão.
45
Tabela 5 – Freqüência dos fungos isolados na etapa de maturação do queijo
parmesão.
46
Tabela 6 – Freqüência dos fungos isolados do ar em várias etapas da cadeia
produtiva do queijo parmesão.-
47
Tabela 7 – Freqüência relativa e número de ocorrência dos bolores isolados
em todos os tratamentos.
49
Tabela 8 - Comparação múltipla das médias do total de bolores no leite,
insumos, massa, nos queijos (resfriamento, salga e nas câmaras–frias de
maturação) em UFC/g.
50
Tabela 9 - Comparação múltipla das médias do total de bolores nas formas,
superfícies dos queijos em maturação e das luvas dos manipuladores em
UFC/cm2.
51
Tabela 10 - Comparação múltipla das médias do total de bolores nas
amostras de ar da fazenda, plataforma de recebimento de leite na fábrica,
sala de fabricação e câmaras-frias de maturação em UFC/m3.
Tabela 11 – Soma das contagens dos organismos nas amostras das
superfícies dos queijos nas três câmaras-frias.
53
Tabela 12 - Comparação múltipla das médias do total de Penicillum no leite,
insumos, massa, nos queijos (resfriamento, salga e nas câmaras–frias de
maturação) em UFC/g.
55
52
11
Tabela 13 - Comparação múltipla das médias do total de Penicillum nas
formas, superfícies dos queijos em maturação e das luvas dos manipuladores
em UFC/cm2.
56
Tabela 14 - Comparação múltipla das médias do total de Penicillum nas
amostras de ar da fazenda, plataforma de recebimento de leite na fábrica,
sala de fabricação e câmaras-frias de maturação em UFC/m3.
57
Tabela 15 - Identificação de Pencillium isolado das manchas de queijos com
defeitos de qualidade.
59
Tabela 16 - Local de isolamento das diversas cepas do gênero Penicillium
dentro da cadeia produtiva do queijo parmesão.
62
12
Resumo
O presente trabalho teve como objetivo subsidiar tecnicamente o programa de
controle de qualidade de uma indústria de queijo parmesão onde alguns queijos
aparentavam estarem contaminados por bolor. Todas as análises realizadas foram
estrategicamente planejadas visando esclarecer quais os fatores que contribuíam
para a ocorrência dos bolores dentro do processo de produção. Com esta
finalidade foram amostrados, desde o leite na fazenda, até a maturação dos
queijos em câmaras-frias. Também foram avaliadas as condições ambientais
internas e externas da fábrica em questão. Os bolores isolados foram quantificados
e identificados através de análise morfológica e demais provas complementares.
Bolores representaram apenas 3,44% do total de UFC porem mais significantes
como contaminantes e deteriorantes. As amostras úmidas apresentaram altas
contagens de leveduras, que representaram 95,13% das UFC quantificadas e
1,44% das UFC não puderam isoladas para identificação. Entre os bolores isolados
constatou-se a presença de 14 diferentes gêneros: Penicillium, Aspergillus,
Cladosporium, Rhizopus, Fusarium, Aureobasidium, Chrysosporium, Alternaria,
Epicoccum, Helminthosporium, Geotrichum, Gliocladium, Nigrospora e Rizomucor.
Destes, Penicillium e Aspergillus foram os gêneros mais ocorrentes com uma
freqüência de 53,16% e 41,33% respectivamente. Contudo, somente o gênero
Penicillium, provavelmente a espécie Penicillium roqueforti, foi isolado das
manchas escuras que comprometiam visualmente a qualidade dos queijos.
Palavras-chave: contaminação fúngica, Penicillium, queijo parmesão, controle de
qualidade, amostras ambientais.
13
Abstract
The basic idea of this work was to support technically the quality control program in
a Brazilian Parmesan cheese-making factory where some cheese were looking
spoilage by mould. A microbiological check-up was made following the entire chain
of Parmesan production. Sampling starts with milk production at farm and finishing
with the cheeses at the ripping-room in the industry. Also environmental conditions
were analyzed by internal and external air sampling. The fungi were identified by
morphology analyses and other supplementary tests. The results showed a much
higher frequency of yeast (95.13%) than moulds (3.44%). It was not possible to
isolate for identification 1.44% of the CFU. In all treatments were found 14 different
genera of moulds: Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Rhizopus, Fusarium,
Aureobasidium,
Chrysosporium,
Alternaria,
Epicoccum,
Helminthosporium,
Geotrichum, Gliocladium, Nigrospora e Rizomucor. The genera Penicillium and
Aspergillus were the most presents with a relative frequency of 53.16% and 41.33%
respectively. The identifications procedures showed up the specie Penicillium
roqueforti as the probably organism isolated from the dark spot on the spoiled
cheese.
Key words: Fungi spoilage, Penicillium, Parmesan cheese, quality control,
environmental analyses.
14
SUMÁRIO
Resumo
Abstract
Introdução
Objetivos
Revisão Bibliográfica
Segurança Alimentar e Controle de Qualidade
O Queijo Parmesão
Os Fungos e os Queijos
Conservantes Antifúngicos
Micotoxinas
Análise de Bolores em Alimentos
Contaminação por Bolores na Indústria de Alimentos
Contaminação Ambiental
Materiais e Métodos
Materiais
1.
2.
3.
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.
3.6.
3.7.
3.8.
4.
4.1.
A.
B.
C.
D.
E.
F.
G.
H.
I.
J.
Leite cru
Insumos
Leite pasteurizado
Massa de queijo
Agentes intervenientes
Queijo parmesão antes da maturação
Queijo parmesão na maturação
Ar ambiental
Salmoura
Queijos contaminados
4.2.
Métodos
A. Coleta de amostras
B. Contagem em placas
C. Identificação
D. Ar ambiental
E. Salmoura
F. Agentes intervenientes
G. Análises complementares
H. Análises de dados
5.
Resultados
5.1.
Bolores e Leveduras
5.2.
Bolores
Penicillium
5.3.
5.4.
Identificação do Agente Deteriorante
6.
Discussão
7.
Conclusões
...............
...............
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17
19
20
20
21
22
24
24
25
27
27
29
33
33
33
34
34
34
34
35
36
36
37
37
37
37
38
38
39
39
39
39
41
41
52
53
57
52
66
15
8.
Referências Bibliográficas
ANEXOS
...............
...............
68
75
16
1. Introdução
Fungos de várias espécies são citados na literatura cientifica como agentes
deteriorantes de queijo, devendo ser considerados nos programas de garantia da
qualidade e segurança alimentar das indústrias (FRANCO et al., 1999).
Dependendo da espécie, a contaminação fúngica pode constituir--se em
potencial problema de segurança alimentar devido à produção de micotoxinas, mas
também, acarretar prejuízos econômicos devido a alterações nas características
dos produtos (KURE et al., 2001; KURE et al., 2004). Os principais problemas que
comprometem as qualidades comerciais de vários tipos de queijos em todo o
mundo são alterações da aparência, do aroma, do sabor e da textura.
Nas várias etapas do processo será de extrema importância monitorar a
presença dos bolores para as indústrias que queiram ter um eficiente controle da
qualidade em suas linhas de produção. O longo processo de maturação do queijo
parmesão requer especial atenção quanto à deterioração por fungos, pois os
queijos acabam ficando mais expostos ao seu ataque e de outros organismos
deteriorantes neste período.
Consciente das informações acima mencionadas, o presente trabalho
procurou rastrear através de análises micológicas toda a cadeia produtiva de uma
indústria de queijo parmesão no Brasil. As informações levantadas irão subsidiar
tecnicamente o programa de controle de qualidade da indústria, onde alguns
queijos aparentavam-se contaminados por bolor.
Tendo como base o programa de APPCC em implantação na empresa, as
amostras foram coletadas em locais estratégicos, desde o leite na fazenda até os
queijos em maturação nas câmaras-frias, afim de que fossem quantificadas e
identificadas todas as possíveis ocorrências de fungos deteriorantes.
O trabalho de identificação dos bolores foi direcionado principalmente para o
gênero Penicillium, cujas análises preliminares indicavam como o agente causador
das manchas escuras presentes nos queijos visualmente deteriorados. Estas
manchas eram apontadas pelo controle de qualidade como o principal fator de
comprometimento da qualidade do produto final destinado ao mercado, na época
de realização deste estudo.
17
Conhecer o “inimigo” e sua procedência são informações fundamentais para
qualquer estratégia visando à prevenção e o controle de contaminações
microbianas nas indústrias de alimentos.
18
2. Objetivos
O objetivo do presente trabalho foi quantificar e identificar a incidência de
bolores deteriorantes nas várias etapas do processamento de uma indústria de
queijo parmesão.
19
3. Revisão Bibliográfica
3.1. Segurança Alimentar e Controle de Qualidade
Seguindo uma tendência mundial (GARRETT et al., 1998) a partir da década
de 90 tornou-se obrigatório, nas indústrias de alimentos do Brasil, a implantação e
aplicação dos programas de BPF (BRASIL, 1997b) e o APPCC (BRASIL, 1998). A
obrigatoriedade destes programas ocasionou uma maior demanda por informações
microbiológicas pelas indústrias, sendo que os autores UNTERMANN, (1998);
BOCCAS et al., (2001); HEGGUM, (2001), ressaltam ser de grande importância, ter
em mãos informações microbiológicas consistentes para o planejamento dos
programas de segurança alimentar em plantas fabris.
Para as agroindústrias de laticínios é desejável que os programas de
garantia de qualidade comecem já nas fazendas fornecedoras de leite e se
estendam até o consumidor final (HEGGUM, 2001) visto que com a globalização
da economia, os problemas de segurança alimentar e contaminação microbiológica
dos alimentos, deixaram de ser apenas uma questão operacional ou de saúde
pública, e também passaram a ser um requisito fundamental para a competição
nos mercados (ARVANITOYANNIS & MAUROPOULOS, 2000). Atento a estas
questões, em 2002 o governo brasileiro transformou em lei o Programa Nacional
de Melhoria da Qualidade do Leite - PNQL que tem como objetivo principal
melhorar a qualidade do leite consumido no Brasil (BRASIL, 2002).
O risco da cadeia produtiva do queijo vir a ser acometida por uma
contaminação microbiológica começa na produção do leite, passando pelas etapas
de
armazenagem
na
fazenda,
transporte,
armazenagem
na
indústria,
pasteurização, fabricação, maturação, embalagem, transporte para o consumidor,
exposição no ponto de venda até o armazenamento pelo consumidor final,
(ANVANITOYANNIS & MAUROPOULOS, 2000).
3.2. O Queijo Parmesão
O primeiro relato da produção artesanal de queijos no Brasil data de 1875,
na região da Serra da Mantiqueira no Estado de Minas Gerais (HOMEWOOD &
20
HESS, 1993). Atualmente vários tipos de queijos são produzidos aqui, sendo o
parmesão um dos mais representativos.
Tecnologicamente, o parmesão é um legítimo representante do grupo dos
queijos italianos. Sua difusão pelo mundo ocorreu juntamente com a migração
italiana sendo que o queijo Parmigiano Reggiano original é produzido com leite cru
numa região restrita do Vale do Pó, na Itália (BATTISTOTI & CORRADINI, 1996).
As principais características do queijo parmesão são: Queijo duro com teor
de umidade entre 30 e 40% , teor de gordura na matéria seca não menor que 32%,
tamanho entre 4 e 20 Kg, agentes proteolíticos provenientes de bactérias
termofílicas fermentadoras de ácido láctico e tempo de maturação longo, entre 12 e
24 meses (BATTISTOTI & CORRADINI, 1996). Todas estas características estão
dentro das especificações previstas pela legislação brasileira que regulamenta a
produção e comercialização de queijos do tipo parmesão (BRASIL, 1997a).
3.3. Os Fungos e os Queijos
Na matriz dos alimentos, os fungos podem se desenvolver em pHs menores
que 2 e maiores que 9, a maioria cresce em temperaturas entre 5 e 35 oC e em
atividade de água de 0,85 ou menor (MISLIVEC et al., 1992).
Leveduras
dos
gêneros:
Candida,
Debariomyces,
Issatchenkia,
Kluyveromyces, Rhodotorula e Saccharomyces podem ser agentes potenciais de
deterioração microbiana em produtos lácteos (FRANCO et. al, 1999). Os bolores,
porem, são os mais importantes deteriorantes dos queijos duros e semiduros
(FILTENBORG et al., 2000).
No entanto deve-se destacar que algumas espécies de fungo fazem parte do
processo tecnológico da fabricação de queijo. Como o Geotrichum candidum em
queijos moles como Brie e Cammembert, o Penicillium cammembert responsável
pelas características de aroma e sabor do queijo Cammembert, o P. roqueforti e P.
glaucum, fungos azuis usados na fabricação dos queijos Stilton, Roquefort e
outros, o Mucor rasmusen, usando em queijos noruegueses do tipo Gammelost
(FURTADO, 2003).
O trabalho de NIELSEN et al., (1998) também mostra que alguns fungos
usados como “starter”, atuam como inibidores dos bolores deteriorantes nos queijo
aos quais são adicionados.
21
Os gêneros Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Byssochlamys,
Cladosporium, Claviceps, Colletotrichum, Geotrichum, Monilia, Mucor, Neurospora,
Penicillium, Rhizopus, Scopulariopsis, Sporotrichum, Thamnidium e Chrysosporium
são citados por FRANCO et al., (1999) como os principais bolores contaminantes
dos alimentos.
Já FILTENBORG et al., (1996) destacam as espécies Penicillium commune
e P. nalgiovense como os principais fungos deteriorantes dos queijos.
Em trabalho visando identificar os bolores que contaminavam queijos
noruegueses semiduros, KURE & SKAAR, (2000) isolaram os gêneros Penicillium,
Alternaria, Aureobasidium, Cladosporium, Epicocum, Geotrichum, Mucor, Phoma e
Ulocladium.
Em outro estudo Penicillium (13 espécies), Acremonium, Aspergillus sp,
Cladosporium sp, Eurotium sp, Geothichum sp, Mucor sp, Phoma sp e Trichoderma
também foram isolados de queijos noruegueses (KURE et al., 2001). P. commune
e P. palitans foram às espécies mais encontradas. Estas espécies são
reconhecidas como ancestrais selvagens de P.cammembert que acabaram
desenvolvendo mecanismos para colonizarem os queijos devido a sua utilização no
processo de fabricação do queijo Cammembert.
Em nosso meio, o gênero Penicillium também predominou como
contaminante em amostra de queijos parmesãos obtidos em supermercados da
região de Campinas - SP (TANIWAKI & DENDER, 1992).
3.4. Conservantes Antifúngicos
O ácido sórbico, o ácido benzóico, a natamicina, o sulfeto de sódio e o
tiabendazol estão entre os conservantes antifúngicos mais usados em alimentos
(NIELSEN & DE BOER, 2000). Contudo, algumas espécies de fungo, além de se
mostrarem resistentes ao efeito preservativo do ácido sórbico, também podem
metabolizar o conservante, transformando-o em compostos que alteram o sabor
em certos tipos de queijos (FILTENBORG et al., 1996). Estas reações podem
comprometer a qualidade e a aceitação comercial dos produtos em questão.
P. solium produz compostos que alteram o sabor na manteiga, sugerindo
que isto também seja possível de acontecer em queijos com alto teor de gordura
(KURE et al., 2001).
22
O tipo de embalagem, a composição da atmosfera de armazenamento e
maturação, o tipo de queijo, o tipo de leite, os ácidos orgânicos originados como
produto do metabolismo durante a maturação, a temperatura de armazenamento e
outros, são todos fatores que irão influenciar o potencial de desenvolvimento dos
fungos deteriorantes nos queijos (FILTENBORG et al., 1996; KURE & SKAAR,
2000; KURE et al. 2001; TANIWAKI et al., 2001a).
3.5. Micotoxinas
A produção de micotoxinas é outro ponto importante na questão da
contaminação de alimentos por fungos. Segundo FILTENBORG et al., (1996), a
mais importante micotoxina encontrada em queijos até a data de seu trabalho foi
esterigmatocistina, porém muitas outras, como o ácido ciclopiazônico, a
rugucovasina A e B e a ocratoxina A podem ser potencialmente importantes
(FRISVAD & THRANE, 2000).
Queijos inoculados com Aspergullus flavus, P. roqueforti e P. commune
apresentaram produção de aflatoxina B1 e B2, roquefortine C e ácido
ciclopiazônico, respectivamente. Destes, os maiores teores foram encontrados nos
queijos armazenados em atmosfera com ar. As atmosferas modificadas com baixos
teores de O2 inibiram drasticamente a produção de toxinas (TANIWAKI et al.,
2001).
O trabalho de BARBIERI et. al, (1994) mostrou a ocorrência eventual de
aflatoxina M1 em amostras de queijo parmesão italiano.
No mundo todo há uma preocupação cada vez maior em se avaliar os níveis
de micotoxinas nos mais variados tipos de alimentos e produtos agrícolas
(BOYSEN et al., 2000), porém atualmente a legislação brasileira de alimentos não
fixa parâmetros para a presença de micotoxinas no parmesão (BRASIL, 2001).
3.6. Análise de Bolores em Alimentos
As propriedades bioquímicas dos alimentos restringem o desenvolvimento
dos microorganismos a poucas espécies específicas, fazendo com que as técnicas
de identificação e isolamento tendam a ser também cada vez mais restritivas às
espécies fúngicas com que se deseja trabalhar (DE BOER & BEUMER, 1999).
23
Meios de cultura diferenciados foram introduzidos para análise de fungos em
alimentos, como, o PCA com antibióticos, o DRBC e o PDA com antibióticos.
Atualmente estes são os meios mais indicados para a contagem de bolores e
leveduras em placa (MISLIVEC et al., 1992; SILVA et al., 2001).
O trabalho de TANIWAKI et al. (2001b) mostrou que os meios DRBC, PDA e
DG18 são equivalentes para a contagem de fungos em alimentos.
TANIWAKI et al. (2001a) empregou o CYA para crescimento de isolados de
Mucor plumbeus, Fusarium oxysporium, Byssochlamys fulva, P. commune, P.
roqueforti e A. flavus. O MEA para Byssochlamys nívea e o CYA mais 20% de Agar
Sacarose para Eurorium chevalieri.
O YESA, CREA e o NSA foram usados para crescimento e identificação das
espécies de Penicillium. SAB para as espécies do gênero Geotrichum, e PDA para
os gêneros Alternaria, Aureobasidium, Cladosporium, Epicocum, Mucor, Phoma e
Ulocladium Acremonium, Aspergillus Eurotium e Trichoderma (KURE & SKAAR,
2000; KURE et al., 2001).
Para os gêneros Penicilium, Aspergillus e Fusarium, a identificação
morfológica vem sendo substituída por métodos que identificam os metabólitos
secundários, a produção de iso-enzimas, características fisiológicas, características
ecológicas, suscetibilidade a drogas e técnicas moleculares (FILTENBORG et al.,
1996).
Além da escolha e execução correta dos procedimentos de isolamento,
quantificação e identificação, o bom êxito de qualquer trabalho científico em
microbiologia, dependerá muito dos cuidados com a amostragem. As amostras
devem ser coletadas em recipientes assépticos e o volume coletado nunca deverá
ultrapassar três quartos da capacidade total do recipiente (SILVA et al., 2001). O
transporte até o laboratório deve ser feito a uma temperatura entre 0 e 4,4o C. e as
amostras processadas num prazo máximo de 36 horas após sua coleta (MESSER
et al., 1992). Amostras de “swab” devem ser analisadas em 24 horas (SVEUM et
al., 1992).
3.7. Contaminação por Bolores na Indústria de Alimentos
Nas indústrias são muitas as fontes potenciais de contaminação póspasteurização a serem analisadas nos programas de garantia da qualidade e
24
segurança alimentar. O ar, a salmoura, a superfície de equipamentos e os filmes
plásticos de embalagem foram os materiais amostrados por KURE et al., (2004),
para identificar as fontes de contaminação por bolores em uma linha de produção
de queijo. Os manipuladores e os equipamentos (LUIZ, 2000; FRANCO et al.,
1996) bem como insetos sinantrópicos também podem ser fontes de contaminação
fúngica na indústria de alimentos (CARLILE et al., 2001).
3.8. Contaminação Ambiental
A contaminação ambiental é outro ponto relevante (FRANCO et al., 1996).
Esporos de alguns fungos ambientais resistem ao estresse de serem transportados
pelo ar e sobrevivem em baixa atividade de água, podendo assim, colonizar vários
tipos de construções (STETZENBACH, 1998).
Quando as instalações estão situadas em regiões rurais, os fungos
provenientes do ar externo podem se tornar importantes agentes contaminantes
dos ambientes internos (STETZENBACH, 1998).
Penicillium, Aspergillus, Fusarium entre outros, são alguns gêneros de
fungos deteriorantes de alimentos, também citados por LARONE, (1996) como
contaminantes ambientais.
Para fábricas de laticínios, RADMORE & LUCK, (1984) citados em
SCHOLTE et al., (2000), consideraram como “bons” os ambientes com contagem
total de bolores e leveduras menores que 100 UFC/cm3 e “pobres” os ambientes
cujas contagens forem superiores a 1000 UFC/cm3.
Para melhor avaliar as condições ambientais, as amostras de ar devem ser
coletadas nos ambientes externos e internos do prédio em questão, e se possível,
com o uso de amostradores com fluxo de ar forçado (STETZENBACH, 1998). A
correlação entre a presença de microrganismo nos alimentos e as condições
ambientais devem ser bem avaliadas nos programas de garantia da qualidade,
principalmente no caso do queijo parmesão, visto que estes são submetidos a
longos períodos de maturação e acabam ficando mais expostos ao ataque de
microorganismos deteriorantes, como os bolores e as leveduras (SCHOLTE et al.,
2000).
25
4. Materiais e Métodos
Para o isolamento, quantificação e identificação dos fungos, foram coletadas
amostras em vários pontos da indústria e na fazenda fornecedora de matériaprima. A seleção dos pontos de amostragem na indústria levou em consideração
as etapas mais significativas em relação aos aspectos de segurança alimentar
conforme fluxograma de produção representado na Figura 1.
Foram realizados ensaios pilotos para a determinação dos meios de cultura
e diluições a serem empregadas nos diversos materiais amostrados. De cada
ponto de amostragem coletaram-se cinco amostras. Depois de quantificados e
isolados os fungos foram identificados morfologicamente e testes complementares
foram realizados quando necessário. O esquema da coleta das amostras
especificando os locais, os materiais, as etapas do processo e as datas estão
resumidos no Quadro 1.
As quantidades amostradas e as diluições aplicadas aos respectivos
tratamentos se encontram no Quadro 2.
26
Preparo do
Soro fermento
Preparo do
Fermento Lático
Recepção do
Leite
PCC 1
(B,Q, FR)
Leite Pasteurizado
Filtração
Coagulação
Resfriamento
Corte da
Coalhada
Inoculação Isca
Fermentação
Agitação/cozimento
Quebra Coagulo
Prensagem
Acondicionamento
Inoculação
Resfriamento
Estocagem
Padronização
Acondicionamento
Fermentação
Massa
Pasteurização
PCC 3
(B)
Coalho
Recepção
PCC 2
(B)
Cloreto de
Cálcio
Estocagem
Estocagem
Diluição
Dosagem
Creme
Enchimento
a
Coagulação
Enformagem
Blocagem
Pré-prensagem
1
Mexedura/corte
Ponto
a
2
Mex./cozimento
Soro
a
1 Prensagem
Viragem
a
2 Prensagem
Resfriamento
Cloreto de Sódio
Recepção
Emplacagem
Maturação
Secagem
Salga
Limpeza
Embalagem
Expedição
Figura 1 – Fluxograma de produção do queijo parmesão.
Estocagem
Prep. da
Salmoura
27
Quadro 1 - Esquema dos tratamentos e coleta de amostras.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
Amostras
Local
Fazenda
Fazenda
Caminhão
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Fazenda
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Indústria
Material
Leite cru
Leite cru
Leite cru
Cloreto de cálcio
Fermento láctico
Soro fermentado
Leite pasteurizado
Massa de queijo
Formas
Queijo
Queijo
Queijo + sorbato (profundidade)
Queijo + sorbato (superfície)
Queijo (profundidade)
Queijo (superfície)
Queijo + sorbato (superfície)
Queijo + sorbato (profundidade)
Queijo (superfície)
Queijo (profundidade)
Queijo + sorbato (superfície)
Queijo + sorbato (profundidade)
Queijo (superfície)
Queijo (profundidade)
Queijo + sorbato (profundidade)
Queijo + sorbato (superfície)
Queijo (profundidade)
Queijo (superfície)
Queijo + sorbato (superfície)
Queijo + sorbato (profundidade)
Queijo (superfície)
Queijo (profundidade)
Queijo + sorbato (superfície)
Queijo + sorbato (profundidade)
Queijo (superfície)
Queijo (profundidade)
Queijo + sorbato (profundidade)
Queijo + sorbato (superfície)
Queijo (profundidade)
Queijo (superfície)
Queijo + sorbato (superfície)
Queijo + sorbato (profundidade)
Queijo (superfície)
Queijo (profundidade)
Queijo + sorbato (superfície)
Queijo + sorbato (profundidade)
Queijo (superfície)
Queijo (profundidade)
Ar ambiental
Ar ambiental externo
Ar ambiental
Ar ambiental
Ar ambiental
Ar ambiental
Ar ambiental
Ar ambiental
Ar ambiental
Ar ambiental
Ar ambiental
Ar ambiental
Ar ambiental
Ar ambiental
Luvas dos manipuladores
Água da salga
Etapa do Processo
Ordenha
Tanque de expansão
Transporte
Enchimento
Inoculação
Fermentação
Pasteurização
Blocagem
Enformagem
Resfriamento
Salga
Maturação câmara 1
Maturação câmara 1
Maturação câmara 1
Maturação câmara 1
Maturação câmara 1
Maturação câmara 1
Maturação câmara 1
Maturação câmara 1
Maturação câmara 1
Maturação câmara 1
Maturação câmara 1
Maturação câmara 1
Maturação câmara 2
Maturação câmara 2
Maturação câmara 2
Maturação câmara 2
Maturação câmara 2
Maturação câmara 2
Maturação câmara 2
Maturação câmara 2
Maturação câmara 2
Maturação câmara 2
Maturação câmara 2
Maturação câmara 2
Maturação câmara 3
Maturação câmara 3
Maturação câmara 3
Maturação câmara 3
Maturação câmara 3
Maturação câmara 3
Maturação câmara 3
Maturação câmara 3
Maturação câmara 3
Maturação câmara 3
Maturação câmara 3
Maturação câmara 3
Ordenha
Recepção
Fabricação
Salga
Secagem
Maturação câmara 1
Maturação câmara 1
Maturação câmara 1
Maturação câmara 2
Maturação câmara 2
Maturação câmara 2
Maturação câmara 3
Maturação câmara 3
Maturação câmara 3
Enformagem
Salga
Data *
Dia 1
Dia 1
Dia 1
Dia 2
Dia 2
Dia 2
Dia 2
Dia 2
Dia 2
Dia 8
Dia 8
Dia 38
Dia 38
Dia 38
Dia 38
Dia 98
Dia 98
Dia 98
Dia 98
Dia 188
Dia 188
Dia 188
Dia 188
Dia 38
Dia 38
Dia 38
Dia 38
Dia 98
Dia 98
Dia 98
Dia 98
Dia 188
Dia 188
Dia 188
Dia 188
Dia 38
Dia 38
Dia 38
Dia 38
Dia 98
Dia 98
Dia 98
Dia 98
Dia 188
Dia 188
Dia 188
Dia 188
Dia 1
Dia 2
Dia 2
Dia 8
Dia 8
Dia 38
Dia 98
Dia 188
Dia 38
Dia 98
Dia 188
Dia 38
Dia 98
Dia 188
Dia 2
Dia 8
* Dia 1, 27 de maio de 2003; dia 2, 28 de maio de 2003; dia 8, 4 de junho de 2003; 38 dias, 30 de julho; dia 98, 23 de outubro
de 2003 e dia 188, 9 de dezembro de 2003.
28
Quadro 2 - Quantidade de material amostrado e diluições aplicadas aos respectivos
tratamentos.
Amost.
Material
1
Leite cru *
286,00
2
Leite cru *
261,00
3
Leite cru *
262,00
4
Cloreto de cálcio *
354,00
5
Fermento láctico *
199,00
6
Soro fermentado *
179,00
7
Leite pasteurizado *
290,00
8
Massa de queijo *
54,00
10
Queijo *
102,00
11
Queijo *
124,00
12
Queijo+sorb. (prof.) *
88,98
14
Queijo (prof.) *
85,92
16
Queijo+sorb. (prof.) *
60,56
18
Queijo (prof.) *
69,83
20
Queijo+sorb. (prof.) *
65,8
22
Queijo (prof.) *
50,72
24
Queijo+sorb. (prof.) *
93,04
26
Queijo (prof.) *
82,35
28
Queijo+sorb. (prof.) *
73,52
30
Queijo (prof.) *
73,97
32
Queijo+sorb. (prof.) *
78,45
34
Queijo (prof.) *
53,49
36
Queijo+sorb. (prof.) *
75,65
38
Queijo (prof.) *
91,32
40
Queijo+sorb. (prof.) *
82,13
42
Queijo (prof.) *
84,93
44
Queijo+sorb. (prof.) *
72,34
46
Queijo (prof.) *
69,57
48
Ar ambiental externo **
25
49
Ar ambiental externo **
50
50
Ar ambiental **
150
51
Ar ambiental **
100
52
Ar ambiental **
100
53
Ar ambiental **
100
54
Ar ambiental **
100
55
Ar ambiental **
100
56
Ar ambiental **
100
57
Ar ambiental **
100
58
Ar ambiental **
100
59
Ar ambiental **
100
60
Ar ambiental **
100
61
Ar ambiental **
100
63
Água da salga *
370,00
* peso em gramas; ** volume de ar em litros
Quantidades
276,00
272,00
262,00
349,00
260,00
261,00
322,00
94,00
105,00
90,00
86,96
102,5
64,19
71,84
50,09
56,78
64,1
80,5
74
73,4
82,39
57,93
85,65
86,37
79,69
71,25
71,4
79,19
25
50
150
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
336,00
343,00
268,00
286,00
340,00
261,00
233,00
302,00
72,00
99,00
110,00
86,09
104,33
55,55
69,68
63,5
66,7
83,05
56,78
81,12
79,01
82,98
55,39
84,23
76,33
81,5
71,02
75,54
87,49
25
50
150
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
288,00
287,00
222,00
275,00
374,00
276,00
159,00
306,00
67,00
73,00
82,00
74,39
91,03
56,09
67,72
61,97
62,76
92,73
71,59
74,62
66,97
82,18
52,13
78,21
81,27
71,04
79,76
67,59
77,77
25
50
150
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
301,00
230,00
218,00
236,00
295,00
294,00
193,00
255,00
80,00
57,00
83,00
78,71
87,75
67,45
60,57
63,44
71,17
86
48,87
71,12
65,48
74,05
62,16
65,74
88,81
71,12
84,4
62,84
77,15
25
50
150
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
352,00
Diluição
1
1
10 X
1
10 X
1
1
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
10 X
1
29
4.1. Materiais
A. Leite cru
As amostras de leite cru foram retiradas de 5.000 litros provenientes de
quatro ordenhas da mesma fazenda. Esta batelada de leite foi processada em
separado na linha de produção e deste leite foram obtidas 60 peças de queijo
utilizadas no experimento.
Foram considerados os pesos em gramas das amostras de leite para a
realização das análises.
O leite foi amostrado em três etapas diferentes.
Amostra 1: Leite logo após a última ordenha mecânica, antes de chegar no
tanque de expansão.
Amostra 2: Leite de quatro ordenhas das mesmas vacas, já resfriado e
misturado no tanque de expansão da fazenda.
Amostra 3: Leite após o transporte rodoviário a granel da fazenda até a
indústria.
B. Insumos
Considerando que insumos e seu procedimento de manipulação também
podem ser uma fonte de contaminação, foi analisado o cloreto de cálcio, o
fermento láctico e o soro fermento após manipulação (diluição e crescimento).
Estes três insumos são adicionados ao leite pasteurizado na etapa do enchimento.
Amostra 4: cloreto de cálcio.
Amostra 5: fermento láctico.
Amostra 6: soro fermentado.
C. Leite pasteurizado
Foram coletadas amostras de leite pasteurizado antes do processo de
enchimento (amostra 7).
30
D. Massa de queijo
Foram coletadas cinco porções de massa de queijo provenientes do
processo de coagulação e cozimento. A idéia foi analisar uma possível
contaminação pós-pasteurização e pré-maturação (amostra 8).
E. Agentes intervenientes
Amostras de cinco formas plásticas e cinco luvas de borracha usadas pelos
colaboradores foram coletadas com “swab”, correspondendo às amostras 9 e 62
respectivamente. Foi uma forma de avaliar se os procedimentos de higienização e
limpeza estavam sendo eficientes quanto à prevenção das contaminações
fúngicas. As formas mediam 4747 cm2 e as luvas 836 cm2.
F. Queijo parmesão antes da maturação
Pedaços de queijo escolhidos ao acaso foram analisados, nas etapas de
resfriamento e salga. Foi uma forma de verificar qual a contribuição destas etapas
para o processo de contaminação fúngica (amostras 10 e 11 respectivamente).
Na câmara de resfriamento os queijos permaneceram por um período de 48
horas a uma temperatura entre 15 OC e 18 OC e umidade relativa do ar entre 75% e
85%.
Na câmara de salga os queijos permaneceram por 24 horas a uma
temperatura de 10 OC e 12 OC.
G. Queijo parmesão na maturação
Amostras de queijos parmesão em processo de maturação em câmaras-frias
foram coletadas para análises laboratoriais, visando avaliar se as condições de
armazenamento durante a maturação atuam como fatores de contaminação. Os
queijos
usados
neste
trabalho
correspondiam
exatamente
ao
padrão
comercializado pela indústria, com aproximados 23 cm de diâmetro, 14 cm altura e
6 Kg. Sessenta peças de queijos foram divididas em três grupos de vinte peças e
distribuídas em três câmaras-frias diferentes. Das vinte peças de queijo, colocadas
31
em cada câmara fria, dez foram tratadas somente com álcool etílico e dez tratadas
com uma solução de álcool etílico mais 2% de sorbato de potássio (p/v), conforme
esquema utilizado na rotina da indústria. Dos dez queijos que receberam um dos
tratamentos citados acima (só álcool ou álcool mais sorbato), cinco foram
separados ao acaso para serem amostrados em superfície (swab) e cinco para que
fossem tiradas amostras do interior da peça de parmesão (profundidade).
Cada grupo de cinco queijos foi amostrado aos trinta dias de maturação, aos
sessenta dias e aos cento e oitenta dias respectivamente, correspondendo às
amostras de 12 a 47 conforme esquema do Quadro 1.
Antes de serem colocados nas câmaras-frias, cada peça de queijo recebeu
um banho de imersão numa solução de natamicina a 0,1% (p/v) do produto
comercial (Global Food).
A área amostrada em cada queijo foi de aproximadamente 415 cm2
(correspondendo às duas faces).
As câmaras-frias de maturação foram mantidas com temperatura entre 12
O
C e 15 OC e a umidade relativa do ar entre 75% e 85%.
H. Ar ambiental
Amostras do ar foram coletadas na fazenda de produção de leite, no exterior
e interior da fábrica, na sala de salga, na sala de secagem e nas câmaras-frias de
maturação. Elas visavam analisar a correlação entre a contaminação ambiental e
os dados obtidos das amostras nas diversas etapas do processo. Estas se referem
às amostras de 48 até 61 conforme esquema no Quadro 1.
I. Salmoura
Com a finalidade de verificar a qualidade da salmoura quanto à presença de
fungos deteriorantes, foram coletadas amostras de solução salina provenientes dos
tanques de salmoura onde os queijos ficam imersos para processo de salga
(amostra 63).
A concentração salina esteve entre 20O e 21O Baumé.
32
J. Queijos contaminados
Dois queijos aparentemente contaminados foram embalados a vácuo e
levados ao laboratório para isolamento do agente contaminante. O fungo isolado
das manchas escuras presentes nas cascas destes queijos foi posteriormente
submetido ao processo de identificação. Todo o procedimento para isolamento
deste material foi realizado assepticamente em cabine de fluxo laminar.
4.2. Métodos
A. Coleta de amostras
As amostras foram coletadas sob chama, em garrafas de vidros (leite,
cloreto de cálcio, fermento lácteo, salmoura), sacos plásticos (massa, queijo) e
tubos de ensaio estéreis (swabs), conforme esquema do Quadro 1. Todas as
amostras foram transportadas para o laboratório de Micologia da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Araraquara – UNESP , sob refrigeração conforme
SILVA et al., (2001).
B. Contagem em placas
As amostras de leite, cloreto de cálcio, fermento lácteo e soro fermento
foram diluídas conforme mostra o Quadro 2, e destes materiais foram colhidas
alíquotas de 0,1 mL para inoculação em meio DRBC (Acumedia). As placas em
tréplicas foram incubadas por 5 a 7 dias a 25 oC para posterior contagem das UFC
(MISLIVEC et al., 1992; SILVA et al., 2001).
Das amostras de queijo, 25 g foram trituradas em liquidificador com 225 mL
de uma solução de citrato de sódio 2% mais Tween 80 a 1% (p/v). Desta
suspensão (diluição 10-1) foram retiradas alíquotas de 0,1 mL e plaqueadas em
meio DRBC. As placas em triplicata foram incubas por 5 a 7 dias a 25 oC e depois
contadas como UFC/g (MISLIVEC et al., 1992; SILVA et al., 2001).
Os “swabs” foram mantidos em solução de salina peptonada 0,1% e
plaqueados em meio DRBC sem diluição. As placas em triplicata foram incubadas
33
por 5 a 7 dias a 25 oC e depois contadas as UFC/cm2 (MISLIVEC et al., 1992;
SILVA et al., 2001).
C. Identificação
Os
bolores
isolados
foram
inicialmente
identificados
pelas
suas
características morfológicas, macro e microscópicas conforme LARONE, (1996).
Após o isolamento, os fungos foram mantidos em SAB com cloranfenicol a
temperatura ambiente e repicados quando necessário. Os fungos do gênero
Penicillium foram isolados e identificados por espécie conforme chave de
identificação proposta por SAMSON et al., (2000). Todos os testes foram
realizados em triplica.
D. Ar ambiental
As amostras de ar foram coletadas com o auxilio de um aparelho de fluxo de
ar forçado marca Millipore, modelo Monitor M AIR T, em meio MEA, conforme
metodologia proposta por SAMSON et al., (2000). Cada placa foi incubada por 5 a
7 dias a 25 oC e depois contadas as UFC/m3 de ar.
E. Salmoura
Os fungos da salmoura foram isolados segundo metodologia da American
Public Health of Water and Wastewater - APHWW (1998). Alíquotas de 0,1 mL,
sem diluição, foram inoculadas em meio DRBC. A contagem e identificação
realizaram-se da mesma maneira que nos itens B e C.
F. Agentes intervenientes
Os “swabs” utilizados na amostragem das formas e luvas foram analisados
conforme descrito no item C.
34
G. Análises complementares
No momento da coleta foram realizadas as medidas de pH e temperatura
dos respectivos materiais. Estas medidas estão no Quadro 3 em anexo.
H. Análises de dados
Para a análise dos dados dos tratamentos foram consideradas as médias de
5 repetições. Cada repetição foi realizada em triplicata.
Os resultados obtidos foram tratados estatisticamente pelo teste ANOVA e
submetidos ao teste de Tukey. Também foram realizadas análises da correlação
entre a presença de fungo nos queijos durante a maturação nas câmaras-frias
(amostras: 12 a 47) contra a ocorrência de fungos nas amostras ambientais.
35
5. Resultados
5.1. Bolores e Leveduras
De maneira geral a freqüência de leveduras (95,13%) foi maior do que a de
bolores (3,44%). Do total das unidades formadoras de colônias contadas em todas
as amostras, 1,44% das ocorrências não puderam ser identificadas.
As Tabelas 1, 2 e 3 mostram a comparação das médias da ocorrência de
bolores e leveduras em todas as amostras em UFC/g, UFC/cm2 e UFC/m3
respectivamente, de acordo com as características de cada material amostrado nos
diversos tratamentos.
Nas Tabelas 4, 5 e 6 tem-se as distribuição das freqüências absolutas e
relativas de ocorrências dos microorganismos isolados neste trabalho e sua
distribuição dentro da cadeia de produção do queijo parmesão. A analise dos
dados da Tabela 5 mostra uma freqüência absoluta de apenas 9% (soma das
freqüências relativas nas câmaras 1, 2 e 3) para as leveduras isoladas diretamente
dos queijos. A maior parte das leveduras foram isoladas dos outros materiais
amostrados, especialmente daqueles que apresentavam altos teores de umidade.
Vale lembrar, que os queijos em maturação foram submetidos a 3 amostragens em
tempos diferentes, enquanto outros materiais foram amostrados apenas uma única
vez.
A Figura 2 mostra a comparação entre as contagens de fungos obtidas nas
amostras de ar deste trabalho em relação a um padrão sugerido pela literatura.
Nesta figura e na Tabela 3, podemos notar que a sala de fabricação, a câmara de
secagem e a câmara de maturação 2 foram os ambientes internos que excederam
as contagens consideradas como “pobre”. A pior situação parece ser na câmara de
maturação 2 onde as contagens foram predominante de bolores.
36
Tabela 1 - Comparação múltipla das médias da contagem total de fungos no leite, insumos,
massa, nos queijos (resfriamento, salga e nas câmaras-frias de maturação) e na salmoura
em UFC/g.
Tratamentos
n
Média
1
Tratamento: 1
Leite ordenha
5
1 X 101
c
Tratamento: 2
Leite tanque
5
3,7 X 101
c
Tratamento: 3
Leite caminhão
5
9,4 X 101
c
Tratamento: 4
Cloreto de Cálcio
5
< 10
c
Tratamento: 5
Fermento láctico
5
3,4 X 103
b
Tratamento: 6
Soro fermento
5
9,1 X 101
c
Tratamento: 7
Leite pasteurizado
5
< 10
c
Tratamento: 8
Massa de queijo
5
4,3 X 103
a,b
Tratamento: 10 Queijo resfriamento
5
5,8 X 103
a
Tratamento: 11 Queijo salga
5
1 X 101
c
Tratamento: 12 Queijo câmara 1 c/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
c
Tratamento: 14 Queijo câmara 1 s/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
c
Tratamento: 16 Queijo câmara 1 c/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
c
Tratamento: 18 Queijo câmara 1 s/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
c
Tratamento: 20 Queijo câmara 1 c/ sorbato profund. - 180 dias
5
< 100
c
Tratamento: 22 Queijo câmara 1 s/ sorbato profund. - 180 dias
5
< 100
c
Tratamento: 24 Queijo câmara 2 c/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
c
Tratamento: 26 Queijo câmara 2 s/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
c
Tratamento: 28 Queijo câmara 2 c/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
c
Tratamento: 30 Queijo câmara 2 s/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
c
Tratamento: 32 Queijo câmara 2 c/ sorbato profund. - 180 dias
5
1,2 X 103
c
Tratamento: 34 Queijo câmara 2 s/ sorbato profund. - 180 dias
5
< 100
c
Tratamento: 36 Queijo câmara 3 c/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
c
Tratamento: 38 Queijo câmara 3 s/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
c
Tratamento: 40 Queijo câmara 3 c/ sorbato profund. - 60 dias
5
4,9 X 102
c
Tratamento: 42 Queijo câmara 3 s/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
c
Tratamento: 44 Queijo câmara 3 c/ sorbato profund. - 180 dias
5
3,7 X 102
c
Tratamento: 46 Queijo câmara 3 s/ sorbato profund. - 180 dias
5
< 100
c
Tratamento: 63 Água da salga
5
< 100
c
1 Médias indicadas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ( =5%)
37
Tabela 2 - Comparação múltipla das médias da contagem total de fungos nas formas,
superfície dos queijos em maturação e das luvas dos manipuladores em UFC/cm2.
1
n
Média
5
1,20
a
Tratamento: 13 Queijo câmara 1 c/ sorbato swab - 30 dias
5
0,00
d
Tratamento: 15 Queijo câmara 1 s/ sorbato swab - 30 dias
5
0,00
d
Tratamento: 17 Queijo câmara 1 c/ sorbato swab - 60 dias
5
0,00
d
Tratamento: 19 Queijo câmara 1 s/ sorbato swab - 60 dias
5
0,00
d
Tratamento: 21 Queijo câmara 1 c/ sorbato swab - 180 dias
5
0,03
d
Tratamento: 23 Queijo câmara 1 s/ sorbato swab - 180 dias
5
0,13
c
Tratamento: 25 Queijo câmara 2 c/ sorbato swab - 30 dias
5
0,00
d
Tratamento: 27 Queijo câmara 2 s/ sorbato swab - 30 dias
5
0,00
d
Tratamento: 29 Queijo câmara 2 c/ sorbato swab - 60 dias
5
0,10
c
Tratamento: 31 Queijo câmara 2 s/ sorbato swab - 60 dias
5
0,14
c
Tratamento: 33 Queijo câmara 2 c/ sorbato swab - 180 dias
5
0,44
b
Tratamento: 35 Queijo câmara 2 s/ sorbato swab - 180 dias
5
0,27
b, c
Tratamento: 37 Queijo câmara 3 c/ sorbato swab - 30 dias
5
0,07
c
Tratamento: 39 Queijo câmara 3 s/ sorbato swab - 30 dias
5
0,00
d
Tratamento: 41 Queijo câmara 3 c/ sorbato swab - 60 dias
5
0,14
c
Tratamento: 43 Queijo câmara 3 s/ sorbato swab - 60 dias
5
0,46
b
Tratamento: 45 Queijo câmara 3 c/ sorbato swab - 180 dias
5
0,23
c, d
Tratamento: 47 Queijo câmara 3 s/ sorbato swab - 180 dias
5
0,44
b
Tratamento: 62 Luvas
5
0,45
b
Tratamentos
Tratamento: 9
Formas
1 Médias indicadas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ( =5%)
1
1
Os valores da Tabela 2 se referem às contagens obtidas nas placas e depois divididas pela área
amostrada de cada material. Porém as contagens brutas obtidas ficaram dentro dos limites de
detecção do método.
38
Tabela 3 - Comparação múltipla das médias do total de fungos nas amostras de ar da
fazenda, plataforma de recebimento de leite na fábrica, sala de fabricação e câmaras-frias
de maturação em UFC/m3.
Tratamentos
1
n
Média
Tratamento: 48 Ar fazenda
5
1,4 X 103
a
Tratamento: 49 Ar plataforma
5
3,4 X 102
b
Tratamento: 50 Ar fabricação
5
1,2 X 103
b
Tratamento: 51 Ar salga
5
3,5 X 102
b
Tratamento: 52 Ar secagem
5
1,1 X 103
a
Tratamento: 53 Ar câmara 1 - 30 dias
5
1,9 X 102
b
Tratamento: 54 Ar câmara 1 - 60 dias
5
5 X 101
b
Tratamento: 55 Ar câmara 1 - 180 dias
5
5 X 101
b
Tratamento: 56 Ar câmara 2 - 30 dias
5
2,6 X 101
b
Tratamento: 57 Ar câmara 2 - 60 dias
5
1,9 X 103
a
Tratamento: 58 Ar câmara 2 - 180 dias
5
1,2 X 103
a
Tratamento: 59 Ar câmara 3 - 30 dias
5
1,5 X 102
b
Tratamento: 60 Ar câmara 3 - 60 dias
5
1,3 X 101
b
Tratamento: 61 Ar câmara 3 - 180 dias
5
9,1 X 101
b
1 Médias indicadas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ( =5%)
39
Tabela 4 – Freqüência dos fungos isolados nas etapas de produção da cadeia produtiva do
queijo parmesão.
Local
Material
Organismo
Freq. relativa
Freq. Absoluta
Leveduras
98,6%
0,07%
Aspergillus
1,4%
0,001%
Leveduras
97,7%
0,25%
Aspergillus
2,3%
0,006%
Leite do caminhão
Leveduras
100%
0,66%
Cloreto de cálcio
#
#
#
Fermento lácteo
Leveduras
100%
19,0%
Soro fermento
Leveduras
100%
0,57%
Leite pasteurizado
Penicillium
100%
0,001%
Massa de queijo
Leveduras
100%
30,1%
Formas
Leveduras
100%
8,9%
Queijo resfriamento
Leveduras
100%
19,2%
Leveduras
97,3%
0,03%
Cladosporium
2,7%
0,001%
Leveduras
99,8%
2,1%
Aureobasidium
0,002%
0,000004%
Leveduras
95,2%
0,02%
Chrysosporium
0,05%
0,000009%
Leite da ordenha
Fazenda
Leite tanque expansão
Área de produção
Queijo na salga
Luvas
Água da salga
40
Tabela 5 – Freqüência dos fungos isolados na etapa de maturação do queijo parmesão.
Local
Câmara 1
Câmara 2
Câmara 3
Material
Queijo (superfície e
profundidade)
Queijo (superfície e
profundidade)
Queijo (superfície e
profundidade)
Organismo
Freq. relativa
Freq. Absoluta
Aspergillus
19,6%
0,009%
Penicillium
0,24%
0,000001%
Leveduras
80,1%
0,04%
Chrysosporium
0,001%
0,000000002%
Alternaria
0,001%
0,0000000005%
Leveduras
96,0%
5,2%
Aspergillus
1,5%
0,08%
Penicillium
1,7%
0,09%
Penicillium
7,0%
0,46%
Leveduras
53,7%
3,6%
Aspergillus
2,1%
0,14%
Cladosporium
0,6%
0,04%
0,000008%
0,000001%
Gliocadium
41
Tabela 6 – Freqüência dos fungos isolados do ar em várias etapas da cadeia produtiva do
queijo parmesão.
Local
Ar da fazenda
Ar da plataforma
Ar da sala de fabricação
Ar da sala de salga
Ar da câmara de secagem
Ar da câmara 1
Ar da câmara 2
Ar da câmara 3
Organismo
Cladosporium
Leveduras
Fusarium
Penicillium
Alternaria
Cladosporium
Chrysosporium
Epicoccum ssp
Leveduras
Helminthosporium
Alternaria
Penicillium
Fusarium
Nigrospora
Aspergillus
Cladosporium
Levedura
Cladosporium
Levedura
Fusarium
Penicillium
Alternaria
Cladosporium
Leveduras
Aspergillus
Penicillium
Fusarium
Levedura
Geotrichum
Chrysosporium
Rhizomucor
Aspergillus
Penicillium
Cladosporium
Levedura
Rhyzopus
Aspergillus
Penicillium
Levedura
Cladosporium
Freq. Relativa
52,9%
25,7%
8,6%
1,4%
1,4%
81,4%
3,5%
2,3%
4,7%
2,3%
1,2%
2,3%
2,3%
0,14%
2,9%
8,8%
88,0%
52,9%
25,7%
8,6%
1,4%
1,4%
0,19%
98,7%
56,4%
19,9%
0,7%
2,4%
1,8%
1,8%
0,47%
30,2%
18,8%
0,31%
0,17%
0,53%
7,7%
24,7%
67,0%
0,6%
Freq. Absoluta
0,69%
0,33%
0,11%
0,02%
0,02%
0,65%
0,03%
0,02%
0,04%
0,02%
0,01%
0,02%
0,02%
0,003%
0,068%
0,21%
2,1%
0,17%
0,08%
0,028%
0,005%
0,005%
0,000%
2,4%
0,44%
0,3%
0,005%
0,02%
0,003%
0,003%
0,001%
4,4%
2,7%
0,05%
0,03%
0,2%
0,045%
0,15%
0,4%
0,003%
42
Bolores
Leveduras
3
contagem em UFC/m
de ar
2.500,00
2.000,00
1.500,00
1.000,00
500,00
Ar
fa
Ar z e
pl nda
a
Ar tafo
r
fa
br ma
ic
ac
a
Ar o
Ar
s
al
c â Ar
s e ga
m
Ar
a
c
ag
ra
câ
em
1
m
Ar ara - 3
0
câ
1
- 6 di a
m
s
Ar ara 0 d
ia
câ 1
m -1 s2
Ar
c â ar a 80 d
2
m
ia
s
Ar ara - 3
0
câ
2
d
ia
-6
m
s
Ar ara 0 d
c â 2 - i as
m
2
ar 180
Ar
di
câ a 3
as
Ar ma - 3
0
câ r a
di
3
m
- 6 as
ar
0
a
di
3
a
Pa 180 s
dr
ão di a
s
Pa "p o
br
dr
ão e"
"b
om
"
-
amostras de ar
Figura 2 – Comparação das contagens de bolores e leveduras nas amostras de ar em
relação ao padrão sugerido por RANDMORE & LUCK, (1984) citados em SCHOLTE et
al.,(2000).
5.2. Bolores
Neste trabalho foram identificados 14 diferentes gêneros de bolores. Eles
representaram apenas 3,44% da freqüência absoluta dos fungos presentes em
todas as amostras. Destes 53,16% foram do gênero Penicillium com 50
ocorrências e 41,33% do gênero Aspergillus com 19 ocorrências. Os outros
gêneros isolados foram: Cladophiadophora, Rhizopus, Fusarium, Aureobasidium,
Chrysosporium,
Alternaria,
Epicoccum,
Helminthosporium,
Geotrichum,
Gliocladium, Nigrospora e Rhizomucor conforme a Tabela 7. Helminthosporium,
Epicoccum, Fusarium, Geotrichum Rhizomucor e Rhizopus foram bolores isolados
somente das amostras ambientais.
Nas Tabelas de 8 a 10 estão as comparações das médias de ocorrência de
bolores em todas as amostras em UFC/g, UFC/cm2 e UFC/m3 respectivamente, de
acordo com as características de cada material amostrado nos diversos
tratamentos.
43
O tratamento com sorbato de potássio parece pouco alterar a questão da
contaminação dos queijos por bolores, pois não há diferenças significativas entre
as amostras, conforme dados das Tabelas 8 e 9.
Tabela 7 – Freqüência relativa e número de ocorrência dos bolores isolados em todos os
tratamentos.
Nº de ocorrências 1
Freqüência 2
Penicillium spp
50
53,161%
Aspergillus spp
19
41,333%
Cladosporium spp
10
4,534%
Rhizopus spp
1
0,343%
Fusarium spp
5
0,215%
Aureobasidium spp
1
0,143%
Chrysosporium spp
5
0,100%
Alternaria spp
4
0,057%
Epicoccum spp
1
0,029%
Helminthosporium spp
1
0,029%
Geotrichum spp
1
0,014%
Gliocladium spp
1
0,014%
Nigrospora spp
1
0,014%
Gêneros
Rhizomucor spp
1
0,014%
1 Refere-se ao número de vezes que um determinado gênero foi identificado
independentemente das contagens de UFC.
2 Leva em conta a contagem total de UFC de cada um dos diferentes gêneros isolados.
44
Tabela 8 – Comparação múltipla das médias da contagem total de bolores no leite,
insumos, massa, nos queijos (resfriamento, salga e nas câmaras-frias) e na salmoura em
UFC/g.
Tratamentos
n
Média
1
Tratamento: 1
Leite ordenha
5
< 10
a
Tratamento: 2
Leite tanque
5
< 10
a
Tratamento: 3
Leite caminhão
5
< 100
a
Tratamento: 4
Cloreto de Cálcio
5
< 10
a
Tratamento: 5
Fermento láctico
5
< 100
a
Tratamento: 6
Soro fermento
5
< 10
a
Tratamento: 7
Leite pasteurizado
5
< 10
a
Tratamento: 8
Massa de queijo
5
< 100
a
Tratamento: 10 Queijo resfriamento
5
< 100
a
Tratamento: 11 Queijo salga
5
< 100
a
Tratamento: 12 Queijo câmara 1 c/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
a
Tratamento: 14 Queijo câmara 1 s/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
a
Tratamento: 16 Queijo câmara 1 c/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
a
Tratamento: 18 Queijo câmara 1 s/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
a
Tratamento: 20 Queijo câmara 1 c/ sorbato profund. - 180 dias
5
< 100
a
Tratamento: 22 Queijo câmara 1 s/ sorbato profund. - 180 dias
5
< 100
a
Tratamento: 24 Queijo câmara 2 c/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
a
Tratamento: 26 Queijo câmara 2 s/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
a
Tratamento: 28 Queijo câmara 2 c/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
a
Tratamento: 30 Queijo câmara 2 s/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
a
Tratamento: 32 Queijo câmara 2 c/ sorbato profund. - 180 dias
5
< 100
a
Tratamento: 34 Queijo câmara 2 s/ sorbato profund. - 180 dias
5
< 100
a
Tratamento: 36 Queijo câmara 3 c/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
a
Tratamento: 38 Queijo câmara 3 s/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
a
Tratamento: 40 Queijo câmara 3 c/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
a
Tratamento: 42 Queijo câmara 3 s/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
a
Tratamento: 44 Queijo câmara 3 c/ sorbato profund. - 180 dias
5
< 100
a
Tratamento: 46 Queijo câmara 3 s/ sorbato profund. - 180 dias
5
< 100
a
Tratamento: 63 Água da salga
5
< 10
a
1 Médias indicadas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ( =5%)
45
Tabela 9 - Comparação múltipla das médias da contagem total de bolores nas formas,
superfície dos queijos em maturação e das luvas dos manipuladores em UFC/cm2.
Tratamentos
1
n
Média
5
0,00
d
Tratamento: 13 Queijo câmara 1 c/ sorbato swab - 30 dias
5
0,00
d
Tratamento: 15 Queijo câmara 1 s/ sorbato swab - 30 dias
5
0,00
d
Tratamento: 17 Queijo câmara 1 c/ sorbato swab - 60 dias
5
0,00
d
Tratamento: 19 Queijo câmara 1 s/ sorbato swab - 60 dias
5
0,02
d
Tratamento: 21 Queijo câmara 1 c/ sorbato swab - 180 dias
5
0,05
d
Tratamento: 23 Queijo câmara 1 s/ sorbato swab - 180 dias
5
0,04
c, d
Tratamento: 25 Queijo câmara 2 c/ sorbato swab - 30 dias
5
0,00
d
Tratamento: 27 Queijo câmara 2 s/ sorbato swab - 30 dias
5
0,00
d
Tratamento: 29 Queijo câmara 2 c/ sorbato swab - 60 dias
5
0,50
c, d
Tratamento: 31 Queijo câmara 2 s/ sorbato swab - 60 dias
5
0,60
b, c
Tratamento: 33 Queijo câmara 2 c/ sorbato swab - 180 dias
5
0,00
d
Tratamento: 35 Queijo câmara 2 s/ sorbato swab - 180 dias
5
0,20
c, d
Tratamento: 37 Queijo câmara 3 c/ sorbato swab - 30 dias
5
0,01
d
Tratamento: 39 Queijo câmara 3 s/ sorbato swab - 30 dias
5
0,00
d
Tratamento: 41 Queijo câmara 3 c/ sorbato swab - 60 dias
5
0,04
d
Tratamento: 43 Queijo câmara 3 s/ sorbato swab - 60 dias
5
0,03
c, d
Tratamento: 45 Queijo câmara 3 c/ sorbato swab - 180 dias
5
1,13
b
Tratamento: 47 Queijo câmara 3 s/ sorbato swab - 180 dias
5
2,19
a
Tratamento: 62 Luvas
5
0,00
d
Tratamento: 9
Formas
1 Médias indicadas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ( =5%)
2
2
Os valores da Tabela 9 se referem às contagens obtidas nas placas e depois divididas pela área
amostrada de cada material. Porém as contagens brutas obtidas ficaram dentro dos limites de
detecção do método.
46
Tabela 10 – Comparação múltipla das médias do total de bolores nas amostras de ar da
fazenda, plataforma de recebimento de leite na fábrica, sala de fabricação e câmaras-frias
de maturação em UFC/m3.
Tratamentos
1
n
Média
Tratamento: 48 Ar fazenda
5
1,1X 103
b
Tratamento: 49 Ar plataforma
5
3,3 X 102
c
Tratamento: 50 Ar fabricação
5
1,3 X 102
c
Tratamento: 51 Ar salga
5
2,6 X 102
c
Tratamento: 52 Ar secagem
5
1,6 X 101
c
Tratamento: 53 Ar câmara 1 - 30 dias
5
1,9 X 102
c
Tratamento: 54 Ar câmara 1 - 60 dias
5
4,4 X 101
c
Tratamento: 55 Ar câmara 1 - 180 dias
5
4,8 X 101
c
Tratamento: 56 Ar câmara 2 - 30 dias
5
2,6 X 101
c
Tratamento: 57 Ar câmara 2 - 60 dias
5
1,9 X 103
a
Tratamento: 58 Ar câmara 2 - 180 dias
5
1,2 X 103
b
Tratamento: 59 Ar câmara 3 - 30 dias
5
1,4 X 101
c
Tratamento: 60 Ar câmara 3 - 60 dias
5
6,7 X 100
c
Tratamento: 61 Ar câmara 3 - 180 dias
5
6,3 X 101
c
1 Médias indicadas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ( =5%)
Amostras ambientais comparadas na Tabela 10 mostram uma presença
significativamente maior de bolores na amostra 57 (ar da câmara 2 aos 60 dias)
com média de 1,9 X 103 UFC/m3 seguida da amostra 58 (ar da câmara 2 aos 180
dias) com média de 1,2 X 103 UFC/m3 e depois da amostra 48 (ar da fazenda) com
média de 1,1 X 103 UFC/m3. Os demais tratamentos não diferem entre si.
Há uma correlação positiva entre as contagens de bolores e o tempo em que
os queijos permaneceram nas câmaras-frias durante o processo de maturação
(Figura 3), porém não há correlação entre a contagem de UFC nos queijos com a
quantidade de bolores das amostras ambientais.
Os dados da Tabela 11 mostram um aumento das contagens em UFC/cm2
conforme o período de permanência dos queijos nas câmaras-frias.
47
tempo em dias
200
y = 42,952x + 17,928
R2 = 0,9574
150
100
50
0
0
1
2
3
4
contagem de bolores em UFC/cm2
Figura 3 – Correlação entre o tempo de maturação e a presença de bolores no queijo
parmesão (amostras de superfície – swabs).
Tabela 11 - Soma das contagens dos microrganismos nas amostras das superfícies dos
queijos nas três câmaras-frias.
Tempo de maturação do parmesão em câmara-fria
30 dias
60 dias
180 dias
153
1754
3163
bolor (UFC) *
6
588
1495
Penicillium (UFC) *
3
447
837
bolor + levedura (UFC) *
* É a somatória das contagens dos tratamentos 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39,
41, 43, 45 e 47 em valores brutos das UFCs.
48
5.3. Penicillium
O gênero Penicilium predominou (53,2%) entre os bolores isolados (Tabela
7). As Tabelas de 12 a 14 mostram as comparações entre as médias da ocorrência
de Penicillium em todas as amostras em UFC/g, UFC/cm2 e UFC/m3
respectivamente, de acordo com as características de cada material amostrado nos
diversos tratamentos. Leite, insumos e partes internas dos queijos não
apresentaram diferenças significativas entre si nas contagens de UFC/g conforme
os dados da Tabela 12.
Os dados da Tabela 12 deixam dúvidas quanto à ação antifúngica do
sorbato de potássio contra a presença do gênero Penicillium.
A Tabela 11 mostra que há um aumento nas contagens de Penicillium em
UFC/cm2 conforme o tempo de permanência dos queijos nas câmaras-frias,
principalmente após os 60 dias.
49
Tabela 12 – Comparação múltipla das médias da contagem de Penicillium no leite,
insumos, massa, nos queijos (resfriamento, salga e nas câmaras-frias) e na salmoura em
UFC/g.
Tratamentos
n
Média
1
Tratamento: 1
Leite ordenha
5
< 10
a
Tratamento: 2
Leite tanque
5
< 10
a
Tratamento: 3
Leite caminhão
5
< 100
a
Tratamento: 4
Cloreto de Cálcio
5
< 10
a
Tratamento: 5
Fermento láctico
5
< 100
a
Tratamento: 6
Soro fermento
5
< 10
a
Tratamento: 7
Leite pasteurizado
5
< 10
a
Tratamento: 8
Massa de queijo
5
< 100
a
Tratamento: 10 Queijo resfriamento
5
< 100
a
Tratamento: 11 Queijo salga
5
< 100
a
Tratamento: 12 Queijo câmara 1 c/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
a
Tratamento: 14 Queijo câmara 1 s/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
a
Tratamento: 16 Queijo câmara 1 c/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
a
Tratamento: 18 Queijo câmara 1 s/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
a
Tratamento: 20 Queijo câmara 1 c/ sorbato profund. - 180 dias
5
< 100
a
Tratamento: 22 Queijo câmara 1 s/ sorbato profund. - 180 dias
5
< 100
a
Tratamento: 24 Queijo câmara 2 c/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
a
Tratamento: 26 Queijo câmara 2 s/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
a
Tratamento: 28 Queijo câmara 2 c/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
a
Tratamento: 30 Queijo câmara 2 s/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
a
Tratamento: 32 Queijo câmara 2 c/ sorbato profund. - 180 dias
5
< 100
a
Tratamento: 34 Queijo câmara 2 s/ sorbato profund. - 180 dias
5
< 100
a
Tratamento: 36 Queijo câmara 3 c/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
a
Tratamento: 38 Queijo câmara 3 s/ sorbato profund. - 30 dias
5
< 100
a
Tratamento: 40 Queijo câmara 3 c/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
a
Tratamento: 42 Queijo câmara 3 s/ sorbato profund. - 60 dias
5
< 100
a
Tratamento: 44 Queijo câmara 3 c/ sorbato profund. - 180 dias
5
< 100
a
Tratamento: 46 Queijo câmara 3 s/ sorbato profund. - 180 dias
5
< 100
a
Tratamento: 63 Água da salga
5
< 10
a
1 Médias indicadas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ( =5%)
50
Tabela 13 - Comparação múltipla das médias da contagem total de Penicillium nas formas,
superfície dos queijos em maturação e das luvas dos manipuladores em UFC/cm2.
Tratamentos
1
n
Média
5
0,00
c
Tratamento: 13 Queijo câmara 1 c/ sorbato swab - 30 dias
5
0,00
c
Tratamento: 15 Queijo câmara 1 s/ sorbato swab - 30 dias
5
0,00
c
Tratamento: 17 Queijo câmara 1 c/ sorbato swab - 60 dias
5
0,00
c
Tratamento: 19 Queijo câmara 1 s/ sorbato swab - 60 dias
5
0,00
c
Tratamento: 21 Queijo câmara 1 c/ sorbato swab - 180 dias
5
0,01
c
Tratamento: 23 Queijo câmara 1 s/ sorbato swab - 180 dias
5
0,01
c
Tratamento: 25 Queijo câmara 2 c/ sorbato swab - 30 dias
5
0,00
c
Tratamento: 27 Queijo câmara 2 s/ sorbato swab - 30 dias
5
0,00
c
Tratamento: 29 Queijo câmara 2 c/ sorbato swab - 60 dias
5
0,10
b
Tratamento: 31 Queijo câmara 2 s/ sorbato swab - 60 dias
5
0,06
b, c
Tratamento: 33 Queijo câmara 2 c/ sorbato swab - 180 dias
5
0,00
c
Tratamento: 35 Queijo câmara 2 s/ sorbato swab - 180 dias
5
0,05
b, c
Tratamento: 37 Queijo câmara 3 c/ sorbato swab - 30 dias
5
0,00
c
Tratamento: 39 Queijo câmara 3 s/ sorbato swab - 30 dias
5
0,00
c
Tratamento: 41 Queijo câmara 3 c/ sorbato swab - 60 dias
5
0,01
c
Tratamento: 43 Queijo câmara 3 s/ sorbato swab - 60 dias
5
0,05
b, c
Tratamento: 45 Queijo câmara 3 c/ sorbato swab - 180 dias
5
0,00
c
Tratamento: 47 Queijo câmara 3 s/ sorbato swab - 180 dias
5
0,34
a
Tratamento: 62 Luvas
5
0,00
c
Tratamento: 9
Formas
1 Médias indicadas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ( =5%)
3
3
Os valores da Tabela 13 se referem às contagens obtidas nas placas e depois divididas pela área
amostrada de cada material. Porém as contagens brutas obtidas ficaram dentro dos limites de
detecção do método.
51
Tabela 14 - Comparação múltipla das médias do total de Penicillium nas amostras de ar da
fazenda, plataforma recebimento de leite na fábrica, sala de fabricação e câmaras-frias de
maturação em UFC/m3.
Tratamentos
1
n
Média
Tratamento: 48 Ar fazenda
5
2 X 101
b
Tratamento: 49 Ar plataforma
5
8 X 100
b
Tratamento: 50 Ar fabricação
5
<1
b
Tratamento: 51 Ar salga
5
5 X 100
b
Tratamento: 52 Ar secagem
5
6 X 100
b
Tratamento: 53 Ar câmara 1 - 30 dias
5
5,6 X 101
b
Tratamento: 54 Ar câmara 1 - 60 dias
5
9,1 X 100
b
Tratamento: 55 Ar câmara 1 - 180 dias
5
1,3 X 101
b
Tratamento: 56 Ar câmara 2 - 30 dias
5
1,8 X 101
b
Tratamento: 57 Ar câmara 2 - 60 dias
5
1,2 X 101
b
Tratamento: 58 Ar câmara 2 - 180 dias
5
1,2 X 103
a
Tratamento: 59 Ar câmara 3 - 30 dias
5
<1
b
Tratamento: 60 Ar câmara 3 - 60 dias
5
2,7 X 100
b
Tratamento: 61 Ar câmara 3 - 180 dias
5
6 X 101
b
1 Médias indicadas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ( =5%)
52
A Figura 4 confirma haver uma correlação positiva entre as contagens de
Penicillium e o tempo em que os queijos permaneceram nas câmaras-frias durante
o processo de maturação. Porém não há correlação entre a contagem nos queijos
com a quantidade de Penicillium das amostras ambientais.
tempo em dias
200
y = 73,534x + 13,949
R2 = 0,8687
150
100
50
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
contagem de Penicillium em UFC/cm2
Figura 4 – Correlação entre o tempo de maturação e a presença de Penicillium no queijo
parmesão (amostras de superfície – swabs).
5.4 Identificação do Agente Deteriorante
A descrição morfológica macroscópica do agente deteriorante e os
resultados dos testes complementares para identificação estão na Tabela 15 e nas
Figuras 4 e 5, respectivamente.
A microscopia do fungo isolado nos queijos contaminados revelou as
seguintes características: conidióforos “tetraverticilados”, “conidióforo” rugosas e
conídios redondos lisos (Figura 6).
53
Tabela 15 - Identificação de Penicillium isolado das manchas de queijos com defeitos de
qualidade.
Meios de
cultura
Características das colônias *
Tamanho
Forma
Cor
Reverso
Obs.
MEA
450 mm
aveludada, chata,
densa
verde/cinza
característico
verde escuro
_
CYEA
450 mm
aveludada, chata,
densa
verde/cinza
característico
verde escuro
_
CREA
400 mm
aveludada, chata, rala
verde/cinza
característico
_
sem
ácido
NSA
400 mm
aveludada, chata,
densa
verde/cinza
característico
_
_
0,5% AA **
300 mm
aveludada, chata, rala
verde/cinza
característico
_
_
o
* Resultados obtidos após incubação por 7 dias a 25 C.
**MEA + 0,5% de AA.
MEA
CREA
CYEA
Figura 5 – Crescimento do agente deteriorante nos meios de cultura MEA, CREA e CYEA.
54
NSA
MEA + 0,5% AA
Figura 6 – Crescimento do agente deteriorante nos meios de cultura NSA e MEA + 0,5% de
AA.
a
3. ramificação
a
2. ramificação
a
1. ramificação
Haste principal: rugosa
Figura 7 – Características morfológicas microscópicas do agente deteriorante.
Conídios
globosos
55
Quando analisados dentro da chave de identificação proposta por SAMSON
et al., (2000) estes resultados indicam que o material isolado das manchas escuras
características dos queijos visualmente comprometidos pertence à espécie
Penicillium roqueforti.
Vale lembrar que as espécies Penicillium roqueforti, Penicillium carneum e
Penicillium paneum possuem morfologias muito semelhantes entre si, e só foram
diferenciadas através de protocolos baseados na genética molecular (BOYSEN et
al., 1996).
Resultados praticamente idênticos aos mencionados acima foram obtidos
para bolores do gênero Penicillium isolados nas amostras 23 (cepa Scala 6), 28
(cepa Scala 33), 30 (cepa Scala 33), 37 (cepa Scala 11), 41 (cepa Scala 18), 42
(cepa Scala 2), 46 (cepa Scala 30), 47 (cepa Scala 6), 56 (cepa Sala 14) e 57
(cepa Scala 24) apresentados na Tabela 16.
56
Tabela 16 - Local de isolamento das diversas cepas do gênero Penicillium dentro da cadeia
produtiva do queijo parmesão.
Amostra
Local
Material
Etapa do Processo
Cepa
7
Indústria
Leite pasteurizado
Enchimento
Cepa Scala 17
13
Indústria
Queijo + sorbato (swab)
Maturação câmara 1
Cepa Scala 7 ou 16
17
Indústria
Queijo + sorbato (swab)
Maturação câmara 1
Cepa Scala 7 ou 16
19
Indústria
Queijo (swab)
Maturação câmara 1
Cepa Scala 7 ou 16
21
Indústria
Queijo + sorbato (swab)
Maturação câmara 1
Cepa Scala 27
23
Indústria
Queijo (swab)
Maturação câmara 1
Cepa Scala 6
28
Indústria
Queijo + sorbato (profundidade)
Maturação câmara 2
Cepa Scala 33
29
Indústria
Queijo + sorbato (swab)
Maturação câmara 2
Cepa Scala 15
30
Indústria
Queijo (profundidade)
Maturação câmara 2
Cepa Scala 33
31
Indústria
Queijo (swab)
Maturação câmara 2
Cepa Scala 15
32
Indústria
Queijo + sorbato (profundidade)
Maturação câmara 2
Cepa Scala 10
35
Indústria
Queijo (swab)
Maturação câmara 2
Cepa Scala 27
37
Indústria
Queijo + sorbato (swab)
Maturação câmara 3
Cepas Scala 8 e 11
38
Indústria
Queijo (profundidade)
Maturação câmara 3
Cepa Scala 23
41
Indústria
Queijo + sorbato (swab)
Maturação câmara 3
Cepa Scala 18
42
Indústria
Queijo (profundidade)
Maturação câmara 3
Cepa Scala 2
43
Indústria
Queijo (swab)
Maturação câmara 3
Cepa Scala 26
45
Indústria
Queijo + sorbato (swab)
Maturação câmara 3
Cepa Scala 27
46
Indústria
Queijo (profundidade)
Maturação câmara 3
Cepa Scala 30
47
Indústria
Queijo (swab)
Maturação câmara 3
Cepa Scala 6
48
Fazenda
Ar ambiental
Ordenha
Cepa Scala 35
49
Indústria
Ar ambiental externo
Recepção
Cepa Scala 21
51
Indústria
Ar ambiental
Salga
Cepa Scala 5
53
Indústria
Ar ambiental
Maturação câmara 1
Cepas Scala 19 e 34
54
Indústria
Ar ambiental
Maturação câmara 1
Cepas Scala 9 e 32
55
Indústria
Ar ambiental
Maturação câmara 1
Cepa Scala 28
56
Indústria
Ar ambiental
Maturação câmara 2
Cepas Scala 1, 13 e 14
57
Indústria
Ar ambiental
Maturação câmara 2
Cepa Scala 24
58
Indústria
Ar ambiental
Maturação câmara 2
Cepa Scala 22
60
Indústria
Ar ambiental
Maturação câmara 3
Cepa Scala 4
61
Indústria
Ar ambiental
Maturação câmara 3
Cepas Scala 20 e 28
57
6. Discussão
As informações levantadas neste trabalho servirão para subsidiar o
programa de controle de qualidade da indústria onde foram coletadas as amostras.
Elas indicarão quais os melhores procedimentos a serem adotados para minimizar
as perdas pela contaminação por bolores na produção do queijo parmesão.
As leveduras foram a grande maioria dos fungos quantificados. Contudo,
apesar das altas contagens em algumas amostras, durante o período de realização
do trabalho, os queijos não apresentaram quaisquer problemas que aparentemente
se relacionasse a estes organismos.
Os bolores representaram 3,44% dos fungos quantificados. Entre os bolores,
o gênero Penicillium com uma freqüência relativa de 53,1% e 50 ocorrências,
predominou como principal contaminante, seguido do gênero Aspergillus com
freqüência de 41,3% e 19 ocorrências e depois do gênero Cladosporium com
freqüência de 4,5% e 10 ocorrências.
As condições de temperatura no processo de maturação talvez seja uma
explicação para estes dados, uma vez que a maioria das espécies do gênero
Penicillium são psicrófilos.
Nos queijos também foram isolados os gêneros Chrysosporium, Alternaria e
Gliocadium.
O mofo deteriorante que formava as manchas escuras na casca do queijo
parmesão é provavelmente da espécie P. roqueforti ou espécies morfologicamente
próximas.
A identificação do agente deteriorante deixa claro que os bolores,
principalmente o gênero Penicillium, são mais importantes como agentes
deteriorantes quanto à qualidade comercial do queijo parmesão na indústria em
questão.
A ação deteriorante acontece primordialmente na casca. A condição de
aerobiose e o contato da casca com as prateleiras de madeira (material poroso)
talvez sejam os fatores que contribuam para que estes bolores se desenvolvam na
casca dos queijos.
58
Helminthosporium,
Epicoccum,
Fusarium,
Geotrichum
Rhizomucor
e
Rhizopus foram bolores isolados somente das amostras de ar. Todos eles são
citados por LARONE, (1996) como organismos contaminantes do ambiente. O ar
da câmara 2 se mostrou o mais contaminado por bolores durante o período do
experimento. Esta câmara-fria apresentou valores de UFC/m3 significativamente
maiores que os considerados “pobre” por SCHOLTE at. al, (2000). Os resultados
sugerem que maiores cuidados deverão ser tomados quanto à qualidade do ar no
interior da indústria. A mesma sugestão é feita por KURE et al., (2004) após
trabalho visando identificar as fontes de contaminação por bolores em fábricas de
queijo na Noruega. Contudo, o problema parece estar mais localizado nas
câmaras-frias de maturação, do que em outras instalações.
Confirmou-se também a tendência de aumento dos problemas ligados à
deterioração por bolores conforme o maior período de permanência dos queijos
nas câmaras-frias de maturação. Quanto maior o tempo de maturação, maior o
grau de contaminação por bolores.
Leite cru, insumos, agentes intervenientes e a salmoura parecem não
contribuir na contaminação dos queijos por bolores.
Os resultados deixam dúvidas quanto à ação do sorbato de potássio como
agente conservante. Este dado sugere realização de testes de susceptibilidade às
drogas, para melhor avaliar a ação dos conservantes como inibidores da
deterioração fúngica nas condições da indústria em questão, visto que P. roqueforti
e outras espécies do gênero são mencionadas na literatura como tolerantes a ação
deste e outros conservantes (FILTENBORG et al., 1996; FILTENBORG et al.,
2000).
O gênero Aureobasidium (em baixa quantidade) foi isolado somente das
luvas de borracha,
De maneira geral, os resultados deste trabalho, com algumas variações se
assemelham aos de outros autores que trabalharam com a questão da
deterioração fúngica em queijos (TANIWAKI & DENDER, 1992; FILTENBORG et
al., 1996; KURE et al., 2001; KURE et al., 2004), conforme mencionado no item
3.3. deste trabalho.
59
7. Conclusões
De acordo com os resultados obtidos nesta pesquisa, pode-se concluir que:
7.1. As etapas de fabricação anteriores à maturação, o leite, os insumos e os
agentes intervenientes pouco contribuem como fonte de contaminação por bolores
no queijo parmesão.
7.2. A ação deteriorante dos bolores ocorre predominantemente na casca
(superfície) do queijo parmesão.
7.3. Bolores do gênero Penicillium, provavelmente a espécie P. roqueforti, foram
identificados com os agentes deteriorantes responsáveis pelo aparecimento das
manchas escuras nas cascas dos queijos.
7.4. A maior contribuição para a contaminação por bolores esta relacionada à
etapa de maturação e aumenta proporcionalmente ao período em que os queijos
permanecem nas câmaras-frias.
7.5. A ação antifúngica do sorbato de potássio e da natamicina, nas concentrações
usadas na rotina da empresa, precisa ser criteriosamente avaliada quanto a sua
real eficiência, para as cepas isoladas neste trabalho.
7.6. Os resultados de estudo devem ser levados em consideração na aplicação do
programa de APPCC da indústria no que se refere à prevenção da deterioração por
bolores no queijo parmesão.
60
8. Referências Bibliográficas
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65
ANEXOS
Quadro 3 - Temperatura e pH dos materiais amostrados.
Amost.
1
2
3
4
5
6
7
8
10
11
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
42
44
46
63
Material
Leite cru
Leite cru
Leite cru
Cloreto de cálcio
Fermento láctico
Soro fermentado
Leite pasteurizado
Massa de queijo
Queijo
Queijo
Queijo+sorb. (prof.)
Queijo (prof.)
Queijo+sorb. (prof.)
Queijo (prof.)
Queijo+sorb. (prof.)
Queijo (prof.)
Queijo+sorb. (prof.)
Queijo (prof.)
Queijo+sorb. (prof.)
Queijo (prof.)
Queijo+sorb. (prof.)
Queijo (prof.)
Queijo+sorb. (prof.)
Queijo (prof.)
Queijo+sorb. (prof.)
Queijo (prof.)
Queijo+sorb. (prof.)
Queijo (prof.)
Água da salga
Nc = não coletado
Temperatura (oC)
34,0
7,0
8,0
21,0
27,0
28,0
26,0
45,0
40,0
13,0
12,9
12,8
14,4
15,1
13,5
12,7
12,5
12,7
14,9
14,9
13,3
13,2
14,7
14,2
14,4
13,8
15,6
14,4
12,0
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
12,0
13,3
12,8
14,1
14,7
13,0
12,9
12,6
12,5
14,0
12,8
13,4
13,0
14,6
13,5
14,5
14,0
14,3
13,7
12,0
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
12,0
13
13,2
14,1
15,3
13,2
12,8
12,5
12,4
13,6
12,9
13,5
13,0
14,2
13,7
14,1
13,7
14,2
14
12,0
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
12,0
13,1
13,5
13,8
14,4
12,9
12,8
12,7
12,4
13,8
12,9
13,3
13,1
13,6
13,8
13,7
13,7
13,5
13,8
12,0
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
12,0
13,5
13,8
13,6
13,8
12,9
12,9
12,4
12,4
13,3
12,7
13,3
13,0
13,6
13,7
Nc
13,3
14,3
13,2
12,0
pH
6,7
6,9
6,9
6,4
3,9
3,5
6,8
5,3
5,1
5,2
5,27
5,39
5,44
5,31
5,36
5,43
5,42
5,31
5,46
5,49
5,38
5,44
5,42
5,31
5,44
5,54
5,35
5,37
5,0
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
5,3
5,24
5,45
5,45
5,43
5,45
5,28
5,46
5,29
5,47
5,37
5,36
5,38
5,44
5,4
5,46
5,45
5,4
5,33
5,0
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
5,2
5,33
5,38
5,41
5,44
5,34
5,35
5,39
5,3
5,41
5,43
5,35
5,33
5,46
5,49
5,43
5,43
5,34
5,34
5,0
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
5,2
5,36
5,33
5,42
5,44
5,38
5,47
5,37
5,37
5,44
5,43
5,35
5,35
5,39
5,35
5,5
5,58
5,38
5,3
5,1
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
Nc
5,4
5,4
5,38
5,44
5,53
5,46
5,43
5,37
5,35
5,58
5,47
5,53
5,37
5,46
5,45
Nc
5,46
5,56
5,37
5,1
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