Técnicas de Preservação de Microrganismos Lara Durães Sette CBMAI-CPQBA/UNICAMP [email protected] Importância da preservação armazenamento de culturas por longos períodos e utilização periódica para pesquisa e/ou produção – – – contaminação perda de viabilidade mutação (perda das características fisiológicas) solução → metodologia de preservação de longa duração – diminuição do crescimento e das atividades metabólicas crescimento em meio mínimo resíduos metabólicos podem comprometer a viabilidade da cultura Importância da preservação preservação a longo prazo – – evita problemas com o novo isolamento de microrganismos economia de tempo, mão de obra e custos com material de consumo importante função da coleção de culturas – – pesquisadores: falta de experiência e/ou equipamentos para preservação por períodos prolongados garantia de sobrevivência, estabilidade e pureza Escolha do método de preservação pontos a serem considerados – manutenção da viabilidade: perda de células no processo de preservação e durante o armazenamento – manutenção das propriedades originais: perda de características de interesse científico ou industrial – pureza: evitar chances de contaminação do microrganismo – custos de preservação e manutenção Escolha do método de preservação – tamanho estimado do acervo: tempo operacional exigido anteriormente e posterior à manipulação; espaço disponível para armazenamento – importância do acervo: conseqüência de sua eventual perda; culturas com potencial biotecnológico → preservação por mais de um método – necessidade de acesso e uso da cultura: réplicas em quantidades adequadas; facilidade de reativação; preservação adequada para embalagem de envio e condições de transporte – disponibilidade de equipamentos e de recursos humanos e financeiros Métodos de preservação curto prazo – médio prazo – – – – repique contínuo preservação em óleo mineral preservação em água congelamento a -20°C secagem em sílica, solo e papel de filtro longo-termo – – – liofilização congelamento a -80°C criopreservação em nitrogênio líquido Repique contínuo princípio – diminuição do metabolismo (meios mínimos; baixa temperatura) fatores a serem considerados – – – meio adequado para manter a cultura temperatura de estocagem: temperatura ambiente de 2-3 meses; geladeira (4 a 7 ºC) de 4-6 meses freqüência entre as transferências: determinação empírica minimizar o n° de repiques → evitar a seleção de mutantes examinar a pureza em cada transferência conservar em duplicata Repique contínuo Repique contínuo vantagens – – – baixo custo não requer equipamentos especializados o manuseio é simples desvantagens – – – – – – riscos de contaminação e possível perda da linhagem perda de características morfológicas, fisiológicas ou patogenicidade seleção de células atípicas (variantes ou mutantes) supervisão especializada mão-de-obra espaço relativamente grande para a armazenamento Preservação em óleo mineral e em água princípio – diminuição da atividade metabólica fatores a serem considerado (Castellani) – – espessura do ágar número de blocos na água Preservação em óleo mineral Preservação em óleo vantagens - ↓ custo de equipamento - evita contaminação por ácaros desvantagens - necessidade de mais transferências até que a cultura revigore - requer espaço para amazenamento armazenamento em geladeira Preservação em água (Castellani) Geladeira Blocos de ágar de 4-6 mm3 10-15 mL água destilada esterilizada Preservação em água Preservação em água vantagens - boa taxa de viabilidade - evita contaminação por ácaros desvantagens - limitado a organismos que aderem ao ágar (Castellani) - dificuldade da retirada dos cubos na reativação (Castellani) - crescimento durante a estocagem - requer espaço p/ amazenamento - riscos de contaminação armazenamento em geladeira Secagem princípio – diminuição do metabolismo por desidratação e conservação em geladeira fatores a serem considerados – – – – tipo de célula idade da cultura concentração celular condições de estocagem Secagem em sílica e em solo Secagem em papel de filtro Secagem vantagens – – – – simples e de baixo custo não requer equipamento especial estabilidade elevada ácaros não sobrevivem desavantagens – – – métodos limitados a bactérias e fungos filamentosos esporulados risco de contaminação devido ao manuseio sucessivo papel: poucos dados sobre o sucesso do método Liofilização princípio – remoção da água por sublimação fatores a serem considerados – – – – – – tipo de células idade da cultura concentração celular agentes crioprotetor condições de estocagem método de reidratação Liofilização agentes crioprotetores – – reduzem danos durante o congelamento e descongelamento estabilidade ao microrganismo contra os efeitos adversos da estocagem leite desnatado (skim milk) 10% leite desnatado 10% + inositol 5% sacarose 7% + peptona 7% inositol 5% em soro de sangue de cavalo Liofilização Maçarico Liofilizador Maçarico Cultura pura 3 mL 0,2 mL Skim Milk na ampola Liofilização - reativação Liofilização vantagens – – – – – – vedação total da amostra longa viabilidade estabilidade elevada em muitas espécies produção em larga escala não requer armazenamento especial (somente ao abrigo da luz) fácil distribuição e transporte desvantagens – – – – muitas espécies não sobrevivem ao processo viabilidade ocasionalmente insatisfatória mão-de-obra especializada requer equipamentos sofisticado Congelamento em ultrafreezer princípio – – indução da dormência do microrganismo armazenamento a - 80˚C fatores a serem considerados – – – – – – tipo de microrganismo idade da cultura concentração celular agente crioprotetor (dimetilsufoxido 10%; glicerol 10% ou concentração maior) condições de estocagem método de descongelamento Congelamento 1 mL Fungos filamentosos não esporulados 10 mL 1 mL Fungos filamentosos esporulados 1 mL 7 mL Bactérias, arqueas e leveduras Congelamento em ultrafreezer Congelamento em nitrogênio líquido princípio – – indução da dormência do microrganismo armazenamento a - 196˚C fatores a serem considerados – – – – – – tipo de microrganismo idade da cultura concentração celular agente crioprotetor condições de estocagem método de descongelamento Congelamento em nitrogênio líquido Congelamento em nitrogênio líquido vantagens – – – condições estáveis por longos períodos vedação completa, evitando contaminação utilização para esporulados e não esporulados desvantagens – – – – viabilidade ocasionalmente insatisfatória requer equipamento sofisticado suprimento contínuo de N2 boa infra-estrutura – caso de acidentes de vazamento Controle de qualidade de preservação contagem de população viável antes e após preservação – – – pureza – determinar a taxa de mortalidade do microrganismo específico no protocolo utilizado aplicável a métodos de médio e longo-termo imprescindível para garantia de preservação de longo-termo logo após o processamento do lote viabilidade – – primeira pós: até um mês após o processamento segunda pós em diante: anualmente Controle de qualidade de preservação 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL Suspensão de células em crioprotetor (10-2) 9,9 mL água + 0,1% ágar (10-4) (10-6) (10-8) 10-2 10-4 10-8 10-6 no de células mL-1 inoculados na ampola = (no de colônias em 0,1 mL = 3 gotas) x 10 x (fator de diluição) UFC/mL
