Conceitos de cinética enzimática e modelos clássicos de inibição
enzimática
Índice
1
2
3
4
5
Conceitos básicos de cinética química. ........................................................................................................................... 1
Natureza química das enzimas e modelos de interação com os seus substratos. ........................................................ 3
O que é a cinética enzímica? ............................................................................................................................................ 4
Como fazer um estudo cinético de uma enzima? ........................................................................................................... 5
Que resultados podem ser obtidos no estudo cinético de uma enzima? ...................................................................... 5
5.1 Noção de atividade enzímica ou atividade catalítica de uma enzima. ............................................................................... 5
5.2 Noção de v0 ou velocidade inicial. .................................................................................................................................... 6
5.3 Influência da quantidade de enzima na velocidade de conversão v0. ................................................................................ 7
5.4 Influência da temperatura na atividade enzímica. ............................................................................................................. 8
5.5 Influência do pH................................................................................................................................................................ 8
5.6 Influência da concentração dos substratos na atividade enzímica e saturabilidade. .......................................................... 9
5.7 Influência da concentração do substrato em enzimas com “cinética de tipo michaeliano ou hiperbólico”..................... 10
5.8 Significado da constante de Michaelis-Menten............................................................................................................... 12
5.9 Influência da concentração de substrato em enzimas “com cinética de tipo cooperativo ou sigmoide”. ........................ 13
5.10 A atividade enzímica molar .......................................................................................................................................... 15
6
Modificadores da atividade enzímica: inibidores e ativadores................................................................................... 16
6.1 Inibidores competitivos ................................................................................................................................................... 16
6.1.a As estatinas competem eficazmente com o hidrometilglutaril-CoA (HMG-CoA) na sua ligação à redútase de
HMG-CoA e são medicamentos usados para fazer descer a concentração de colesterol plasmático ............................. 18
6.2 Inibidores não competitivos ............................................................................................................................................ 19
6.3 Inibição mista .................................................................................................................................................................. 21
6.4 Inibidores que reagem com a enzima de forma covalente e irreversível ......................................................................... 22
6.4.a O orlistato é um inativador das lípases digestivas .................................................................................................. 22
6.5 Efeitos alostéricos ........................................................................................................................................................... 23
6.6 Efeitos induzidos por modificação covalente de enzimas catalisada por outras enzimas ............................................... 24
7
Para que pode servir o estudo cinético de uma enzima? ............................................................................................. 25
8
Bibliografia ..................................................................................................................................................................... 26
8.1 Bibliografia geral ............................................................................................................................................................ 26
8.2 Referências específicas ................................................................................................................................................... 26
1
Conceitos básicos de cinética química.
Quando se diz que uma determinada reação tem tendência termodinâmica para ocorrer num determinado
sentido não se quer dizer com isso que ela ocorra de facto a uma velocidade apreciável num intervalo de tempo
determinado. A velocidade a que ocorre uma determinada reação depende de vários fatores como a natureza dos
reagentes e a sua concentração, a temperatura, e nalguns casos da presença de radiações e de catalisadores.
As reações químicas elementares de 1ª ordem obedecem à lei de velocidade expressa pela Equação 1:
Equação 1
= k[A]
Se numa reação A→B, a velocidade de reação é proporcional à concentração do reagente A e k é a
constante de proporcionalidade a reação diz-se de 1ª ordem em relação a A; porque relaciona a concentração de
um reagente com a velocidade da sua conversão em produtos diz-se que k é uma constante cinética.
Pode acontecer que uma determinada reação (A + B → P + ...) seja elementar e de 1ª ordem em relação a
cada um de dois reagentes A e B, sendo globalmente de 2ª ordem:
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= −k [A][B]
Equação 2
Os valores de k e k1 (constantes cinéticas) são independentes da concentração dos reagentes mas variam
com a natureza destes e com a temperatura, aumentando quando esta aumenta.
Atentemos no esquema que se apresenta a seguir:
k1
A+B
P+Q
k2
Fig. 1: Esquema de uma reação admitindo que é elementar de 2ª ordem quer no sentido direto quer no sentido
inverso.
Se a transformação de A + B em P + Q é uma reação química elementar o valor da velocidade de reação
que podemos observar experimentalmente na ausência de P e Q é igual a k1 [A] [B]. Se a reação inversa também é
uma reação química elementar então, na ausência de A e de B, a velocidade que se pode observar
experimentalmente nesta reação é igual a k2 [P] [Q]. Qualquer que seja a concentração de A, B, P e Q a
velocidade de formação de P (= velocidade de formação de Q = velocidade de consumo de A ou de consumo de
B) que podemos observar experimentalmente, sem recurso a compostos marcados (radioactivamente, por
exemplo) é dada pela Equação 3:
Equação 3
vaparente = k1 [A] [B] - k2 [P] [Q]
De notar que, a nível molecular, a velocidade a que ocorrem as reações elementares não é influenciada
pela presença de produtos e este facto pode ser comprovado experimentalmente usando compostos marcados
radioactivamente.
A Equação 3 permite-nos relacionar a Keq com as constantes k1 e k2. O sistema está em equilíbrio quando
as propriedades macroscópicas do sistema se mantêm constantes no tempo, ou seja, quando vaparente = 0. Donde:
=
Equação 4
[P]( ) [Q]( )
[A]( ) [B]( )
=
k1
k2
Deve notar-se que conhecer o valor da Keq não nos diz nada acerca do valor absoluto das constantes k1 e
k2 . Se, por exemplo, na reação em análise o valor de Keq for 1 a única informação que este valor indica é que k1 =
k2 . Assim, se não nos estivermos a referir à conversão líquida de reagentes em produtos, podemos dizer, sem
contradição, que uma reação se está a processar muito rapidamente (ou muito lentamente) e que se encontra no
estado de equilíbrio.
A maioria das reações químicas e todas as reações em que intervêm catalisadores são reações complexas e
podem tentar interpretar-se como uma sequência de reações elementares em que ocorre a formação de estados de
transição e compostos intermediários que não chegam a atingir no meio reativo uma concentração apreciável por
métodos correntes de análise.
Na presença de um catalisador a velocidade das reações aumenta. Do ponto de vista de alguém que está
interessado no mecanismo das reações químicas, o catalisador é um novo reagente que foi adicionado no meio
reativo e que tem a característica especial de ser regenerado no final do ciclo reativo em que intervém. A sua
concentração total não varia durante o processo reativo.
Admitamos que a reação de transformação de A em P+Q é, na ausência de catalisador, uma reação elementar de
primeira ordem e que v(sem catalisador) = k1 [A].
A
k1
P+Q
Fig. 2: Esquema em que se admite que é elementar de 1ª ordem relativamente ao reagente A
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Admitamos que, na presença de catalisador, o mecanismo reativo é diferente. Cada vez que uma molécula
de A se encontra com uma molécula de catalisador C elas reagem para gerar um complexo ativado A•C e que este
complexo se pode dissociar em C + P + Q. Nas reações elementares, as constantes de velocidade que lhes estão
associadas dependem da natureza dos reagentes e, portanto, as constantes de velocidade associadas ao processo de
formação de A•C e ao processo de dissociação deste complexo em P + Q + C podem ser muito maiores que o
valor de k1.
No entanto a presença do catalisador não altera a Keq da reação. A Equação 5 exprime a Keq (Keq1) para a
reação esquematizada na Fig. 2.
Equação 5
1=
[P]( ) [Q]( )
[ ]( )
Admitindo que o catalisador C é um reagente temos também de admitir que é um produto (ver Fig. 3).
Neste caso é a Equação 6 que exprime o valor da Keq (Keq2) para a reação que é catalisada.
A+C
P+Q+C
Fig. 3: Esquema em que se admite que a conversão de A em P + Q é catalisada pelo catalisador C.
Equação 6
2=
[P]( ) [Q]( ) [C]
[ ]( ) [C]
É, imediato reconhecer que Keq1 = Keq2 = Keq. Os catalisadores modificam a velocidade das reações mas
não modificam o valor da constante de equilíbrio nem o sentido líquido em que a reação, macroscopicamente, vai
ocorrer e que pode ser previsto pela relação Keq/QR. Se a constante de equilíbrio não for demasiado alta
impedindo-nos de observar a reação inversa (síntese de A a partir de P+Q) podemos constatar que esta reação
também é catalisada pelo mesmo catalisador C.
2
Natureza química das enzimas e modelos de interação com os seus substratos.
As enzimas são os catalisadores que existem nos seres vivos. A palavra “enzima” (do Grego: en, na +
zima, levedura) foi inventada em 1878 por Fredrich Wilhelm Kühne e traduz a ideia de que são substâncias que
existem dentro das células (as leveduras são seres vivos). A natureza proteica das enzimas só foi definitivamente
aceite nos anos 30 deste século, na sequência dos trabalhos de James Summer (que purificou e cristalizou a urease
do feijão) e de John Northrop e Moses Kunitz (que demonstraram correlação direta entre a atividade catalítica de
preparações purificadas de enzimas digestivas e o seu conteúdo proteico).
Curiosamente, estudos da década de 80 de Thomas Cech num protozoário (Tetrahymena thermophila) e
de Sidney Altman em E. coli demonstraram atividade catalítica em certas moléculas de RNA. Daqui surgiu o
termo “ribozimas”: catalisadores biológicos de natureza não proteica, mas sim ácidos ribonucleicos.
Tal como acontece com todos os catalisadores quando se diz que uma enzima E catalisa a transformação
A→P está-se implicitamente a dizer que também catalisa a transformação inversa; a reação vai progredir
macroscopicamente no sentido A→P ou no sentido P→A dependendo da relação Keq/QR.
Numa reação enzímica chamam-se aos reagentes substratos da enzima.
Relativamente aos catalisadores não enzímicos, as enzimas são em geral mais potentes, atuam em
condições “ pouco agressivas “ (pH próximo da neutralidade, temperatura ambiente, etc.), têm uma enorme
especificidade, quer em relação aos substratos, quer em relação aos produtos da reação que catalisam e as suas
atividades podem, frequentemente, ser reguladas por substâncias diferentes dos substratos e dos produtos.
Sendo a sua natureza proteica significa que sofrem desnaturação (a sua estrutura secundária, terciária ou
quaternária modifica-se dramaticamente ou deixa mesmo de existir) quando são misturadas com ácidos fortes ou
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quando são aquecidas. Nalguns casos, a desnaturação também pode ser provocada pela adição de solventes
orgânicos. Uma vez desnaturada, a atividade de uma enzima desaparece irreversivelmente.
Sendo as enzimas moléculas proteicas o seu tamanho é, normalmente, muito maior que o das moléculas
dos substratos. Este facto, assim como a enorme especificidade das enzimas relativamente aos substratos com que
podem interagir, levaram à introdução do conceito de “sítio ativo” (ou “sítio catalítico”), um local específico
modelado de tal forma que permite a interação específica com o substrato ou substratos e onde ocorre a reação
química. Mesmo quando o substrato é uma outra proteína e não se pode dizer que a enzima seja maior que o
substrato, o local da proteína alvo onde a transformação ocorre é limitado e vai depender da interação do centro
ativo da enzima com uma região específica da proteína alvo.
Fig. 4 Modelos de chave-fechadura e de encaixe induzido para a interação enzima-substrato. O primeiro modelo
(chave-fechadura) surgiu para explicar a alta especificidade das enzimas em relação aos substratos nomeadamente a
sua interação com apenas um dos enantiómero. O segundo modelo (encaixe induzido) surgiu da necessidade de
explicar certos casos de inibição competitiva (ver Capítulo 6.1). Em algumas enzimas estudos de difração de raios X
apoiam o segundo modelo (por exemplo, no caso da transcarbamílase do aspartato).
Em 1894, Emil Fisher descobriu que as enzimas da via glicolítica podem distinguir enantiómeros (formas
D de L) e esse facto levou-o a propor uma analogia com “a chave e a fechadura” como modelo de interação entre
as enzimas e os seus substratos. Este modelo admite a existência de locais preformados na enzima onde os
substratos se podem ligar e reagir. Koshland, em 1959, propôs um modelo diferente a que podemos chamar de
“encaixe induzido”; quando os substratos interagem com a enzima provocam nestas modificações
conformacionais que ocorrem não só no “sítio catalítico” mas também se podem repercutir em toda a estrutura da
proteína (ver Fig. 4).
3
O que é a cinética enzímica?
A cinética enzímica é um ramo da Bioquímica que estuda as enzimas em ação; a sua atividade catalítica.
No entanto, pode também ser encarada como um ramo da cinética química que estuda as propriedades catalíticas
das enzimas.
O estudo cinético de uma enzima visa primariamente caracterizar, ou seja descrever, a atividade dessa
enzima. In vitro estuda-se a atividade da enzima procurando saber que tipo de reações pode catalisar, com que
substratos pode interatuar e como se modifica essa atividade (qualitativa e/ou quantitativamente) quando se fazem
variar as condições em que é ensaiada. O valor de pH, a temperatura, o tempo de incubação, as concentrações dos
substratos, de cofactores ou de outras substâncias (inibidores ou ativadores) são exemplos de condições de ensaio
que podem ser modificadas com o objetivo de observar como varia a atividade da enzima, ou seja, como varia a
velocidade da conversão ou conversões que esta catalisa.
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4
Como fazer um estudo cinético de uma enzima?
O estudo cinético de uma enzima é feito in vitro. Para esses estudos podem ser usados, como fontes de
enzima, preparações que a contenham em estado mais ou menos purificado; quanto mais purificada estiver a
preparação enzímica mais fácil será o seu estudo cinético. De acordo com os objetivos definidos não devem estar
presentes na preparação, outras enzimas que interfiram no estudo que estamos a fazer.
Durante o complexo processo de purificação podem ocorrer alterações nas características cinéticas da
enzima de tal forma que as características observadas podem não ser as mesmas da enzima no seu estado nativo;
além disso, as condições que usamos in vitro para estudar a enzima são diferentes daquelas que a enzima tem no
seu meio natural, a célula. Se o objetivo dos estudos visa compreender o papel da enzima na célula os resultados
experimentais devem ser interpretados com especial prudência. Estes estudos podem servir de guia para planear e
interpretar experiências realizadas em condições menos artificiais.
Quando uma atividade enzímica é estudada escolhe-se um meio de ensaio apropriado para o seu estudo; o
objetivo pode ser estudar como varia a atividade catalítica da enzima quando modificamos as características desse
meio, mas numa fase precoce do estudo é necessário buscar condições que permitam, no mínimo, reconhecer a
existência dessa atividade.
Se a enzima catalisa a transformação reversível A + B
P + Q e a constante de equilíbrio é muito
superior à unidade, as dificuldades do estudo podem ser minimizadas se escolhermos estudar a transformação de
A + B em P + Q e não o inverso. Assim, se for esse o caso, adicionaríamos no meio de ensaio os compostos A e
B. Um tampão de pH com um pH determinado, assim como outras substâncias como, por exemplo, cofactores
essenciais à atividade da enzima estão, em geral, também presentes no meio de ensaio.
O meio de ensaio está a uma temperatura determinada e a reação pode ser iniciada adicionando ao meio a
preparação que contém a enzima. Para determinar a velocidade de conversão de A+B em P+Q é indispensável
termos uma maneira de seguir (de modo contínuo ou descontínuo) como cresce a concentração de P ou de Q (ou
desce a concentração de A ou de B) em função do tempo.
5
Que resultados podem ser obtidos no estudo cinético de uma enzima?
5.1 Noção de atividade enzímica ou atividade catalítica de uma enzima.
A atividade enzímica é uma propriedade medida pelo aumento de velocidade de conversão de uma reação
química que uma enzima produz num sistema de ensaio especificado.
Admitamos que a reação A + B → P + Q é catalisada por uma determinada enzima. Num meio de ensaio
onde foram introduzidos os compostos A e B, a velocidade de conversão dos reagentes em produtos (v1) poderá
não ser nula na ausência de enzima. Se a reação é catalisada pela enzima a velocidade de conversão na presença
desta pode ser v2. A quantidade (v2 - v1) é uma medida da atividade catalítica presente na preparação enzímica
adicionada ao meio de ensaio. É frequente que a velocidade de conversão na ausência de enzima (o valor de v1)
seja tão pequeno comparado com v2 que, sem grande erro, se possa considerar v2 como correspondendo ao valor
da atividade catalítica da enzima.
É importante referir que e a atividade enzímica (a velocidade de conversão na presença da enzima) é uma
quantidade extensiva e que, portanto, as suas dimensões são quantidade de substância/tempo (n/t). Se a adição de
1 μL de uma dada preparação (soro sanguíneo, por exemplo) que contém uma enzima a um meio de ensaio com
999 μL fizer com que a velocidade de conversão seja de 1 μmol de produto formado/min a atividade da enzima
presente na preparação (1 μL de soro, no exemplo) usada era de 1 μmol/min. Obviamente que, no caso em análise,
a velocidade da reação no tubo onde decorreu o ensaio também se pode expressar como a velocidade da variação
de concentração do produto; seria 1 μmol mL-1 min-1. Embora as expressões “velocidade de reação” (variação de
uma concentração por unidade de tempo) e “velocidade de conversão” (variação da quantidade de substância por
unidade de tempo) sejam, frequentemente, usadas como sinónimos existe uma diferença entre elas e só a segunda,
corresponde, estritamente, à definição de atividade enzímica. Dado que a quantidade de substância que se forma
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num dado volume de meio de ensaio pode ser calculada a partir desse volume e da variação de concentração, a
conversão de velocidades de reação em velocidades de conversão é uma operação aritmética trivial.
A atividade enzímica de um dado volume de preparação enzímica é expresso como uma velocidade de
conversão e pode ser expresso em UI (Unidade Internacional). 1 UI é a quantidade de enzima que, num meio de
ensaio adequado, leva a que a reação ocorra à velocidade de 1 μmol de produto formado por minuto (ou 1 μmol
de substrato consumido por minuto). No exemplo acima a quantidade de enzima adicionada ao meio de ensaio foi
de 1 μmol min-1 ou 1 UI.
Estritamente, a quantidade de enzima deveria referir-se à massa ou ao número de moles de enzima mas,
por razões que resultam do facto de, só excecionalmente, se conhecerem estes valores e porque a atividade é
proporcional à quantidade de enzima (ver Capítulo 5.3), é muito mais usual exprimir a quantidade de enzima
usando unidades de atividade. Se a velocidade de conversão induzida pela adição de 1 mL de uma preparação
enzímica a um meio de ensaio adequado, é de 1μmol/min, é frequente escrever-se que a quantidade de enzima
presente nesse mL de preparação era de 1 UI; ou seja, que a atividade da enzima era 1 μmol/min.
5.2 Noção de v0 ou velocidade inicial.
Quando se faz uma experiência visando desenhar um gráfico quantidade de P formado versus tempo e se
espera tempo suficiente, obtemos quase sistematicamente um gráfico com um aspeto semelhante ao da Fig. 5.
Num dado momento t a atividade catalítica é dada pelo declive da curva nesse tempo t. À medida que o tempo de
ensaio aumenta diminui a velocidade. Isto pode ser causado pela diminuição de concentração de reagentes (que se
vão consumindo), pelo aumento de concentração de produtos (que podem tornar significativa a velocidade da
reação inversa ou, ligando-se à enzima, provocar inibição) ou/e simplesmente porque a enzima é instável nas
condições de ensaio e sofre desnaturação. A esmagadora maioria dos estudos de cinética baseiam-se na estimativa
da velocidade para tempo zero (velocidade inicial ou v0); nesse momento as características do meio de ensaio,
nomeadamente a concentração dos substratos, são aquelas que foram escolhidas para o realizar.
Quando dizemos que medimos a atividade catalítica de uma enzima e que essa atividade era, por
exemplo, de 1 μmol/min estamos a referir-nos ao v0. Se escolhêssemos arbitrariamente um outro tempo de ensaio,
o valor da atividade que apontássemos, já não refletia as condições que foram escolhidas para o determinar. No
entanto, na prática, também poderá ser sensato escolher um tempo de reação em que a velocidade não tenha
diminuído demasiado (por exemplo, menos de 10% da velocidade inicial) e considerar que a razão “quantidade de
produto formado/tempo de ensaio” é uma boa estimativa do v0 (ver Fig. 5).
Fig. 5 Quantidade de produto formado versus tempo. A atividade enzímica é uma quantidade extensiva (n/t) e em
cada momento t corresponde ao declive de uma curva como a desta figura. A velocidade de conversão A → P diminui
com o tempo de ensaio. v0 é o valor do declive no tempo zero e o valor da atividade catalítica para as condições de
ensaio nesse tempo zero. No caso em análise o resultado da operação de dividir a quantidade (µmol) de produto
formado ao fim de 5 minutos por 5 min poderia ser uma boa estimativa de v0: a atividade da enzima na preparação
enzímica que foi adicionada neste meio de ensaio seria 1UI (5 μmol/ 5 min = 1 μmol/min).
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5.3 Influência da quantidade de enzima na velocidade de conversão v0.
Mantendo invariantes todas as outras condições de ensaio, a velocidade de conversão v0 é diretamente
proporcional à quantidade de enzima adicionada no meio de ensaio. De facto, isto só se verifica se a concentração
molar de sítios catalíticos da enzima for muito mais baixa que a concentração molar dos substratos mas, pelo
menos nas condições habitualmente usadas nos ensaios in vitro, esta condição é amplamente satisfeita.
Assim, é de prever que o gráfico v0 versus quantidade de enzima seja uma linha reta de declive positivo
que passa pela origem (ver Fig. 6).
Como já referido, este facto permite entender que se use a atividade enzímica como uma medida da
quantidade de enzima e também permite definir quantidades derivadas da atividade enzímica. Uma das unidades
derivadas mais frequentemente usada designa-se por atividade específica e corresponde à atividade por massa de
proteína.
Se, por exemplo, adicionarmos a um meio de ensaio adequado, 1 μL de um homogeneizado hepático e a
velocidade de conversão for 1 μmol min-1 podemos dizer que esta era a atividade da enzima em questão no μL de
homogeneizado adicionado. Se, simultaneamente, soubermos que a quantidade de proteína nesse 1 μL de
homogeneizado era de 10 μg podemos concluir que a atividade específica da enzima nesse homogeneizado
hepático era de 0,1 μmol min-1 μg de proteína. Este valor poderia servir para comparar o resultado obtido com um
outro em que se usou a mesma técnica, mas um outro fígado como fonte de enzima. É de notar que a atividade
medida nos ensaios em questão dependem de múltiplas escolhas (como a temperatura, o pH, a concentração de
substrato, etc.) e que só repetindo essas condições é que se podem legitimante comparar os resultados obtidos com
os dois fígados distintos.
Se, o que não é muito frequente, conhecermos o número de moles de enzima adicionada no meio de
ensaio podemos calcular a atividade exprimindo-a em moles de substrato convertido por segundo e por mole de
enzima. Neste caso, a atividade seria expressa em s-1. A isto se chama atividade enzímica molar e o conceito será
desenvolvido no Capítulo 5.10.
Fig. 6 Atividade enzímica versus quantidade de enzima. Os três gráficos desta figura representam o resultado de uma
mesma experiência. Em cada um de 4 tubos de ensaio contendo um meio especificado foram adicionadas 4 diluições
de uma mesma preparação enzímica; 1E, 2E, 3E e 4E representam as distintas quantidades de enzima adicionadas.
No gráfico da esquerda estão representados os traçados obtidos (quantidade de produto formado versus tempo) para
cada um dos tubos e as retas que estimam v0 (a tracejado). O gráfico acima à direita representa v0 versus quantidade
de enzima. Os pontos do gráfico abaixo à direita representam a atividade específica obtida em cada um dos quatro
ensaios (UI/mg proteína). A Equação 11 (ver à frente) mostra claramente que, quando as de condições de ensaio são
fixadas e a única que varia é a concentração de enzima, v0 é proporcional a [Et], a concentração total de enzima no
meio de ensaio.
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5.4 Influência da temperatura na atividade enzímica.
Em todas as reações químicas, incluindo as catalisadas por enzimas, a velocidade das reações aumenta
com a temperatura, mas a velocidade com que uma proteína sofre desnaturação (e uma enzima se inativa) também
aumenta com a temperatura. O número de enzimas capazes de resistir a temperaturas da ordem dos 100°C durante
alguns segundos é extremamente restrito. A temperaturas elevadas, a velocidade de desnaturação da enzima é
muito alta podendo acontecer que a atividade enzímica se anule pouco tempo após o início do ensaio (ver Fig. 7).
Por isso é prudente escolher temperaturas de ensaio que minimizem a velocidade de desnaturação da enzima.
Fig. 7: Quantidade de produto formado versus tempo a várias temperaturas. O uso de temperaturas elevadas pode
dificultar ou mesmo impedir uma boa estimativa de v0; assim é habitual usar temperaturas de ensaio em que a enzima
é estável. Esta figura mostra como pode variar a quantidade de produto ao longo do tempo para ensaios de uma
mesma enzima a várias temperaturas. Se usássemos um tempo de incubação suficientemente curto poderíamos
concluir que a enzima era mais ativa a 60°C; nesse tempo muito curto a velocidade da reação enzímica foi alta e ainda
não houve tempo suficiente para que a desnaturação se processasse em extensão apreciável. Temperaturas mais
baixas facilitam a estimativa de v0 pois a atividade varia menos ao longo do tempo de ensaio.
5.5 Influência do pH.
O pH a que uma reação enzímica é estudada é normalmente imposto pelo experimentador adicionando no
meio de ensaio uma quantidade adequada de um determinado tampão de pH. Um determinado tampão só funciona
adequadamente numa faixa limitada de valores de pH e se o objetivo é estudar uma reação enzímica numa ampla
gama de valores de pH temos de escolher tampões diferentes. Assim, um determinado resultado experimental
atividade versus pH pode refletir apenas a influência do tampão na atividade catalítica. Excluída esta
possibilidade, os gráficos experimentais atividade versus pH podem traduzir que a ligação de protões em resíduos
aminoacídicos críticos para a atividade da enzima (ou nos substratos) tem consequências no valor da atividade que
é medido. Para determinadas condições de ensaio existe um pH ótimo, o pH a que se obtém maior atividade (ver
Fig. 8).
Se pretendermos estudar uma isoenzima A e, na mesma preparação enzimática, estiver presente uma
isoenzima B poderá ser difícil distinguir qual das duas isoenzimas está a catalisar a reação. No entanto se os pHs
ótimos das duas isoenzimas forem diferentes pode-se favorecer uma delas em detrimento da outra escolhendo um
pH que otimize a atividade da isoenzima que se quer estudar e prejudique a da outra (ver Fig. 8).
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Fig. 8: Atividade (unidades arbitrárias) de duas isoenzimas em função do pH do meio de ensaio. Se a isoenzima A tem
como pH ótimo, 7 e a isoenzima B, 10 pode-se favorecer a atividade da isoenzima B escolhendo pH 10 para fazer
ensaio. Nestas condições o contributo da enzima A para a atividade global seria muito baixa e seria sensato pensar que
se estava a estudar a atividade da isoenzima B.
5.6 Influência da concentração dos substratos na atividade enzímica e saturabilidade.
O efeito da concentração dos substratos na velocidade das reações enzímicas foi sempre um tema com
especial interesse quando se estuda a atividade das enzimas.
Quando se estuda a influência da concentração de um substrato na atividade duma enzima começa por
fixar-se a concentração dos outros substratos (se os houver) e das demais condições de ensaio e estuda-se como
varia a atividade versus concentração de um dos substratos.
Em 1902 Adrian Brown estudando a reação de hidrólise da sacarose (a sua lise em glicose e frutose) e
usando como catalisador sacarase observou que para concentrações altas do substrato sacarose, a ordem da reação
era zero em relação à sacarose; ou seja, nessas concentrações a velocidade da reação não variava quando variava a
concentração de substrato. Brown propôs um mecanismo que explicaria o fenómeno:
Equação 7
E + sacarose
E•sacarose ⎯
⎯→ E + glicose + frutose
A enzima formaria com o substrato um complexo intermediário (mais tarde chamado complexo de
Michaelis); este complexo E•sacarose daria origem aos produtos regenerando-se a enzima livre E e a velocidade
de reação seria proporcional à concentração deste complexo. Se a concentração de sacarose for suficientemente
elevada pode acontecer que, praticamente, todas as moléculas de enzima presentes no meio estejam ligadas à
sacarose e que não seja possível, pela adição de mais sacarose, aumentar a concentração do complexo E•sacarose.
Estas condições dizem-se “de saturação”; a enzima está saturada de substrato e a velocidade de reação não
aumenta quando se aumenta a concentração deste.
Nalgumas enzimas o gráfico atividade versus concentração do substrato tem um aspeto semelhante à
enzima h, enquanto noutras o aspeto deste gráfico se assemelha ao da enzima s (ver Fig. 9). No primeiro caso (h)
o gráfico em questão é uma hipérbole retangular que passa pela origem enquanto no segundo é um sigmoide (s).
De qualquer forma ambos os tipos de gráfico espelham uma característica dos resultados que se obtêm quando se
estudam enzimas: aumentado a concentração de substrato atingir-se-ão concentrações que mostram que as
enzimas “são saturáveis”. Como será analisado no Capítulo 5.7, ao v0 medido em condições de saturação chamase Vmax.
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Fig. 9: Os gráficos atividade versus concentração podem ter aspetos diferentes mas a saturabilidade é uma
característica das enzimas.
5.7 Influência da concentração do substrato em enzimas com “cinética de tipo michaeliano
ou hiperbólico”.
Para muitas enzimas o gráfico v0 versus concentração de um dos substratos, mantendo constantes todas as
outras condições do meio, é um ramo de uma hipérbole retangular que cruza os eixos horizontal e vertical no
ponto 0,0 (ver Fig. 9). Um tratamento matemático possível que explica este tipo de gráficos em reações enzímicas
com apenas um substrato (ou mais de um, mas em que a concentração dos outros é fixa) foi proposto por Leonor
Michaelis e Maude Menten em 1913.
Estes autores admitiram vários pressupostos:
1) Um mecanismo representado pelo esquema seguinte:
E+S
k1
k2
E•S
k3
E+P+…
Fig. 10: Esquema do mecanismo proposto por Michaelis e Menten.
A velocidade de formação do complexo E•S seria de 1ª ordem em relação a S (o substrato), e em relação
a E (a enzima livre; não ligada a S); ou seja, a reação seria globalmente de 2ª ordem e a constante cinética
associada ao processo seria k1. Quer a velocidade de formação dos produtos, quer a de dissociação do complexo
E•S em S + E seriam proporcionais à concentração deste complexo: ambos os processos seriam de 1ª ordem em
relação a E•S e as constantes cinéticas seriam, respetivamente, k3 e k2.
2) A velocidade de formação dos produtos a partir do complexo E•S era muito lenta relativamente às
velocidades de dissociação e formação do complexo em E + S (k2>>k3 e k1[E][S]>>k3 [E•S]) donde se poderia
admitir que a reação de formação e dissociação do complexo E•S se encontrava num estado muito próximo do
equilíbrio químico.
3) O equilíbrio respeitante ao processo de formação do complexo E•S se atingia tão rapidamente que, na
escala de tempo da conversão macroscópica de S em P, se poderia considerar instantâneo e se mantinha durante
todo o tempo em que ocorria a transformação S → P+... Além disso, a concentração de sítios catalíticos na
enzima, [Et], era muito baixa relativamente à concentração de [S] de maneira que, para que esse estado de
equilíbrio fosse atingido, muito poucas moléculas de S tinham que reagir com E. Ou seja, enquanto era necessário
considerar que, durante a reação, parte das moléculas da enzima estavam na forma do complexo E•S e outras na
forma livre (E), no caso de S a concentração total não era significativamente afetada pela ligação à enzima: [S] era
a concentração de substrato no meio de ensaio e o valor que se poderia subtrair pelo facto de algumas moléculas
estarem ligadas no complexo E•S era irrelevante.
Para a reação de dissociação do complexo E•S definiram a constante de equilíbrio Ks (s de substrato) que
tem dimensões de concentração.
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Equação 8
Ks =
[S][E]
[E∙S]
=
k2
k
Com base nestes pressupostos definiram v0 como a velocidade da reação (expressa, neste caso, como a
velocidade de variação da concentração do substrato ou dos produtos); essa velocidade será expressa pela
Equação 9:
Equação 9
v0 = k3 [E•S]
k3 é a constante de velocidade para a reação elementar de 1ª ordem E•S → E + P +...
A concentração total de enzima ([Et]) é igual à soma das concentrações de enzima livre ([E]) e da enzima
complexada ([E•S]):
Equação 10
[Et] = [E] + [E•S]
As Equações 8, 9 e 10 constituem um sistema que pode ser desenvolvido de forma a obter v0 em função
de [Et], Ks e [S]:
Equação 11
=
k [Et][S]
s [S]
Um gráfico v0 versus [S] é um ramo de uma hipérbole retangular com um aspeto que se adequa à
descrição da variação da velocidade das reações catalisadas pela maioria das enzimas; ver Fig. 11.
Fig. 11: Variação da atividade de uma enzima com cinética de tipo hiperbólica com a concentração de substrato.
Quando [S]>>Ks uma das parcelas do denominador da Equação 11 é irrelevante comparativamente à outra
e a Equação em análise simplifica para v0=k3 [Et]. Nestas circunstâncias praticamente toda as moléculas de
enzima estão complexadas com substrato, [Et]≈[E•S] e, mantendo todas as outras condições do ensaio, não seria
possível aumentar a velocidade aumentando a concentração de substrato. É imediato reconhecer que estas são as
condições que definimos como “de saturação” no Capítulo 5.6. Ou seja, o valor de v0 medido nestas condições
designa-se por velocidade máxima, a sigla correspondente é Vmax, sendo Vmax = k3 [Et] (ver Fig. 11). É de notar
que o valor de Vmax obtido em determinadas condições de temperatura e pH pode ser diferente daquele que é
obtido noutras condições de temperatura e pH. Vmax apenas significa v0 para concentrações saturantes de substrato,
nas condições de ensaio que foram usadas.
Assim podemos escrever a equação de Michaelis-Menten como se segue:
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Equação 12
=
[S]
Ks [S]
Quer nesta equação, quer na Equação 11, a razão
[S]
Ks [S]
representa a percentagem de saturação da enzima.
Quando [S]>>Ks o seu valor é próximo de 1 e, como já referido, a enzima está saturada.
[S]
Quando [S]<<Ks, o valor da razão
é pequeno e a Equação 12 simplifica para
[S]
Ks
v0= Vmax [S]/Ks. Para valores de concentração de substrato muito mais baixas que o valor de Ks, praticamente toda
a enzima está na forma não complexada ([Et]≈[E]) e a velocidade é (quase) diretamente proporcional à
concentração de substrato.
[S]
Quando [S]=Ks, o valor da razão
é ½ e a enzima está hemisaturada, ou seja, [E]=[E•S] e a enzima
[S]
Ks
está igualmente distribuída entre as formas complexada e não complexada. Nestas condições v0 = Vmax/2. Ver Fig.
12.
Fig. 12: Distribuição das formas enzímicas complexada e não complexada com o substrato para três concentrações de
substrato. Para valores de concentração de substrato muito superiores a Ks (ou a Km) a soma no denominador da
Equação 12 pode simplificar para [S]; a enzima está saturada, v0≈Vmax e a hipérbole, para estas concentrações de
substrato, “tende” para uma reta de declive nulo. Para valores de concentração de substrato muito inferiores a Ks a
soma no denominador da Equação 12 pode simplificar para Ks; v0 é proporcional a [S] (e a constante de
proporcionalidade = Vmax/Ks) e a hipérbole, para estas concentrações de substrato, “tende” para uma reta de declive =
Vmax/Ks. Quando a concentração de substrato é igual a Ks a enzima está hemisaturada e na Equação 12 o denominador
pode simplificar para 2 × [S]; v0 = Vmax/2. Ks é a concentração de substrato para a qual v0 é igual a metade de Vmax. Na
Equação 13 Ks será substituído por Km e todas estas afirmações continuam a fazer sentido.
5.8 Significado da constante de Michaelis-Menten
Um dos pressupostos de Michaelis e de Menten, concretamente a imposição de k3<<k2 e a consequente
necessidade de equilíbrio químico na formação e dissociação de E•S, foi questionados por Briggs e Haldane em
1925. Estes autores admitiram a possibilidade de não haver equilíbrio químico nesse processo, mas que, na escala
de tempo considerada, a concentração do complexo E•S se mantinha constante (estacionária) durante o processo
catalítico; ou seja que a soma das velocidades de desagregação do complexo E•S (k2 [E•S] + k3 [E•S]) iguala a
velocidade da sua formação (k1 [S] [E]). Ver Fig. 10.
Com base neste pressuposto, o desenvolvimento matemático leva a uma equação semelhante à proposta
por Michaelis e Menten (ver Equação 13), mas em que a constante de equilíbrio Ks é substituída por uma outra
Km, sendo que o valor deste parâmetro é o determinado pela Equação 14.
Equação 13
Equação 14
=
=
[S]
[S]
m
+
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De forma mais pragmática que Ks (que é uma constante de equilíbrio), o valor de Km, a constante de
Michaelis-Menten, pode ser definida como o valor da concentração de substrato quando a atividade da enzima é
metade de Vmax (ver Fig. 13).
Fig. 13 Fig.8: Atividade versus concentração de substrato em enzimas com cinética de tipo hiperbólico. O Vmax é o
limite para que tende v0 quando a concentração do substrato S tende para infinito. O Km é a concentração de
substrato para o qual o valor de v0 é metade do valor de Vmax. A Equação 13 descreve uma hipérbole retangular
passando pela origem, com uma assímptota horizontal (y= Vmax) e outra vertical (x=- Km).
Admitindo, como fizeram Michaelis e Menten, que k3<<k2 a constante de Michaelis-Menten será a
constante de dissociação do complexo E•S em S + E (enzima livre) e coincide com Ks. Se aceitarmos tal como
Briggs e Haldane o valor do Km como definido pela Equação 14 o seu valor será tanto maior quanto maiores
forem os valores das constantes cinéticas associadas à dissociação do complexo E•S (em E+S no caso de k1; em
E+P no caso de k3) e tanto menor quanto maior for o valor da constante cinética associada à formação do
complexo E•S (k1). Quer a simplificação de Michaelis e Menten seja aceitável, quer não seja, o valor do Km é uma
medida da afinidade do substrato em relação à enzima. O valor deste parâmetro tem as mesmas unidades que a
concentração de substrato e será tanto maior quando menor for a afinidade da enzima para o seu substrato. Na
Equação 13 o valor do Km está no denominador o que significa que, quanto menor for o seu valor, maior será a
atividade da enzima.
Para determinadas condições de ensaio os valores de k1, k2 e k3 são constantes e, portanto, também é
constante o valor de Km; este valor não varia com a quantidade de enzima utilizada no ensaio e é, portanto, uma
característica da atividade dessa enzima.
5.9 Influência da concentração de substrato em enzimas “com cinética de tipo cooperativo
ou sigmoide”.
Quando se estuda a influência da concentração de alguns substratos na atividade de algumas enzimas
podem obter-se gráficos v0 versus concentração de substrato que se assemelham mais a um sigmoide que a uma
hipérbole (ver Fig. 9). Este fenómeno ocorre, por exemplo, nos casos da cínase da glicose, da cínase-1 da frutose6-fosfato, da cínase do piruvato, da desidrogénase do glutamato, da transférase de amidofosforibosilo e da
transcarbamílase do aspartato.
Para baixas concentrações de substrato a atividade cresce de forma exponencial com a concentração
deste. Para altas concentrações de substrato manifesta-se o fenómeno da saturação: o facto de existir uma
quantidade limitada de enzima no meio de ensaio implica que, quando a enzima está próxima da saturação, as
variações da concentração de substrato provocam modificações mínimas na atividade.
As cinéticas de tipo sigmoide também se chamam de tipo cooperativo ou de cooperatividade positiva.
A palavra cooperatividade surgiu na sequência das teorias que foram formuladas em meados dos anos 60 do
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século passado para explicar o traçado sigmoide nos gráficos que relacionam a quantidade de oxihemoglobina
(hemoglobina•O2) com a pressão parcial de oxigénio (pO2); a chamada curva de saturação da hemoglobina.
Os modelos formulados tentam explicar porque é que, para baixas concentrações de substrato (ou de O2
no caso da hemoglobina), um aumento discreto nessas concentrações provoca aumentos desproporcionadamente
maiores na forma ligada da enzima (ou da hemoglobina) e partem da constatação de que, na maioria dos casos, as
enzimas com esta característica são, tal como a hemoglobina, proteínas oligoméricas (com estrutura quaternária).
Talvez que o modelo mais conhecido seja o que foi proposto por Koshland em 1966 desenvolvendo, para o caso
de proteínas (ou enzimas) com mais que um local de ligação para o ligando (ou o substrato), um modelo por si
formulado em 1959 (o modelo de encaixe induzido; ver Capítulo 2). Na sua formulação mais simples a proposta
de Koshland admite que a ligação de uma molécula de substrato num dos monómeros da enzima oligomérica
induz uma modificação conformacional nesse monómero que, por sua vez, influencia a conformação dos outros
monómeros de um mesmo oligómero de tal forma que estes aumentam a sua afinidade para o substrato. A ligação
de uma molécula de ligando (o oxigénio ou um substrato) a um dos monómeros da proteína em análise influência
positivamente a ligação de uma segunda molécula de ligando aos outros monómeros e algo de semelhante se
poderia dizer da ligação desta segunda molécula de ligando. Ou seja, a ligação de moléculas de ligando aos
monómeros de uma enzima oligomérica “coopera” na ligação de mais moléculas de ligando nos locais de ligação
situados nos outros monómeros do oligómero.
O modelo de Koshland permite escrever equações muito complexas que podem descrever adequadamente
as curvas sigmoides nos gráficos atividade versus concentração de substrato de todas as enzimas oligoméricas
com mais de um local de ligação para o substrato. No entanto, deixam sem explicação alguns casos de enzimas
monoméricas que apresentam cinéticas de tipo sigmoide, como por exemplo a glicocínase. Foram propostas
teorias que explicam estas situações; em muitas delas se admite a existência de mais de uma forma
conformacional para a enzima.
É de notar que nem todas as enzimas oligoméricas têm cinéticas de tipo cooperativo; por exemplo os
dados experimentais obtidos com a desidrogénase láctica (uma enzima tetramérica) ajustam-se a uma cinética de
tipo michaeliano.
As equações resultantes do tratamento matemático do modelo de Koshland (e de um outro formulado por
Monot, Wyman e Changeux) são demasiado complexas para serem usadas na prática da Bioquímica. Uma forma
mais simples e muito mais comum é usar (para a descrição paramétrica das sigmoides), de forma pragmática, uma
equação proposta por Hill em 1913 para descrever a curva de saturação da hemoglobina.
Adaptando essa equação (equação de Hill) para o caso das enzimas temos a Equação 15.
Equação 15
=
[S]
(
)
[S]
Nesta equação [S] é a concentração de substrato, S50 é a concentração de substrato para a qual a enzima
está hemisaturada e em que a velocidade é metade de Vmax. (Nas cinéticas de tipo sigmoide a sigla S50 é mais
adequada que Km.) h é o coeficiente de Hill e é uma medida do grau de cooperatividade (ou sigmoidicidade):
quando h=1 a Equação 15 simplifica e é igual à equação de Michaelis-Menten (ausência de cooperatividade; ver
Equação 13), quando h>1 dizemos que a cooperatividade é positiva e o gráfico v0 versus [S] é um sigmoide (ver
Fig. 14).
Por razões que serão discutidas à frente é frequente chamar às enzimas que exibem uma cinética de tipo
cooperativo enzimas alostéricas. No entanto estas duas expressões não são sinónimas: existem muitas enzimas
sensíveis a efetores alostéricos e que podem por isso chamar-se também de alostéricas que não apresentam
cinéticas de tipo cooperativo.
Página 14 de 26
10
Vmax
h=4
h=2
h=1
Vo
Vmax/2
5
0
0
5
10
S50
15
[Substrato]
Fig. 14 Fig.9: Gráficos v0 versus [S] usando a Equação 15 para diferentes valores de h; S50=5 e Vmax = 10 para todos os
casos. S50 é a concentração de substrato para v0= Vmax/2.
5.10 A atividade enzímica molar
Já foi referido no Capítulo 5.3 que, em algumas situações, a atividade de uma enzima se pode exprimir
em unidades de tempo-1: a atividade enzímica molar.
Quando se trabalha com enzimas purificadas, se se sabe a massa de proteína presente na preparação
enzímica e a massa molar da enzima, é trivial calcular os moles de enzima presentes na preparação.
A constante cinética que relaciona a velocidade de formação de produtos a partir do complexo
intermediário E•S foi, até aqui designada por k3 (ver Equação 9, Equação 11 e Fig. 10). No entanto, também é
frequente usar a sigla kcat (e a expressão constante catalítica) para a designar. Tendo isto em conta e o que se
escreveu nos Capítulos 5.7 e 5.8 é imediato concluir que a Equação de Michaelis-Menten pode ser escrita como se
segue (ver Equação 16).
Equação 16
=
cat [Et] K
[S]
[S]
m
Nesta equação v0 representa uma velocidade de reação (variação de concentração do substrato ou do
produto por umidade de tempo) mas, se multiplicarmos ambos os termos pelo volume de ensaio, obtemos a
atividade enzímica (que pode expressa pelo mesmo símbolo v0) em função da quantidade de enzima e de uma
[S]
que representa a percentagem de saturação (ver Equação 17). (É de notar que uma equação
razão
[S]
Km
semelhante pode ser escrita para o caso das enzimas com cinéticas de tipo sigmoide; neste caso a razão que
representa a percentagem de saturação seria
[S]
(
)
[S]
e, na maioria dos casos, Et representa o número de moles
de sítios catalíticos no meio de ensaio.)
Equação 17
= k cat Et
[S]
Km [S]
Se exprimirmos Et em molaridade, o proa expressão Et
[S]
Km [S]
representa o número de moles de enzima
que está a converter substrato em produto, ou seja, o número de moles do complexo E•S presente no meio de
ensaio. Na Equação 17, kcat é o inverso do tempo necessário para que uma molécula de enzima ligada ao substrato
complete um ciclo catalítico. Se o valor de kcat for, por exemplo, 1 s-1 significa que o tempo que uma molécula de
enzima ligada ao substrato demora a completar um ciclo catalítico é 1 segundo. Este valor também se designa por
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turnover number e é uma forma adequada de exprimir a atividade catalítica de uma enzima quando se conhecem
os dados pertinentes para a sua dedução. Se estivermos a fazer o ensaio em condições de saturação, o kcat é o valor
que resulta da divisão da velocidade de conversão (em mol s-1, por exemplo) pelo número de moles de enzima no
meio de ensaio (expresso em mol).
6
Modificadores da atividade enzímica: inibidores e ativadores.
Quando comparamos um par de ensaios enzímicos feitos nas mesmas condições (inclusive a concentração
de substrato), exceto a presença e a ausência de uma substância M, pode acontecer que as atividades sejam
significativamente diferentes. Nestes casos pode ser útil usar o conceito de grau de modificação (inibição ou
ativação) induzido por M (inibidor ou ativador). O grau de inibição pode ser definido como a variação de
atividade provocada pelo inibidor relativamente ao ensaio em que ele estava ausente: = (v0 - v0inibidor) /v0. No caso
de ativação o grau de ativação seria: = (v0ativador - v0) /v0. Ver Fig. 15.
140
}
Δv
80
{
o
+activador
Δv
100
o
60
+inibidor
Actividade enzímica
120
40
20
0
Fig. 15 Pela adição de determinadas substâncias ao meio de ensaio podemos eventualmente aumentar ou diminuir a
atividade catalítica da enzima. Quando em determinadas condições de ensaio uma substância pode aumentar a
atividade enzímica diz-se um ativador; se diminui a atividade catalítica diz-se um inibidor. O grau de ativação ou de
inibição pode ser expresso como uma percentagem e neste caso o seu valor será 100 × Δv0 /(v0 na ausência de
modificador).
6.1 Inibidores competitivos
Quando se estuda o efeito da concentração de substrato na atividade podemos, multiplicando o número de
tubos, fazê-lo também na presença de várias concentrações de uma substância I: um inibidor da atividade da
enzima.
Algumas vezes observa-se que o inibidor não altera o Vmax, mas que é o valor de Km que cresce
linearmente com o valor de I. O grau de inibição é marcado para baixas concentrações de substrato, mas diminui
quando esta concentração aumenta podendo mesmo deixar de observar-se inibição para altas concentrações de
substrato. Nos casos em que a cinética é hiperbólica um mecanismo enzímico como o que é apresentado a seguir
pode explicar o fenómeno:
E+S
+
I
k5
k1
k2
E•S
k3
E+P+…
k6
E•I
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Fig. 16 Modelo esquemático de um mecanismo que se traduz em inibição competitiva do inibidor relativamente ao
substrato S.
O esquema acima representa um mecanismo em que E (a enzima livre), I e E•I estão em equilíbrio
químico durante todo o processo catalítico; existe assim uma constante de equilíbrio Ki (à frente designada de
constante de inibição) que relaciona as concentrações de equilíbrio destas três substâncias e que pode ser definida
como a constante de dissociação do complexo E•I.
=
Equação 18
[I][E]
[E∙I]
=
k6
k
O desenvolvimento matemático deste modelo conduz à Equação 19:
[S]
=
Equação 19
[I]
K
m
[S]
A Equação 19 mostra que o valor da constante de Michaelis para um determinado valor de [I], o valor da
constante de Michaelis aparente (o que pode ser observada na presença de uma dada concentração de I) é expresso
pela Equação 20.
Equação 20
=
m
m
1+
[I]
K
Assim, Ki, para além de se poder definir como o valor da constante de dissociação para o complexo E•I
(ver Equação 18), também passa a poder ser redefinida como a concentração de inibidor que dobra o valor do Km
(ver Equação 20). Quanto menor for o seu valor maior será a capacidade inibidora da substância I.
Vmax
10
9
S
vo
8
7
S+I
6
5
4
3
2
1
0
0
10
Km Km'
20
30
40
[S]
Fig. 17 Os inibidores competitivos atuam aumentando o Km aparente. A hipérbole S representa v0 versus [S] na
ausência de inibidor e a hipérbole S+I, v0 versus [S] na presença de uma determinada concentração do inibidor I. Km e
Km’ representam, respetivamente, a constante de Michaelis observável na ausência e na presença do inibidor. Na
presença do inibidor o valor de Km aumenta, mas o valor de Vmax não se modifica: o efeito inibidor anula-se para
concentração “infinita” de substrato.
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Na posse de dados experimentais podemos, num único gráfico, desenhar uma família de hipérboles (v0
versus [S]), cada uma delas correspondendo a ensaios com uma determinada concentração de inibidor. No tipo de
inibição em discussão as hipérboles tendem a encontrar-se quando a concentração de substrato aumenta, ou seja, o
Vmax não é afetado e o grau de inibição diminui quando a concentração de substrato aumenta (Ver Fig. 17).
Este tipo de inibição diz-se competitiva pois que, para uma dada concentração de inibidor, o grau de
inibição é sempre mais marcado em ensaios com baixas concentrações de substrato que com altas concentrações
de substrato. Aumentando a concentração de substrato pode ser possível anular (Vmax é invariante) ou, pelo menos,
diminuir o grau de inibição: o substrato e o inibidor parecem ter afinidade para um mesmo “sítio ativo” na enzima
e competirem na ligação a esse “sítio ativo”. Se o substrato e I forem estruturalmente semelhantes esta ideia fica
reforçada.
Algumas vezes uma mesma enzima pode ligar-se a dois substratos diferentes (embora com estruturas
relacionadas) catalisando duas reações diferentes: ligando A pode catalisar a transformação A→P, ligando B pode
catalisar a transformação B→Q. Neste caso A é um inibidor competitivo da reação B→Q e B um inibidor
competitivo da reação A→P. O valor do KiA (constante de inibição associada a A na reação B→Q) é igual a KmA
(constante de Michaelis associada a A na reação A→P); também KiB = KmB.
Os medicamentos mais usados na clínica para baixar a concentração de colesterol plasmático
anormalmente aumentado são inibidores competitivos relativamente a um dos substratos de uma enzima: a
redútase de hidroximetilglutaril-CoA (ver Capítulo 6.1.a).
6.1.a As estatinas competem eficazmente com o hidrometilglutaril-CoA (HMG-CoA) na sua ligação à
redútase de HMG-CoA e são medicamentos usados para fazer descer a concentração de
colesterol plasmático
A maior parte do colesterol do plasma existe ligado a dois tipos de lipoproteínas. Um desses tipos
designa-se de LDL (da expressão inglesa “low density lipoproteins”) e, quando a concentração plasmática de
colesterol ligado às LDL está aumentado o risco de infarto de miocárdio e tromboses cerebrais aumenta. A
captação das LDL pelas células do organismo é regulada pelo conteúdo das células em colesterol: se a
concentração intracelular de colesterol diminuir a velocidade de captação de colesterol plasmático aumenta e
diminuindo o que continua no plasma ligado às LDL.
Um grupo de medicamentos coletivamente designados de estatinas são usados na clínica para fazer baixar
o colesterol ligado às LDL e o mecanismo desta ação das estatinas envolve a diminuição da síntese endógena de
colesterol: menos síntese de colesterol nas células faz aumentar a captação de LDL.
A enzima alvo das estatinas é redútase do hidrometilglutaril-CoA (HMG-CoA) que é das enzimas
envolvidas no processo de síntese de colesterol catalisando um dos passos do processo; o que é expresso pela
seguinte equação:
Equação 21
HMG-CoA + 2 NADPH → mevalonato + 2 NADP+
As estatinas competem com o HMG-CoA ligando-se no mesmo local em que este substrato se liga à
enzima [1]. A inibição é de tipo competitivo relativamente a este substrato e poderíamos pensar que as estatinas
não seriam eficazes in vivo. Quando a enzima fica bloqueada pela ligação ao inibidor é de esperar que a
concentração de HMG-CoA suba e que a inibição acabe por desaparecer. No entanto não é isso que acontece e as
estatinas são, de facto, eficazes a fazer baixar a síntese endógena de colesterol. O que se passa é a afinidade das
estatinas para a enzima é cerca de 3 ordens de grandeza maior que para o substrato HMG-CoA: enquanto o Km do
HMG-CoA é de 4 μM o Ki da rosuvastatina, por exemplo, é de 2 nM [1].
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6.2 Inibidores não competitivos
Em situações experimentais semelhantes às que foram descritas no Capítulo 6.1, às vezes, observa-se que
o inibidor I provoca uma diminuição no Vmax sem provocar modificação no valor de Km. Se a enzima tem uma
cinética de tipo hiperbólico dizemos que I é um inibidor não competitivo.
Fig. 18 Os inibidores não competitivos atuam diminuindo o Vmax aparente e o grau de inibição é invariante com a
concentração de substrato. A hipérbole S representa v0 versus [S] na ausência de inibidor e a hipérbole S+I, v0 versus
[S] na presença de uma determinada concentração do inibidor I. Vmax e Vmax’ representam respetivamente o Vmax
observável na ausência e presença do inibidor. Na presença do inibidor o valor de Vmax diminui mas o valor de Km
não se modifica.
Um mecanismo compatível com este resultado é o que está representado no esquema a seguir:
E+S
+
I
k5
k1
E•S
k2
E+P+…
+
I
k6
E•I + S
k3
k9 k10
k7
E•S•I
k8
Fig. 19 Modelo esquemático de um mecanismo que se traduz em inibição não competitiva do inibidor I.
Para que este modelo responda de forma adequada ao problema colocado, nomeadamente que o valor da
constante de Michaelis não seja modificado pela presença de I, teremos ainda de impor que as constantes de
dissociação dos complexos E•I (=Ki1; ver Equação 22) e E•I•S (=Ki2; ver Equação 23) relativamente a I tenham
o mesmo valor: Ki1 = Ki2 = Ki.
Equação 22
1=
Equação 23
2=
[I][E]
[E∙I]
[I][E]
[E∙S∙I]
=
k6
k
=
k10
k
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O modelo também impõe e, isso é uma mera consequência de Ki1 = Ki2, que as constantes de dissociação
dos complexos que contêm S (E•S e E•S•Ι) relativamente a S também sejam iguais. Ou seja, a afinidade de S em
relação à enzima livre (E) e ao complexo E•I são iguais.
O desenvolvimento matemático deste modelo conduz à Equação 24:
[I]
Equação 24
=
m
[S]
[S]
A Equação 24 mostra que o valor de Vmax para um determinado valor de [I], a velocidade máxima
aparente nessas condições é o que se obtém usando a Equação 25.
Equação 25
max
=
[I]
Assim, a constante Ki pode ser redefinida como a concentração de inibidor que reduz a metade o valor da
Vmax. É também de concluir que concentrações saturantes de I ([I]>>Ki) fazem com que a enzima só exista nas
formas que contêm I (E•I e E•S•I) e que não possam formar-se produtos: quando a concentração de I aumenta
tende para zero.
max
O modelo (ver Fig. 19) pode ser descrito da seguinte maneira: quer a enzima livre E, quer o complexo
E•S podem ligar I com uma afinidade idêntica; I ligado à enzima não perturba a ligação de S à enzima, mas
impede que a forma ligada a S seja capaz de gerar P. O inibidor I atua como se eliminasse enzima ativa da
solução; de facto, parte da enzima (a fração que está ligada a I) fica excluída do processo catalítico. O modelo é
compatível com a existência na enzima de um local distinto do “sítio ativo” onde I pudesse ligar-se; a ligação de I
nesse local poderia provocar uma modificação conformacional na enzima de maneira que, quando ligada a I, a
enzima podia ligar o substrato mas não podiam desencadear-se as reações necessárias para a formação dos
produtos. Se a estrutura de I for diferente de S esta hipótese aparece reforçada.
Estamos assim a colocar a hipótese de que I se liga à enzima um sítio diferente do sítio ativo, um sítio
alostérico (do Grego: allos, outro + stereos, espaço). Embora, este modelo tenha surgido antes de se ter inventado
a palavra “alostérico” e que, por isso, mantenha a designação clássica de não competitiva, na opinião do autor
destas linhas, o que se está a admitir é que, quando ligada ao inibidor a enzima não tem a capacidade de gerar os
produtos. Algo mudou na sua conformação que explicará o seu diferente comportamento.
A palavra “alostérico” é um adjetivo que classifica um ativador ou um inibidor que atua ligando-se à
enzima num local distinto do(s) substrato(s), o seu efeito (o efeito alostérico), o local onde se ligam (o sítio
alostérico) ou uma enzima (enzima alostérica) onde ocorrem efeitos alostéricos. É frequente encontrar na
literatura científica a expressão enzima alostérica como sinónimo de enzima com cinética de tipo cooperativo.
Compreende-se o uso dessa expressão porque nestas enzimas é extremamente frequente observar efeitos
comprovadamente alostéricos e, no caso de poderem ligar mais de uma molécula de substrato em distintos
monómeros, pode considerar-se que o local de ligação de uma molécula de substrato é um sítio alostérico em
relação ao local de ligação da segunda molécula de substrato. Neste caso o substrato ligado num monómero pode
ser designado de modificador alostérico homotrópico usando-se a expressão heterotrópico para classificar os
modificadores alostéricos que não são substratos.
Como já referido, as expressões enzima alostérica e enzima com cinética de tipo cooperativo (sigmoide)
não são sinónimas porque a existência de efeitos alostéricos não é exclusivo das enzimas com gráficos v0 versus
concentração de substrato de tipo sigmoide. O antónimo de alostérico é isostérico e um efeito inibidor de tipo
competitivo baseado num mecanismo de competição com o substrato em relação ao sítio ativo da enzima podia
classificar-se desta maneira (ver Fig. 16).
A possibilidade de um inibidor se ligar no sítio ativo (inibidor isostérico) e ser um inibidor não
competitivo também existe. Se a ligação do inibidor ao centro ativo é de tipo covalente e estável (a velocidade
com que se pode dissociar do centro ativo é muito baixa ou nula) e impede a ligação do substrato as moléculas de
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enzima ligadas ao inibidor estão excluídas do processo catalítico. Este assunto é abordado com mais detalhe no
Capítulo 6.4.
6.3 Inibição mista
Quando, no capítulo anterior apresentamos o modelo (ver Fig. 19) que pode explicar a inibição não
competitiva impusemos a condição que Ki1=Ki2 e, dado que admitimos equilíbrio entre as quatro formas da
enzima, foi também referido que estes pressupostos impõem que a afinidade de S em relação à enzima livre (E) e
ao complexo E•I são iguais. De facto podemos ser mais abrangentes. Definindo Ks1 e Ks2 como correspondendo,
respetivamente, às constantes de equilíbrio relativas aos processos de dissociação dos complexos E•S e E•S•I
com libertação de S (ver Equação 26 e Equação 27), a igualdade expressa pela Equação 28 é uma característica do
modelo em análise.
Equação 26
1=
Equação 27
2=
Equação 28
=
[S][E]
[E∙S]
[S][E]
[E∙S∙I]
=
=
k2
k
k8
k
O desenvolvimento matemático do modelo apresentado na Fig. 19, admitindo que Ks1 pode ser diferente
de Ks2 (ou, o que é equivalente, que Ki1 pode ser diferente de Ki2) leva à Equação 29. Os valores de max
e
dependem da concentração do inibidor e das constantes de dissociação em questão e são expressos,
de m
respetivamente, pela Equação 30 e pela Equação 31.
=
Equação 29
[S]
max
[S]
m
Equação 30
max
=
Equação 31
m
=
[I]
+
(
)[I]
[I]
Na presença de I, o valor de m
tende a aumentar se Ks2 for maior que Ks1 e tende a diminuir na
condição contrária. Em ambos os casos m
tende para um limite que corresponde ao valor de Ks2, a
constante de dissociação para E•S•I libertando S e E•I. Pode demonstrar-se que o valor do m
é dado por
uma razão em que as concentrações dos complexos que contêm S estão no denominador e os que o não contêm S
estão no numerador:
Equação 32
m
([ ] [ ∙ ])[S]
∙ ] [ ∙ ∙ ])
= ([
No que se refere ao max
, quando a concentração de I aumenta o seu valor diminui e o limite é o
valor zero (ver Equação 30).
Se a afinidade do substrato para o complexo E•I for maior que para a enzima livre (E) (ou seja, se Ks2 <
Ks1) o m
diminui quando se adiciona I mas, por outro lado, o valor de max
diminui quando [I]
aumenta. Poderíamos eventualmente pensar o modelo poderia comportar a possibilidade de haver um efeito
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ativador de I, mas não é o caso: pode demonstrar-se matematicamente que, neste modelo, a adição de I ao sistema
provoca sempre inibição.
Quando, como no modelo em análise, o Vmax diminui pela adição de I e o Km varia, diz-se que a inibição é
de tipo misto, não é “não competitiva” nem “competitiva”.
Porque estamos a admitir que apenas uma molécula de I pode estar complexada com a enzima é razoável
pensar que esse local de ligação não é o centro ativo. (As consequências da ligação reversível do inibidor no
centro ativo já foram discutidas e correspondem à inibição competitiva.) Tal como no caso da inibição não
competitiva é mais sensato admitir que a ligação de I ocorre num centro alostérico e que essa ligação modifica a
conformação da enzima. Quando I se liga à conformação que já contém S (E•S + I → E•S•I) o resultado é um
complexo que não é capaz de gerar produto. Quando I se liga à enzima livre (E + I → E•I) o resultado é uma
conformação que pode ligar S, mas em que a afinidade entre E•I e S é diferente da afinidade entre E e S.
É imediato reconhecer que a inibição acima designada de “não competitiva” é apenas um caso particular
do modelo apresentado na Fig. 19 e explicado neste Capítulo: no caso da inibição não competitiva impôs-se a
condição de a afinidade entre E•I e S ser igual à afinidade entre E e S (ou, o que é equivalente, da afinidade entre
E e I ser igual à afinidade entre E•S e I).
6.4 Inibidores que reagem com a enzima de forma covalente e irreversível
De forma semelhante ao que foi referido nos pressupostos que permitiram a dedução da Equação 11 (ver
Capítulo 5.7), também as equações apresentadas nos Capítulos 6.1 e 6.2 pressupõem que existe equilíbrio químico
instantâneo na formação dos complexos E•S, E•I e E•S•Ι e que os processos são reversíveis.
No entanto, nalgumas situações, estes pressupostos não são conciliáveis com a realidade.
Se, por exemplo, um inibidor reage com a enzima formando uma ligação covalente irreversível no sítio
ativo, a adição ao meio de uma concentração elevada de substrato não vai reverter a inibição. Ou seja, neste caso a
ação do inibidor não está de acordo com o que se referiu a propósito da inibição competitiva. Se, podermos, como
uma boa aproximação à realidade, pensar que todas as moléculas de inibidor adicionadas ao meio de ensaio
ficaram ligadas à enzima então, o número de moléculas de enzima livre foi reduzido no valor correspondente às
de inibidor adicionado ao meio. Ou seja só as moléculas de enzima que não se ligaram ao inibidor é que ficaram
disponíveis para catalisar a reação, enquanto as ligadas ao inibidor ficaram excluídas do processo catalítico.
Nestas condições para uma concentração fixada de inibidor que se deixou durante algum tempo (designado de
pré-incubação) reagir com a enzima o gráfico v0 versus [S] será semelhante ao que se apresentou na Fig. 18 para
ilustrar a inibição não competitiva. Ou seja, diminui o Vmax enquanto o Km se mantém invariante.
Uma expressão que é, às vezes, usada para os classificar as substâncias que atuam desta forma é o de
“inativadores enzimáticos” o que traduz a ideia de que as moléculas de enzima às quais se ligam ficam
definitivamente excluídas do processo catalítico.
Um exemplo de um inativador enzimático (orlistato) é apresentado no Capítulo 6.4.a.
6.4.a O orlistato é um inativador das lípases digestivas
O orlistato é um medicamento usado no tratamento da obesidade e também é conhecido pelo nome de
tetrahidrolipestatina. É um inativador das lípases pancreática e gástrica, as enzimas que, no tubo digestivo,
catalisam a hidrólise dos triacilgliceróis da dieta. O orlistato reage lentamente com um resíduo de serina situado
no centro ativo da enzima formando uma ligação covalente irreversível e desta forma impede a ligação da enzima
ao seu substrato. O facto de a ligação ser isostérica (ocorrer no centro ativo) não faz com a inibição seja de tipo
competitivo. No entanto, quando existem triacilgliceróis no meio de incubação contendo enzima e o orlistato é
adicionado posteriormente, o processo de inativação é retardado [2, 3].
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6.5 Efeitos alostéricos
Em enzimas com cinéticas de tipo cooperativo (mas não exclusivamente nestas como já referido) é
frequente observar efeitos ativadores ou/e inibidores que foram interpretados como estando relacionados com a
interação reversível de efetores (substâncias ativadoras ou inibidoras), com um ou mais sítios alostéricos
existentes na enzima. Frequentemente, estes efeitos, observados in vitro, foram interpretados como tendo
importantes implicações metabólicas na fisiologia química da célula. A ligação do efetor (um ligando L) à enzima
provocaria uma alteração na conformação da enzima que se refletiria numa modificação na sua atividade
catalítica. Se a conformação ligada a L tiver maior atividade que a conformação desligada, a adição de L
provocaria ativação e L seria um ativador alostérico.
Em alguns casos o efeito ativador ou inibidor relaciona-se com uma alteração no valor do Vmax
relativamente a um ou mais dos substratos da enzima. Outras vezes o efeito ativador ou inibidor relaciona-se com
uma alteração no valor do Km (ou do S50) relativamente a um ou mais dos substratos da enzima. No primeiro caso
diz-se que há um efeito de tipo V e no segundo um efeito de tipo K e uma combinação dos dois também é
possível. De notar que um efeito de tipo K ativador significa um diminuição no valor de Km (ou de S50), ou seja
um aumento da afinidade da enzima para o substrato; um efeito de tipo K inibidor significa um aumento no valor
de Km (ou de S50), ou seja uma diminuição da afinidade da enzima para o substrato. Ver Fig. 20.
Vmax
+Activador
14
+Activador
vo 12
Vmax
9
8
10
vo
8
Vmax
Vmax 10
+Inibidor
7
6
5
6
4
+Inibidor
4
3
2
2
1
0
0
0
10
20
30
40
[S]
S50
0
10
20
30
40
[S]
Km Km Km
Fig. 20 Efeitos alostéricos ativadores e inibidores de tipo V (à esquerda) e de tipo K (à direita) em enzimas com
cinéticas de tipo sigmoide. Existe um efeito ativador ou inibidor de tipo V quando, respetivamente o Vmax aumenta ou
diminui por ação do efetor. No caso de efeitos de tipo K um efeito ativador significa uma diminuição no valor do S50 e
um efeito inibidor um aumento no valor de S50.
Em enzimas com cinéticas de tipo cooperativo em relação com um substrato S no qual se pode observar
um efeito K ativador é frequente observar-se paralelamente com uma diminuição do valor de S50 uma diminuição
da sigmoidicidade da curva que descreve a relação v0 versus [S]; para valores altos de concentração do ativador, o
aspeto sigmoide da curva pode desaparecer e surgir um aspeto hiperbólico. Para o caso de inibidores de tipo K é
frequente observar-se o oposto: um aumento do valor do S50 e, paralelamente, um aumento da sigmoidicidade da
curva em análise. Ver Fig. 21.
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sem efector alostérico
vo
+ATP
+CTP
0
10
20
30
40
Aspartato (m M)
Fig. 21 Efeito de tipo K inibidor (CTP) e ativador (ATP) sobre a atividade catalítica da transcarbamílase do
aspartato. A transcarbamílase do aspartato catalisa a seguinte reação: fosfato de carbamilo + aspartato → Pi +
carbamil-aspartato; esta reação integra-se na via metabólica da síntese dos nucleotídeos pirimidínicos. Na presença de
CTP o valor de S50 para o substrato aspartato aumenta e paralelamente aumenta a sigmoidicidade da curva v0 versus
[aspartato]. O contrário ocorre na presença do ATP.
Em algumas enzimas, como no caso da redútase dos nucleosídeos difosfato, podem observar-se efeitos
alostérico que se refletem em alterações na especificidade em relação a determinados substratos.
Em algumas enzimas oligoméricas compostas por subunidades diferentes observou-se que os efeitos
catalíticos da enzima estavam relacionados com um tipo de subunidades e que os efeitos alostéricos com um
segundo tipo: ou seja que o(s) centro(s) ativo(s) e o(s) centro(s) alostérico(s) se situavam em diferentes
monómeros da enzima.
Um caso assim acontece na PKA (cínase de proteínas dependente do AMP cíclico). Nesta enzima as
subunidades reguladoras estão ligadas às subunidades catalíticas no centro ativo destas e, portanto, bloqueiam a
sua ação catalítica da enzima. O AMP cíclico é o ligando capaz de ligar num sítio alostérico situado nas
subunidades reguladoras e esta ligação provoca uma modificação conformacional destas subunidades que tem
como consequência a perda de afinidade entre as subunidades reguladoras e as subunidades catalíticas. Isto tem
como consequência a dissociação dos dois tipos de subunidades: a libertação das subunidades reguladoras expõe o
centro ativo e desbloqueia a atividade da PKA.
Embora, na área do conhecimento que estuda os recetores hormonais, não seja frequente usar-se a
linguagem que, há décadas se usa no campo da enzimologia, na opinião do autor destas linhas a ação da insulina
no seu recetor também se pode descrever como um efeito alostérico. O recetor da insulina é de facto uma cínase
de proteínas que catalisa a transferência do fosfato terminal do ATP para resíduos de tirosina de proteínas
designadas por “substratos do recetor da insulina”. O recetor da insulina é uma proteína integral situada na
membrana citoplasmática e contém quatro subunidades. Duas dessas subunidades têm locais de ligação para a
insulina que ficam voltadas para a face extracelular da membrana. As outras duas têm a atividade catalítica acima
referida e têm o centro ativo voltado para o citoplasma, o local onde se situam os substratos do recetor da insulina.
Quando a insulina se liga nos seus locais de ligação, a alteração de conformação nas subunidades onde a hormona
se liga induz alterações conformacionais nas subunidades catalíticas que passam a ser ativas. Na opinião do autor
destas linhas, uma forma de resumir o processo seria dizer que a insulina é um ativador alostérico da enzima que é
designada por recetor da insulina.
6.6 Efeitos induzidos por modificação covalente de enzimas catalisada por outras enzimas
Em geral, quando se fala de efeitos alostéricos pensa-se num local da enzima diferente do sítio ativo no
qual o ligando L pode ligar-se de forma não covalente e que a velocidade com que se atinge o estado de equilíbrio
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químico nessa ligação é extraordinariamente rápida e não é catalisada enzimicamente. No entanto, nalguns casos a
atividade de uma enzima pode ser modificada pela ação catalítica de outras enzimas.
O caso mais frequente é a modificação reversível por ação de cínases (que catalisam fosforilações) e de
fosfátases (que catalisam desfosforilações). Algumas enzimas podem apresentar conformações e características
cinéticas muito distintas consoante estão numa forma desligada ou ligada a um ou mais grupos fosfato (ligação
covalente de tipo fosfoéster num resíduo aminoacídico hidroxilado distante do sítio ativo) sendo a transformação
reversível entre as duas formas catalisada enzimicamente por outras enzimas. Neste caso não é costume falar de
efeito alostérico embora, de facto, o local de ligação do fosfato seja distinto do sítio ativo.
Exemplos deste tipo de processos são as ativações e inibições que ocorrem na fosforílase do glicogénio
quando sobre esta enzima atua a cínase da fosforílase ou a fosfátase-1 de proteínas. Se, como é tradicional,
usarmos as letras a e b para designar as formas ativa e menos ativa da enzima, a Equação 33 expressa a
fosforilação e consequente ativação da fosforílase do glicogénio pela cínase da fosforílase. Por sua vez, a Equação
34 expressa a desfosforilação hidrolítica e consequente inibição da fosforílase do glicogénio pela fosfátase-1 de
proteínas.
Equação 33
Equação 34
fosforílase do glicogénio b + ATP →
fosforílase do glicogénio a (fosforilada) + ADP
fosforílase do glicogénio a + H2O → fosforílase do glicogénio b (desfosforilada) + Pi
Outro tipo de modificação covalente que também muito conhecido é a ação de enzimas hidrolíticas que
atuam sobre zimogénios (precursores da enzima ativa) convertendo estas proteínas em enzimas ativas. É o caso,
por exemplo, da enteropeptídase a atuar no tripsinogénio: por ação da enteropeptídase uma enzima situada no
polo apical dos enterócitos o tripsinogénio do suco pancreático é convertido em tripsina ativa que atua na digestão
das proteínas da dieta e na ativação de outros zimogénios presentes no suco pancreático.
7
Para que pode servir o estudo cinético de uma enzima?
O estudo cinético de uma enzima permite obter informação acerca do modo como a atividade da enzima é
afetada pelas condições em que está a operar.
Esse conhecimento pode servir para compreender o metabolismo porque a esmagadora maioria das
reações químicas que ocorrem nos ser vivos são catalisados por enzimas. A ativação ou a inibição por compostos
que existem nas células pode fazer pensar que estes compostos podem regular o metabolismo regulando a
atividade das enzimas e eventualmente, compreender esta regulação quando a sua concentração varia. Se se
souber que os substratos de uma determinada enzima existem na vizinhança da enzima em concentrações que se
situam abaixo ou são semelhantes ao Km permitem prever que variações na sua concentração podem afetar
marcadamente a sua atividade.
Quando se quer dosear uma determinada enzima existente num tecido também é importante ter
conhecimentos que permitam desenhar técnicas que permitam esse doseamento e minimizem a interferência de
outras enzimas que possam existir na preparação que contém a enzima a dosear. É com base neste tipo de
conhecimentos que, quando há suspeita de que uma determinada enzima está deficitária ou em excesso num dado
tecido, a enzima em questão, ou melhor dito, a sua atividade é medida.
Além disso as enzimas purificadas podem ser usadas para dosear substâncias. Se uma determinada
enzima catalisa de forma específica a conversão A→B, a deteção específica de A pode, eventualmente, ser feita
tirando partido dessa característica da enzima. Se o objetivo for sintetizar B a enzima também poderá ser útil. O
contributo da enzimologia para o desenvolvimento de métodos de análise em contextos médicos (análises
clínicas), científicos, industriais ou de investigação criminal não pode deixar de ser realçado. Um exemplo é o uso
comum de uma enzima de origem fúngica altamente específica, a glicose oxídase, no doseamento da glicose.
Alguns medicamentos são inibidores enzimáticos e, nas fases iniciais do seu desenvolvimento, podem
estar estudos em que se avaliou a ação de diferentes compostos na atividade das enzimas.
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Este texto foi escrito por Rui Fontes em janeiro de 1996 e corrigido em janeiro de 2007 e em outubro de 2011. O
autor agradece a todos os que lerem este texto todas as críticas que entendam fazer.
8
Bibliografia
8.1 Bibliografia geral
Dixon, M. & Webb, E. C. (1979) Enzymes, 3rd edn, Academic Press, New York.
Engel, P. C. (1981) Enzyme Kinetics. A Steady-state Approach, 2nd edn, Chapman and Hall, London.
Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry. (1981) Symbolism and Terminology in Enzyme Kineticsrecommendations, Eur J Biochem. 128, 281-291.
Cornish-Bowden, A. (1995) Fundamentals in enzyme kinetics, Portland Press, London
Fontes, R., Ribeiro, J. M. & Sillero, A. (2000) Inhibition and activation of enzymes. The effect of a modifier on the reaction rate and on
kinetic parameters, Acta Biochim Pol. 47, 233-57.
8.2 Referências específicas
1. Istvan, E. (2003) Statin inhibition of HMG-CoA reductase: a 3-dimensional view, Atheroscler Suppl. 4, 3-8.
2. Hadvary, P., Lengsfeld, H. & Wolfer, H. (1988) Inhibition of pancreatic lipase in vitro by the covalent inhibitor tetrahydrolipstatin,
Biochem J. 256, 357-61.
3. Hadvary, P., Sidler, W., Meister, W., Vetter, W. & Wolfer, H. (1991) The lipase inhibitor tetrahydrolipstatin binds covalently to the
putative active site serine of pancreatic lipase, J Biol Chem. 266, 2021-7.
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