Orientações para Coleta,
Transporte, Processamento,
Análise e Meios de Cultura.
• ARTIGOS PARA OS SEMINÁRIOS;
• CONTEÚDO PROGRAMÁTICO;
• CASOS CLÍNICOS;
blog do professor:
http://chitoteixeira.wordpress.com
Colheita de Amostras
Quando se suspeita de doença infecciosa
Técnicas dirigidas à detecção
sorológica de antígenos e anticorpos
Sondas de DNA - PCR
Anticorpos monoclonais
Outros procedimentos sem cultivo
Cultivos apropriados
Colheita de Amostras
É possível que a colheita apropriada de uma
amostra para cultivo seja a etapa mis
importante na confirmação final de que um
microrganismo é responsável pelo processo
de enfermidade infecciosa.
Uma amostra mal colhida:
Fracasso
no de
isolamento
deincorreta e ainda
Na
instituição
uma terapia
microrganismos
importantes.seja dirigido para
danosa,
caso o tratamento
um comensal.
Exemplo: (caso clínico)
Klebsiella pneumoniae foi isolada do escarro
de um paciente com pneumonia clínica;
Klebsiella pneumoniae
Escarro colhido de forma inadequada sendo
constituído principalmente de saliva;
pneumonia
Nasofaringe
O pior:
O tratamento seria inadequado e só
resultaria efetivo, por casualidade, se a
espécie causadora da pneumonia tivesse um
padrão de susceptibilidade a antibióticos
Pseudomonas aeruginosa
similar à de K. pneumoniae.
A terapia eleita poderia ter sido
errônea.
Colheita de Amostras
Considerações fundamentais na
colheita de amostras.
• A amostra deve ser material do sítio real de
infecção, devendo ser colhida com o mínimo
de contaminação dos tecidos, órgãos e
secreções adjacentes;
• Deve-se estabelecer o momento ótimo para a
colheita de amostras, com o objetivo de
contar com melhor possibilidade de isolar
microrganismos causadores de enfermidades;
Colheita de Amostras
Considerações fundamentais na
colheita de amostras.
• Enviar
Deve-se
obter uma swab
quantidade
ao laboratório
seco ousuficiente
secreçõesde
Calcularam que Swabs
o
retais para isolar
amostra
para
realização
dase de
técnicas
escassas
é uma
prática inútil
custo de
rendimento do isolamento
espécies de Shigella, o material
cultivo solicitadas;
considerável para o paciente;
de microrganismoscolhido
a partir deve ser inoculado
de culturas de sangue
diretamente na superfície de
• Com
Devem
demasiada
ser em
utilizados
freqüência,
dispositivos
são enviados
de
ao
aumentava
cerca
ágarde
Mac Conkey
ou colheita,
caldo
recipientes
laboratório
de
0,5
amostras
mLenriquecido
ou menos
e meios
de
material
de
cultura
3%
por mL de
sangue
para
gramapropriados
identificado
para
como
assegurar
“escarro”
isolamento
ou
“lavado
ótimo
colhido;
(Mermel
e
Maki).
negativos
bactérias anaeróbicas
de microrganismos.;
brônquico”;
Colheita de Amostras
Considerações fundamentais na
colheita de amostras.
• Sempre que possível, deve-se obter amostras
Etiqueta
com nome,
antes dalegível
administração
de antibióticos;
número de idenficacção,
Neisseria meningitidis
origem,
médico e a data/hora
Garganta
Líquido
da colheita;
• O recipiente
da amostra deve ser rotulado
de
forma correta;
cefalorraquidiano (LCR)
Haemophilus influenzae
Amostras
geniturinárias
Neisseria gonorrhoea
Colheita de Amostras
Outros exemplos importantes.
Transporte de Amostras
O objetivo primário no transporte de
amostras para diagnóstico consiste em
manter a amostra o mais próximo possível
de seu estado original, com deterioração
mínima, e minimizar os riscos para os
transportadores das amostras, utilizando-se
dispositivos protetores do recipiente da
amostra inseridos no interior de um
recipiente adequado.
Transporte de Amostras
Deve-se evitar:
Calor extremo
Frio
Mudanças na pressão
Condições ambientais adversas
Transporte de Amostras
Se for previsto:
Um atraso prolongado (acima de 4 dias por
exemplo) antes da amostra ser processada;
É preferível congelar a amostra a
-70ºC, podendo ser utilizado um
congelador a -20ºC, se o período
de estocagem for breve.
Transporte de Amostras
As amostras de escarro colhidas principalmente
para o isolamento:
Podem ser remetidas sem qualquer tratamento
desde que colhidas em recipientes de propileno
fungos
ou polietileno
esterilizados.
micobactérias
Transporte de Amostras
A maioria das amostras líquidas, em particular
amostra de urina, deve ser transportada ao
laboratório o quanto antes possível:
Recomenda-se um limite
máximo de 2 horas entre
a colheita e a chegada da
amostra ao laboratório.
Contexto hospitalar
Transporte de Amostras
O limite de tempo representa um problema
quando as amostras são colhidas em
consultórios particulares.
Amostras de urina
Podem ser utilizados
recipientes contendo uma
pequena quantidade de
ácido bórico, se o
transporte rápido não for
possível.
Transporte de Amostras
Para a maioria das amostras pode ser utilizado
um meio de manutenção ou transporte,
seguindo-se as instruções do fabricante.
Meio de
transporte Stuart
Solução tampão, isenta de
nutrientes e fatores de
crescimento, conserva a
viabilidade sem permitir a
multiplicação das bactérias
durante o transporte.
Transporte de Amostras
• Tioglicolato de sódio – tem função de agente
redutor para melhorar o isolamento de
bactérias anaeróbias;
• Ágar (pequena quantidade) – proporciona
uma consistência semi-sólida que impede a
oxigenação e o derrame durante o
transporte;
Transporte de Amostras
Solução de borato de sódio
Tampão com sacarose,
fosfato e glutamato
Transporte de Amostras
As amostras devem ser embaladas de modo a
suportar golpes ou mudanças de pressão que
podem ocorrer durante a manipulação e
causar vazamento do conteúdo;
Um recipiente que vaza não apenas predispõe
a amostra a uma potencial contaminação, mas
também expõe os microrganismos ao pessoal
que transporta ou recebe a amostra;
Transporte de Amostras
Técnica apropriada para embalar e rotular
agentes etiológicos:
Recipiente primário com
tampa à prova d’água
Recipiente secundário
de preferência de metal
Embalagem para envio
fabricada em cartão
ondulado, cartão grosso
ou gomaespuma
Recepção de Amostras
luvas
máscaras
jalecos
Processamento de Amostras
• Ingresso de dados essenciais em um livro de
registros ou em um terminal de computador;
• Exame visual e determinação do
cumprimento de todos os critérios para
aceitação da amostra;
• Para certas amostras, o exame microscópico
de montagens úmidas ou de esfregaços
corados, para estabelecer um diagnóstico
presuntivo;
Processamento de Amostras
USO DE CORANTES EM MICROBIOLOGIA:
É recomendável que os microbiologistas
efetuem exames microscópicos diretos das
amostras enviadas para cultivo;
Rápido diagnóstico
presuntivo
Guia para selecionar os meios
de cultura apropriados
Processamento de Amostras
Coloração de Gram
• Cristal violeta – serve como coloração
primária, unindo-se à parede celular
bacteriana após tratamento com uma
solução de iodo fraca (mordente para a
ligação do corante);
• Descorante (mistura etanol 95% e acetona) –
as bactérias que retêm o corante aparecem
azuladas se observadas ao microscópio e
são denominadas gram-positivas;
Processamento de Amostras
Coloração de Gram
• Contracorante Safranina – certas bactérias
perdem a coloração primária com cristal
violeta quando são tratadas com o
descorante e captam a contracoloração com
safranina e aparecem em vermelho quando
observadas ao microscópio, denominandose gram-negativas;
A coloração de Gram pode ser utilizada para
efetuar identificações presuntivas.
Processamento de Amostras
Colorações de àlcool-ácido-resistência
micobactérias
Recobertas por um
espesso material ceroso
que resiste à coloração,
entretanto, uma vez
coradas, resistem à
descoloração mesmo por
solventes orgânicos fortes,
como o álcool-ácido.
Fenômeno descoberto por Ziehl e Neelsen (1881).
Processamento de Amostras
OUTROS CORANTES:
Laranja de acridina
Azul de toluidina e Azul de Metileno
Coloração com Prata
Coloração com Wright-Giemsa
Ácido periódico de Schiff
Processamento dos Cultivos
Após recebimento de amostras para cultivo no
laboratório de microbiologia, devem ser
tomadas as seguintes decisões:
• Selecionar os meios de cultura primários
apropriados para o tipo de amostra
particular;
• Determinar a temperatura e a
atmosfera de incubação para
isolar todos os microrganismos
potencialmente significativos;
Processamento dos Cultivos
• Determinar qual dos microrganismos
isolados em meios primários requer uma
maior caracterização;
• Determinar se são necessárias provas de
suscetibilidade a antibióticos, uma vez
conhecida a identidade do organismo;
Comum a todos é o reconhecimento das
dificuldades envolvidas na manutenção da
qualidade dos serviços, em vista das políticas de
redução de custos, cada vez mais rigorosas;
Seleção de Meios de
Cultura Primários
Meios não-seletivos – são isentos de inibidores
e permitem o crescimento de microrganismos
encontrados freqüentemente em laboratórios
clínicos;
Gardnerella vaginalis
Haemophilus influenzae
Ágar com 5% de Ágar com sangue Ágar com sangue de
cavalo ou de ovelha
sangue de carneiro
humano
Seleção de Meios de
Cultura Primários
Pode-se tornar o ágar sangue seletivo mediante
a adição de um ou mais antibióticos ou de
certas substâncias químicas;
Inibem gram-positivos
Colistina e o ácido
Canamicina e vancomicina
nalidíxico
Bacilos
gram-negativos
Inibe gram-negativos
e
anaeróbios
(bacteroides)
favorece
o crescimento
de
gram-positivos
Ágar-KV
sangue
ÁgarÁgar
McConkey
Ágar EMB
Seleção de Meios de
Cultura Primários
O caldo de enriquecimento é empregado para
isolar
microrganismos
patogênicos
de
amostras, como fezes, nas quais existe uma
elevada concentração de microrganismos
comensais;
Fase logaritmica
Escherichia coli e outros
comensais entéricos
Salmonella e Shigella
Fase de latência
Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas
Uma vez que a amostra tenha ultrapassado os
vários critérios para rejeição e tenha sido
aceita para cultivo, porções apropriadas da
mesma devem ser transferidas aos vários
meios de cultura descritos no item anterior.
Essa atividade também é usualmente realizada
luvas
em uma parte separada
de outras áreas do
laboratório,
conhecida
como
área
de
máscaras
“semeadura”;
jalecos
Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas
O equipamento necessário para a inoculação
primária de amostras é relativamente simples:
Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas
UFC
Espalhamento nos
quatro quadrantes
Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas
O meio nos tubos pode ser líquido, semi-sólido
(0,3 a 0,5% de ágar) ou sólido. O ágar semisólido é adequado para as provas de
motilidade;
Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas
Os microrganismos diferem quanto à
temperatura ótima de incubação. Porém, a
maioria dos microrganismos cresce a 35ºC;
assim, se o laboratório dispõe apenas de uma
estufa, esta deve estar ajustada para 35ºC;
O crescimento da maior parte dos
microrganismos é potencializado por uma
atmosfera de 5% a 10% de CO2;
Transferência e Cultivo
de Amostras Biológicas
Mais importante que o modo de incubação é a
prevenção de amplas flutuações na
temperatura. Deve-se cuidar para que os tubos
e placas fiquem protegidos de correntes de arcondicionado ou de fluxos de calor;
O controle da umidade no interior da estufa
também é importante. A maioria dos
microrganismos tem crescimento máximo
quando a umidade é de 70% ou superior;
Interpretação dos Cultivos
A identificação dos cultivos primários após 24
a 48 horas de incubação requer uma
considerável habilidade;
O microbiologista deve avaliar o crescimento
das colônias e decidir se são necessários
procedimentos adicionais;
Essa avaliação se faz:
Interpretação dos Cultivos
• Anotando as características e o número
relativo de cada tipo de colônia isolada em
meios de ágar;
• Determinando a pureza, reação à coloração
de Gram e morfologia das bactérias em cada
tipo de colônia;;
• Verificando mudanças no meio que circunda
as colônias, o que reflete atividades
metabólicas específicas de bactérias
isoladas;
Interpretação dos Cultivos
Características macroscópicas das colônias
OBRIGADO