Universidade de São Paulo
Instituto de Ciências Biomédicas
Depto. de Fisiologia e Biofísica
Doutorado em Fisiologia Humana
Análise de Canais para Na+
Ativados por Voltagem em Neurônios do
Gânglio da Raiz Dorsal
João Luis Carvalho de Souza – aluno de doutorado
Antônio Carlos Cassola – orientador
Setembro de 2006
São Paulo – Brasil
Potencial de ação
voltagem (mV)
+30 mV
0
Nav
-70
Kir/Twik
0
1
tempo (ms)
Kv
Kv
Kir/Twik
Superfamília de Canais
Ativados por Voltagem
Nomenclatura e Genealogia dos canais para Na+
Nav 1.1
Nav 1.1
Nav 1.2
Nav 1.2
Nav 1.3
Nav 1.3
Nav 1.7
Nav 1.4
Nav 1.4
Nav 1.5
Nav 1.6
Nav 1.6
Nav 1.5
Nav 1.7
Nav 1.8
Nav 1.8
Nav 1.9
Nav 1.9
75
80
85
90
95
100
% de identidade na seqüência de aminoácidos
Estrutura terciária de canais iônicos
6 TM
Kv
2 TM
Kcsa
Doyle et al, 1998
Filtro de seletividade
em solução
no filtro
Doyle et al, 1998
Estrutura terciária de canais iônicos ativados por voltagem
Kv1.2
MacKinnon et al, 2005
Ativação e inativação dos
canais para Na+
Kcsa
Farmacologia dos Nav
Farmacologia dos Nav
Bloqueio do poro
Farmacologia dos Nav
Alteram a dependência de voltagem por efeito alostérico
Sítios em segmentos transmembrana
batrachotoxin, ciguatoxin
Farmacologia dos Nav
Alteram a dependência de voltagem por estabilizar segmentos transmembrana
Sítios em alças extracelulares
a-scorpion toxins
b-scorpion toxins
sea-anemone
toxins
spider toxins
Farmacologia dos Nav
Anestésicos locais
Expressão de canais para Na+ ativados por
voltagem em células de mamíferos
Expressão de canais para Na+ em mamíferos
Neurônios
Células não neuronais
Canais para Na+ em gânglio da raiz dorsal (GRD)
Nav 1.1
Nav 1.2
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Nav 1.7
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Nav 1.5
Nav 1.8
Nav 1.9
75
80
85
90
% de identidade
95
100
TTX-S
TTX-R
Registro de correntes de Na+ ativadas por voltagem pela
técnica de “voltage clamp”
Im = Vm
fixa
x
Gm
Fixação de voltagem
“Voltage clamping” tradicional
Vm
i
Vc
célula
10mm
Fixação de voltagem
“Voltage clamping” / “Patch Clamping”
Rf
Vc
Rf
Cm
Ic
Ra
Cp
Icp
Ip
Im
Rm
Vc
Hamill et al, 1981
INa+ ativadas por voltagem
2
20
1
-110 mV
15
Vm (mV)
0
-80
-40
5 nA
40
5 ms
0
10
80
Vr
5
Vm (mV)
-1
-80
-60
-40
-20
20
40
60
80
100
-5
-2
-3
Y/Ymáx
0
Extracelular - banho
NaCl 50 mM
Cloreto de colina 82
CaCl2 1,8
CoCl2 1
KCl 4
Hepes 10
Glicose 5
pH 7,4 (NaOH)
Im (nA)
+80 mV
Vm-Vr
-10
GNav
-15
INav
-20
INav = (Vm-Vr) x GNav
Sol. Intracelular - pipeta
NaCl 10 mM
CsF 150
TEA 10
EGTA 9
Hepes 10
ATP 2
pH 7,4 (CsOH)
-25
ENa= +41,5 mV
Im


Gmax
 Vm  Vr   
 V  Vm
 1  exp 1 / 2
k






 

Neurônios do GRD expressam canais
para Na+ com diferentes propriedades
biofísicas
Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com
diferentes propriedades biofísicas
10
8
6
Ipico (nA)
RELAÇÃO I-V
4
2
-80
-60
-40
Vm (mV)
0
-20
20
40
60
-2
-4
-6
-8
-10
Im


Gmax
 Vm  Vr   
 V  Vm
 1  exp 1 / 2
k






 

Duas equações de Ohm-Boltzmann são necessárias para
se ajustar à relação IV
Im


Gmax 1
 Vm  Vr   

 V1 / 2 1  Vm
1

exp



k1


 
 
Gmax 2

 
 V 2  Vm
   1  exp 1 / 2
k2
 




 
 
 
Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com
diferentes propriedades biofísicas
8
8
Componente 1
Componente 2
6
6
soma
4
60
4
2
2
Vm (mV)
0
-90
-70
-50
-30
-80
-60
-40
-20
-10
0-2
-2
-4
10
30
20
40
50
Vm (mV)
60
40
30
20
10
-4
-6
-6
-8
-8
-10
-10
LV conductance
HV conductance
Gaussian fitting of data
50
number of cells
10
Ipico (nA)
10
INa - pico (nA)
RELAÇÃO I-V
0
n=200
-50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5
0
5 10 5
V1/2 classes (mV)
Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com
diferentes propriedades biofísicas
INATIVAÇÃO ESTACIONÁRIA
0 mV
-5 mV
-110 mV
-160 mV
-15000
Pico de corrente (pA)
0
2 nA
1 ms
-10000
dado
1 equação
-5000
Gm 
0
-180
-160
-140
-120
-100
-80
Vpré-pulso (mV)
-60
-40
-20
0
Gmax
 V  Vm 
1  exp 1 / 2

k


Duas equação de Boltzmann são necessárias para se ajustar à
curva de inativação estacionária
Gm 
Gmax 1
 V 1  Vm
1  exp 1 / 2
k1

Gmax 2

 V1 / 2 2  Vm 
1

exp



k2




Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com
diferentes propriedades biofísicas
INATIVAÇÃO ESTACIONÁRIA
total
-15000
Pico de corrente (pA)
componente 1
INa (pA)
-18000
-16000
-14000
-12000
-10000
-10000
-8000
dado
1 equação
2 equações
-5000
0
-6000
componente 2
-4000
-2000
Vprépulso (m V)
-180
-160
-140
-120
-100
-80
Vpré-pulso (mV)
-60
-40
-20
0
0
-180
-130
-80
-30
Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com
diferentes propriedades biofísicas
CINÉTICAS E ATIVAÇÃO E INATIVAÇÃO
dado
1 equação
0 mV
-110 mV
20 nS
0
5 ms
1 nA
1 ms
Im
Gm 
Vm  Vr
Gt   Gmax

 t
 1  exp 
 m

3
 
 t
    exp 
 
 
 th

 


Hodgkin and Huxley, 1952c
Duas equações do modelo de Hodgkin e Huxley são
necessários para se ajustar à
curva de ativação e inativação da condutância no tempo
3


  t 
 
Gt   Gmax 1  1  exp


  m1  


3


  t   
  t 
   Gmax 2  1  exp
 
  exp



  h1   
 m 2 



  t  

 
  exp

  h 2  

Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com
diferentes propriedades biofísicas
CINÉTICAS E ATIVAÇÃO E INATIVAÇÃO
1,2
dado
1 equação
2 equações
componente 1
20 nS
5 ms
fração de condutância
1
componente 2
total
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-5
5
15
tempo (ms)
25
35
Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com
diferentes propriedades biofísicas
CINÉTICA DE RECUPERAÇÃO DA INATIVAÇÃO
fração de corrente
recuperada da inativação
1,0
0 mV
0,8
-110 mV
0
0,6
1 nA
20 ms
0,4
 t
Yt   A  exp 
 
0,2

 C

0,0
0
20
40
60
80
intervalo entre pulsos (ms)
100
120
Duas exponenciais são necessárias para se ajustar à
cinética de recuperação da inativação das condutâncias
ativadas por voltagem
 t 
 t 
Yt   A1  exp    A2  exp 
 C
 1 
 2 
Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com
diferentes propriedades biofísicas
CINÉTICA DE RECUPERAÇÃO DA INATIVAÇÃO
CONTROLE
1,0
da
recuperada
fração
de corrente
fração
inativação
da inativação
recuperada
1,0
0,8
0,9
0,8
0,6
0,7
0,6
0,5
0,4
0,4
0,3
0,2
0,2
0,1
0,0
0,0
dado
1 equação
2 equações
EXP1
EXP2
SOMA
0
0
20
20
40
40
60
60
80
80
tempo
intervalo entre
pulsos (ms)
100
100
120
120
Conclusões
Neurônios do gânglio da raiz dorsal de ratos neonatos expressam populações
de canais para Na+ ativados por voltagem com diferentes propriedades
biofísicas.
Métodos biofísicos de análise são úteis em distingüir as duas populações de
canais.
Agradecimentos
Prof. Dr. Antônio Carlos Cassola
FIM
f(x)
5
4
3
2
1
-5
-4
-3
-2
-1
x
0
f(x) = mx + b
m= 1,3
0
b= -1,3
2
f(x) = 1,3x – 1,3
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Análise de Canais para Na+ Ativados por Voltagem em Neurônios