Clonagem Gênica
1-Introduçao
2-Estratégia geral de clonagem gênica
3-Clonagem gênica
4-Vetores de clonagem plasmidial
5-Isolamento de gene por PCR
Edmar Vaz de Andrade
1-Introduçao
Tecnologia do DNA recombinante (TDR): conjunto de
técnicas que permite o isolamento de fragmentos gênicos.
Vetor + fragmento de DNA
isolado
DNA recombinante
Multiplicação do DNA recombinante
em uma célula hospedeira
Isolamento e estudos para a caracterização do
fragmento de DNA purificado (gene isolado)
1-Introduçao
Tecnologia do DNA recombinante (TDR): conjunto de
técnicas que permite o isolamento de fragmentos gênicos.
Relevância: possibilita o isolamento e
multiplicação de genes in vitro para posterior
análise/caracterização
Duas importantes classes de enzimas:
Endonucleases de restrição (Tipo II)
DNA ligase
2-Estratégia geral de clonagem
gênica
1-isolamento de um fragmento de
DNA
2-Inserção em um vetor de escolha
(DNA recombinante ou quimera)
3-Transporte para o interior de uma
célula hospedeira (transformação)
4-Seleçao de células transformantes
(OGM)
5-Replicação da molécula de DNA
recombinante
6-Multiplicação de células, cada uma
contendo cópias do mesmo
plasmídio recombinante (clones)
3-Clonagem gênica
Clivagem
Extremidades coesivas
Clivagem do DNA pela enzima de restrição EcoRI
Extremidades Coesivas
3-Clonagem gênica
Fragmentos de DNA genômico
Isolamento de fragmento
gênico com enzimas de
restrição tipo II
Vetor de clonagem
Extremidades
complementares
Ligação de fragmentos
isolados a um vetor de
clonagem pela DNA ligase
DNA recombinante
Extremidades
incompatíveis (b e c)
não se ligam ao
vetor
4-Vetor de Clonagem Plasmidial
Região de Múltiplos Sítios
de Clonagem
Vetor Plasmidial de
Clonagem
Componentes básicos de vetor plasmidial de clonagem
4-Vetor de Clonagem Plasmidial
1-Origem de replicação em E.
coli (10 a 20 cópias do plasmídio
por célula)
2-Genes que conferem
resistência a antibióticos
3-Sítios únicos para diferentes
endonucleases de restrição
pBR322: plasmídio para clonagem
em Escherichia coli (1977)
5-Isolamento de gene por PCR
Amplificação do gene de phuA de
Chromobacterium violaceum
Rev (HInd III)
5’
3’
Gene de phuA
3’
DNA genômico
de C. violaceum
FW (BamH I)
PCR
3’-A
BamH I
Gene de phuA
Hind IIII
A-3’
Iniciadores específicos para
Chromobacterium violaceum ATCC12472
5’
5-Isolamento de gene por PCR
Clonagem do gene de phuA