Começando a decifrar...
O fenômeno de
restrição-modificação
Infecções com bacteriófagos em
diferentes cepas bacterianas
produziam o fenômeno de
restrição-modificação.
K
Cepa K
Cepa B
B
OK
OK
Arber, 1962
Nathans & Smith, 1962
Enzimas de restrição
Clivagem de restrição
Sítio de Restrição
Nomenclatura das
enzimas de restrição
EcoRI
BamHI
BglII
PvuII
HindIII
HinfI
Sau3A
AluI
TaqI
HaeIII
NotI
Escherichia coli
Bacillus amyloliquefaciens RH
Bacillus globigii
Proteus vulgaris
Haemophilus influenzae Rd
Haemophilus influenzae Rf
Staphylococcus aureus
Arthrobacter luteus
Thermus aquaticus
Haemophilus aegyptius
Nocardia otitidis-caviarum
Fracionamento de DNA
Mapa de Restrição
Utilização do Mapa
Detectar mutações
Comparação de Mapas
Fracionamento de DNA
Como reconhecer o
fragmento de interesse?
Complementariedade
Hibridação
Calor
ou
pH
= desnaturação
Reassociação
Temperatura e força iônica
Sonda
Marcação da sonda
Estringência
Reação de Hibridação e Lavagem:
• especificidade da sonda
• tamanho da sonda
• temperatura (T’m)
• força iônica
Especificidade : identidade de seqüência
Tamanho: fragmento/ oligonucleotídeo
Temperatura: T’m - 25oC
Força iônica: NaCl
Southern blot
Resultado
Hibridação in situ
Localização de mRNA de ciclina (uma
proteína que incita a célula a se dividir)
= azul escuro
Em azul claro os núcleos corados com
DAPI
Southern blot
Animação
O que fazer com o
fragmento?
Clonagem de DNA
A clonagem permite a
eternizar o fragmento
Um pedaço de DNA de um
eucarioto poderia ser
produzido por um procarioto.
Vetores de clonagem
O que deve ter uma molécula
para ser um veículo de
clonagem?
1. Replicação autônoma
2. Marcas de seleção
3. Sítio para clonagem
Sítio de clonagem
O sítio de restrição deve estar nas duas
moléculas a serem ligadas.
Após a clivagem, as extremidades são
recombinadas e a enzima LIGASE refaz
a ligação fosfodiester.
Plasmídio recombinante
Transformação
Hospedeiro: E.coli
fenótipo e genótipo
seleção,
contenção,
multiplicação
Hospedeira
transformada
Clonagem molecular
Outro vetor?
Bacteriófagos e, mais recentemente,
cosmídios são utilizados como vetores
de clonagem, principalmente quando
se deseja inserir um fragmento de DNA
com tamanho de ~40 kb.
YACs - fragmentos maiores ainda.
Biblioteca
Genômica
Genoteca
Varredura de
biblioteca
Seqüenciamento de
DNA
Princípios
Reação em cadeia de
polimerização
1. Replicação
PCR
2. Amplificação
PCR - ANIMAÇÃO
Um momento, por favor,
estou carregando o programa.