VI Congresso Brasileiro de Biossegurança
Simpósio Latino-Americano de Produtos Biotecnológicos
Rio de Janeiro, 21-25 setembro de 2009
Universidade do Estado do Rio de Janeiro - UERJ
Construções Mais Comuns de OGMs
- Aspectos de Biossegurança
More common GMOs constructions - Biosafety aspects
Adriana Sotero Martins
Fundação Oswaldo Cruz
Escola Nacional de Saúde Pública
• O que é a clonagem molecular
(definição)
• Quais os objetivos da Clonagem
Molecular
Expressões utilizadas com o mesmo significado
Clonagem molecular
Engenharia genética
Manipulação gênica
Clonagem Gênica
Tecnologia do DNA recombinante
Modificação Genética
Nova Genética
A clonagem molecular é o processo de construção de moléculas de
DNA recombinante e da sua propagação em hospedeiros
apropriados que possibilitam a seleção do DNA recombinante.
Esta tecnologia permite estudar os genes e os seus produtos, obter
organismos transgênicos e realizar a terapia gênica.
Fenômeno Comum na Natureza
Recombinação entre moléculas de DNA de diferentes origens
"Conversão Lisogênica" –
Ex. de engenharia genética na natureza
•
Fago λ inserie o seu genoma no cromossoma de Escherichia coli – MUDANDO
O SEU CONTEÚDO GENÉTICO E TORNANDO-SE PATOGÊNICA.
•
Bactéria Corynebacterium diphtheriae infectada pelo vírus β , produz a toxina,
após insersão do genoma viral no cromossoma bacteriano, responsável pelos
sinais e sintomas da difteria.
Fenômeno Comum na Natureza
Recombinação entre moléculas de DNA de diferentes origens
Ex.Bactéria Agrobacterium tumefaciens,
parasita de plantas, a inserção do
DNA exógeno provoca a formação do tumor
“COROA DE GALHA”
(a) Plasmídio Ti (indutor de tumor) – 200 kb
(b) Células lesadas da planta produzem
composto fenólico, que induzem os
genes de virulencia (vir), estes codificam
enzimas necessárias para introdução do
segmento de DNA T (23 kb) nas células
da planta.
O gene T codifica hormônio de crescimento
e opinas que é usada como fonte de
nutriente pela bactéria parasita.
Desenvolvimento da Clonagem Molecular
Objetivos Gerais da Clonagem Molecular (1)
Objetivos Gerais da Clonagem Molecular (2)
A clonagem molecular permite isolar e amplificar uma seqüência particular
de DNA a partir de uma mistura complexa de fragmentos, porque se
formam moléculas de DNA recombinante independentes do genoma do
hospedeiro, que replicam numerosas vezes no hospedeiro.
Moléculas Centrais da Clonagem Molecular
Os ácidos nucléicos são as moléculas centrais da clonagem molecular
•O DNA é utilizado como vetor de clonagem ou como inserto
• O cDNA, obtido a partir do mRNA, é utilizado como inserto
• DNA e RNA obtidos por clonagem molecular são utilizados como
sondas de hibridização na identificação, quantificação e caracterização
de outros ácidos nucléicos
Etapas da Clonagem Molecular
Especificação das Etapas de Clonagem Molecular
(A) Construção do DNA recombinante
- Preparação do DNA vetor de clonagem
- Preparação do DNA inserto (Diferentes Métodos de Produção)
- Ligação do DNA vetor e inserto
(B)Transformação
-Seleção do melhor sistema vetor/hospedeiro
- Introdução do DNA recombinante no hospedeiro
(C) Amplificação
- Seleção de clones recombinantes (transformados)
- Identificação dos clones recombinantes
- Manutenção em coleção
(D) Isolamento do DNA recombinante
- Purificação do DNA recombinante
A- Construção do DNA recombinante
1- Preparação do Vetor de Clonagem (Escolha do Mais Apropriado *)
Digestão com enzima(s) de restrição
Modificações das extremidades do DNA (preenchimento e remoção de
extremidades; adição de ligadores ou de adaptadores; adição de caudas de
homopolímeros, etc)
2- Produção dos Fragmentos de DNA inserto
Digestão com enzimas de restrição
Digestão parcial com DNase I
Quebra mecânica controlada
Síntese enzimática (cDNA, PCR)
Síntese química de oligodesoxirribonucleótidos
3- Ligação do DNA vetor e inserto
DNA ligase
Vetor – são veículos utilizados para introdução e manutenção de um DNA
exógeno em um hospedeiro.
Condições de um bom vetor:
•
•
•
•
Ter propriedades que facilite a sua ligação ao DNA clonado ex. sítios de multipla
clonagem
Ter propriedades para seleção de hospedeiros que contenham o DNA
recombinante
Possibilitar a expressão da mensagem exógena inserida no hospedeiro (se for o
caso também será vetor de expressão.
Propriedades que colaborem para não proliferação ambiental do DNA clonado.
Vetores de Clonagem (Escolha do Mais Apropriado *)
Vetores especializados em diversas funções
1)Vetores de expressão
Ori
Marcador de seleção
Promotor
Rib
Codon de iniciação da tradução
Pelo menos 1 sítio de restrição
2) Vetores de expressão-secreção
Antes do sítio de clonagem tem a sequencia do peptídio sinal
3) Vetores especialistas em clonagem de promotores
Contem um gene reporter sem promotor e na frente o sítio de clonagem
4) Vetores integrativos
Vetores bifuncionais
Com marcador genético para dois hospedeiros
Ori para apenas um hospedeiro, usados em S. cerevisiae para disrupção
gênicia
Fago λ
Conjuga a eficiência da infecção do fago com a vantagem
do DNA replicado como um plasmídeo e possuem
marcador de resistência a antibióticos.
sítios cos – promovem a
embalagem do fago
YACs: (Yeast Artificial Chromosome) –
cromossomo artificial de levedura –
Variação de um vetor de cópia única, que contêm:
- sequências centroméricas (CEN)
- sequências teloméricas
São replicados como moléculas lineares de DNA
cromossomal.
- Usado na caracterização de grandes segmentos genômicos
- fragmentos de 100 a 2000 kb
Métodos de Introdução de DNA no Hospedeiro
Construções de Bibliotecas de DNA recombinante
Métodos de seleção de clones recombinantes
Seleção Indireta
Seleção Direta
Métodos de identificação de clones recombinantes
•Análise de Padrão de Restrição
•Por Sequenciamento
• Por Hibridização de colônias
•Por Southern
•PCR
•Análise de Produtos Gênicos
•Por reconhecimento imunológico
Exemplo de Estratégia de Utilização
Uso de 2 plasmídeos para criar
planta recombinante
(a)Plamídeo 1 sem o gene DNA T,
mas com o gene vir, que controla a
transferência para o genoma da
planta do segmento contendo o gene
desejável presente no 2º. plasmídeo
(b)Plamídeo 2 com o gene de
interesse flanqueado por 25 pares
de bases de repetição do DNA T
Planta de tabaco tendo como inserto o
gene da luciferase do vaga-lume
expresso
Planta foi aguada com solução de
luciferina , substrato para a enzima
produtora de luz
Exemplo de DNA
recombinante inserido
no Genoma
Estudo de Via de
Endereçamento
Construção e expressão do gene quimérico ASP3-GFP.
(1)etapa de produção do cassete de fusão por PCR, in vitro.
(2)transformação com o cassete de fusão e recombinação homóloga, in
vivo.
(3)seleção da construção desejada.
(4)produto do gene quimérico, após transcrição e tradução.
Tese de Dissertação de Mestrado da aluna Meryellen Iannuzzi, 2005
Programa Multiinstitucional de Pós-graduação em Biotecnologia
da Universidade Federal do Amazonas
Adriana Sotero Martins
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