Genética molecular dos sistemas
eritrocitários: importância na prática
clínica
Lilian Castilho
Sistemas eritrocitários
. Constituídos por
antígenos de grupos
sanguíneos definidos
por aloanticorpos
RAPH
OK
Sistemas 29
Locus
34
ABO
KX
GE
SC
XG
YT
CR
(12)
MNS (43)
CH/RG
LW
CO
P
DO
RH (48)
DI (21)
>620
JK
FY
LE
www.bioc.aecom.yu.edu/bgmut/index.htm
GLOB
GIL
KN
Antígenos 239
Alelos
JMH
IN
H
Diversidade:
I
KELL (24)
LU (20)
Modelo de membrana: inserção dos antígenos de
grupos sanguíneos
GPA/GPB (MNSs)
GPC/GPD (Gerbich)
CD239 (Lutheran, B-CAM)
ICAM-4 (LW)
ERMAP (Sc)
CD44 (Indian)
CD99 (Xg)
CD147 (Ok)
CR1 (CD35; Knops)
NH 2
ABO
Hh
Lewis
I
P1
P
Pk
CD238 (Kell)
Band 3 (Diego)
Rh
Kx
AQP-1 (Colton)
Kidd
AQP-3 (GIL)
CD151 (Raph)
COOH
CD234 (Duffy)
NH 2
AChE (Yt)
Dombrock (ART4)
DAF (CD55, Cromer)
CD108 (JMH)
Emm
NH 2
Outside
COOH
Carbohydrate
NH 2
Type I
Singlepass
Type II
Singlepass
COOH
NH2
Multipass
COOH
GPIlinked
Reid, 2004
Antígenos de grupos sanguíneos:
produtos de genes
• 28/29 genes identificados
• polimorfismos de GS definidos ao nível genético
• antígenos carreados em proteínas são codificados diretamente
pelos genes
• antígenos carbohidratos estão sob o controle de genes que
codificam glicosiltransferases
• análise molecular dos genes de GS pode ser útil na clínica
• entendimento das bases moleculares de GS permite explorar a
função da proteína
www.bioc.aecom.yu.edu/bgmut/index.htm
Antígenos de grupos sanguineos estão localizados em
moléculas funcionais
Carboidratos
Enzimas
Transporte e canais
P
ABO
Lewis
GLOB
H
I
LW
Xg
Duffy
Lutheran
Indian
Raph
Moléculas de adesão
JMH
Oka
Glicoproteinas de
estrutura ou função
desconhecida
Regulação de
complemento
Mecanismos moleculares que levam à diversidade
dos antígenos de grupos sanguíneos
SNPs (single nucleotide
polymorphisms) : maioria
• Inserção:
•
Transcrição: GATA
• Duplicação
•
Deleção
•
Gene, Exon, Nucleotídeo (s):
ABO, MNS, Rh, Kell, Duffy,
Dombrock, etc
Nucleotídeo (s) : Rh, Colton
Exon: Gerbich
• Splicing alternativo: S-s• Conversão gênica ou
recombinação
MNS, Rh, Ch/Rg
SNPs (mutações de ponto missenses)
AAGTCAGCTGGACTTCGAAGATGTATGGAATTCTTCCTATGGTGTGAATGATTCCTTCCCA
GATGGAGACTATGATCCAACCTGGAAGCAGCTGCCCCCTGCCACTCCTGTAACCTG
(FY B) A (Asp)
(FY A) G (Gly)
•
RH: C/c; E/e
• Duffy: Fya/Fyb
•
MNS: S/s
• Kidd: Jka/Jkb
•
Kell: K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb
• Lutheran: Lua/Lub
•
Diego: Dia/Dib
• Dombrock: Doa/Dob
Transcrição
Mutações no gen promotor que afetam a
expressão do antígeno na hemácia
GATA box
TATC
FY A/FY B
1
2
FY Normal
2
FY Mutado*
FY B
TACC
1
* Fenótipo Fy(a-b-)
Rearranjos gênicos
Rhesus
box
Rhesus
box
RHD
SMP1
RHCE
RHCE
2
3
4
5
6
7
8 9 10
SMP1
1
RHD
DANIELS, 2002
Métodos de análise de DNA
• Amplificação do DNA por PCR
– PCR-RFLP
– PCR-alelo-especifico
– PCR-multiplex
• Amplificação (PCR) + sonda-especifica
(probe)-Real time PCR
– TaqMan
– Molecular beacons
• Microarray – chips
PCR-RFLP (Polimorfismo Duffy)
TCCCCCTCAACTGAGAACTCAAGTCAGCTGGACTTCGAAGATGTATG
GAATTCTTCCTATGGTGTGAATGATTCCTTCCCAGATGGAGACTATGA
TCC AACCTGGAAGCAGCTGCCCCCTGCCACTCCTGTAACCTG
(FY B) GATCC (ausência de sítio Ban I)
G
(FY A) GGTCC (sítio Ban I)
CTGGATGACTCTGCACTGCCCTTCTTCATCCTCACCAGTGTCCTGGG
TATCCTAGCTAGCAGCACTGTCCTCTTCATGCTTTTCAGACCTCTCTT
CCGCTGGCAGCTCTGCCCTGGCTGGCCTGTCCTGGCACAGCTGGCT
GTGGGCAGTGCCCTCTTCAGCATTGT GGTCC CGTCTTGGCCCC
AGGGCTAGGTAGCACTCGCAGCTCTGCCCTGTGTAGCCTGGGCTAC
TGTGTCTGGTATGGCTCAGCCTT
RFLP para genotipagem Duffy
306pb
100 bp
FY B
86pb
400pb
300pb
FY A
96pb
210pb
Ban I
novo sítio
86pb
392 pb
306pb
200pb
210pb
100pb
96pb
86pb
Ban I
sítio comum
PCR Alelo-Especifico (AS-PCR): Ss
B
s+
5
s+
4
s+
S+
3
s-
S+
2
s-
S-
1
100 pb
S+
s-específico
S+
100 pb
S-específico
1
2
3
4
5
B
CI
205pb
RHD/RHCc
RHD y
RHDcc
100bp
PCR Multiplex: RHCE Cc e RHDy
RHD I4
RHC
RHDy
RHc
RHDEx7
Real Time PCR
DNA fetal no
Plasma materno
Microarray – Tecnologia Chip
4000 ENCODED BEADS
Oligo 1
Oligo 2
Oligo 3
0.3 mm
Microarray – Tecnologia Chip
MULTIPLEXED ANALYSIS OF POLYMORPHISMS
ASSAY IMAGE
X
G
G
T
C
G
A
C
C
A
G
C
T
G
C
FY A
Mismatch
C
A T
G C
A T
G C
A T
G C
T A
C G
G C
A T
C G
C
FY B
Match
SIGNAL INTENSITY
ON-CHIP ELONGATION
PAIRS OF GENETIC MARKERS
Microarray – Tecnologia Chip
Aquisição da imagem automática
DECODING IMAGE
ASSAY IMAGE
Microarray – Tecnologia Chip
HEA-18
GENÓTIPO:
FY, Fy-265 , GATA
Do-624, -793, -323, -350.-378
K
JK
GPB
GPA
AB, AA, AA
AA
BB
AB
BB
AB
LW, Co, Sc & Di
Lu
AA
AB
Fontes de DNA que podem ser
utilizadas para genotipagem
• Sangue (Leucócitos)
• Células do epitélio bucal
• Urina (células no sedimento urinário)
• Líquido amniótico (amniócitos)
• DNA fetal em plasma materno
Genética molecular dos sistemas
eritrocitários: aplicações
Em doadores
• Seleção limitada de anti-soros
 Genotipagem em larga escala para identificação de
antígenos comuns e raros (Programa de hemácias
fenotipadas)
 Produção de painéis complementares
 Zigozidade D, Fya, Fyb : controle de qualidade de
reagentes
 Determinação dos tipos de D fraco e D parcial
 Identificação de novos alelos
Genética molecular dos sistemas
eritrocitários: aplicações
Em pacientes
– Resolução de casos clínicos em situações que os testes de hemaglutinação não
fornecem resultados seguros (pacientes recém-transfundidos, pacientes portadores
de AHAI aloimunizados)
– Resolução de discrepâncias ABO e Rh
– Determinação de microquimerismo após transplante de stem cell alogênico
– Identificação de fenótipos fracos e deprimidos (D fraco, e fraco)
– Investigação e confirmação de fenótipos raros (DI, DO, SC, CO)
– Identificação de variantes raras (D parcial + e parcial)
– Identificação de novos alelos
Genética molecular dos sistemas
eritrocitários: aplicações
Medicina materno-fetal
• Zigozidade do gene RHD paterno
• Genotipagem RHD fetal
– DNA de amniócitos
– DNA de origem fetal na circulação materna
(usar DNA de plasma materno)
Genotipagem eritrocitária na prática clínica
Caso clínico 1:
 Paciente politransfundido aloimunizado com anti-E e provável
anti-Jkb e história de transfusão recente
 Fenotipagem: R2r, K-k+, Fy(a+b-), Jk(a-b+)
 Teste complementar: genotipagem RH, KEL, FY e JK
Genotipagem eritrocitária na prática clínica
Caso clínico 1:
K2K2
100 pb
RH ee
100 pb
RHDcc
100pb
 Genotipagem:RHD+ RHCE cc ee, K2K2, FY A/FY A, JK A/JK A
 Componente selecionado para a transfusão:
Fenótipo deduzido do genótipo: R0r, K-, Fy(b-), Jk(b-)
Genotipagem eritrocitária na prática clínica
Caso clínico 2:
 Paciente politransfundido com TDA positivo (4+) eluato e soro positivos
4+ com todas as células, história de transfusão recente e evidência
clínica de diminuição da sobrevida de hemácias transfundidas
– Fenotipagem do paciente: ?
– Genotipagem do paciente:
RHD-, RHCE cc ee, K2K2, FY A/FY B, JK A/JK B, Ms/Ns
– Análise sorológica complementar
adsorções alogênicas com hemácias rr, K-, S- para retirada do autoac
– Conclusão: Aloanticorpos detectados:anti-E, -K
 Componente selecionado para a transfusão: Fenótipo rr, K-, S-
Genotipagem eritrocitária na prática clínica
Caso clínico 3:
 Paciente falciforme aloimunizado com anti-E, anti-K e anti-Jka
recebendo sangue fenótipo compatível
 Fenotipagem do paciente: R0r, K-k+, Fy(a-b-), Jk(a-b+)
 Genotipagem do paciente: RHD+, RHCE cc ee , K2K2, FY B/FY B
(Gata mutado), JK B/JK B
 Conclusão: Paciente pode receber sangue Fy(b+)
 Componente selecionado para a transfusão:
Fenótipo R0r, K-, Fy(a-b+), Jk(a-)
Genotipagem eritrocitária na prática clínica
Caso clínico 4:
 Paciente sexo feminino, 27 anos, história de 1 transfusão
anterior, nenhuma gestação ou aborto
 Aloimunizada com anti-D
 Fenotipagem da paciente: D Fenotipagem do doador da hemácia transfundida: D-
Genotipagem eritrocitária na prática clínica
Ctl
RHDF1
100pb
RHD-
RHD+
50pb
RHD-
RHD+
Caso clínico 4:
245pb (RH D)
160pb (RH CE)
(RH CE) 236pb
(RH D) 115pb
Intron 4
Exon 10
 Genotipagem da paciente:
Exon 6
RHD-
Genotipagem do doador: D fraco tipo 1
Genotipagem eritrocitária na prática clínica
Caso clínico 5:
 Paciente falciforme aloimunizado com anti-D e anti-K
 Fenotipagem do paciente: R0r (D fraco), K-k+
K2K2
100 pb
RH ee
100 pb
RHDcc
100bp
 Genotipagem do paciente: RHD+, RHCE cc ee , K2K2
Genotipagem eritrocitária na prática clínica
Caso clínico 5:
PCR
DAR
DAR
 Genotipagem complementar: D parcial DAR
262pb
234pb
45pb
 Componente selecionado para a transfusão: Fenótipo rr, K-
Aspectos práticos
•
D fracos tipos 1> 4> 3> 2 mais frequentes
•
Anti-D IgM: pacientes; anti-D IgG:doadores
•
Reatividades < 1+ com anti-D IgG na AGH podem indicar a presença de DAR, DVI, DHMi
Genotipagem eritrocitária na prática clínica
Caso clínico 6:
 Paciente falciforme aloimunizado com anti-e like, anti-E e provável
anti-D
 Fenotipagem do paciente: B, D+C+E-c+e+
 Sangue selecionado para a transfusão: R2R2 e rr (incompatível)
 Genotipagem do paciente: RHD+, RHCE cc ee ,
 Genotipagem complementar (e-parcial): ces (hrB-)
 Genotipagem complementar (D-parcial): DIIIa
 Componente selecionado para a transfusão: Fenótipo hrB-, D-
Aspectos práticos
Pacientes descendentes de Africanos com variantes do gene
RHCE (ceMO, ceEK, ceAR, ceBI) podem desenvolver anti-elike, incluindo anti-hrB, anti-hrs
Estes pacientes podem também desenvolver anti-D (DIIIa,
DAR)
RHD parcial
RhCe
RHD
e parcial
e-parcial: -hrB/-hrs
RHD parcial
e parcial
Anti-D+e-like(-hrB/-hrs)
Anti-D
Aspectos práticos
DIIIa e DAR em pacientes com anemia falciforme
Pacientes
Normal D
130
122
%
94
DIIIa
2
1,5
DAR
DIIIa/DAR
4
2
3,1
1,5
3 pacientes desenvolveram anti-D (1 DAR e 2 DIIIa/ DAR)
Castilho et al, 2004
Genotipagem eritrocitária na prática clínica
Caso clínico 7:
 Paciente falciforme aloimunizado com anti-C e anti-K
 Fenotipagem do paciente: R2R2, K-k+
 Genotipagem do paciente: RHD+, RHCE cc Ee , K2K2
 Genotipagem complementar: VS+, Cys16
 Conclusão: e+f (variante): paciente R2r
 Componente selecionado para a transfusão:Fenótipo R2r K-
Aspectos práticos
Cys16 e VS associados ao alelo Rhce em pacientes falciformes
Haplótipos
16Cys
*R2r (2)
Ror (56)
r r (2)
2
16Trp
VS+
VS-
0
2
0
56
0
0
2
50
0
6
2
* Anti-soros monoclonais


anti-e (MS63)
anti-e (MS16, MS21)
Rodrigues & Castilho, Vox Sang.2002
Genotipagem eritrocitária na prática clínica
Caso clínico 8:
 Paciente talassêmico aloimunizado com anti-c, anti-K, anti-Jka e outro
aloac? Recebendo sangue fenótipo compatível
 Fenotipagem do paciente: R0r, K-k+, Fy(a+b-), Jk(a-b+), M+N+S+s+
 Genotipagem do paciente:
RHD+ RHCE cc ee, K2K2, FY A/FY A, JK B/JK B, MS/Ns
Genotipagem eritrocitária na prática clínica
Caso clínico 8:
 Análise molecular complementar:
DO A/DO A
 Análise sorológica complementar
DOA/A DOB/B DOA/A
adsorção com hemácias R0r, K-, Fy(b-), Jk(a-), Do(b+) /eluição): anti-Dob
 Conclusão: Paciente portador de anti-c, -K, -Jka, Dob
 Componente selecionado para a transfusão: Fenótipo R0r, K-, Fy(b-), Jk(a-), Do(b-)
Aspectos práticos
Genotipagem Dombrock
IMPORTÂNCIA CLÍNICA
• Identificação de anticorpos anti-Do
• Possibilidade
de
genotipar
os
doadores
selecionar hemácias antígeno-negativas
• Maior aproveitamento transfusional
e
Genotipagem eritrocitária na prática clínica
Caso clínico 9:
 Gestante aloimunizada (200 semana)
 Anticorpo identificado: Anti-D (título: 512)
 Fenótipo da paciente: rr
 Teste complementar: Zigozidade paterna, genotipagem fetal
através do plasma materno
Genotipagem eritrocitária na prática clínica
Ctl+
RHD-
Ctl+
Genotipagem RHD fetal
RHD-
RHD+/D-
PCR
Zigozidade paterna
3100pb
1888pb
744pb
564pb
397pb
I4
 Gestação não monitorada
Ex10
Genotipagem eritrocitária na prática clínica
Caso clínico 10:
 Gestante aloimunizada (120 semana)
 Anticorpo identificado: Anti-D (título: 512)
 Fenótipo da paciente: rr
Genotipagem eritrocitária na prática clínica
3100pb
1888pb
744pb
397pb
 Gestação sistematicamente monitorada
RHD+
RHD-
RHD+
Genotipagem RHD fetal
RHD-
RHD+/D+
PCR
Zigozidade paterna
Situações em que genótipo e fenótipo
podem não corresponder
• Transfusões crônicas/maciças
• Alteração no gene afetando: transcrição (Fyb-); splicing
(S-s-); introdução de stop codon (Fy(a-b-), Rhnull), ou
mutação que afeta a estabilidade da proteina na
membrana da célula (Fyx)
• Crossing overs e outros rearranjos gênicos (RHD/RHCE)
• Alteração em outro gene que está associado com a
expressão do gene : RHAG Rhnull
Implementação da genotipagem para
uso clínico
• Amostras de sangue fenotipadas devem ser analisadas por
PCR em estudo cego para avaliação do método
• O número de amostras usadas na validação de um teste
deve incluir o máximo de variantes genéticas presentes na
população para a qual o teste vai ser utilizado
• População Europeia Vs População Brasileira
• Revalidação do teste com novas variantes
• Participação em testes de proficiência
Genética molecular dos sistemas eritrocitários na
população brasileira
•
Melhoria da qualidade e exatidão dos resultados
imunohematológicos
•
Determinação de novas variantes alélicas não descritas em
outras populações (DIA/166A, FY145, Rhnull)
•
Identificação de variantes alélicas de origem Africana
(GATA, RHD, RHD-CE-Ds, VS, DIIIa, DAR)
•
Elaboração de protocolos de genotipagem eficientes
Genética molecular dos sistemas eritrocitários
Genotipagem de grupos sanguíneos na clínica requer:
– Conhecimento em grupos sanguíneos
– Experiência na interpretação das reações de PCR utilizadas
– Obtenção dos achados sorológicos e da história clínica do paciente
antes de interpretar os resultados da genotipagem
– Conhecimento dos genes que codificam os antígenos de GS e suas
formas variantes (fenótipos e genótipos podem não correlacionar)
na população estudada
Genética molecular dos sistemas eritrocitários
• A genotipagem de grupos sanguíneos é uma ferramenta útil
na medicina transfusional e apresenta gradualmente um
número crescente de aplicações. Torna-se poderosa
quando associada a hemalutinação
• Os métodos moleculares permitem obter um melhor
conhecimento da distribuição dos grupos sanguíneos e
suas bases moleculares na população brasileira
• Achados moleculares na população brasileira ajudam a
desenvolver protocolos mais seguros para genotipagem de
grupos sanguíneos em nossos laboratórios
Genética molecular dos sistemas eritrocitários