Sistema Rh
Lilian Castilho, PhD
Simpósio Hemopasso
Passo Fundo, 24 a 26/03/2008
Sistema Rh
 Sistema complexo




49 antígenos
muitos fenótipos
no mínimo 200 alelos
um fenótipo pode gerar vários genótipos
 Principais antígenos
D; C/c; E/e
8 haplótipos: Dce(R1),Ce(r’), DcE(R2), cE(r”),
Dce(R0), ce(r), DCE(RZ), CE(ry)
Sistema Rh:Terminologia




Rh não Rhesus
Sistema ISBT: 004
Símbolo ISBT: RH
Fenótipo: D+C+E-c+e+
RH:1,2-3,4,5
Dce/ce ou Dce/dce=R1r
 Provável genótipo: DCE/ce, RH*1,2,5/RH*4,5
ou R1r
Questões frequentemente realizadas
1. Por que RhD é tão imunogênico?
Principal causa da DHFR
40-75% dos D- tornam-se aloimunizados quando expostos a hemácias D+
2. Por que o sistema Rh é tão complexo?
- Número elevado de antígenos
D, C/c, E/e (comuns)
~outros 40
Variantes
- Diferenças na expressão de D
D positivo ou D negativo?
- D fraco
- D parcial
3. Por que grupos étnicos Africanos/ Hispânicos desenvolvem anticorpos RhD
complicados?
Anti-D em D+, D fraco
Locus RH
Duplicação de 2 Genes
RHCE
RHD
“Rh positivo”
ce, Ce, cE, or CE
antígeno D
“Rh negativo”
antígenos CcEe
X Deletado X
ce
Europeus- 15-17%
C/c
RhD
E/e
RhCE
Circulos- representam 32-35 diferentes amino acidos entre RhD e RhCE
1. Esta diferença explica por que RhD é tão imunogênico
Maioria dos antígenos de grupos sanguíneos diferem em um (ou poucos) aa
2. Por que o sistema Rh é tão complexo ?
RHCE
RHD
5’
3’
antígeno D
3’
ce, Ce, cE, or CE
5’
antígenos CcEe
Durante a replicação cromossômica
3’
3
- Localização no cromossomo- genes muito próximos
- Orientação – final 3’ face a face um com outro
5’
5’
RHD
RHCE
formação de hair-pins
trocas ocorrem
- um atua como template para a porção do outro
“Conversão gênica”
Principal causa para a diversidade RH
Diferenças na expressão de RhD
D-negativo - 15-17% Europeus- devido a deleção RHD
3-7% Africanos, 0.5-1% Asiáticos – devido a mutações RHD
D-positivo – Maioria tem o gene RHD – MAS HÁ EXCEÇÕES
D Fraco – requer teste indireto da antiglobulina para detecção
trocas de único amino ácido (transmembrana)
diminuição na QUANTIDADE DE RhD
53 “tipos de D fracos” diferentes
Del - expressão muito fraca de D- não detectável por sorologia
adsorve e elui anti-D
mais comum em populações Asiáticas
D Parcial –epítopos de D alterados
tipam como D+ mas desenvolvem anti-D
Causas – Troca de único amino ácido na superfície da hemácia
- Parte do gene RHD substituído pelo RHCE
Problemas devido a D Fraco e Del
RhD
Fraco
V270G
Tipo 1
1. Alguns são difíceis de detectar com reagentes sorológicos
Discrepâncias na tipagem: D- com um reagente; D+ com outro
Se unidades de sangue de doador são rotuladas como D- podem
estimular anti-D em receptores DExemplos: D Fraco tipo 2
D Fraco com RHCe em trans
Del- nenhum reagente detecta
2. Alguns pacientes desenvolvem anti-D
Preconizado- maioria dos pacientes com D fraco não desenvovem anti-D
- altera quantidade da proteína, mas não os epítopos D da supefície
- Não é regra para todos os tipos de D fracos – difícil de pré determinar
Proteína D Fraco
 RhD: 10.000 a 25.000 sítios/hemácias
 D Fraco: densidade antigênica varia de acordo com o
tipo de D fraco: 66 a 5.000 sítios/hemácia
2500
tipo 4
1500
tipo 3
1000
tipo 1
500
tipo 2
300
tipo 5
Cut off sorológico=
500 ags/hemácias
D fraco tipo 5: geralmente tipados como RhD-negativo
Proteína Del
RhD: 10.000 a 25.000 sítios/hemácias
Del: densidade antigênica: < 50
sítios/hemácia
Cut off sorológico=500 ags/hemácias
Del: geralmente tipados como RhD-negativo
DEL encontrado nos raros Asiáticos RhD-negativos e são C+ ou E+
Problemas com D Parcial
Hemácias D Parcial tipam como D+ e não são identificadas
até que o paciente desenvolva anti-D
possuem epítopos de D alterados
NH2
-
Devido a mutações localizadas na região extracelular
DMH- L54P
DVII- L110P
-
DFW- H166P
DHR- R229K
DHMi- T283I
DNU-G353R
DII- A354D
DNB- G355S
Devido a proteínas RhD/RhCE híbridas
DIII
DIV
DV
DVI DBT DAR
DOL DAU etc.
Proteína D Parcial
RhD: 10.000 a 25.000 sítios/hemácias
D parcial: densidade antigênica: 500 a 25.000
sítios/hemácia
D Cat VI e DAR: podem ser tipados como RhD-negativo
Tipagem RhD: positivo ou negativo?
Pacientes
Anti-D#1
(IgM)
Anti-D#2
(IgM)
Resultado
Transfusão
POS
POS
RhD+
RhD+
NEG
NEG
RhD-
RhD-
POS
NEG
DF/DP?
RhD-*
NEG
POS
DF?DP?
RhD-*
* até resolver a discrepância: painel de monoclonais ou genotipagem
Tipagem RhD: positivo ou negativo?
Doadores
Anti-D#1
(IgG/AGH)
Resultado
Transfundir
para
pacientes
RhD+
RhD+
NEG
RhD-
RhD-*
POS Fraco
DF/DP?
RhD-**
POS
Voce sabe
qual é sua
unidade
RhDnegativo?
* genotipagem?
** até resolver a discrepância: genotipagem
D Fraco ou D parcial?
D Fraco ou D parcial?
 Identificação em gel
 Painel com 12 soros monoclonais (DII, DNU, DIII, DIV, DV, DVI, DVII, DFR, DBT,
DHAR, DAR, DCS, DOL, DHK/DAU-4, Weak D 5,7, Weak D type 38)
D Fraco ou D neg?
D Fraco
D-neg, D fraco ou Del ?
–
D conf.
D-neg, D fraco ou Del ?
–
 D Fraco tipo 38
D-neg, D Fraco ou Del ?
DEL RHD(M295I)
D Fraco
IgM
DVI
DF4
PAP
DF1
IgG
Problemas nos testes
sorológicos
 Testes sorológicos não distinguem D fraco
de D parcial com fraca expressão
 Testes sorológicos não detectam alguns D
fracos, Del e D parcial
Testes sorológicos associados a testes
moleculares auxiliam na identificação de
variantes do antígeno D
D Fraco e D parcial
 Imunizam receptores D-negativos
 Desenvolvem anti-D
Casos enviados ao nosso laboratório para
genotipagem RHD (2007)
Tubo
Gel
Variações de D
IgM
Poli
DVI+
DVI-
Dconf.
DF1
0/(+)
0/1+
0/2+
0/1+
1+/3+
DF2
0
0
0/2+
0
DF3
0/2+
0/1+
2+
2+
4+
DF4
0/2+
0/2+
(+)/3+
1+/3+
4+
DVI
0/1+
0/1+
0/2+
0
1+/4+
DF1+DF2
0/3+
02+
(+)/2+
(+)/2+
3+
DF1+DF4
0/2+
0/1+
(+)/4+
(+)/4+
DF1+DF2+DF3
3+
2+
2+
3+
2+/3+
4+
Reagentes anti-D na detecção de D fraco e D parcial
Amostras
Tipos de D fraco e
D parcial
Graus de aglutinação
Anti- D mono
(gel)
Anti-D conf
(gel)
Densidades
antigênicas
9
DF1
2+
3+
1273
4
DF2
0
1+
462
1
DF3
1+
3+
1936
13
DF4
2+
4+
2184
2
DAR
0
1+
988
1
DHMi
0
1+
1112
3
DVI
(+)
1+
1050
2
DF1/DHMi
(+)
2+
1577
1
DF4/DAR
(+)
2+
1432
Genotipagem RHD em doadores de sangue
 Indicações:
 Discriminar D neg de DEL e D pos
 Discriminar D parcial e D Fraco
 Limitações
 Custo
 Tempo
 Imunogenicidade de DEL?
 Quem deveria ser testado?
 Doadores de primeira vez
 Doadores de repetição (discrepâncias)
Esta unidade
é RH
compatível?
Aplicações clínicas
Genotipagem RH
Pacientes com fenótipos D fraco
D fracos mais frequentes devem ser transfundidos com
hemácias RhD pos (3 a 6% das unidades RhD-neg são
preservadas)
Doadores de sangue
Triagem para DEL e D fraco entre doadores sorológicamente
D neg (prevenção da aloimunização)
Recomendações clínicas para pacientes com o
fenótipo D fraco
Fenótipo D fraco
D fraco tipo 1
D fraco tipo 2
D fraco tipo 3
D fraco tipo 4.0
D fraco tipo 4.1
D fraco tipo 4.2
D fraco tipo 5
D fraco tipo 11
D fraco tipo 15
Outros tipos
Transfusão
RhD-positivo
RhD-positivo
RhD-positivo
RhD-positivo
RhD-positivo
RhD-negativo
RhD-negativo
RhD-negativo
RhD-negativo
RhD-negativo
Caso Clínico
Paciente Afro brasileira, sexo feminino, 36 anos
com sangramento vaginal
Solicitado 2 unidades de sangue
2 gestações
Tipada como O RhD+
Anti-D fraco detectado no soro
Sem história de profilaxia Rh (óbvio!)
Caso Clínico
Soro testado com painel de 6 monoclonais
para detectar D parcial
Anti-D
DIII
DIV
DV
DVI
DVII
DAR
DFR
Paciente
1
+
+
+/-
-
+
+
+
3+
2
+
-
+
+
+
+
+
3+
3
+
+/-
+/-
-
+
-
-
3+
4
+
+
+
-
+
+
+
3+
5
+
-
+/-
-
+
-
+
3+
6
+
-
+
+
+
+
+
3+
Caso Clínico
Suspeitas:
D Normal – mas por que o anticorpo?
DIII?
DVII?
Outro D parcial?
Análise Molecular – screening rotina mostou
RHD normal
Nenhum gene híbrido presente
Análise do DNA
PCR-SSP para DVII: negativo
PCR-RFLP para DIIIa: positivo
DIIIa!
Paciente possuía o fenótipo D parcial
Anti-D era um aloanticorpo
Paciente ficou muito brava porque seu tipo de
sangue estava errado!
Caso Clínico
Paciente Caucasóide, sexo masculino, suspeita
de AHAI
PAI positiva, Auto e TDA positivos
Anti-D detectado no soro e eluato
Paciente tipado como D+
Anti-D: auto ou alo?
Genotipagem!!!!
Caso Clínico
Análise molecular de rotina demonstrou um
gene RHD normal
Nenhum gene híbrido presente, não era DIII e
nem DVII
Sequenciamento do gene RHD: normal
Conclusão: auto-anti-D
Caso Clínico
Doador com 9 doações prévias
Fenotipado como O RhD-neg em todas as doações
Na 100 doação: Suspeita de D Fraco ou Del?
Genotipagem!!!!
Caso Clínico
Análise molecular demonstrou um gene RHD
deletado
Nenhum D fraco, DEL e D parcial detectado
Conclusão: Doador RhD-negativo
Problemas para resolver variantes RHD
Muitas regiões do gene devem ser analisadas
Geralmente requer sequenciamento do gene inteiro
Necessidade de genotipagem por microarray
Conhecimento das mudanças no gene que alteram
os epítopos da proteína = clinicamente significantes
Variantes RHCE
Problemas na fenotipagem do antígeno C
Em Africanos, Hispânicos, e grupos étnicos mistos
com um gene híbrido D-CE-D específico
RHD
RHCE
ces
W16C
15 % D/Ce/D híbrido: D-negativo
L245V
Variante ce
C-positivo
Fenótipo C positivo; desenvolve anti-C
Gene híbrido D-CE-D associado a variante e; desenvolve anti-e
Este haplótipo RH é frequente em pacientes falciformes
aproximadamente 22% Africanos
Variantes RHCE
Problemas na fenotipagem do antígeno e
Em Africanos, Hispânicos, e grupos étnicos mistos
ce “convencional”
Muitos genes diferentes, todos com expressão alterada do antígeno e
ces
W16C
L245V
G336C
ceMO
W16C
V223F
ceEK
W16C
W16C
M238V R263G M267K
M238V L245V R263G M267K I306V
ceAR
ceBI
W16C
M238V A273V
L378V
Fenótipo e-positivo
Desenvolvem anti-e e/ou anti-ce
Frequentes em pacientes falciformes
Antígenos do Sistema Rh
 Antígenos Rh (D, C/c, E/e) são resistentes ao
tratamento por enzimas, DTT, cloroquina
Anticorpos do Sistema Rh
Alo-anticorpos
anti-D, -E, -c, -C, -e
IgM ou IgG
reativos a 37oC, AGH, enzimas
clinicamente significantes
Auto-anticorpos
frequentes (anti-e)
Anticorpos do Sistema Rh
Alo-anticorpos
anti-C associado a anti-G
Anti-C associado a anti-e
anti-E associado a anti-c
anti-e detectado em hemácias e-positivas
Tipagem RhD: positivo ou negativo?
Perspectivas
Genótipo
Fenótipo
+
aglutinação
DNA
Obrigado pela atenção!