International Journal of Experimental Pathology, 91, 144–154 A próstata é o órgão mais afetado por lesões malignas nos homens, e o câncer de próstata é a segunda causa mais comum de morte diagnosticada em homens de vários países. No caso do epitélio acinar secretor da próstata pelo menos seis tipos celulares com características fenotípicas e biológicas distintas são encontrados: células-tronco células basais células de amplificação transitória ou “transit-amplifying cells” (TAC) células intermediárias células luminais secretoras células neuroendócrinas O andrógeno é provavelmente o principal fator trófico para o epitélio acinar prostático, sendo indispensável para a proliferação e diferenciação celular. Portanto, sua ação é decisiva tanto para a indução da diferenciação epitelial durante o desenvolvimento embrionário como para a maturação pósnatal e manutenção da atividade secretora e do padrão normal de diferenciação Diabetes tipo 1 prejudica a biosíntese de androgenos pelas células de Leydig e reduz a captação e retenção de andrógenos na próstata, promovendo regressão da glândula. Remodelação estromal Diminuição do perfil acinar Alterações significativas no epitélio acinar Atrofia Grupos de Animais e tratamento ratos machos Wistar adultos, com 3 meses de idade (400-500g) A indução do diabetes foi realizada após 24 horas de jejum alimentar pela administração endovenosa (veia peniana) de 0,1ml de solução fisiológica contendo 40 mg/kg de peso corporal de aloxana os animais foram alimentados normalmente e a glicemia foi testada diariamente Foram utilizados apenas os ratos que apresentaram diabetes grave, com glicemia de jejum acima de 250mg/dl em todas as medições, perda de peso corporal e aumento do débito urinário ratos diabéticos foram sacrificados uma semana (D1, n= 6) ou três meses (D2, n=6) Análise dos hormônios séricos Amostras de sangue foram coletadas imediatamente após a decaptação Soro foi separado por centrifugação e armazenados para testes subsequentes Foram usados 5 ratos por grupo e as análises foram realizadas em triplicata Testosterona e estradiol Preparação do tecido fixação por imersão em formaldeído 4% recém preparado em tampão fosfato 0,1M pH 7,2 e inclusão em parafina (imuno) fixação por imersão em solução de Karnovsky (formaldeído 2,5% recém preparado, glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato Sörensen 0,2M pH 7,2), por 12-24h (rotina histológica em parafina ou em historesina) Detecção das células apoptóticas foram detectadas in situ utilizando-se o ensaio da fragmentação de DNA associada à morte celular, baseado na reação do TUNEL Reações imunocitoquímicas recuperação antigênica em tampão citrato pH 6,0 (20 min) bloqueio de peroxidases endógenas (30 min em 3% de H2O2 em metanol ) bloqueador de ligações inespecíficas (15 min) Incubar no anticorpo primário em BSA 1% (1:100) – overnight AR e 1h para PCNA e p63 – 37ºC Detecção do anticorpo primário – AR: anticorpo secundário; PCNA e p63: polímero – 45 min em TA revelação com diaminobenzidina (0,03% em TBS) contra-coloração com hematoxilina Análise quantitativa e estatística A imunocitoquímica usa o princípio da ligação específica do anticorpo detectável ao antígeno. A apresentação do antígeno se encontra no tecido fixado. Este método tem como principal vantagem mostrar a localização cito e histológica do antígeno. Os sistemas de detecção nesta técnica geralmente são DAB (diaminobenzidina) + H2O2 ou então os fluoróforos. Usando diversos fluoróforos ligados a diferentes anticorpos é possível determinar em um mesmo tecido a colocalização de dois ou mais antígenos, fato muito importante para a pesquisa em biologia celular. A diaminobanzidina (DAB), na presença de H2O2 e peroxidase, forma um polímero de cor marrom, precipitando no local no qual se encontra a peroxidase, sendo principalmente utilizada em estudos de imunocitoquímica. Parâmetros Biométricos e Hormonais Peso corpóreo Peso relativo da próstata Glicemia Testosterona Estradiol Morfologia da próstata ventral Análise imunocitoquímica e de morte celular no epitélio acinar Figure 2 PCNA Immunocytochemistry (a–e) and TUNEL method (f–j) in the ventral prostate of 1 week control (a and f), 1 week diabetic (b and g), 1 week diabetic insulin-treated (c and h), 3 months control (d and i) and 3 months diabetic rats (e and j). Note that proliferation in prostate epithelium decreases significantly in older group (d) and also in diabetic groups, especially in short-term (b). The levels of apoptosis increased in prostate after diabetes (g and j), mainly in long-term rats (j). Insulin treatment completely reverses apoptotic levels but not cell proliferation in prostatic epithelium. Scale bar: 20 μm. Figure 3 Immunocytochemistry for androgen receptor AR (a–e) and p63 (f–j) in the ventral prostate of 1 week control (a and f), 1 week diabetic (b and g), 1 week diabetic insulin-treated (c and h), 3 months control (d and i) and 3 months diabetic rats (e and j). The frequency of AR significantly decreased because of ageing (d), but not because of diabetes (b and e), although a lower intensity of immunoreaction could be observed in short-term diabetic group (b). The number of p63-positive cells is significantly greater in diabetic rats (g and j) and insulin treatment reduced its expression levels close to those observed in control group (h). Scale Bar: 20 μm. Diferença na cinética epitelial nas diferentes idades utilizadas Comparando-se os grupos controle as freqüências de células apoptóticas e p63 positivas não variaram mas a de células AR- e PCNA- positivas diminuiram nos animais mais velhos. Esses dados indicam que o envelhecimento influencia os mecanismos de proliferação do epitélio da próstata O diabetes reduz os níveis séricos de testosterona, a expressão de AR, prejudica a proliferação celular e aumenta o nível de apoptose das células epiteliais com concomitante aumento de células p63-positivas na próstata de ratos Uma ativação ineficiente de ARs causada pelo diabetes pode comprometer a via de sinalização envolvida com o estímulo à proliferação A apoptose, aliada a diminuição da proliferação celular, é um dos principais mecanismos que levam à involução prostática em situações de privação androgênica p63 tem importante função na regulação do desenvolvimento e diferenciação das células epiteliais, além de controlar a proliferação celular, apoptose e senescência