International Journal of Experimental Pathology, 91, 144–154
A próstata é o órgão mais afetado por lesões malignas nos homens, e o
câncer de próstata é a segunda causa mais comum de morte diagnosticada em
homens de vários países.
No caso do epitélio acinar secretor da próstata pelo menos seis tipos
celulares com características fenotípicas e biológicas distintas são encontrados:
células-tronco
células basais
células de amplificação transitória ou “transit-amplifying cells” (TAC)
células intermediárias
células luminais secretoras
células neuroendócrinas
O andrógeno é provavelmente o principal fator trófico para o epitélio
acinar prostático, sendo indispensável para a proliferação e diferenciação
celular. Portanto, sua ação é decisiva tanto para a indução da diferenciação
epitelial durante o desenvolvimento embrionário como para a maturação pósnatal e manutenção da atividade secretora e do padrão normal de
diferenciação
Diabetes tipo 1 prejudica a biosíntese de androgenos pelas células de
Leydig e reduz a captação e retenção de andrógenos na próstata, promovendo
regressão da glândula.
Remodelação estromal
Diminuição do perfil acinar
Alterações significativas no epitélio acinar
Atrofia
Grupos de Animais e tratamento
ratos machos Wistar adultos, com 3 meses de idade (400-500g)
A indução do diabetes foi realizada após 24 horas de jejum
alimentar pela administração endovenosa (veia peniana) de 0,1ml
de solução fisiológica contendo 40 mg/kg de peso corporal de
aloxana
os animais foram alimentados normalmente e a glicemia foi
testada diariamente
Foram utilizados apenas os ratos que apresentaram diabetes
grave, com glicemia de jejum acima de 250mg/dl em todas as
medições, perda de peso corporal e aumento do débito urinário
ratos diabéticos foram sacrificados uma semana (D1, n= 6) ou
três meses (D2, n=6)
Análise dos hormônios séricos
Amostras de sangue foram coletadas imediatamente após a
decaptação
Soro foi separado por centrifugação e armazenados para testes
subsequentes
Foram usados 5 ratos por grupo e as análises foram realizadas
em triplicata
Testosterona e estradiol
Preparação do tecido
fixação por imersão em formaldeído 4% recém preparado em
tampão fosfato 0,1M pH 7,2 e inclusão em parafina (imuno)
fixação por imersão em solução de Karnovsky (formaldeído 2,5%
recém preparado, glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato Sörensen
0,2M pH 7,2), por 12-24h (rotina histológica em parafina ou em
historesina)
Detecção das células apoptóticas
foram detectadas in situ utilizando-se o ensaio da fragmentação
de DNA associada à morte celular, baseado na reação do TUNEL
Reações imunocitoquímicas
recuperação antigênica em tampão citrato pH 6,0 (20 min)
bloqueio de peroxidases endógenas (30 min em 3% de H2O2 em
metanol )
bloqueador de ligações inespecíficas (15 min)
Incubar no anticorpo primário em BSA 1% (1:100) – overnight AR
e 1h para PCNA e p63 – 37ºC
Detecção do anticorpo primário – AR: anticorpo secundário;
PCNA e p63: polímero – 45 min em TA
revelação com diaminobenzidina (0,03% em TBS)
contra-coloração com hematoxilina
Análise quantitativa e estatística
A imunocitoquímica usa o princípio da ligação específica do anticorpo
detectável ao antígeno. A apresentação do antígeno se encontra no
tecido fixado. Este método tem como principal vantagem mostrar a
localização cito e histológica do antígeno.
Os sistemas de detecção nesta técnica geralmente são DAB
(diaminobenzidina) + H2O2 ou então os fluoróforos. Usando diversos
fluoróforos ligados a diferentes anticorpos é possível determinar em
um mesmo tecido a colocalização de dois ou mais antígenos, fato
muito importante para a pesquisa em biologia celular.
A diaminobanzidina (DAB), na presença de H2O2 e peroxidase, forma
um polímero de cor marrom, precipitando no local no qual se encontra
a peroxidase, sendo principalmente utilizada em estudos de
imunocitoquímica.
Parâmetros Biométricos e Hormonais
Peso corpóreo
Peso relativo da próstata
Glicemia
Testosterona
Estradiol
Morfologia da próstata ventral
Análise imunocitoquímica e de morte celular no epitélio acinar
Figure 2 PCNA Immunocytochemistry (a–e) and
TUNEL method (f–j) in the ventral prostate of 1 week
control (a and f), 1 week diabetic (b and g), 1 week
diabetic insulin-treated (c and h), 3 months control (d
and i) and 3 months diabetic rats (e and j). Note that
proliferation in prostate epithelium decreases
significantly in older group (d) and also in diabetic
groups, especially in short-term (b). The levels of
apoptosis increased in prostate after diabetes (g and
j), mainly in long-term rats (j). Insulin treatment
completely reverses apoptotic levels but not cell
proliferation in prostatic epithelium. Scale bar: 20 μm.
Figure 3 Immunocytochemistry for androgen receptor
AR (a–e) and p63 (f–j) in the ventral prostate of 1 week
control (a and f), 1 week diabetic (b and g), 1 week
diabetic insulin-treated (c and h), 3 months control (d
and i) and 3 months diabetic rats (e and j). The
frequency of AR significantly decreased because of
ageing (d), but not because of diabetes (b and e),
although a lower intensity of immunoreaction could be
observed in short-term diabetic group (b). The number
of p63-positive cells is significantly greater in diabetic
rats (g and j) and insulin treatment reduced its
expression levels close to those observed in control
group (h). Scale Bar: 20 μm.
Diferença na cinética epitelial nas diferentes idades utilizadas
Comparando-se os grupos controle as freqüências de células apoptóticas e
p63 positivas não variaram mas a de células AR- e PCNA- positivas diminuiram
nos animais mais velhos. Esses dados indicam que o envelhecimento influencia
os mecanismos de proliferação do epitélio da próstata
O diabetes reduz os níveis séricos de testosterona, a expressão de AR,
prejudica a proliferação celular e aumenta o nível de apoptose das células
epiteliais com concomitante aumento de células p63-positivas na próstata de
ratos
Uma ativação ineficiente de ARs causada pelo diabetes pode comprometer
a via de sinalização envolvida com o estímulo à proliferação
A apoptose, aliada a diminuição da proliferação celular, é um dos principais
mecanismos que levam à involução prostática em situações de privação
androgênica
p63 tem importante função na regulação do desenvolvimento e
diferenciação das células epiteliais, além de controlar a proliferação celular,
apoptose e senescência
Download

Imunocitoquímica