FeSBE 2012
Resumo: 12.001
CANAIS PARA ÍONS EM CÉLULAS TRONCO DERIVADAS DE POLPA DE DENTES DECÍDUOS.
1
Autores
CRUVINEL, E. M. 1, KOIFFMAN, C. P. 2, CASSOLA, A. C. 1 Genética e Fisiologia Evolutiva - IB, 2
Fisiologia e Biofísica - ICB
Apoio Financeiro:
FAPESP, CEGH/CEPID-FAPESP, CNPq
Resumo
Objetivos
Polpas dentárias remanescentes de dentes decíduos contém células tronco mesenquimais capazes de diferenciação em
vários fenótipos, tais como células neurais, adipócitos e odontoblastos . A expressão de canais iônicos, para Na+ e para
K+, por estas células foi investigada. Interessou à investigação a questão do significado fisiológico dos canais para o
fenótipo e para a diferenciação.
Métodos
As células foram obtidas de 5 dentes decíduos de crianças de 5 a 8 anos de idade (protolo aprovado pelo Comitê de Ética
em Pesquisa em Seres Humanos do Instituto de Biociências, USP, processo: 055-06) e mantidas em meio DMEM/F:12
suplementado com soro fetal bovino. Correntes pelos canais foram observadas em experimentos de fixação de voltagem,
pela técnica de “patch clamp” configuração “whole cell”. As soluções de pipeta e de banho eram planejadas para a
observação de um ou outro tipo de canal. As correntes durante um pulso de voltagem hiperpolarizante ou despolarizante,
em relação a um potencial de manutenção, eram analisadas quanto à intensidade e à cinética. Para a identificação dos
genes expressos cDNAs eram obtidos por RT-PCR e amplificados
Resultados
De 56 células observadas, 29 expressavam correntes por canais para Na+, de tipo Nav. As correntes eram bloqueadas por
TTX em concentração de 100 nM. O gene de expressão mais conspícua foi o SCN1A (isoforma Nav1.1, que equipa
neurônios do sistema nervoso central). Ocorre ainda a expressão do gene SCN3A (isoforma Nav1.3, expressa no sistema
nervoso central embrionário) e a expressão do gene SCN5A (proteína Nav1.5, característica de célula muscular cardíaca).
A análise dos canais K+ tem revelado maiores variações de célula para célula. Muitas células apresentam correntes que se
ativam rapidamente em pulsos despolarizantes e oscilam bastante, resultando em traços com muito ruído. São,
provavelmente, correntes por canais KCa, produtos de gene MaxiK. De fato, a expressão destes genes é inequívoca nos
resultados do RT-PCR. Há células que expressam isoladamente ou em conjunto com outras, correntes de ativação muito
lenta, ainda por esclarecer. Em algumas células, raras, ocorre a expressão de canais de ativação rápida e inativação
também rápida, com padrão de correntes classificadas como “transient outward”. A detecção de mRNA para a isoforma
Kv4.3 confirma a hipótese. Embora não se tenha encontrado, nas observações eletrofisiológicas, indícios claros de
atividade de canais ativados por hiperpolarização, há inequívoca expressão do gene HCN2 cuja proteína forma canais
deste tipo.
Conclusão
No que tange à expressão de canais para íons as células tronco mesenquimais da polpa de dentes decíduos mostram
considerável variação fenotípica, mormente no que concerne à expressão de canais para K+. A regularidade mais notória é
a da expressão de canais de tipo Nav. Canais deste tipo estão associados ao fenômeno do potencial de ação,
característico de células excitáveis. Destes dados procede a especulação que as células troncos estejam já comprometidas
com a diferenciação na direção de neurônios devido a sua origem da crista neural.
FeSBE 2012
Resumo: 12.002
Resveratrol potencializa o efeito citotóxico crônico da temozolomida em células de glioma:
papel da senescência e dano ao DNA
1
Autores
SILVA, M. M. B. E. 1, CHIELA, E. C. F. 2, ZAMIN, L. L. 1, THOMÉ, M. P. 1, PELEGRINI, A. L. 1,
LENZ, G. 1, LENZ, G. 1 Departamento de Biofísica - UFRGS, 2 Departamento de Bioquímica - UFFS
Apoio Financeiro:
FAPERGS e CNPq
Resumo
Objetivos
Gliomas são os tumores mais comuns e malignos do Sistema Nervoso Central. O quimioterápico de primeira escolha
utilizado contra estes tumores, a Temozolomida (TMZ), aumenta a sobrevida dos pacientes em pouco mais de 4 meses.
Recentemente, demonstramos que o polifenol Resveratrol (Rsv) exerce efeito citotóxico em células de glioma humano
através da indução de autofagia e modulação do ciclo celular. Além disso, observamos que Rsv potencializa o efeito da
TMZ após 48h de tratamento através de modulação do ciclo celular e indução de catástrofe mitótica. O objetivo do
presente trabalho é avaliar o efeito do co-tratamento de TMZ e Rsv a longo prazo em células de glioma in vitro.
Métodos
Para tal, células da linhagem de glioma humano U87 foram tratadas com Rsv 30 M (R30), TMZ 100 M (T100) ou cotratamento (T100R30) por 48h, seguido do replaqueamento em meio livre de droga (MLD). Após 7 dias e 15 dias,
respectivamente, foram avaliados a indução de senescência através de marcação para beta galactosidase e o potencial de
proliferação celular através de ensaio clonogênico.
Resultados
Após 7 dias em MLD, 5±3% e 51±8% das células tratadas com Rsv e TMZ, respectivamente, apresentaram marcação
positiva para senescência. Por outro lado, no co-tratamento este índice aumentou para 92±6%, sugerindo que o Rsv
potencializa o efeito de indução de senescência pela TMZ. Este efeito foi acompanhado por uma redução do potencial
clonogênico de células U87: enquanto Rsv e TMZ reduziram a formação de colônias para 56±% e 10±%, respectivamente,
com relação ao controle, no co-tratamento não houve formação de colônias após 15 dias de replaqueamento em MLD.
Uma vez que o co-tratamento disparou a entrada em senescência pelas células de glioma, testamos se este efeito poderia
ser mediado por alta produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e estresse oxidativo ou por dano ao DNA, dois
mecanismos comumente envolvidos na indução de senescência celular, após o tratamento de 48h. O co-tratamento não
induziu aumento de EROs intracelulares, mensuradas pelo ensaio de DCFH (2',7'-diclorofluoresceína-diacetato) por
citometria de fluxo, sugerindo que estresse oxidativo não é o mecanismo desencadeador do aumento da senescência
celular. Por outro lado, co-tratamento induziu níveis semelhantes de dano ao DNA avaliado por ensaio do cometa alcalino
(o qual mensura tanto quebras duplas quanto simples), porém, os níveis de histona H2AX fosforilada, marcador clássico de
quebras duplas no DNA, se mostraram aumentados com relação aos tratamentos de TMZ e Rsv isolados, sugerindo que o
efeito potencializado de indução de senescência pelo co-tratamento pode estar sendo mediado pelo aumento de quebras
duplas na fita de DNA e sinalização em resposta ao dano.
Conclusão
Em conclusão, Rsv potencializou o efeito crônico da TMZ em reduzir o potencial proliferativo de células de glioma através
da indução de senescência, provavelmente mediada por aumento do dano ao DNA.
FeSBE 2012
Resumo: 12.003
MurRF1 e MuRF2 são essenciais para a diferenciação de células-satélites in vivo e in vitro.
1
Autores
BAPTISTA, I. L. 2, BOGOMOLOVAS, J. 1, SILVA, W. J. 2, LABEIT, S. 1, MORISCOT, A. S. 1
Biologia Celular e do Desenvolvimento - USP, 2 Institute for Integrative Pathophysiology - UMM
Apoio Financeiro:
FAPESP
Resumo
Objetivos
O processo de degradação protéica é essencial para a viabilidade celular. No caso da célula muscular, o sistema ubiquitina
proteassoma e as enzimas E3 ligases são cruciais para este processo. Assim, neste estudo o objetivo foi verificar se a
ausência de MuRF1 e MuRF2 (duas E3 ligases) seriam capazes de alterar a diferenciação de células-satélites in vivo,
durante o processo de regeneração e, in vitro, destas células em cultura.
Métodos
O músculo tibial anterior de animais selvagens (WT), MuRF1 KO, MuRF2 KO e Murf1/Murf2 KO (animais duplamente
nocauteados para as E3 ligases MuRF1 e MuRF2) foram injetados com cardiotoxina (0,1 ml de 10µM). Análises
histológicas (hematoxilina-eosina e imunofluorecências) e western blots para fatores miogênicos envolvidos na
diferenciação de células-satélites (MyoD, Myf-5 e Myogenin) foram realizados 3 e 10 dias após a injeção. Para os
experimentos in vitro, utilizamos cultura primária de mioblastos de animais WT na presença e ausência de siRNA para
MuRF1 e MuRF2. CEEA nº 151. CEUA 151. Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
Resultados
Imunofluorecência e western blot para MyoD, importante fator miogênico, mostraram que animais Murf1/Murf2 KO
apresentam importante redução (50% após 3 dias) na expressão deste fator quando comparados com animais selvagens
(WT 3d), ambos lesados com cardiotoxina. Outro fator miogênico estudado, Myf-5 apresentou redução de 37% em animais
Murf1/Murf2 KO (vs. WT 3d) com posterior aumento em 10 dias (40% vs WT 10d). Interessantemente Myogenin não
apresentou qualquer diferença entre os animais. Imunofluorecências para β-catenina evidenciaram que em animais dKO
esta proteína é incapaz de migrar em direção ao núcleo como ocorre em animais WT durante a regeneração. In vitro, com
o uso de siRNA para MuRF1 notamos que a capacidade de diferenciaçãodas células mioblásticas foi extremamente
reduzida, resultado semelhante ao encontrado para células duplamente expostas a siRNA para MuRF1 e MuRF2.
Conclusão
O estudo sugere que MuRF1 e MuRF2, em conjunto, são essenciais para a diferenciação de células-satélites no processo
de regeneração muscular, interessantemente, conseguimos reproduzir este efeito em células de animais WT na presença
de siRNA em cultura, mostrando que estas proteínas possuem um papel regulatório na expressão de fatores miogênicos
com reflexos na capacidade de diferenciação de células satélites.
FeSBE 2012
Resumo: 12.004
EFEITOS DA APLICAÇÃO DE MICROCORRENTE E DO LASER GA-AS 904 nm NA FASE INICIAL
NO PROCESSO DE REPARO APÓS EXCISÃO ÓSSEA NA CALOTA CRANIANA DE RATOS
WISTAR.
1
Autores
MENDONÇA, J. 1, NEVES, L. M. 1, MATHEUS, R. L. 1, MENDONÇA, F. S. 1, ESQUISATTO, M.
A. M. 1, SANTOS, G. M. T. D. 1 Programa de Pós-graduação em Ciências Biomédicas - UNIARARAS
Apoio Financeiro:
Fundação Hermínio Ometto
Resumo
Objetivos
A estimulação elétrica de baixa intensidade a laserterapia têm se mostrado eficazes no processo da osteogênese, contudo
poucas informações estão disponíveis quanto à ação desse agente em ossos planos. Sendo assim, o objetivo desse
trabalho foi avaliar os efeitos da aplicação de microcorrente e da laserterapia no processo inicial no processo de reparo
após excisão óssea na calota craniana de ratos Wistar machos.
Métodos
Foram utilizados 36 ratos machos da linhagem Wistar (Rathus novergicus) com 12 meses de idade e peso corpóreo médio
de 500g. Os animais foram divididos em três grupos de 12 animais, sendo um controle (C), outro submetido a tratamento
com microcorrente (10 μA/5 min/dia) (MC) e, outro tratado com Laser GA-AS 904nm (3 J/cm²/69 seg/dia) (L). Todos os
animais foram submetidos, previamente, a tricotomia na região occipital, assepsia com Diglucoanato de Clorexidina a 0,4%
e anestesia com Cloridrato de Xilazina (0,2ml/Kg) e Cloridrato de Ketamina (1 ml/kg) para o procedimento cirúrgico. A lesão
cirúrgica foi feita por meio da utilização de broca trefina com diâmetro 3.75 acoplada a contra ângulo de implante com
torque de 16:1. Após o ato operatório, os animais receberam os cuidados adequados e foram mantidos em gaiolas limpas
individuais com água e ração apropriadas. Três animais de cada grupo foram sacrificados no 7º, 14º, 21º e 28º dias para
remoção da área de lesão e preparo do tecido para análise histopatológica e morfométrica. Foi aferida, em cada amostra, o
número total de células fibroblásticas (n. em 10 4 μm 2 ), número de vasos neoformados (n. em 10 4 μm 2 ) e a
porcentagem ocupada por fibras colágenas birrefringentes em relação a área de tecido. Os dados foram comparados por
Análise de Variância e pós-teste de Tukey ( p < 0,05). Este estudo foi aprovado pelo CEUA/UNIARARAS (Processo no.
801/2006).
Resultados
Poucos infiltrados inflamatórios foram observados em todo o período experimental. Células fibroblásticas predominaram
desde o 7º dia. A proliferação celular aconteceu mais intensamente até o 14º dia. Foram observadas grandes quantidades
de vasos sanguíneos no tecido de reparo, principalmente entre o 21º e 28º dias. Não foram observadas áreas de
calcificação ou ossificação no período analisado. Os valores apurados para o número de células fibroblásticas durante os
períodos de análise foi, respectivamente, 14±3; 15±3; 14±3 e 16±2, para C; 18±2; 22±2; 19±2 e 20±2, para MC e, 17±3;
21±3; 18±3 e 18±3, para L. Os valores dos grupos MC e L aos 14 dias foram significativamente maiores que o C. Os dados
do número de vasos neoformados atingiram 1,8±0,4; 1,7±0,2; 1,8±0,3 e 1,8±0,4, para C; 2,1±0,3; 2,7±0,4; 2,1±0,2 e 2±0,3,
para MC e, 2±0,4; 2,5±0,3; 1,8±0,3 e 1,7±0,3, para L. Os valores apurados do 14º dia para MC e L foram significativamente
maiores que C. A porcentagem da área ocupada por fibras colágenas birrefringentes, nas amostras do tecido em reparo,
atingiram, respectivamente, 62±8; 64±7; 71±9 e 72±7, para C; 63±7; 69±8; 73±6 e 84±7, para MC e, 64±8; 70±8; 72±7 e
74±6, para L. Apenas os valores apurados do 28º dia para MC foi significativamente maior que o grupo C.
Conclusão
A aplicação de microcorrente e Laser GA-AS 904 nm parecem estimular, na fase inicial do reparo, a proliferação de células
e de vasos sanguíneos e nas fases posteriores, maturação das fibras colágenas. Por outro lado, não foram observadas
FeSBE 2012
diferenças importantes entre os tratamentos quanto ao reparo no modelo experimental proposto neste estudo.
FeSBE 2012
Resumo: 12.005
A deleção dos genes MuRF1 e MuRF2 altera os estoques de gordura no tecido muscular
esquelético de camundongos
1
Autores
SILVESTRE, J. G. D. O. 1, BAPTISTA, I. L. 2, BOGOMOLOVAS, J. 2, LABEIT, S. 1, MORISCOT,
A. S. 1 Biologia Celular do Desenvolvimento - USP, 2 Institute for Integrative Pathophysiology - UMM
Apoio Financeiro:
Fapesp
Resumo
Objetivos
O músculo esquelético é caracterizado por possuir grande capacidade de regeneração. Essa capacidade se dá pela
presença de uma população de células conhecidas como células satélite. Pouca atenção tem sido dada ao papel que as
vias catabólicas podem exercer na atividade de células satélite. A via proteolítica ubiquitina-proteassoma é considerada a
principal responsável pela proteólise muscular esquelética e é formada por três componentes, E1, E2 e E3. As E3 ligases
MuRF1 e MuRF2 são conhecidas por desempenharem um importante papel no controle da massa muscular. Em conjunto
com outras E3 ligases como a Mafbx/Atrogin-1, atuam em diversos estados de catabolismo muscular, como imobilização e
denervação. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar se a ausência de MuRF1 e MuRF2 poderia alterar o
comprometimento das células-satélites durante a regeneração de fibras musculares de camundongos.
Métodos
Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética em experimentação animal (protocolo número 151). O
músculo tibial anterior de camundongos selvagens (WT), MuRF1 KO, MuRF2 KO e MuRF1/2 KO (duplo nocaute-dKO)
foram injetados com cardiotoxina (0,1 ml de 10μM). Análises histológicas com hematoxilina-eosina foram utilizadas para
verificar a morfologia geral; coloração com Oil-Red-O para identificação de células adiposas; imunofluorescências foram
realizadas para Pax7, MHCn, NCAM, Laminina e Pirilipina. As análises foram realizadas em 0 (controle), 3, 10 e 28 dias
após a injeção.
Resultados
As análises histológicas revelaram que com 3 e 10 dias após a injeção de cardiotoxina, a regeneração nos animais
MuRF1/2 KO foi fortemente prejudicada em relação aos animais selvagens (WT 3d e 10d). Imunofluorescências para Pax7,
um importante fator de transcrição expresso em células satélites, revelou que não houve diferenças significativas na
quantidade de células satélites em condições basais, aproximadamente 5% dos núcleos foram positivos para Pax7 tanto
em WT quanto dKO. Após 3 dias de regeneração, os animais dKO não expressaram NCAM, um fator importante para a
fusão de células-satélites durante a diferenciação, diferentemente de animais WT. Após 10 dias da injeção de cardiotoxina,
os animais WT exibiram marcação positiva para MHCn, a qual estava ausente em animais dKO. As análises com
hematoxilina-eosina 28 dias após a lesão revelaram estruturas entre as fibras, sugerindo o aparecimento de adipócitos
entre as fibras em regeneração. A coloração com Oil-Red-O apresentou mais células positivas para adipócitos em animais
dKO (aumento de 36%) em comparação aos animais WT. Imunofluorescências para pirilipina (A+B) exibiu uma marcação
citoplasmática nas miofibras de animais dKO, enquanto animais WT apresentaram uma distribuição periférica destas
proteínas.
Conclusão
Os resultados sugerem que a falta de MuRF1 e MuRF2 prejudicou o processo de regeneração, alterando a capacidade de
diferenciação das células-satélites com reflexos sobre a capacidade de armazenamento e distribuição dos estoques de
gordura nas fibras musculares.
FeSBE 2012
Resumo: 12.006
UP REGULATION OF MDM2 ONCOPROTEIN IN THE SKELETAL MUSCLE FROM
HYPERTHYROID RATS IS ASSOCIATED WITH DOWN REGULATION OF PAX7 AND MYOD
1
Autores
RAMOS, G. V. 1, ROSANSKY, A. 1, BAPTISTA, I. L. 1, GUILHERME, J. P. L. F. 1, MORISCOT,
A. S. 1, MORISCOT, A. S. 1 Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento - ICB I
Apoio Financeiro:
FAPESP and CNPq
Resumo
Objetivos
Mdm2 is an oncogene overexpressed in several types of human sarcomas, leading to loss of cell cycle control. This protein
controls the ubiquitination and degradation of several proteins with essential roles in tumorigenesis. However, the role of
Mdm2 in non tumorous tissue is still elusive. Here we found that this protein is up regulated by thyroid hormone (T3) in
skeletal muscle. Since this hormone leads to muscle atrophy it is possible that Mdm2 acts as an E3 ligase directed to
sarcomere degradation. Recent studies have shown that the muscle specific E3-ligases Atrogin-1 and Murf-1 could be
responsible for muscle mass loss in hyperthyroid rats. Our main aim is to understand the relationship between the Mdm2 E3
ligase and skeletal muscle wasting induced by T3.
Métodos
The responsiveness this E3-ligase to T3 was firstly analyzed by RT-PCR and Western Blot. Subsequently, to characterize
MDM2 location in skeletal muscle tissue as well as PAX 7 and MYOD (satellite cell markers) we used immunofluorescence
and confocal microscopy approaches. Accordingly, rats were induced to experimental hyperthyroidism (6µg T3/100g
BW/day), corresponding to 20X physiological doses for 12, 24 hours and 7 days. All data were analyzed for statistical
significance with Anova one way (Prism and Statmate software; Graphpad, San Diego, CA) to verify the variances of the
control and experimental groups. Data considered significantly different included p < 0.05. All procedures were approved by
the Biomedical Sciences Institute Ethics Committee (#151/112/02).
Resultados
After 7 days of treatment, as expected, we observed loss of soleus muscle mass of approximately 15% vs. control group ( p
< 0.05). Along with muscle mass loss, we noted a two fold increase in MDM2 gene expression after 1 and 7 days of
treatment as compared to control group ( p < 0.05). Similar result was observed in protein expression levels. Next we
decided to characterize MDM2 location in skeletal muscle tissue by immunofluorescence and confocal microscopy. In
controls, the MDM2 protein is located predominantly in the nucleus, in contrast under T3 treatment an increase in
perinuclear labeling was observed, by immunofluorescence. By using the confocal microscopy approach, we confirmed that
MDM2 localizes at the perinuclear region. Next step was to investigate if MDM2 co-localizes with satellite cells in the soleus
by using PAX7 and MYOD as markers. It was observed that T3 treatment caused a severe decrease in PAX7/MYOD
labeling, along with increased MDM2 labeling.
Conclusão
T3 upregulates the E3 ligases MDM2 in skeletal muscle, which might be involved in the negative modulation the satellite
cells activity in the skeletal muscle, leading to loss of muscle mass.
FeSBE 2012
Resumo: 12.007
EFEITOS DA APLICAÇÃO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE Porophyllum ruderale (JACQ.)
CASS. ASSOCIADA AO LASER InGaP - 670nm NO REPARO TECIDUAL DE QUEIMADURAS EM
RATOS WISTAR
1
VELOZO, K. D. A. 1, LOTTI, R. G. 1, NEVES, L. M. G. 1, JACOMO, A. C. J. 1, ESQUISATTO, M.
Autores A. M. 1, SANTOS, G. M. T. D. 1, MENDONÇA, F. A. S. 1, GASPI, F. F. O. G. 1 Programa de Pós
Graduação em Ciências Biomédicas - Uniararas
Apoio Financeiro:
Fundação Hermínio Ometto
Resumo
Objetivos
O uso de fitoterápicos no tratamento de lesões cutâneas tem sido relatado em literatura, bem como a ação da laserterapia.
Entretanto, pouco se sabe sobre a ação sinérgica destes agentes no processo de cicatrização. Assim, o objetivo deste
estudo foi avaliar os efeitos da aplicação tópica do extrato hidroalcoólico de folhas de Porophyllum ruderale (JACQ.) CASS.
à aplicação de Laser InGaP - 670nm na reparação de queimaduras cutâneas induzidas experimentalmente em ratos
Wistar.
Métodos
O extrato hidroalcoólico das folhas de e P. ruderale (PR) foi obtido por maceração em de solução de álcool a 70%, seguido
por filtração e evaporação. Foram utilizados 36 ratos Wistar machos de 120 dias de idade. Os animais foram anestesiados
por Cloridrato de xilazina (0,2ml/kg) e Cloridrato de Ketamina (1ml/kg) e submetidos a protocolo experimental para
queimadura de segundo grau na pele do dorso. Em seguida foram divididos em grupos: C- controle; L-tratado por Laser
InGaP - 670nm; EPR – tratados com extrato de PR (1ml/dia) e L+EPR - laser associado com extrato de PR (1ml/dia). Três
animais de cada grupo foram sacrificados no 7º, 14º e 21º dias para remoção e preparação do tecido para análise
histopatológica e morfométrica onde foram medidos na região de reparo: número de células inflamatórias e fibroblásticas
(N em 104 μm2), número total de vasos (N em104 μm2), espessura do epitélio (μm) e porcentagem ocupada por fibras
colágenas birrefringentes em relação à área de tecido. Os dados foram comparados por ANOVA e pós-teste de Tukey ( p <
0,05). Este estudo foi aprovado pela CEUA-UNIARARAS (725/2009).
Resultados
Os valores encontrados para C quanto ao número de células fibroblásticas no 7º, 14ºe 21º dias foram 15,3 ± 4,4, 24,8 ±
4,1, 28,4 ± 3,7, respectivamente. O total de células inflamatórias foi de 23,6 ± 4,8, 18,1 ± 2,2, 8,3 ± 1,7. A espessura da
epiderme em C atingiu 4,8 ± 1,3, 15,9 ± 4,6, 19,9 ± 4,7 no mesmo período. O número de vasos sanguíneos neoformados
chegou a 1,1 ± 0,4, 1,9 ± 0,5, 2.7 ± 0,7. A porcentagem ocupada por fibras colágenas birrefringentes atingiu 27±5; 48±5;
59±1. O grupo L somente apresentou valores significativamente superiores a C no número de vasos sanguíneos (1,8 ± 0,3,
2,7 ± 0,3, 3,1 ± 0,5) e células fibroblásticas (22,5 ± 4,2, 31,1 ± 2,9, 37,3 ± 4,2). O grupo EPR não apresentou alteração
significativa em nenhum dos períodos e parâmetros estudados, quando comparados ao C. O grupo L+EPR apresentou
quantidades significativamente superiores quanto à quantidade de células fibroblásticas (21,9 ± 3,8, 29,9 ± 3,0, 37,7 ± 3,3,
respectivamente). Não foram encontradas diferenças significativas, quando a área de fibras colágenas birrefringentes,
entre os grupos e períodos estudados. Não foram observadas áreas de necrose e calcificação em todos os grupos. As
fibras elásticas não apresentaram modificações significativas em relação aos grupos e tempos experimentais.
Conclusão
Os dados levantados neste trabalho demonstraram que a laserterapia tem ação positiva no processo de reparo da
queimadura de segundo grau. Contudo, o extrato de Porophyllum ruderale empregado em conjunto com o laser parece não
ter efeito importante na recuperação dessas lesões.
FeSBE 2012
Resumo: 12.008
SIGNALING TRIGGERED BY THE NEUROPEPTIDE PACAP AND SHH INTERACT IN THE
CONTROL OF CELL PROLIFERATION IN THE DEVELOPING RETINA
1
Autores
LIMA, T. D. F. A. D. 1, RIBEIRO, T. P. 1, NJAINE, B. 1, LINDEN, R. 1, SILVEIRA, M. 1 Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ
Apoio Financeiro:
CNPq and FAPERJ
Resumo
Objetivos
During development of the central nervous system various events must be carefully coordinated to ensure that the number
and proportion of cell types of the mature retina are correct. Proliferation and differentiation of retinal progenitors is
controlled by both cell intrinsic and cell extrinsic factors. Our group has shown that Pituitary Adenylyl Cyclase Activating
Polypeptide (PACAP) regulates cell proliferation in retinal progenitors in a cAMP/PKA-dependent manner through the
decrease in cyclin D1 levels (Eur. J. Neurosci. 3; 311-321, 2010). Previous data in the literature have demonstrated that
Shh responses can be antagonized by increasing cAMP levels and PKA activity. This signaling pathway was described to
act on degradation or processing of the transcription factors Gli to a repressor form (Mol. Cell. Biol. 26; 3365–3377, 2006;
Dev. Biol. 326; 177–189, 2009). Since during retinal development Shh has a promitogenic role (Development 132; 51035113, 2005) the aim of this study is to investigate the effect of PACAP in the negative regulation of Shh signaling pathway in
the retina. We propose that this might be a mechanism which contributes to the antimitogenic effect of this neuropeptide.
Métodos
Incorporation of [3H]-thymidine (1μCi/mL) and BrdU (10μM) were used to analyze cell proliferation. Retinal explants were
incubated for 24 hr with or without 10 nM PACAP38 and, SAG (agonist of Shh pathway) (1nM, 5 nM and 10 nM). For the
last 2 hr of the experiment [3H]-thymidine or BrdU were added to label cells in S phase of the cell cycle. [3H]-thymidine
incorporation was determined by liquid scintillation and BrdU positive cells were counted through flow citometry. mRNA
content of various target genes was determined through quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR). CEEA IBCCF 121.
Resultados
Previous results from our group showed that retinal explants obtained from one day-old (P1) Lister-Hooded rats treated for
three hours with 10nM PACAP present a significant reduction in mRNA levels of transcription targets of the Shh pathway,
such as, Ptch1 (65,4% ± 0,03 compared to Control 100%) and Gli1 (49,2% ± 0,07 compared to Control 100%) (unpublished
data). First we evaluated the possibility to use SAG as a tool in our study. Treatment of P1 retinal explants with different
concentrations of SAG induced proliferation of retinal progenitors (1nM - 20%, 5nM - 37% and 10nM - 46%) and increased
Gli1 mRNA levels. Moreover it was observed that treatment with 10nM PACAP blocked in 50% SAG-induced increase in
cell proliferation. This result reinforces our hypothesis that this neuropeptide can negatively modulate cell proliferation of
retinal progenitors through its interference in Shh signaling pathway. Additional experiments are in progress to characterize
the molecular mechanisms associated with this effect.
Conclusão
The results presented here suggest that the neuropeptide PACAP is a negative regulator of Shh pathway.
FeSBE 2012
Resumo: 12.009
AÇÃO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE Solidago chilensis (MEYEN) ASSOCIADO À
APLICAÇÃO DO LASER InGaP - 670nm NO REPARO DE QUEIMADURAS EM RATOS
1
GODOY, N. P. D. 1, SCHARLACK, N. K. 1, NEVES, L. M. G. 1, ESQUISSATO, M. M. A. 1,
Autores MENDONÇA, F. A. S. 1, SANTOS, G. M. T. D. 1, GASPI, F. O. D. G. D. 1 Pós Graduação em
Ciências Biomédicas - Uniararas
Apoio Financeiro:
Fundação Hermínio Ometto
Resumo
Objetivos
O uso de fitoterápicos no reparo de lesões cutâneas tem sido descrito na literatura, bem como a ação da laserterapia sobre
as mesmas. Entretanto, pouco se sabe sobre a ação sinérgica destes agentes no processo de cicatrização. Dessa forma, o
objetivo deste estudo foi avaliar a ação do extrato hidroalcoólico de folhas de Solidago chilensis (MEYEN) associado à
aplicação de Laser InGaP - 670nm na reparação de queimaduras cutâneas induzidas experimentalmente em ratos Wistar.
Métodos
O extrato hidroalcoólico das folhas de S. chilensis (SC) foi obtido por maceração em solução de álcool a 70%, seguido por
filtração e evaporação. Foram utilizados 36 ratos Wistar machos de 120 dias de idade. Os animais foram anestesiados
(Cloridrato de xilazina (0,2ml/kg) e Cloridrato de Ketamina (1ml/kg) e submetidos a protocolo experimental para
queimadura de segundo grau na pele do dorso. Em seguida foram divididos em grupos: C- controle; L-tratado com Laser
InGaP - 670nm; ESC – tratados com extrato de SC (1 ml/dia); L+ESC – Laser associado ao extrato de SC (1 ml/dia). Três
animais de cada grupo foram sacrificados no 7º, 14ºe 21º dias para remoção e preparação do tecido para análise
histopatológica e morfométrica na qual foram aferidas na região de reparo: número de células inflamatórias e fibroblásticas
(N em 104 μm2), número total de vasos (N em 104 μm2), espessura do epitélio (μm) e porcentagem ocupada por fibras
colágenas birrefringentes em relação à área de tecido. Os dados foram comparados por ANOVA e pós-teste de Tukey ( p <
0,05). Este estudo foi aprovado pela CEUA-UNIARARAS (725/2009).
Resultados
No grupo C, o número de células fibroblásticas no 7º, 14º, e 21º dias foram 15,3 ± 4,4, 24,8 ± 4,1, 28,4 ± 3,7,
respectivamente. A quantidade de células inflamatórias foi de 23,6 ± 4,8, 18,1 ± 2,2, 8,3 ± 1,7. A epiderme atingiu a
espessura de 4,8 ± 1,3, 15,9 ± 4,6, 19,9 ± 4,7, no mesmo período. O número de vasos sanguíneos neoformados chegou a
1,1 ± 0,4, 1,9 ± 0,5, 2.7 ± 0,7. A porcentagem ocupada por fibras colágenas birrefringentes atingiu 27±5; 48±5; 59±1. O
grupo L apresentou valores significativamente superiores a C no número de vasos sanguíneos (1,8 ± 0,3, 2,7 ± 0,3, 3,1 ±
0,5) e células fibroblásticas (22,5 ± 4,2, 31,1 ± 2,9, 37,3 ± 4,2). O grupo ESC não apresentou diferença significativa em
nenhum dos períodos e parâmetros estudados, quando comparados ao grupo C. O grupo L+ESC apresentou valores
significativamente superiores quanto à quantidade de células fibroblásticas (22,64 ± 3,4, 28,7 ± 2,9, 38,21 ± 3,2,
respectivamente). Não foram encontradas diferenças significativas, quando a área de fibras colágenas birrefringentes,
entre os grupos e períodos analisados. A organização das fibras elásticas não apresentou alteração significativa em
relação aos grupos e tempos experimentais. Não foram detectadas áreas de necrose e calcificação entre os grupos
estudados.
Conclusão
A aplicação do Laser InGaP - 670nm estimulou o processo de reparo da queimadura de segundo grau. No entanto, o
fitoterápico testado neste estudo parece não ter efeito importante na recuperação destas lesões.
FeSBE 2012
Resumo: 12.010
PARTICIPAÇÃO DO RECEPTOR B2 DE BRADICININA NA NECROSE, MAS NÃO NA APOPTOSE,
APÓS LESÃO POR ISQUEMIA E REPERFUSÃO EM FÍGADOS DE RATOS
1
Autores
PAIO**, M. A. 2, KOUYOUMDJIAN, M. 1, BORGES, D. R. 3, NAGAOKA, M. R. 1 Medicina UNIFESP, 2 Bioquímica - UNIFESP, 3 Biociências - UNIFESP
Apoio Financeiro:
FAPESP (08/08916-6 e 08/55928-0), CNPq (477868) e CAPES
Resumo
Objetivos
A bradicinina (BK) é um peptídeo próinflamatório que tem um papel hipotensor arterial, porém no fígado, causa resposta
hipertensiva portal. Entretanto, esse efeito é rápido, visto que o órgão inativa 90% da BK em concentrações nanomolares,
após uma única passagem. Sua ação é determinada pela ação em dois receptores: B1 (B1R) e B2 (B2R). O B2R é
expresso constitutivamente em fígado humano e de rato, já o B1R é induzido por processo inflamatório. Recentemente,
nós verificamos envolvimento do B1R na morte celular após isquemia e reperfusão hepática. Essa lesão consiste na
interrupção do fluxo sanguíneo (período isquêmico) e, após este evento, o fluxo sanguíneo e, consequentemente, a
oxigenação são restabelecidos (reperfusão). Papel do B2R neste processo ainda é desconhecido. Portanto, o objetivo
deste trabalho é verificar a participação do B2R na lesão por isquemia e reperfusão em fígados de ratos.
Métodos
Número Protocolo CEP 0034/09 - UNIFESP. Fígados de ratos machos Wistar (8 semanas e aproximadamente 250 g)
foram removidos e preservados a 4ºC em solução de preservação University of Wisconsin. Após o 24h de isquemia, o
fígado foi reperfundido ( < i>ex vivo) a 37ºC com solução de Krebs/BSA. Solução salina (controle) ou BK (0,2 µmol) foi
administrada in bolus na cânula aferente e a pressão portal foi monitorada. Os seguintes parâmetros metabólicos foram
analisados: secreção de bile, liberação de glicose e depuração de bromossulfaleína. Para verificar o papel de B2R no
metabolismo após isquemia de 24h, HOE-140 (185 nmol) foi adicionado à solução de Krebs/BSA antes da injeção de BK. A
morte celular foi avaliada por imunoensaio (Cell Death da Roche), TUNEL, necrose pelo corante de exclusão azul de
Tripan e ensaio da atividade da caspase-3, através do substrato DEVDpNA. A análise estatística foi realizada pelo
programa GraphPad Prism 3.0 e foi utilizada ANOVA ou ANOVA pareada, seguida de Bonferroni. O nível de significância
para rejeição da hipótese nula foi considerado inferior ou igual a 0,05.
Resultados
A resposta hipertensiva portal à BK (6,1 ± 1,0) foi abolida com a adição de HOE-140 (ANOVA, p=0,026), e os parâmetros
metabólicos estudados não se alteraram com a inibição do B2R ( p > 0,05). Não houve diferença na morte celular em geral
e nem por apoptose (TUNEL e caspase-3) entre os grupos estudados. Porém, em relação ao número de células
necróticas, observamos diminuição significativa (ANOVA, p=0,0275) da necrose de células sinusoidais no grupo que
recebeu HOE-140 (94,5 ±5,5) em relação ao grupo controle.
Conclusão
Nossos dados sugerem que o B2R pode estar envolvido com a morte celular por necrose na lesão por isquemia e
reperfusão em fígados de ratos.
FeSBE 2012
Resumo: 12.011
Short term 17-beta-Estradiol treatment in C2C12 myoblasts does not alters mitochondrial
parameters
Autores
1
SANTOS, A. T. 1, MATTOS, M. N. 1, SILVA, W. S. D. 1 Instituto de Bioquímica Médica - UFRJ
Apoio Financeiro:
FAPERJ, CNPq and CAPES
Resumo
Objetivos
Aim: Skeletal muscle differentiation is a process involved in formation and regeneration of muscle tissue. Myoblast are the
miogenic precursor cells that once activated first proliferate, then withdraw from the cell cycle, differentiate and fuse,
becoming multinucleated cells. Besides the increase in expression of classic muscle markers, like myosin, differentiated
myoblasts (myotubes) show elevated basal and FCCP-estimulated oxygen consumption compared to undifferentiated cells.
Moreover, an increase in expression of mitochondrial complexes (I, II, III and V). occurs in myotubes Recent data has
demonstrated that the treatment with 17-beta-Estradiol is able to induce miogenic profile in myoblast under proliferation
conditions. Although some stages of mechanism activated by 17-beta-Estradiol in myoblasts are known, the consequences
on mitochondrial physiology have not been investigated yet. Thus, the present work intend to investigate the impact of 17beta-estradiol on mitochondrial parameters in myoblasts.
Métodos
Methods: In this work, the model of study was the myoblast lineage C2C12. The cells were maintained in DMEM
supplemented with 10% of Fetal Bovine serum (FBS). In experiments, the cell media were shifted to DMEM supplemented
with 10% of charcoal-stripped Fetal Bovine Serum, for 17-beta-Estradiol treatments (E2), or DMEM supplemented with 2%
of Horse Serum (DM), to induce classic myoblast differentiation. The 17-beta-Estradiol was added in medium to final
concentration of 10 nM and DMSO was used as vehicle in untreated cells (control). Each condition, E2, DM or Control, was
maintained for 24h. After this time, cells were dissociated with trypsin, counted and mitochondrial parameters were
measured. Respiration measurements were obtained in Oroboros Oxygraph 2k. To obtain oxygen consumption
independent from ADP phosphorylation (uncoupled), oligomycin was added to 1 µg/mL. FCCP was used at 5 µM to reach
maximal oxygen consumption. The groups were compared by paired student´s t-test.
Resultados
Results: We did not observe any differences between control and E2 treated cells. However, myoblast in DM showed
higher basal oxygen consumption (control: 55,08 ± 5,82 vs DM: 77,21 ± 6,84. Unit: pmol O2/ s* Mill cells; n=3; p < 0.05) and
residual respiration after addition of oligomycin (control: 49,92 ± 5,11 vs E2: 69,38 ± 5,85. Unit: pmol O2/ s* Mill cells; n=3; p
< 0.05). Moreover, myoblast in DM showed lower relative increase to maximal oxygen consumption after FCCP addition
(Control: 143,14% ± 5,53; DM: 123,62% ± 3,95. Unit: pmol O2/ s* Mill cells, n=3, p < 0.05).
Conclusão
Conclusion: The treatment with 17-beta-estradiol for 24h was not able to induce any modification in mitochondrial
parameters analyzed. On the other hand, short term exposition to DM provoked an increase in basal and respiration related
to proton leak, besides a decrease in maximal oxygen consumption. These data suggest that the myoblast differentiaton
elicited by 17-beta-Estradiol is not related to mitochondria modifications as it occurs in DM cells.
FeSBE 2012
Resumo: 12.012
EFEITO DE DIETA ENRIQUECIDA COM OMEGA-3 OU OMEGA-6 NA MORTE CELULAR
DECORRENTE DA LESÃO POR ISQUEMIA E REPERFUSÃO DE FÍGADOS DE RATOS
3
Autores
ASSIS*, A. M. 2, PAIO**, M. A. 1, KOUYOUMDJIAN, M. 2, BORGES, D. R. 3, NAGAOKA, M. R.
1
Departamento de Bioquímica - UNIFESP, 2 Medicina - UNIFESP, 3 Biociências - UNIFESP
Apoio Financeiro:
FAPESP (08/55928-0) e CNPq (477868)
Resumo
Objetivos
Analisar o efeito da dieta enriquecida com omega-3 ou omega-6 nos níveis de morte celular em modelo de isquemia e
reperfusão hepática.
Métodos
Número Protocolo CEP 0034/09 - UNIFESP. Ratos machos Wistar, de aproximadamente 8 semanas e 250 g, foram
alimentados por 8 semanas com dieta enriquecida com omega-3 ou omega-6. Após este período,o fígado foi removido e
preservado a 4ºC em solução de preservação University of Wisconsin. Após 24h, o fígado foi reperfundido ( < i>ex vivo) a
37ºC com solução de Krebs/BSA. Os seguintes parâmetros metabólicos foram analisados: liberação de glicose e
depuração de bromossulfaleína (BSP). A morte celular geral foi avaliada por imunoensaio (Cell Death), necrose foi avaliada
pela exclusão do azul de Tripan em 5 campos aleatórios e apoptose pelo ensaio da atividade enzimática da caspase-3,
com o substrato DEVDpNA. Dosagem enzimática de aspartato- e alanino-aminotransferases (AST e ALT, respectivamente)
e lactato desidrogenase (LDH) no soro dos animais também foi realizada por ensaios colorimétricos. A análise estatística
foi realizada pelo programa GraphPad Prism 3.0 e foi utilizada ANOVA, seguida de Bonferroni. O nível de significância para
rejeição da hipótese nula foi considerado inferior ou igual a 0,05.
Resultados
Em relação às enzimas séricas, verificamos que AST e LDH não se alteraram com as dietas, entretanto, a dieta rica em
omega-3 promoveu aumento (35,7 ± 6,1U/L) significativo (ANOVA, p=0,0018) de ALT em relação ao grupo controle (19,0 ±
4,1 U/L). Os parâmetros metabólicos hepáticos estudados não se alteraram com as dietas. A morte celular geral bem como
a atividade enzimática da caspase-3 não apresentou diferença significativa entre os grupos estudados. O número de
células sinusoidais necróticas foi significativamente menor (ANOVA, p=0,037) nos animais que receberam dieta rica em
omega 3 (112 ± 8, n=5) em relação ao controle (132 ± 3, n=5).
Conclusão
Nossos resultados sugerem que na lesão por isquemia e reperfusão, a dieta enriquecida com omega-3 ou omega-6 não
protegeu o fígado de morte celular por apoptose, porém não causa danos hepatocelulares, conforme demonstrado pela
liberação das transaminases, tampouco altera o metabolismo hepático. Interessante, nossos dados sugerem que dieta rica
em omega 3 protege o fígado da necrose de células sinusoidais induzida na lesão por isquemia e reperfusão.
FeSBE 2012
Resumo: 12.013
SENESCÊNCIA CELULAR INDUZIDA PELO TRATAMENTO COMBINADO DE RESVERATROL E
QUERCETINA COM BUTIRATO DE SÓDIO EM GLIOBLASTOMAS
1
Autores
VARGAS, J. E. 1, SUHRE, T. 1, CHIELA, E. C. F. 1, SILVA, A. O. 1, LENZ, G. 1 Departamento de
Biofísica - UFRGS
Apoio Financeiro:
CAPES e CNPQ
Resumo
Objetivos
Glioblastomas (GBM) são os tumores primários mais agressivos do sistema nervoso central. A senescência celular
desempenha um papel antitumoral endógeno e parece também estar envolvida na ação de drogas antitumorais. No
presente trabalho, avaliamos os efeitos celulares e mecanismos moleculares do tratamento com Resveratrol (Resv) ou
Quercetina (Querc) combinados com Butirato de Sódio (SB) sobre a senescência celular em glioblastomas.
Métodos
Células C6 (glioma de rato) foram tratadas para determinar a concentração sub-letal de SB, que foi definida através de
uma curva de crescimento (population doubling) de 10 dias. Posteriormente, foi avaliada a viabilidade celular após o
tratamento com SB combinado com Resv e Querc por 24, 48 e 72h e realizou-se uma curva de crescimento por 10 dias
com subseqüente marcação de X-gal (substrato da enzima β-galactosidase) para avaliar senescência. O potencial
proliferativo das células após tratamento foi medido pelo ensaio clonogênico. A partir da obtenção dos dados, foi realizado
ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Resultados foram considerados estatisticamente significativos quando apresentaram
* p < 0.1,** p < 0.01 e ***p < 0.001. Todos os experimentos anteriores foram repetidos três vezes, de forma independente.
Resultados
Concentrações de 3mM e 10mM de SB resultaram ser letais, 1mM e 2mM sub-letais, sendo ambas estatísticamente
significativas quando comparadas com o controle (***p < 0.001) . Para avaliar, o efeito agudo sobre a viabilidade celular,
células C6 foram tratadas com Resv (10 uM) e Querc (25 uM) combinados com SB ( 2mM). Em 72h houve uma diminuição
de 25% para o tratamento com Resv e 55% para Querc, e quando combinados com SB, a redução se estendeu a 85%
(Resv-SB) e 95% (Querc-SB), respectivamente comparada com o controle não tratado, porém estes tratamentos
combinados não são significativos comparados ao tratamento com SB para C6. Posteriormente, realizaram-se curvas de
crescimento populacional por 10 dias utilizando as concentrações anteriores. As combinações (Resv-SB e Querc-SB)
apresentaram diferenças significativas com aumento da letalidade (***p < 0.001) no décimo dia de tratamento. Após este
dia de tratamento, realizou-se a marcação com X-gal. As células tratadas com Resv-SB resultaram ser 85%±0,07 positivas
e as tratadas com Querc-SB foram 80%±0,09 positivas para β-galactosidase, apresentando diferença significativa
comparado ao tratamento com SB (*p < 0.01). Similarmente, ensaios clonogênicos confirmaram a diminuição da
proliferação celular pelo tratamento combinado. O número de colônias formadas a partir de células tratadas com Resv-SB
resultou ser de 12,3±8,05 e as tratadas com Querc-SB foram de 18±7,48 apresentando diferença significativa considerando
o tratamento com SB (*p < 0.01).O número de colônias de SB corresponde a 45,5±18,5 e o controle não tratado a 59,1 ±
18,44.
Conclusão
A combinação de SB com Resv e Querc aumenta a senescência celular nas células tumorais. Oferecendo assim, uma
alternativa terapêutica segura no tratamento de GBM.
FeSBE 2012
Resumo: 12.014
AVALIAÇÃO DO MECANISMO DE AÇÃO ENVOLVIDO NO EFEITO NEUROPROTETOR DO ÁCIDO
DOCOSAHEXAENÓICO (DHA) EM UM MODELO IN VITRO DE ISQUEMIA CEREBRAL
1
Autores
KRAUS, J. R. 1, LUDKA, F. K. 1, OLESCOWICZ, G. 1, MOLZ, S. 1, MOLZ, S. 1 Laboratório de
pesquisas - UnC-Canoinhas/SC
Apoio Financeiro:
Fundação de apoio à pesquisa científica e tecnológica do estado de Santa
Catarina – FAPESC.
Resumo
Objetivos
Objetivos: A privação de glicose e oxigênio (PGO) resultante da interrupção do fornecimento de sangue durante a isquemia
cerebral causa estresse oxidativo, aumento da liberação de glutamato, excitotoxicidade e morte celular. (J Neurol Sci., 1:1,
2000; Free Radic Biol Med, 3:376, 2006). A adenosina tem papel a neuromodulator nas sinapses através da ativação de
receptores A1, A2A, A2B e A3. A ativação dos receptores de adenosina resulta em neuroproteção frente a diversos danos
ao sistema nervoso, incluindo a isquemia cerebral in vivo e frente a modelos de PGO que utilizaram fatias de hipocampo
(Prog Neurobiol., 68:, 2003). O ácido docosahexaenoico (DHA) é um ácido graxo essencial da família ω-3 que apresenta
potente efeito neuroprotetor. Estudos in vivo demonstram que o DHA inibe a neurodegeneração induzida pela isquemia
cerebral (Brain Pathol., 15:66, 2005). Tendo em vista que a ativação de receptores de adenosina e o DHA são
neuroprotetores frente ao dano celular induzido pela isquemia cerebral, o objetivo deste trabalho foi investigar o
envolvimento da ativação de receptores de adenosina no efeito neuroprotetor do DHA em fatias de hipocampo submetidas
a PGO, um modelo in vitro de isquemia cerebral.
Métodos
Métodos:Foram utilizados camundongos machos swiss (60-90dias) com 35-40g, aprovado pelo comitê de ética em
pesquisa número 986/09. Para a indução do modelo de isquemia in vitro, as fatias foram pré-incubadas na presença de
diferentes concentrações de DHA em tampão Krebs Ringer Bicarbonato (KRB). Posteriormente este meio foi retirado e as
fatias foram então incubadas por 15 minutos com DHA em tampão KRB onde a D-glucose foi substituída por 2-deoxyglucose (PGO) e gaseificadas com N2. Durante o tempo de reperfusão, o meio de incubação PGO foi retirado e substituído
por meio de incubação KRB gaseificado com O2 e mantidas por 2h. A atividade mitocondrial foi avaliada através do
método MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) relacionando a viabilidade celular. Os resultados
obtidos foram através da análise de variância de uma via (ANOVA) seguido do teste de Tukey.
Resultados
Resultados: Os resultados demonstraram que a PGO (61% de viabilidade celular) foi prevenida pela pré-incubação das
fatias com DHA nas concentrações de 5, 10 e 50µM (87, 90 e 92% de viabilidade celular, respectivamente, n=6). O efeito
neuroprotetor do DHA (5µM) frente a morte celular induzida pela PGO foi completamente prevenida na presença de um
antagonista de receptor A1 de adenosina (DPCPX 100nM, 68% de viabilidade celular, n=6) e parcialmente prevenido na
presença de antagonista A2B de adenosina (aloxazina 0,1µM, 70% de viabilidade celular, n=6) ou de antagonista A3 de
adenosina (VUF5574, 1µM, 72% de viabilidade celular, n=6). O efeito neuroprotetor do DHA não foi alterado na presença
de um antagonista de receptor A2A de adenosina (ZM241385 50nM, 78% de viabilidade celular, n=6).
Conclusão
Conclusão: Estes resultados indicam que o efeito neuroprotetor do DHA frente em fatias de hipocampo submetidas a PGO
envolve a ativação de receptores de adenosina.
FeSBE 2012
Resumo: 12.015
EFEITO DA OBESIDADE INDUZIDA POR DIETA SOBRE A RESPOSTA HEMATOLÓGICA
CENTRAL E PERIFÉRICA EM RATOS WISTAR
1
CARMO, L. S. 2, ROGERO, M. M. 3, CORTEZ, M. 4, XAVIER, J. G. 5, PAREDES-GAMERO, E. J.
5
, NOGUEIRA-PEDRO, A. 1, BORELLI, P. 1, FOCK, R. A. 1 Departamento de Análises Clínicas e
Toxicológicas - USP, 2 Departamento de Nutrição - USP, 3 Departamento de Análises Clínicas e
Autores
Toxicológicas - USP, 4 Departamento de Patologia Animal e Comparada - UNIP, 5 Departamento de
Bioquímica - UNIFESP, 6 Departamento de Bioquímica - UNIFESP, 7 Departamento de Análises
Clínicas e Toxicológicas - USP, 8 Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas - USP
Apoio Financeiro:
FAPESP; CNPQ
Resumo
Objetivos
As características da dieta podem determinar não somente a saúde, mas também influenciar o desenvolvimento das
doenças crônicas não-transmissíveis (DCNT), como obesidade, câncer, doenças cardiovasculares e diabetes, em período
de vida mais tardio. O aumento do tecido adiposo corporal e conseqüentemente a geração de possíveis mediadores
ocasionados pelo aumento da adiposidade podem ter um efeito direto na proliferação de células-tronco hematopoéticas.
Portanto, propusemo-nos avaliar o efeito da ingestão de uma dieta hiperlipídica sobre a capacidade proliferativa e de
diferenciação das células mononucleares medulares.
Métodos
Ratos, Wistar, machos, com dois meses de idade, foram distribuídos em dois grupos, controle (CON) (n=6) e experimental
(HL) (n=6). Após 12 semanas de protocolo, os animais foram eutanasiados e, realizados o hemograma, mielograma,
caracterização da porcentagem de células CD34+/CD133+ (citometria de fluxo), avaliação do ciclo celular (PI e 7AAD),
cultura líquida e semissólida. O projeto de pesquisa deste trabalho foi aprovado pela comissão de ética no uso de animais
da FCF/USP (273, 35/2010).
Resultados
Animais do grupo HL apresentaram aumento de PCR, colesterol total, LDL e triacilglicerol (610,8 ± 106,3 ng/mL N=6)
(72,42 ± 2,867 mg/dL N=12), (29,91 ± 2,359 mg/dL N=13), (95,50 ± 5,101 mg/dL N=12), quando comparado com os
animais do grupo controle (1002 ± 68,54 mg/dL N=6) (86,29 ± 2,908 mg/dL N=14), (40,72 ± 1,541 mg/dL N=15) e (117,3 ±
6,523 mg/dL N=14), p < 0,05. O número de neutrófilos circulantes foi maior no grupo HL (30,1 ± 2,0 % e 1815 ± 119⁄mm3)
em relação ao grupo CON (24,1 ± 1,6 % e 1410 ± 112⁄mm3, p≤0,05), bem como o número de células totais da medula
óssea (2,99 ± 0,36 x 108 cels⁄mm3 e 2,6 ± 0,32 x 108 cels⁄mm3, respectivamente, p≤0,05) e o número de neutrófilos
medulares (6,84 ± 1,0 x 107 cels⁄mm3 e 4,92 ± 0,72 x 107 cels⁄mm3 respectivamente, p≤0,05). Animais do grupo HL
apresentaram, na medula óssea, maior porcentagem de células CD34+ (1,783 ± 0,3256 N=6) e maior porcentagem de
células totais na fase S do ciclo celular (7,890 ± 0,2375 N=4) bem como maior número de células CD34+ na fase S do ciclo
celular (28,03 ± 1,913 N=4) quando comparados com animais do grupo controle (3,093 ± 0,3443 N=6), (10,47 ± 0,7303
N=7), (46,93 ± 5,621 N=4), respectivamente. Os blastos hematopoéticos isolados do gupo HL apresentam maior
capacidade de formar unidades de colônia granulo-monocitica (CFU-GM) quando comparados com o grupo CON (2,35 ±
0,17 x 105 cels⁄mm3 e 1,84 ± 0,21 x 105 cels⁄mm3, respectivamente, p≤ 0,01).
Conclusão
Os animais hiperlipídicos apresentaram neutrofilia, eosinofilia e linfocitose medular, enquanto que no sangue periférico
encontramos neutrofilia e eosinopenia. A hiperplasia medular decorreu em parte do aumento da população de células
CD34+ e da síntese de IL-3. Os resultados in vitro mostraram aumento da fase S/G2M do ciclo celular das células totais da
medula óssea e das células CD34+ e aumento da capacidade de diferenciação celular observada pelo aumento de G-CSF.
FeSBE 2012
Resumo: 12.016
EFEITOS DA MICROCORRENTE SOBRE O PROCESSO DE REPARO EM CARTILAGEM XIFÓIDE
DE RATOS (Rattus norvegicus) MACHOS DE DIFERENTES IDADES
Autores
1
CICCONE, C. D. C. 1, ESQUISSATTO, M. 1 Pós Graduação - UNIARARAS
Apoio Financeiro:
Fundação Herminio Ometto
Resumo
Objetivos
O objetivo desse estudo foi analisar o processo de reparo em cartilagem xifoide de ratos, tratados por eletroterapia, em
animais de diferentes idades.
Métodos
Sessenta ratos Wistar machos com idade de 45 e 90 dias de idade, obtidos do CEA-UNIARARAS, foram divididos em
quatro grupos: Grupos Controle: 45d (GC45d) e 90d (GC90d) e Grupos Tratados: 45d (GT45d) e 90d (GT90d). Os animais
foram mantidos em caixas individuais e tratados com ração comercial e água ad libitum. Estes foram anestesiados por
solução de xylazina (0,2 ml/kg) e ketamina (1,0 ml/kg) e submetidos ao procedimento cirúrgico experimental. Após isolada,
a cartilagem xifóide foi lesionada, com preservação do pericôndrio, por punch (3mm) na região central. Após a cirurgia, os
animais foram tratados com dipirona (0.5% na proporção de 1:1000) durante 24h. Os animais do GT foram tratados
diariamente por corrente elétrica contínua de baixa frequência (1 Hz) e baixa intensidade (20 μA) por 5 min. Para este
procedimento, cada animal foi levemente anestesiado com 50% da dose utilizada para o procedimento cirúrgico. O GC foi
submetido ao mesmo procedimento sem o tratamento. Cinco animais de cada grupo foram sacrificados após 7, 21 e 35
dias da lesão para remoção e preparo da cartilagem para análise histopatológica e morfométrica do tecido de reparo. Os
dados foram analisados por ANOVA e pós-teste de Tukey e comparados pelo Teste t de Student ( p < 0.05). Este estudo
foi aprovado pelo CEUA-UNIARARAS (Processo n.073/2010).
Resultados
Foram observadas diferenças significativas quanto a porcentagem de redução da área de lesão entre os grupos. O GC45d
apresentou valores de 2.5±1.1 (7d), 31.8±10.6 (21d) e 44.5±11.8 (35d). No GT45d, os valores foram 3.9±1.8 (7d), 36.4±9.8
(21d) e 49.8±13.7 (35d). Em GC90d, os dados foram 1.9±1.4 (7d), 23.3±9.7 (21d) e 41.5±9.3 (35d). No GT90d, foram
2.6±1.9 (7d), 35.1±6.7 (21d) e 44.2±18.4 (35d). Não houve diferenças entre as idades. No GC45d, foi observado um
aumento na deposição de tecido fibroso, na área de reparo, com intensa basofilia em todo o período experimental. No
GT45d foi observado ninhos de cartilagem neoformada a partir do 21º dia. As amostras do GC90d apresentaram tecido
fibroso, permeado com células conjuntivas e vasos sanguíneos, mas com uma basofilia menos intensa que os animais de
45d. Alguns pontos de tecido cartilaginoso foram observados em áreas próximas a borda nos animais de 35d. Nos animais
do GT90d houve predomínio de tecido fibroso na área de reparo, com aparecimento de tecido neoformado, no 35º dia,
associado a borda da lesão. O conteúdo de células conjuntivas no tecido de reparo apresentou diferenças significativas
entre os grupos, mas não apresentou diferenças entre as idades. No GC45d, os valores (N in 104µm2) foram 23.4±8.9
(7d), 47.4±11.3 (21d) e 91.5±22.8 (35d). No GT45d, os dados foram 28.2±7.8 (7d), 56.6±14.1 (21d) e 107.8±20.7 (35d).
Para o GC90d, os valores atingiram 18.6±9.1 (7d), 39.4±16.7 (21d) e 88.5±23.1 (35d). Em GT90d, foram 24.7±4.9 (7d),
49.9±15.7 (21d) e 100.5±21.6 (35d). Fibras elásticas foram observadas no tecido de reparo em todos os grupos e idades,
mas não apresentaram diferenças organizacionais importantes entre eles. Pontos de calcificação foram observados nas
amostras de 35d do GT45d e GT90d.
Conclusão
Os dados indicam, apesar da resposta particular de cada idade, que a microcorrente representa uma alternativa
terapêutica importante no reparo da cartilagem hialina em animais pré-púberes e jovens adultos.
FeSBE 2012
Resumo: 12.017
ASPECTOS ULTRAESTRUTURAIS DA CARTILAGEM XIFÓIDE DE RATOS DE DIFERENTES
IDADES APÓS LESÃO EXPERIMENTAL E TRATAMENTO POR MICROCORRENTE.
Autores
1
MITO, D. 1, ESQUISSATTO, M. 1 Pós Graduação - UNIARARAS
Apoio Financeiro:
Fundação Herminio Ometto
Resumo
Objetivos
O objetivo desse estudo foi analisar as características ultraestruturais das células e da matriz extracelular da cartilagem
xifoide de ratos Wistar machos, durante o processo de reparo e tratamento por microcorrente.
Métodos
Sessenta ratos Wistar machos com idade de 45 e 90 dias de idade, obtidos do CEA-UNIARARAS, foram divididos em
quatro grupos: Grupos Controle: 45d (GC45d) e 90d (GC90d) e Grupos Tratados: 45d (GT45d) e 90d (GT90d). Os animais
foram mantidos em caixas individuais e tratados com ração comercial e água ad libitum. Os mesmos foram anestesiados,
utilizando xylazina (0,2 ml/kg) e ketamina (1,0 ml/kg), e submetidos ao procedimento cirúrgico experimental. Após isolada,
a cartilagem xifóide foi lesionada, com preservação do pericôndrio, por punch (3mm) na região central. Após a cirurgia, os
animais foram tratados com dipirona (0.5% na proporção de 1:1000) durante 24h. Os animais do GT foram tratados
diariamente por corrente elétrica contínua de baixa frequência (1 Hz) e baixa intensidade (20 μA) por 5 min. O GC foi
submetido ao mesmo procedimento sem o tratamento. Cinco animais de cada grupo foram sacrificados após 7, 21 e 35
dias da lesão para remoção e preparo da cartilagem para análise ultraestrutural e morfométrica do tecido de reparo. Os
dados foram analisados por ANOVA e pós-teste de Tukey e comparados pelo Teste t de Student ( p < 0.05). Este estudo
foi aprovado pelo CEUA-UNIARARAS (Processo n. 073/2010).
Resultados
No GC 45d de 7d e 21d, as células fibroblásticas são envolvidas por uma matriz fibrilar frouxa. Nos animais de 35d, as
células predominantes tem características condroblásticas com grande quantidade de vesículas de secreção e abundante
retículo endoplasmático rugoso (RER), presente no citoplasma. A matriz pericelular apresenta uma malha fibrilar mais
compacta que a observada na matriz territorial. No GT 45d de 7 e 21d, as células apresentaram características
condroblásticas com citoplasma rico em vesículas de secreção. Estas estão envolvidas por uma matriz pericelular de
natureza predominantemente fibrilar. Aos 35 dias, as células condroblásticas apresentam citoplasma com grande
quantidade de RER e vesículas de secreção. Nas amostras de GC90d de todas as idades, as células predominantes
apresentaram aspectos condroblásticos com a presença de vesículas secretoras distribuídas pelo citoplasma celular. Nos
animais de 35d no GC foram observadas células ricas em RER e complexo de Golgi. No GT90d, por outro lado, os animais
de 7 dias apresentaram, predominantemente, células com aspecto fibroblástico, contudo, nos animais de 21d e 35d do GC
e GT, elas passaram a apresentar aspecto condroblástico. A matriz pericelular se apresentou com aspecto fibrilar nos
animais de 7d e 21d nos dois grupos experimentais. Aos 35d, a matriz pericelular de ambos os grupos passam a
apresentar uma organização granular associada a uma malha fibrilar frouxa. A quantificação das marcações para
proteoglicanos (método de Azul de cuprolínico) apresentou diferentes significativas entre os grupos e idades estudadas. Os
dados (n/25 µm2) apurados foram: GC45d (7d:3,4±1,9, 21d: 4,1±1,7 e 35d:9,9±2,8); GT45d (7d:4,2±1,1, 21d: 7,6±2,2 e
35d:14,2±1,7); GC90d (7d:2,9±1,6, 21d: 3±1,5 e 35d: 3,4±1,8) GT90d (7d:2,8±1,1, 21d: 2,9±1,2 e 35d 6,2±2,87).
Conclusão
Os resultados desse estudo indicam que a microcorrente estimula a diferenciação das células conjuntivas e a deposição de
proteoglicanos durante o reparo da cartilagem hialina em animais pré-púberes e jovens adultos.
FeSBE 2012
Resumo: 12.018
COLLAGEN V FIBRILOGENESIS FAILING IN SKIN AND LUNG FIBROBLASTS CULTURE FROM
SYSTEMIC SCLEROSIS
1
TEODORO, W. R. 1, MORAIS, J. 1, MARTIN, P. 1, VELOSA, A. P. P. 1, CARRASCO, S. 1,
TEODORO, W. R. 1, SOUZA, R. B. 2, KATAYAMA, M. L. 1, GOLDEINSTEIN-SCHAINBERG, C.
Autores 3, PARRA, E. R. 3, CAPELOZZI, V. L. 1, YOSHINARI, N. H. 1 Disciplina de Reumatologia - FMUSP,
2
Divisão de Oncologia do Departamento de Radiologia - FMUSP, 3 Departamento de Patologia FMUSP
Apoio Financeiro:
FAPESP, Federico Fundation, LIM 17, LIM 05
Resumo
Objetivos
The type V collagen (COLV) mutations are involved in collagen vascular diseases, such as systemic sclerosis (SSc), in
which an unusual accumulation of this collagen was demonstrated (Pathol Res Pract 200:681, 2004). In this context, our
purpose was to analyze the tridimensional reconstruction (3D) and biochemical and molecular profile of COLV alpha-1 and
alpha-2 chains in skin and lung fibroblasts culture from patients with SSc.
Métodos
Lung biopsies of 7 patients and 3 controls and skin of 6 patients and 6 controls were obtained from SSc according American
College of Rheumatology (CAPPesq 0817/07, CAPPesq 0436/08). For fibroblast culture skin and lung evaluation was used
the following score: intense expression (1-4), fibroblast number/field (1-2) and collagen fibers architecture (1-3).The total
evaluations were: mild (3-5), moderate (6-7) and severe (8-9). COLV tridimensional reconstruction (3D) was performed by
confocal microscopy, Col Vα1 and Col Vα2 gene expression in fibroblasts of skin and lung was performed in PCR-RT and
COLV protein expression by immunobloting.
Resultados
The structure of COL V fiber in 3D reconstruction showed distorted and strongly thickened fibers in skin and lung fibroblasts
with irregular bundles of Col V distributed in parallel and perpendicular arrangements resulting in a dense network in SSc
patients compared with thin fibers pattern from the healthy controls. Collagen quantification showed increase of Col V fibers
expression in SSc cutaneous fibroblast (82,50 ± 9,5% vs 47,5 ± 9,5% p= 0,002) and lung fibroblast 38,87 ± 2,99% vs 20,33
± 7,50% p=0,002) compared with respective controls. The molecular evaluation demonstrated increased Col Vα1 and Col
Vα2 mRNA expression in SSc fibroblast skin when compared to control (1,375 ± 0,373au: arbitrary unity vs 0,0047 ±
0,0013au, p= 0.05). Similar results were observed in lung (1,61 ± 0,654 vs 0,99±0,51au;p= 0,05).The proportion Col
Vα1/Col Vα2 mRNA in fibroblast lung and skin was higher in SSc than in controls being the chains ratio1:2. COL V chains
from skin and lung fibroblasts presented alteration of molecular weight of the quoted chain.
Conclusão
The overexpression and the unusual organization of COLV fibers, besides the biochemical changes, suggest an
interference with the fibrillogenesis process in skin and pulmonary fibrosis from SSc patients, reinforcing the participation of
this collagen in pathogenesis of SSc and open new therapeutic perspectives for these patients.
FeSBE 2012
Resumo: 12.019
COLÁGENOS V: INFLUÊNCIA NA DIFERENCIAÇÃO DAS CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS
DO TECIDO ADIPOSO DE COELHOS
1
CRUZ, I. C. B. D. ** 1, VELOSA, A. P. P. 1, CARRASCO, S. 1, GOLDENSTEIN-SCHAINBERG, C.
Autores , POMPEU, E. 3, CAPELOZZ, V. L. 1, TEODORO, W. R. 1, FULLER, R. 1 Disciplina de
Reumatologia - FMUSP, 2 Centro de Bioterismo - FMUSP, 3 Departamento de Patologia - FMUSP
2
Apoio Financeiro:
FAPESP – 2010/17824-8, Frederic Foundation Grants, FFMUSP.
Resumo
Objetivos
A osteoartrite (OA) é a doença articular mais prevalente do homem, entretanto os tratamentos atualmente disponíveis são
ainda pouco eficazes. O estudo das células tronco mensenquimais (CTMs) tem sido uma grande esperança no tratamento
de doenças osteoarticulares, devido a sua grande capacidade de proliferação e diferenciação em condrócitos. As proteínas
da matriz cartilaginosa atuam na formação e integridade do tecido e na manutenção do fenótipo celular. Nossa proposta foi
avaliar a influência dos colágeno V e XI (COLV e COLXI, respectivamente) na diferenciação das CTMs provenientes do
tecido adiposo de coelhos.
Métodos
As CTMs foram isoladas do tecido adiposo de coelhos (n=2) Nova Zelândia (machos, com peso aproximado de 2300g e
idade média de 2 meses) (CAPPesq 028/11), utilizando liberase 12,5 mg/mL e imersas em meio de cultura. O colágeno V
(COLV) proveniente de placenta humana comercial e o colágeno XI de traquéia de boi (COLXI) isolado por gradiente
sequencial salino, (COLV, COLXI e COLV/XI) foram adicionados in vitro na concentração de 1:50. Após 4 semanas de
confluência dessas células foram confeccionadas lamínulas e lâminas (com pellet) e imunomarcação para colágenos I, II,
III, CD34 e vimentina e histoquímica para Picrosirius e Azul de Toluidina. Comitê de ética em pesquisa 028/11.
Resultados
As CTMs cultivadas com COLV responderam positivamente ao estímulo, podendo observar a síntese de colágeno total
(Picrosirius) e proteoglicanos (Azul Toluidina), além de expressar intensa quantidade de colágeno II, específico de
condrócitos, isto não ocorreu ao estímulo de COLXI e COLV/XI. A cultura estimulada com COL XI e COLV/XI mostrou
marcação positiva para colágenos fibrilares (I e III).
Conclusão
Apesar da semelhança estrutural entre os colágenos V e XI, suas funções mediante as CTMs in vitro parecem diferentes.
O COLV apresenta ação efetora na diferenciação das CTMs em fenótipo condrocitário, visto a expressão aumentada de
colágeno II, enquanto o COL XI influencia na expressão de colágenos de reparo/fibróticos como os tipos I e III. Este estudo
mostra que a terapeutica com células mesenquimais, aliadas a proteínas estruturais de matriz possibilitam o
estabelecimento de novas condutas terapêuticas em processos degenerativos como a OA.
FeSBE 2012
Resumo: 12.020
Melanoma cells lines exposed to ultraviolet radiation: VHR expression and contribution to
proliferation and survival
Autores
1
SANTOS, A. dos 1, FORTI, F. L. 1 Departamento de Bioquimica - USP
Apoio Financeiro:
Fapesp grant #08/58264-5 and fellowship #2011/05822-3
Resumo
Objetivos
The purpose of the present study was to investigate the effect of exogenous expression of the VHR phosphatase on the
survival and proliferative capacity of melanoma cell lines exposed to ultraviolet radiation (UVR).
Métodos
Malignant melanoma cell lines (Mel85 and MeWo) were seeded in RPMI supplemented with 10% heat inactivated fetal
bovine serum (FBS). MeWo clonal cell lines expressing wild type VHR or the dominant negative mutant (C124S) were
generated by stable transfections with the pEF-His-tagged vector system harboring the respective VHR cDNAs. Cell-based
assays (growth curves, clonogenic assays and senescence-associated β-galactosidase staining) and western blots were
performed to analyze the effect of VHR in both melanoma cell lines exposed to equivalent doses of ultraviolet radiation
(UVA, UVB and UVC = UVR).
Resultados
The VHR expression in parental cell lines varies between the three UVs wavelength, but the kinetics is very similar. In
relation to growth curves and clonogenic assays MeWo cell line recovers its growth faster than Mel85 cell line after UV
exposure and shows higher proliferative capacity and survival. For instance, the number of colonies formed in clonogenic
assay of Mel85 (seeded at a density of 1000 cells/plate), was 85.25; 67.25 and 37.5 when exposed to UVA (50kJ/m2), UVB
(80J/m2) and UVC (4J/m2), respectively. In clonogenic assays of MeWo the number of colonies formed was 90.5, 54 and
19.5 when exposed to UVA (50kJ/m2), UVB (80J/m2) and UVC (4J/m2), respectively. Both cell lines present similar
senescence-associated β-galactosidase staining when exposed to UVR compared to non-irradiated cells. One of the
selected MeWo clonal cells expressing the dominant negative mutant VHR-C124S presented a striking resistance to UVR in
survival assays when compared to wild-type or empty vector expressing clones (number of colonies formed in clonogenic
assay to dominant negative mutant was 129.5, 93 and 61.5 when exposed to UVA (50kJ/m2), UVB (80J/m2) and UVC
(4J/m2), respectively).
Conclusão
The proliferative and survival response of MeWo cells expressing the wild-type VHR compared to the dominant negative
mutant (C124S) of VHR are differently affected by the UVR treatments. These results raise a possible role of VHR
phosphate in DNA damage and repair of melanomas.
FeSBE 2012
Resumo: 12.021
Balanço entre parâmetros de adipogênese e apoptose no tecido adiposo mesentérico durante o
desenvolvimento da caquexia induzida
1
FRANCO, F. O. 1, HENRIQUES, F. S. 1, KNÖB, P. 1, SANTOS, K. B. N. H. D. 2, NEVES, R. X. 1,
Autores SHIDA, C. S. 1,2, SERTIÉ, R. A. L. 3, PERES, S. B. 1, JR, M. B. 1 Núcleo Integrado de Biotecnologia UMC, 2 Instituto de Ciências Biomédicas - USP, 3 Departamento de Ciências Morfofisiológicas - UEM
Apoio Financeiro:
FAPESP 2010/51078-1 e 2012/00488-0
Resumo
Objetivos
A caquexia é uma síndrome multifacetada, caracterizada pela acentuada redução da massa corporal total, afetando
principalmente o tecido adiposo branco (TAB) e muscular estriado esquelético. Neste aspecto, apesar da acentuada
redução na massa de TAB visceral, notadamente o mesentérico, ser bem estabelecida, pouco se sabe acerca das
possíveis alterações no turnover celular deste tecido durante o desenvolvimento da síndrome. Assim, o presente estudo
avaliou alguns parâmetros relacionados à adipogênese e apoptose durante o desenvolvimento da caquexia induzida por
tumor de Walker 256.
Métodos
Os procedimentos experimentais estão de acordo com a Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) na Universidade
de Mogi das Cruzes (N°001 / 2012). Foram estudados 20 ratos machos da linhagem Wistar (250-300g), utilizado células
tumorais de Walker 256 para indução da caquexia, com inoculação subcutânea de 2x107 células no flanco direito de cada
animal. Os grupos experimentais foram compostos da seguinte forma; 4, 7 e 14 dias após a inoculação das células
tumorais. Para grupo controle utilizou-se animais submetidos ao mesmo procedimento, sem inoculação das células
tumorais (tempo 0). Em cada período experimental, amostras do TAB mesentérico e da fração vascular estromal (FVE), do
mesmo tecido, foram coletas para análises posteriores. A expressão gênica de Pref-1 (marcador fenotípico de préadipócito) e adiponectina (marcador de adipócito maduro) da FVE foram avaliados por qRT-PCR. A expressão proteica da
Pró-caspase-3, Pró-Caspase-9 e Caspase-9 (marcadores de apoptose) do TAB mesentérico foram avaliadas por Western
Blot. Para análises estatísticas utilizou-se ANOVA em uma via, seguida do pós-teste de Tukey. O valor adotado para
significância foi p < 0,05.
Resultados
A expressão gênica de Pref-1 aumentou 8 vezes ( p < 0,05) no 4º dia e 5 vezes ( p < 0,05) no 7º dia em relação ao grupo
controle, voltando aos níveis iniciais no 14º dia após a inoculação, quando comparado ao tempo 0. A expressão gênica da
adiponectina em celulas provenientes da FVE não apresentou diferença nos perídos avaliados, apesar de forte tendência
(p= 0,0567). No TAB mesentérico, a concentração de Caspase-9 (clivada) aumentou 4 vezes ( p < 0,05) no 7° dia, quando
comparado ao tempo 0. Não houve alteração na Pró-Caspase-9 e 3 em nenhum período avaliado.
Conclusão
O presente estudo demonstrou alteração na expressão gênica do Pref-1, sugerindo aumento na população de préadipócitos nas fases inicias do desenvolvimento da caquexia, no entanto, este parece não ser seguido ao aumento de
adipócitos maduros na FVE. Durante o desenvolvimento da síndrome, houve aumento da clivagem da caspase-9,
sugerindo um papel relevante da via apoptótica no TAB mesentérico em ratos caquéticos.
FeSBE 2012
Resumo: 12.022
EFEITO DA CROTAMINA NA EXPRESSÃO DE GENES DA VIA DE AUTOFAGIA EM MODELO DE
CÉLULA TUMORAL
1
NEIVA, M. 1, YONAMINE, C. M. 1, NERING, M. B. 2, OLIVEIRA, E. B. 3, SUNAGA, D. Y. 4,
Autores PELLEGRINO, R. 1, HAYASHI, M. A. F. 1 Farmacologia - EPM/Unifesp, 2 Bioquímica e Imunologia
- USP-Ribeirão Preto, 3 Instituto de Biociências - USP, 4 Laboratório de Microarrays - Afip
Apoio Financeiro:
CAPES, CNPq e FAPESP
Resumo
Objetivos
Avaliar a o efeito da crotamina na modulação de alguns genes envolvidos na via de autofagia em modelo de célula tumoral.
Métodos
A modulação de alguns genes envolvidos na via de autofagia foi avaliada por ensaios de microarray utilizando células
tumorais tratadas com crotamina. A modulação, tanto negativa quanto positiva, destes genes foi confirmada por PCR em
tempo real (qPCR). Células da linhagem B16F10 foram cultivadas e tratadas por 24 horas, em triplicata, com a crotamina
natural purificada do veneno. Em seguida, o RNA total das células não tratadas (controle) e tratadas (com 1 ou 10 µM de
crotamina) foi extraído utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, Eugene, OR, USA) e após quantificação por
espectrofotometria, o mesmo foi analisado qualitativamente por eletroforese em gel de agarose corado com brometo de
etídeo. Para os ensaios de microarray, o RNA total foi re-purificado utilizando o RNeasy kit (Qiagen, Hiden, Alemanha).
Foram utilizados aproximadamente 1-2 µg de RNA total de cada condição de tratamento para realização dos ensaios de
microarray (n = 3 para cada condição de tratamento). Para os ensaios de qPCR, a partir de 5 µg de RNA total das
amostras controle ou tratadas sintetizou-se o cDNA utilizando o kit Superscript first strand synthesis (Invitrogen). As
reações de qPCR foram realizadas utilizado o kit Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (n = 5 para cada condição),
e primers na concentração de 100 µM num volume final de 10 µL. As reações foram realizadas em triplicata utilizando o
equipamento Mx3000pro (Stratagene). A análise dos dados foi feita utilizando o software MxPro 4.10, que calcula a
expressão relativa (razão) dos genes alvo divididos pela expressão do gene normalizador, i.e., GAPDH.
Resultados
A partir da análise dos resultados de microarray foram identificados oito genes envolvidos da via de autofagia
potencialmente modulados nas células B16F10 pelo tratamento com a crotamina. Preliminarmente foram selecionados três
destes genes para os ensaios de confirmação por qPCR: Atg4a, Ambra1 e UlK4. O gene Ulk4 codifica para uma proteína
diretamente envolvida no inicio do processo de autofagia, enquanto o Ambra1 e Atg4a estão envolvidos na formação do
autofagossomo. As análises indicaram a regulação negativa dos genes Atg4a e Ambra1 com valores médios de razão
(&±;erro padrão) 0,90 ± 0,04 e 0,82 ± 0,03, respectivamente. Para o gene Ulk4 as análises indicaram regulação positiva
com valor de razão igual a 1,26 ± 0,04.
Conclusão
Embora os dados permitam sugerir uma regulação positiva de um dos genes envolvidos no inicio do processo de autofagia,
os outros genes analisados e que estão envolvidos na formação do autofagossomo, e que é um processo chave desta via,
parecem estar sendo modulados negativamente, ou seja, apresentam uma expressão diminuída frente ao tratamento com
a crotamina. O trabalho será complementado com a análise dos outros genes, e mais experimentos que permitam avaliar
também a expressão protéica (como o Western blot) serão realizados em breve para se confirmar essa potencial
modulação negativa da via de autofagia induzida pelo tratamento com a crotamina.
FeSBE 2012
Resumo: 12.023
Neuroprotective effects of Atorvastatin in Mice Hippocampal Slices Submitted to OxygenGlucose Deprivation are Dependent of Cholesterol Reduction
Autores
1
Vandresen-Filho, S. 1, MARTINS, W. C. 1, BERTOLDO, D. B. 1, TASCA, C. I. 1 Bioquímica - UFSC
Apoio Financeiro:
CAPES, CNPq, IBN/NET
Resumo
Objetivos
The aim of this study was to investigate if the protective effects of atorvastatin, a cholesterol-lowering agent by inhibition of
3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase, would be prevented by cholesterol reposition in hipocampal
slices submitted to oxygen-glucose deprivation (OGD), an in vitro model of ischemia.
Métodos
All experiments have been approved by Comite de Ética de Uso de Animais - UFSC (23080.037859/2010-15). Male adult
Swiss albino mice (30–50 g, 2-3 months old) were pretreated with Atorvastatin 10 mg/kg/day, orally, or vehicle (saline,
0.9%) for seven days. In the eighth day, mice were killed by decapitation and hippocampi rapidly dissected and placed in
ice-cold Krebs–Ringer bicarbonate buffer (KRB). To evaluate the effects of cholesterol reposition, 50 µM of cholesterol was
preincubated before OGD induction. In order to obtain the in vitro model of ischemia, hippocampal slices were incubated for
15 min in an ischemic buffer (IB), where D-glucose was replaced by 2-deoxy-glucose and gassed with nitrogen, followed or
not by 2h of reperfusion in KRB. Cellular viability assay were performed by the 3-4,5-dimethylthiazol-2-yldiphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. For the glutamate uptake assay, the intracellular L-[3H]Glutamate content was
measured through liquid scintillation. To evaluate the glutamine synthetase (GS) activity, the colour of the reaction product,
γ-glutamyl hydroxamate, was measured at 540nm in a plate reader.
Resultados
The MTT assay revealed that 15 min OGD plus reperfusion decreased cell viability in (54.6%±5.08) in comparison to control
(100%). Atorvastatin in vivo pretreatment promoted increased cell viability during 2h of reperfusion after OGD (73.4%±4.6)
and this effect was prevented by cholesterol reposition (56.7%±3.8). Glutamate uptake assay revealed that OGD followed
by reperfusion decreased glutamate uptake (0.02±0.01) and this effect was prevented by atorvastatin pretreatment
(0.1±0.02). In addition, cholesterol reposition prevented the atorvastatin protective effect on glutamate uptake (0.02±0.01).
GS assay revealed that OGD followed by reperfusion decreased GS activity (58.1%±5.7) and this effect was prevented by
atorvastatin pretreatment (88.2%±3.8). In addition, cholesterol reposition prevented the atorvastatin protective effect on GS
activity (68.1%±5.4).
Conclusão
These results show that atorvastatin can prevent OGD induced cell death during reperfusion. Since the protective effects of
atorvastatin were abolished in the presence of cholesterol, we concluded that these neuroprotective effects of atorvastatin
are mediated by its cholesterol lowering action.
FeSBE 2012
Resumo: 12.024
CARACTERIZAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS FATORES MIOGÊNICOS, GENES DACT,
MIOSTATINA, E PAX7 DURANTE A REGENERAÇÃO DO MÚSCULO ESQUELÉTICO DE
CAMUNDONGO APÓS INJEÇÃO DE VENENO BOTRÓPICO
1
Autores
KAGAWA, B. K. 1, ALVARES, L. E. 1, CRUZ-HÖFLING, M. A. 1 Histologia e Embriologia - IB UNICAMP
Apoio Financeiro:
CNPq/FAPESP/FAEPEX
Resumo
Objetivos
Objetivos: O desenvolvimento do músculo esquelético requer a expressão coordenada dos fatores miogênicos, os quais
promovem a determinação ( < i>MyoD, Myf5) e, posteriormente, a diferenciação dos mioblastos ( < i>miogenina). Este
processo é regulado por fatores parácrinos das famílias Wnt e TGF-beta, os quais são modulados pelas proteínas
adaptadoras Dact2 e 3. Por sua vez, a Miostatina ( < i>Mstn) garante que os mioblastos interrompam o ciclo celular para
fundir-se e formar fibras musculares. A caracterização da expressão dos fatores miogênicos, dos genes Dact e do
marcador molecular para células satélites ( < i>Pax-7) em diferentes estádios de mio-intoxicação é uma estratégia
interessante para ampliar os conhecimentos sobre os mecanismos moleculares envolvidos no processo de reparação pósinjúria do músculo esquelético. Esta estratégia irá permitir a comparação entre os mecanismos pós-natais e reparativos de
miogênese, induzidos por lesão muscular em um modelo induzido por veneno ofídico, com aqueles que atuam durante a
miogênese embrionária.
Métodos
Métodos: O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA/Unicamp (protocolo no. 2613 – 1).
Foram utilizados camundongos (Mus musculus) adultos (8 semanas), machos da linhagem Swiss, com peso médio de 30
gramas. Três grupos (n = 3/grupo) foram comparados: camundongos injetados intramuscularmente com veneno de
Bothrops jararacussu (25μg/ml) (grupo Bjssu), com salina 0,9% (grupo sham) ou não manipulados (grupo intacto). Após
24h da injeção, os animais dos três grupos foram sacrificados com isoflurane e o músculo gastrocnêmio foi coletado; a
porção mediana do músculo, correspondente ao local da injeção de Bjssu ou salina foi separada e colocada no reagente
Trizol para extração de RNA total. As análises de expressão gênica foram realizadas por RT-PCR, usando primers geneespecíficos.
Resultados
Resultados: Tanto o grupo Bjssu quanto os controles intacto e sham apresentaram expressão dos fatores miogênicos
MyoD, Myf5 e miogenina em todas as três repetições realizadas. Por sua vez, o gene Dact2 foi expresso em todas as três
repetições dos grupos Bjssu, sham e intacto e Dact3 foi expresso em todas as três repetições dos grupos Bjssu, sham, já
no grupo intacto não foi expresso em duas das três repetições realizadas. O marcador molecular para células satélite,
Pax7, foi expresso nas três repetições do grupo Bjssu e controles sham e intacto, enquanto não foi observada expressão
do gene Mstn em nenhum dos grupos.
Conclusão
Conclusão: Os grupos Bjssu e sham não expressaram o gene Mstn e o grupo intacto não expressou Mstn e Dact3. Os
dados coletados até o momento não permitem afirmar que há diferenças significativas quanto à expressão dos fatores
miogênicos e genes Dact entre músculo esquelético em processo de regeneração e em homeostase. Análises adicionais
por RT-PCR quantitativo e hibridação in situ são requeridas para possibilitar maior compreensão dos mecanismos
moleculares subjacentes à regeneração (miogênese pós-desenvolvimental) induzida por veneno botrópico.
FeSBE 2012
Resumo: 12.025
GUANOSINE-INDUCED NEUROPROTECTION AGAINST OXYGEN/GLUCOSE DEPRIVATION IN
HIPPOCAMPAL SLICES INVOLVES A1, A2A ADENOSINE RECEPTORS AND MAPK PATHWAY
1
DAL-CIM, T. 1, LANZNASTER, D. 2, PARADA, E. 1, REGINATO, C. R. 1, LUDKA, F. K. 1,
Autores VANDRESEN-FILHO, S. 2, LOPEZ, M. G. 1, TASCA, D. I. 1 Bioquímica - UFSC, 2 Farmacología UAM, 3 Bioquímica - UFSC
Apoio Financeiro:
CAPES-DGU, CNPq, FAPESC, INCT-EN, IBN-Net/CNPq
Resumo
Objetivos
Guanosine (GUO) is an endogenous modulator of glutamatergic excitotoxicity and has been shown to promote
neuroprotection in in vivo and in vitro models of neurotoxicity. The aim of this study was to evaluate the role of GUO on
ROS production and glutamate uptake in rat hippocampal slices subjected to oxygen/glucose deprivation (OGD). Also, it
was analyzed the involvement of adenosine A1 (A1R) and A2A receptors (A2AR), PI3K, MAPK/ERK on the mechanism of
neuroprotection promoted by GUO.
Métodos
Experiments have been approved by Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) -UFSC protocol: PP00582.Process nº
117/CEUA/PRPE/2011 CEUA/UFSC. Hippocampal slices from male Wistar rats (60-90 days) were subject to 15 minutes of
OGD followed to 2 hours of re-oxygenation. ROS production and mitochondrial membrane potential were measured by
molecular probes H2DCFDA and TMRE, respectively. Cell viability was measured by MTT reduction. Glutamate uptake was
evaluated by using L-[3H] glutamate and glutamine synthetase (GS) activity was evaluated by measuring the production of
γ-glutamyl hydroxamate by colorimetry. Statistic analysis: ANOVA followed by Duncan’s test with P < 0.05 considered to be
statistically significant.
Resultados
GUO prevented ROS production(C:1; OGD:2.48±0.25; OGD+GUO:1.49, ±0.13;n=6) and mitochondrial depolarization
(C:1;OGD:2.15±0.028; OGD+GUO:1.4±0.14 n=4) induced by OGD in hippocampal slices. The presence of the MAPK/ERK
inhibitor (PD98059, 25 µM: 2.42±0.19 n=6; 2.033±0.24 n=4) or the A1R antagonist (DPCPX, 250 nM: 2.19±0.18 n=6;
2±0.21n=4) inhibited this GUO effect. GUO fully reversed the reduction of glutamate uptake evoked by OGD (C:100; OGD:
42.48±7.79; OGD+GUO:97.96, ±20.4; n=6). This effect was blocked by PD98059 (42.7±13.5 n=6) but not by DPCPX
(96.5±13.59 n=6). The participation of A2AR was also investigated. A2AR antagonist (106.9±19.5 n=4) did not prevent GUO
effect (C:100; OGD: 25.78±4.15; OGD+GUO:98±11.5 n=4) on glutamate uptake and the addition of A2AR agonist
(47±13.14 n=4) abolished GUO-induced protection. By preincubating hippocampal slices with Pertussis toxin (PTX, 500
ng/ml), we have shown that GUO neuroprotective effect against OGD depends on Gi/o proteins activity (C: 100; OGD:
70.8±0.7; OGD+GUO: 92.4±4.1; OGD+PTX+GUO: 64.4±4.8 n=5). The increase in glutamate uptake promoted by GUO was
also prevented by PTX(C: 100;OGD:50±4.9;OGD+GUO:96.94±16.5;OGD+PTX+GUO:64.78±13.4n=7). Additionally, OGD
promoted a decrease in GS activity and GUO partially reversed this effect(C: 100; OGD: 51.7±9.4; OGD+GUO: 74.94±10.6
n=6).
Conclusão
The neuroprotective mechanism of action of GUO involves the reduction of ROS production, mitigates mitochondrial
depolarization, which is mediated by A1R and ERK pathway. GUO induce an increase in glutamate uptake what depends
on ERK pathway, A2AR inhibition and Gi/o protein activation. Furthermore, GUO modulates GS activity, showing an effect
on glutamate turnover and reinforcing its modulatory role on glutamate transmission.
FeSBE 2012
Resumo: 12.026
CaSRs: A ROLE IN PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF ADULT RAT BONE-MARROW
DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS
1
TONELLI, F. M. P. 2, LADEIRA, L.O. 1, RESENDE, R.R. 1 Department of Biochemistry and
Autores Immunology - Cell Signaling and Nanobiotechnology Laboratory - UFMG, 2 Department of Physics Laboratory of Nanomaterials - UFMG
Apoio Financeiro:
CNPq and FAPEMIG
Resumo
Objetivos
Calcium ion is an important regulator of various cellular processes and this project objective was to examine calciumsensing receptors (CaSRs) downstream intracellular signaling pathways in order to investigate the role of these receptors
on proliferation and apoptosis of adult rat bone-marrow derived mesenchymal stem cells (MSCs).
Métodos
MSCs, in 6-well plate, were incubated overnight in serum-free medium and treated with 300 μM Neomycin for 15 min. On
wells that were not control ones, cells were pre-incubated for 5 min with 10 μM PD98059 or 5 μM U73122 or 250 nM
calphostin C or 10 μM Ly-294002. Cell lysates were separated by 10% SDS-PAGE and Western blotted with antiphosphoERK1,2 and anti-total ERK1,2. Densitometry was performed using Image J Analysis software. To demonstrate that
analyzed signaling pathways were activated via CaSR, MSC were transfected with control siRNA or CaSR siRNA (RNAifect
-QIAGEN). After transfection MSCs were treated with 300 μM Neomycin for 15 min in the presence of 10 mM LiCl, with or
without pre-incubation for 5 min with 5 μM U73122. IP3 production (pmol/well) was measured using D- myo-inositol 1,4,5triphosphate ( < su p > 3 H) Biotrak assay using manufacturer’s protocol. Cell proliferation determination through BrdU
assay involved treatment of transfected cells with 300 μM Neomycin for 24 hours in the presence of BrdU with or without
pre-incubation for 5 min with 10 μM PD98059 or 5 μM U73122. Apoptosis in transfected MSCs treated with Neomycin with
or without signaling inhibitors for 24 hours was determined after cells were fixed, stained with propidium iodide and analyzed
by flow cytometry: with apoptotic cells visualized in the subdiploid area of DNA histogram. Experiments were all performed
in triplicate.
Resultados
CaSRs agonist Neomycin led to increase in ERK1,2 phosphorylation on MSCs, and when pre-incubation with PD98059
(10μM - an MEK1 inhibitor) was performed, it was observed a reduction on this ERK1,2 phosphorylation. Phospholipase C
(PLC) inhibitor U73122 (5μM) abolished ERK1,2 phosphorylation, indicating that PLC signaling is necessary for
MEK1/ERK1,2 activation. IP3 production was increased by Neomycin 3.5±0.7 fold (n=3). MSCs transfected with CaSR
siRNA showed Neomycin reduced ERK1,2 response and IP3 production. MSCs proliferation was increased 2.3±0.4 fold
(n=3) by Neomycin, reduced in CaSR knockdown cells and inhibited by MEK1 and PLC inhibitors. Apoptosis in MSC was
not caused by Neomycin, but U73122 resulted in 3.1±0.6 fold increase (n=3) and CaSR siRNA induced 4.6±1.1 fold
increase (n=3) on it.
Conclusão
Stimulation of the CaSR on MSC by agonist results in activation of MEK1/ERK1,2 and PLC-IP3 pathways and up-regulates
proliferation independently of PKC and PI3K signaling. Furthermore CaSR-mediated PLC-IP3 activation is important for
MSC survival and prevention of apoptosis.
FeSBE 2012