BIO10-329 Biofísica de Proteínas
Regente: Célia R. Carlini
Proteínas: estrutura tridimensional e
forças envolvidas
Os assuntos abordados nessa aula são:
- Modelos de estrutura proteica
- Forças estabilizadoras da estrutura de proteínas
- Métodos de estudo da estrutura de proteínas
Atenção ! Use o modo “apresentação de slides” para ativar as animações
Iniciaremos essa aula relembrando os conceitos de níveis organizacionais
da estrutura de uma proteína, como visto na aula anterior:
Heme
(grupo prostético) Subunidades beta
Subunidades alfa
A Hemoglobina é um heterotetrâmero formada por 2 tipos de cadeias polipeptídicas
.
Para entender a estrutura 3D das proteínas, vamos “dissecá-la” em
níveis organizacionais para facilitar o estudo:
aminoácido
É o esqueleto covalente (fio do
colar), formado pela seqüência dos
átomos (-N-C-Ca-)n na proteína.
Estrutura primária: é a sequência dos
aminoácidos na cadeia polipeptídica;
mantida por ligações peptídicas
Para entender a estrutura 3D das proteínas, vamos “dissecá-la” em
níveis organizacionais para facilitar o estudo:
x4
Estrutura secundária:
• Enovelamento de partes da
cadeia polipeptídica
• Formada somente pelos
átomos da ligação peptídica,
através de pontes de H.
• Ex: alfa-hélices e folhas beta.
Estrutura terciária:
• Enovelamento de uma cadeia
polipeptídica como um todo.
• Ocorrem ligações entre os
átomos dos radicais R de
todos os aminoácidos da
molécula
Estrutura quaternária:
• Associação de mais de uma
cadeia polipeptídica
• No modelo, um tetrâmero
composto de 4 cadeias
polipeptídicas
O primeiro passo para se estudar a estrutura de uma proteína
é obtê-la de forma purificada.
Geralmente a proteína que se deseja estudar é um componente
minoritário (0,01 a 1%) em uma complexa mistura de outras proteínas
que estão presentes em qualquer tipo de tecido ou célula.
Purificar uma proteína significa separar a proteína de interesse das outras
presentes na fonte de origem, de modo a ter somente ela no meio.
Muitas vezes purificar uma proteína é a etapa limitante no estudo de suas
características estruturais e propriedades biológicas.
Em uma próxima aula estudaremos os métodos disponíveis para purificação
de uma proteína
Estrutura primária: é a sequência dos aminoácidos na cadeia polipeptídica.
aminoácido
A proteína pura é tratada com
HCl 6N fervente para quebrar
(hidrólise) as ligações peptídicas.
A mistura resultante é submetida
a métodos cromatográficos (fase
reversa, troca iônica) para separar
os diferentes aminoácidos.
fluorescência
Para determinar a estrutura primária de uma proteína,
é necessário primeiro conhecer a composição (número
e tipos) de seus aminoácidos.
Tempo de retenção (min)
A posição do pico no cromatograma identifica o aminoácido.
A área do pico quantifica o aminoácido.
Existem vários métodos para se determinar a sequência de aminoácidos de
uma proteína. Aqui veremos como funcionam os dois métodos
atualmente mais utilizados:
a) Método de Edman: reação do aminoácido N-terminal da proteína com
fenil-isotiocianato
. A proteína modificada é submetida a
hidrólise ácida liberando o aminoácido N-terminal modificado, e este é
identificado por cromatografia. Segue-se novo ciclo de reação com o
próximo aminoácido na proteína, que se tornou o novo N-terminal.
b) Espectrometria de massa: determinação das massas de fragmentos
correspondendo a aminoácidos, retirados sequencialmente da proteína.
Veremos mais sobre esse método na aula sobre eletroforese e
proteômica.
ciclo 1
Método de Edman sequenciamento de proteínas com
PITC (fenil-isotiocianato)
(1)
acoplamento
(2)
hidrólise com ácido trifluoroacético
Cada ciclo de reação compreende 3 etapas:
ciclo 2
acoplamento
(3)
1.
2.
hidrólise ácida
3.
vai para novo ciclo
Reação da proteína com PITC, que se
acopla ao grupo amino NH2- livre do
aminoácido 1 (no exemplo, uma lisina, K);
Hidrólise ácida da proteína conjugada com
PITC libera a feniltiohidantoína (PTH) do
aminoácido 1 e o restante da proteína,
tornando o aminoácido 2 o novo resíduo
N-terminal (no exemplo uma serina, S);
Análise cromatrográfica do PTHaminoácido e novo ciclo de reação com o
novo N-terminal da proteína.
Sequenciadores automatizados fazem
todas as etapas, com capacidade para
realizar 30 ciclos por dia, a partir de
100-200 picomoles de proteína.
análise cromatográfica (troca iônica ou fase reversa)
Quando uma proteína possui mais de 20-30 resíduos de aminoácidos, não
é possível sequenciá-la diretamente pelo método de Edman.
Proteína
Total 150 a.a
30 aa
sequência obtida a partir da proteína intacta
Para obter a sequência completa de uma proteína, é necessário sequenciar vários peptídeos
da mesma proteína, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, até haver sobreposição
de suas sequências.
proteína
inteira
peptídeos
método A
peptídeos
método B
Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes peptídeos da proteína: A) enzimas
proteolíticas, como tripsina (quebra em resíduos de Lys ou Arg) e quimotripsina (quebra em
resíduos de Phe); B) tratamento com brometo de cianogênio (quebra em Met); e outros.
Estudos da estrutura tridimensional de proteínas tiveram grande impulso na década
de 1950 com Linus Pauling, e o uso de raios-X para analisar cristais de proteína.
Na queratina (proteína da lã de carneiro),
Pauling viu um padrão repetitivo de
zonas claras (eletrondensas) e escuras
na difração de raios X.
Raio X
Para explicar esse padrão, foi proposto
o modelo da a-hélice, com as seguintes
caracterísiticas:
• esqueleto covalente C-C-N-C-C-N
da proteína assume a forma de espiral
ou mola, enrolada para a direita, com
um espaçamento de 3,6 resíduos de
aminoácido por volta;
Filme
fotográfico
• o enovelamento é estabilizado por
pontes de hidrogênio entre átomos das
ligações peptídicas de qualquer
aminoácido, exceto prolina;
a-hélice
• as cadeias laterais dos aminoácidos
voltam-se para fora da hélice.
Linus Pauling também propôs o modelo da folha pregueada ou estrutura b para
explicar o padrão de difração de raios X pela b-queratina, proteína presente na
unha, chifres e cascos de animais.
Na folha pregueada as cadeias polipeptídicas
dispõem-se lateralmente (em paralelo) e fazem
pontes de H entre os átomos da ligação peptídica.
As cadeias laterais R dos aminoácidos voltam-se
para cima ou para baixo do plano da folha
Vista lateral
Folha paralela
Folha anti-paralela
-C
N
-N
C
Pontes de H
-C
-C
N
N
antiparalela
Paralela, torção à direita
Paralela, torção à esquerda
Folhas b paralelas e antiparalelas podem se formar em uma proteína através
de pequenas torções da cadeia polipeptídica.
A a-hélice e a folha b são os tipos de estrutura secundária mais comum entre as
proteínas, por que não dependem da composição e sequência de aminoácidos,
sendo estabilizadas apenas por pontes de H dos átomos da ligação peptídica.
Entre os 20 aminoácidos, apenas a prolina não pode fazer nenhuma das duas
estruturas, por formar uma ligação peptídica mais rígida em torno do Ca.
Existem outros tipos de estruturas secundárias conhecidas, como a dobra b ou
“alças” (domínios) de ligação a íons, como Ca2+ ou Zn2+.
tipo 1
tipo 2
Dobra b
hélice-dobra-hélice
“Zinc-finger”
Beta-alfa-beta
Barril beta
Só beta
Só alfa
Barril alfa-beta
A estrutura terciária descreve a forma tridimensional final de uma cadeia
polipeptídica, resultando da associação de partes organizadas da molécula,
chamadas de “domínios” ou “motivos” proteicos.
Alguns modelos de organização estrutural, como os barris b e ab, aparecem
em vários tipos de proteínas, às vezes não relacionadas.
Subunidade
(uma cadeia polipeptídica)
Proteína
(biológicamente ativa; dímero não covalente )
Proteínas com estrutura quartenária são composta de mais de uma
cadeia polipeptídica, que podem estar associadas covalentemente
(pontes dissulfeto) ou não.
Algumas definições importantes:
- Por serem conceitos didáticos, frequentemente é difícil distinguir em uma
proteína os níveis secundário e terciário de organização estrutural.
- Para evitar tais ambiguidades utiliza-se o termo conformação proteica,
que se refere aos aspectos da estrutura tridimensional de uma proteína
acima de sua sequência de aminoácidos.
- Os termos conformação e configuração não são sinônimos.
 Configuração refere-se à estrutura tridimensional de uma molécula
determinada por ligações covalentes, como por exemplo, as formas
L- e D- de um aminoácido.
 Conformação refere-se à estrutura tridimensional de uma molécula
decorrente da somatória de ligações fracas, não covalentes.
Conformação nativa de uma proteína refere-se à estrutura tridimensional em
que a molécula apresenta suas propriedades biológicas naturais.
Desnaturação refere-se a alterações da conformação nativa de uma proteína,
podendo resultar em perda parcial ou total, reversível ou irreversível, de sua
atividade biológica.
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
Proteína
Proteína
NH2
— CH2 — OH
... O — C — CH2 — CH2 —
FORÇAS NÃO COVALENTES
Ponte de Hidrogênio
Pontes de H
-Aminoácidos polares
Quais são os tipos de forças
que
mantém
a
estrutura
tridimensional de
C —CH2—CH2—
—CH2—CH2—NH+
3 O
Ligação Iônica
—CH2
O
uma proteína ?
CH —CH3
CH3
CH3
CH3 — CH — CH2 —
— CH — CH3 H3C — CH —
CH3
Ligações iônicas
- Aminoácidos carregados
CH3
Interações hidrofóbicas
e Forças de van der Waals
Interações hidrofóbicas
-Aminoácidos apolares
Forças de Van der Waals
-Qualquer aminoácido
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
Proteína
Proteína
Pontes de H ocorrem:
NH2
— CH2 — OH
... O — C — CH2 — CH2 —
Ponte de Hidrogênio
—CH2—CH2—NH+
3 O
Ligação Iônica
—CH2
C —CH2—CH2—
O
- entre cadeias laterais de
aminoácidos polares,
carregados ou não;
CH —CH3
CH3
CH3
CH3 — CH — CH2 —
— CH — CH3 H3C — CH —
CH3
- entre os átomos da ligação
peptídica (por exemplo, a
a-hélice e a folha b);
CH3
Interações hidrofóbicas
e Forças de van der Waals
- para os grupos –NH3+ e
–COO- dos aminoácidos N- e
C-terminal, respectivamente.
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
Proteína
Proteína
NH2
— CH2 — OH
... O — C — CH2 — CH2 —
Ponte de Hidrogênio
—CH2—CH2—NH+
3 O
Ligação Iônica
—CH2
C —CH2—CH2—
O
- ocorrem entre as cadeias
laterais de aminoácidos com
cargas contrárias;
- dependem do estado de
ionização dos aminoácidos e
do pH do meio;
CH —CH3
CH3
Ligações iônicas:
CH3
CH3 — CH — CH2 —
— CH — CH3 H3C — CH —
CH3
CH3
Interações hidrofóbicas
e Forças de van der Waals
- são menos frequentes do
que as pontes de H.
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
Proteína
Proteína
NH2
— CH2 — OH
... O — C — CH2 — CH2 —
Ponte de Hidrogênio
—CH2—CH2—NH+
3 O
Ligação Iônica
—CH2
C —CH2—CH2—
O
CH —CH3
CH3
CH3
CH3 — CH — CH2 —
— CH — CH3 H3C — CH —
CH3
CH3
Interações hidrofóbicas
e Forças de van der Waals
-Interações hidrofóbicas:
- ocorrem entre as cadeias
laterais de aminoácidos
apolares;
- radicais apolares são repelidos
pela água, aproximando-se uns
dos outros;
- não é uma força de atração
real, resultando da repulsão pela
água;
- como consequência, em meio
aquoso o interior de proteínas
globulares é hidrofóbico.
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
Proteína
Proteína
Forças de Van der Waals
NH2
— CH2 — OH
... O — C — CH2 — CH2 —
Ponte de Hidrogênio
—CH2—CH2—NH+
3 O
Ligação Iônica
—CH2
C —CH2—CH2—
O
- é uma força eletrostática que
ocorre entre dipolos temporários;
- dipolos temporários (duração de
nanosegundos) são criados devido
à órbita errática dos elétrons;
CH —CH3
CH3
CH3
CH3 — CH — CH2 —
— CH — CH3 H3C — CH —
CH3
CH3
Interações hidrofóbicas
e Forças de van der Waals
- pode envolver qualquer tipo de
aminoácido;
- geralmente coincidem com as
regiões da proteína onde ocorrem
as interações hidrofóbicas, pois a
aproximação dos radicais apolares
facilita a interação entre os dipolos.
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
Além dos laços não covelentes, uma proteína
pode ter pontes dissulfeto formada a partir
de dois resíduos do aminoácido Cys (cisteína).
Pontes dissulfeto são
covalentes e só podem ser
rompidas por agentes
redutores, como
2-mercapto-etanol.
B
A
O hormônio insulina é composto por duas subunidades, A e B, unidas por duas pontes
dissulfeto intercadeia. Além disso, a cadeia B possui uma ponte dissulfeto intracadeia
A conformação proteica depende basicamente de forças fracas, como a ponte de H
e interações hidrofóbicas.
A tabela mostra que a força das ligações entre os átomos do esqueleto covalente de uma
proteína C-C-N-C-C-N é da ordem de 70 a 80 kcal/mol. (Não esquecer que a ligação C-N tem
carácter parcial de dupla ligação C=N, por causa da ressonância da ligação peptídica.)
Tipo de
ligação
Energia *
(Kcal/mol)
Tipo de
ligação
Energia *
(Kcal/mol)
LIGAÇÃO SIMPLES
O—H
110
LIGAÇÃO DUPLA
C O
170
H—O
P—O
104
100
C
C
C—H
N—H
99
93
C—O
C—C
S—H
C—N
C—S
N—O
S—S
84
83
81
70
62
53
51
N
C
O
147
146
P
120
LIGAÇÃO TRIPLA
195
C C
PONTE DE HIDROGÊNIO
NH ...O
OH ... N
4-5
NH ... N
OH ... O
* O valor indicado para cada ligação refere- se à quantidade
de energia necessária para rompê-la.
A ligação peptídica é muito forte e só
se rompe em condições químicas
drásticas, como 6N HCl a 100ºC.
A ponte dissulfeto (-S-S-) é relativamente rara entre as proteínas. Por
ser um laço covalente, não se rompe
quando uma proteína desnatura em
meio ácido ou por calor.
Proteínas são moléculas frágeis e
podem ser desnaturadas, com perda
de suas propriedades biológicas, por
pequenas variações do pH ou da
temperatura do meio. A ponte de H é
uma das principais forças envolvidas
na estabilidade da conformação nativa.
As interações que as proteínas estabelecem com o meio são importantes na
determinação de sua conformação.
A bacteriorhodopsina é formada por 7 segmentos de a-hélices apolares, que
delimitam um canal interno de natureza polar.
O índice hidropático dos aminoácidos reflete a tendência que as suas cadeias
laterais têm para interagir com o meio aquoso.
Quanto mais negativo esse índice, mais polar é o aminoácido.
O perfil hidropático de uma proteína é calculado como a
soma dos índices hidropáticos a cada 9 resíduos de aminoácidos
na cadeia polipeptídica.
Permite prever regiões da proteína que interagem com a
membrana plasmática ou com os meios interno/externo.
O perfil hidropático da bacteriorhodopsina prevê 7 regiões
hidrofóbicas e 3 regiões hidrofílicas.
canal de H+
meio externo
citoplasma
Bacteriorhodopsina inserida em uma
porção da membrana
A bacteriorhodopsina (bR) da
arqueobactéria Halobacterium salinarum, é o
sistema fotossintético mais simples
conhecido, permitindo a sobrevivência do
organismo em situações de baixo O2, ao
converter luz solar em energia química.
Quando a molécula de bR absorve um fóton,
ela se torna uma bomba de prótons,
bombeando H+ do meio intracelular para o
exterior da célula. A energia do gradiente
eletroquímico formado é então utilizada
para síntese de ATP por uma ATP sintase.
Para ter esse tipo de estrutura, a proteína
apresenta as cadeias laterais de seus
aminoácidos apolares voltadas para “fora”,
em contacto com os lipídeos da membrana
da célula. Aminoácidos polares estão
voltados para “dentro”, delimitando o canal
de prótons da molécula.
Por que diferentes moléculas de uma proteína apresentam sempre a mesma estrutura 3D ?
De onde vem a informação para a estrutura tridimensional de uma proteína ?
O pesquisador sueco Cristian Anfisen foi um
pioneiro no estudo da estrutura 3D de proteínas, e
recebeu o Prêmio Nobel (1972) por suas descobertas.
Anfisen estudou a Ribunuclease (14.000d), proteína
com 8 cisteínas formando 4 pontes dissulfeto.
Ele demonstrou que era possível fazer uma
desnaturação reversível da proteína, adicionando
uréia e 2-mercaptoetanol para abrir as suas 4 pontes
dissulfeto. Ao retirar lentamente (por diálise), esses
reagentes, a proteína volta a ter atividade biológica,
mostrando que voltou à sua conformação nativa.
Esse fato é surpreendente pois as 8 cisteínas,
combinadas 2 a 2, dariam 28 = 256 possibilidades,
de formar diferentes pontes dissulfeto, mas apenas
o arranjo original de pontes se forma.
A conclusão de Anfisen foi a de que a sequência
dos aminoácidos (não alterada na desnaturação) é o
que determina a estrutura 3D das proteínas.
Como é possível termodinamicamente que as proteínas tenham estruturas tão
altamente organizadas ?
De onde vem a energia que estabiliza a estrutura 3D das proteínas ?
energia
entropia
A conformação nativa de uma proteína representa
o estado de menor energia do sistema.
A energia que estabiliza a estrutura 3D de
uma proteína vem do aumento da entropia da água,
representando “desorganização” da água à medida
que interagem com a proteína.
Estrutura nativa
In vivo conformações intermediárias das proteínas são estabilizadas por
chaperonas durante o processo de síntese proteica.
Utilize o programa RasMol para explorar a estrutura tridimensional de proteínas:
1. Clique aqui para fazer o download do arquivo rw32b2a.exe. Salve-o numa
pasta em seu computador.
2. Faça o download dos arquivos .pdb da quimotripsina e da pepsina.
3. Execute o RasMol (clique 2X no arquivo rw32b2a.exe) e abra os arquivos .pdb
4. Explore as várias formas de visualização das proteínas.
Encerramos aqui a segunda aula da disciplina Biofísica de Proteínas.
•
Níveis de organização estrutural das proteínas
•
Modelos de estrutura proteica
•
Métodos de estudo da estrutura primária de proteínas
•
Forças estabilizadoras da estrutura de proteínas
No ED 2 aplicaremos vários dos conceitos aprendidos hoje.