UNIVERSIDADE FEDERAL DA GRANDE DOURADOS
FACULDADE DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS
MARIA ALICE SILVESTRE
BIOPROSPECÇÃO DE FUNGOS COM POTENCIAL
PARA PRODUÇÃO DE β-GLICOSIDASE:
AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS DE CULTIVO E
CARACTERIZAÇÃO DAS ENZIMAS PRODUZIDAS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA
AMBIENTAL
DOURADOS/MS
FEVEREIRO/2013
MARIA ALICE SILVESTRE
BIOPROSPECÇÃO DE FUNGOS COM POTENCIAL
PARA PRODUÇÃO DE β-GLICOSIDASE:
AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS DE CULTIVO E
CARACTERIZAÇÃO DAS ENZIMAS PRODUZIDAS
ORIENTADOR: PROF. DR. RODRIGO SIMÕES
RIBEIRO LEITE
Dissertação de mestrado submetida ao
programa de pós-graduação em Ciência e
Tecnologia Ambiental, como um dos
requisitos necessários para a obtenção do
título de mestre em Ciência e Tecnologia na
área de concentração Ciência Ambiental.
DOURADOS/MS
FEVEREIRO/2013
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP).
S587b
Silvestre, Maria Alice.
Bioprospecção de fungos com potencial para produção de
β-glicosidase: avaliação dos parâmetros de cultivo e
caracterização das enzimas produzidas. / Maria Alice
Silvestre – Dourados, MS : UFGD, 2013.
26f.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Simões Ribeiro Leite.
Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia
Ambiental) Universidade Federal da Grande Dourados.
1. β-glicosidase. 2. Resíduos agroindustriais. 3. Fungos.
I. Leite, Rodrigo Simões Ribeiro. II. Título.
CDD – 589.222
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Central – UFGD.
©Todos os direitos reservados. Permitido a publicação parcial desde que citada a
fonte.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Doutor Rodrigo Simões Ribeiro Leite, orientador dessa dissertação,
agradeço por todos os conhecimentos transmitidos, apoio e disposição para orientação
ao longo do meu mestrado.
A Universidade Federal da Grande Dourados, a CAPES e ao programa de Pós
Graduação em Ciência e Tecnologia Ambiental por propiciarem meu desenvolvimento
acadêmico profissional. A FCBA e seus técnicos, pela disponibilidade dos espaços
físicos e apoio para realização desse trabalho.
Aos amigos de pós-graduação, agradeço pelos bons momentos durante as aulas e
pesquisas, especial ao André, por nunca me deixar em paz, obrigado pela amizade.
Aos alunos de iniciação científica: Ana Carolina, Vinicius, Taísa, Marília, Rodrigo,
Ândrea, Gabriela e Marta obrigada pela colaboração e amizade.
A Paula, que tornou os dias dentro do laboratório mais engraçados, obrigada pela ajuda
e companhia durante esses dois anos de pesquisa.
A Bia, pelas tardes de café para espairecer.
Ao Manu, por sempre ter palavras de incentivo.
Aos meus irmãos Luna e Gabriel, meus cunhados Murilo e Maria Rita, e minha
sobrinha Maia, vocês são lindos e fazem parte de quem eu sou.
Aos meus pais Célia e Rogério, meus orientadores na vida, obrigada por sempre me
mostrarem os caminhos, me ensinarem a pensar criticamente e viver com amor.
Ao meu marido Victor, obrigado por me apoiar e acompanhar com paciência e carinho,
durante a realização desse trabalho sua pessoa foi fundamental para meu equilíbrio.
Ao Hector, que ainda cresce dentro de mim, com muito amor.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1– Seleção de microrganismos para produção de β-glicosidase por cultivo em
estado sólido utilizando farelo de trigo com 70% de umidade por 96 horas. Os isolados
20, 21 e 23 foram cultivados a 45oC e os outros isolados a 28oC. ................................ 10
Tabela 2: Seleção de resíduo agroindustrial como substrato para a produção de βglicosidase, o cultivo em estado sólido ocorreu por 96 horas nas respectivas
temperaturas ótimas de crescimento de cada isolado. ....................................................12
Tabela 3: Parâmetros de cultivo em estado sólido para produção de β-glicosidase à
partir dos microrganismos selecionado. .........................................................................16
Tabela 4: Características bioquímicas das β-glicosidases produzidas em condições
otimizadas de cultivo. .....................................................................................................17
Tabela 5: Atividade relativa das β-glicosidases de fungos termofílicos em substrato
sintético (pNPβG) e substrato natural (Celobiose). As atividades relativas obtidas pela
hidrólise da celobiose foram expressas em porcentagem da atividade enzimática obtida
utilizando pNPβG como substratos. ...............................................................................19
Tabela 6: Tipo de inibição da glicose sobre a atividade enzimática das linhagens
avaliadas. ........................................................................................................................22
ii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura química da molécula de celulose (ÂNGELO, 2010). ......................2
Figura 2 – Representação esquemática da ação catalítica do complexo celulolítico sobre
celulose (OGEDA; PETRI, 2010). ...................................................................................3
Figura 3 – Temperatura ótima de crescimento micelial, medida do diâmetro do alo da
colônia em centímetros. ..................................................................................................11
Figura 4: Produção de β-glicosidase em função da umidade em CES utilizando farelo
de trigo como substrato, o cultivo ocorreu por 96 horas nas respectivas temperaturas
ótimas de cada isolado. ...................................................................................................13
Figura 5: Efeito do pH na produção de β-glicosidase utilizando farelo de trigo para o
CES por 96 horas em temperatura ótima dos microrganismos e umidade de 65% (Is.
20), 60% (Is. 21) e 70% (Is. 23). ....................................................................................15
Figura 6: Tempo de cultivo para produção de β-glicosidases em farelo de trigo, com
umidade de 65% (Is. 20), 60% (Is. 21) e 70% (Is. 23), pH 5,0 (Is. 20 e 21) e pH 4,0 (Is.
23). ..................................................................................................................................16
Figura 7: Efeito de etanol sobre a atividade das β-glicosidases dos isolados 20, 21 e 23
em diferentes temperaturas (40, 50, 55 oC e
Temperatura ótima de atividade das
enzimas). .........................................................................................................................20
Figura 8: Efeito de glicose sobre a atividade das β-glicosidases. .................................21
iii
RESUMO
Neste trabalho foram isoladas 17 linhagens de fungos filamentosos morfologicamente
distintos, sendo 4 termófilos. Devido a crescente busca por microrganismos termófilos,
e a maior estabilidade estrutural de suas enzimas, as linhagens 20, 21 e 23 foram
selecionadas para produção de β-glicosidase por Cultivo em Estado Sólido (CES).
Dentre os subprodutos agroindustriais utilizados, o farelo de trigo foi o melhor substrato
para produção de β-glicosidase em CES e a umidade ideal variou entre 60 e 75% para
os diferentes isolados. O pH inicial ideal para a produção da enzima fica entre 4, 0 e 5,0
e o tempo de cultivo para produção máxima de β-glicosidase pelos isolados 20, 21 e 23
foi respectivamente, 72, 96 e 96 horas. Ao final desta etapa obtivemos extratos onde a
produção máxima de β-glicosidases foi de 6,0 U/mL, 6,81 U/mL e 11,75 U/mL
respectivamente. Esses extratos foram caracterizados bioquimicamente e as βglicosidases contidas neles apresentaram pH ótimo entre 4,5 e 5,5 e temperatura entre
60 e 70 oC. A β-glicosidase produzida pelo isolado 20 apresentou maior estabilidade
térmica, mantendo-se estável até 70oC . Todas as enzimas apresentaram aumento da
atividade catalítica com a presença de etanol na mistura de reação, indicando atividade
transglicosilação. O perfil de inibição por glicose foi muito semelhante para todas as
enzimas avaliadas. No entanto, o tipo de inibição apresentado pela enzima do isolado 20
é diferente dos demais por ser não competitiva. Todas as enzimas apresentaram
potencial para hidrolisar celobiose, no entanto, a maior afinidade para esse substrato foi
apresentada pelas β-glicosidases produzidas pelos isolados 20 e 23. Os resultados
obtidos demostram que as linhagens selecionadas apresentam potencial para produção
de β-glicosidases por CES e as características das enzimas são apreciáveis para
aplicação industrial, considerando principalmente a elevada estabilidade apresentada.
Palavras-chave: Celulases; Cultivo em Estado Sólido; Fungos Filamentosos.
iv
ABSTRACT
In this work, 17 strains of morphologically distinct filamentous fungi were isolated, 4 of
them being thermophiles. Due to the growing demand for thermophilic microorganisms,
due to the greater structural stability of their enzymes, the isolates 20, 21 and 23 were
selected to produce β-glucosidase by Solid State Cultivation (CES). Among the agroindustrial by-products used, wheat bran was the best substrate for the production of βglucosidase in CES and ideal humidity ranged between 60 and 75% for the different
isolates. The initial optimal pH for the enzyme production is between 4. 0 and 5.0 and
the culture time for maximum production of β-glucosidase by isolates 20, 21 and 23 was
respectively 72, 96 and 96 hours. At the end of this step, extracts were obtained in
which the maximum production of β-glucosidases was 6.0 U / mL, 6.81 U / mL and
11.75 U / mL respectively. These extracts were biochemically characterized and βglucosidase contained therein had an optimum pH between 4.5 and 5.5 and temperature
between 60 and 70 oC. The β-glucosidase produced by isolate 20 showed higher thermal
stability, remaining stable up to 70 oC. All enzymes showed increased catalytic activity
in the presence of ethanol in the reaction mixture, indicating transglycosylation activity.
The inhibition by glucose profile was very similar for all the enzymes studied.
However, the type of inhibition displayed by the enzyme from isolated 20 differs from
others by being non-competitive. All enzymes showed potential to hydrolyze cellobiose,
however, the highest affinity for this substrate was presented by β-glucosidase produced
by isolates 20 and 23. The results demonstrate that the selected strains have potential for
the production of β-glucosidase by CES and characteristics of enzymes for industrial
application are appreciable, considering mainly the high stability they presented.
Keywords: Cellulases; Solid State Cultivation; Filamentous Fungi
v
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 1
2. METODOLOGIA.................................................................................................... 6
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 9
3.1) Isolamento e seleção de linhagens com potencial para produção de βglicosidade ................................................................................................................ 9
3.2) AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS DE CULTIVO PARA PRODUÇÃO DE
β-GLICOSIDASE ...................................................................................................... 11
3.2.1) Seleção do Substrato .................................................................................... 12
3.2.2) Umidade ideal .............................................................................................. 13
3.2.3) Determinação do pH inicial para a produção das enzimas ....................... 14
3.2.4) Tempo de Cultivo ......................................................................................... 15
3.3) CARACTERIZAÇÃO DAS β-GLICOSIDASES PRODUZIDAS PELAS
LINHAGENS ISOLADAS. ....................................................................................... 17
3.3.1) Efeito de pH e temperatura sobre a atividade das enzimas........................ 17
3.3.2) Hidrólise de Celobiose ................................................................................. 18
3.3.3) Efeito de etanol............................................................................................. 19
3.3.4) Efeito de glicose ............................................................................................ 21
4) CONCLUSÕES ..................................................................................................... 23
5) REFERÊNCIAS .................................................................................................... 24
vi
1. INTRODUÇÃO
O conhecimento da biodiversidade e a bioprospecção de microrganismos
tornaram-se um dos principais focos da era biotecnológica, visto que a utilização destes
organismos em diferentes setores, tanto industriais como ambientais, crescem de forma
acelerada no atual cenário mundial. A diversidade metabólica e a adaptabilidade
genética dos microrganismos permitiu seu uso como fonte inesgotável de produtos
bioativos utilizados em processos biotecnológicos (OLIVEIRA, 2006).
Com o desenvolvimento de novas técnicas de biologia molecular, genômica,
metagenômica e bioinformática, o processo de busca e descoberta de produtos naturais a
partir de recursos microbianos vem sofrendo profundas alterações, principalmente no
estudo de microrganismos não cultiváveis. As técnicas tradicionais de isolamento e
cultivo associadas às novas tecnologias permitem uma exploração mais abrangente, pois
se estima que apenas 10% dos microrganismos existentes no planeta tenham sido
caracterizados e descritos. Dessa forma será possível ampliar o conhecimento sobre a
diversidade microbiana, capacidade metabólica e características fenotípicas dos
microrganismos (PEIXOTO, 2008; OLIVEIRA, 2006).
Entre os inúmeros microrganismos não patogênicos utilizados industrialmente, os
fungos filamentosos se destacam pela facilidade de cultivo e alta eficiência na produção
de enzimas extracelulares (GUIMARÃES, 2006).
Os fungos são microrganismos eucariontes que contribuem para a estabilidade de
ecossistemas, por serem altamente eficientes na degradação de diversos substratos,
sendo responsáveis pela produção de uma ampla gama de metabólitos primários e
secundários que são utilizados na área médica, industrial, agrícola ou ambiental
(ESPOSITO; AZEVEDO, 2010).
Fatores ambientais apresentam profunda influência sobre o crescimento dos
fungos; temperatura, teor de umidade, pH e aeração afetam o crescimento de modo que
distintas espécies têm diferentes valores ótimos. A maior parte dos fungos descritos são
mesófilos, crescem em temperaturas ótimas entre 15 e 40 oC, mas também existem
espécies termófílas e psicrófilas, isto é, adaptadas a altas e baixas temperaturas,
respectivamente (GALVAGNO; FORCHIASSIN, 2010).
1
Dentre as 50.000 espécies de fungos descritas, existem cerca de 30 que possuem
capacidade de crescer em temperaturas acima de 40 °C, chamados de termófilos. A
capacidade de crescer em temperaturas elevadas está relacionada a adaptações na
estrutura de membrana plasmática, proteínas e DNA (GOMES et al., 2007).
Os fungos termófilos desenvolvem-se naturalmente em processos de compostagem,
sucedendo os mesófilos na fase de alta temperatura (acima de 40°C), e assimilando
carbono a partir de polissacarídeos constituintes da biomassa vegetal, como amido,
celulose, hemicelulose e pectina, cuja degradação requer intensa liberação de enzimas
extracelulares (MAHESHWARI et al., 2000; GOMES, et al., 2007).
A celulose é o principal polímero presente na parede celular vegetal e a substância
orgânica renovável mais abundante na natureza, podendo ser utilizada como fonte de
carbono em bioprocessos a fim de obter enzimas degradadoras de celulose (celulases).
A molécula de celulose é composta de unidades de β-D-glicose (Figura 1), sintetizado
principalmente pelas células vegetais para constituição da parede celular, caracterizada
pela sua organização molecular e recalcitrância das regiões cristalinas (ÂNGELO,
2010).
Figura 1: Estrutura química da molécula de celulose (ÂNGELO, 2010).
Celulases são enzimas que constituem um complexo capaz de atuar sobre
materiais celulósicos, promovendo sua hidrólise. Estas enzimas são biocatalisadores
altamente específicos que atuam em sinergia para a liberação de açúcares, dos quais a
glicose é o que desperta maior interesse industrial, devido à possibilidade de sua
conversão em etanol (OGEDA; PETRI, 2010).
As enzimas do complexo celulolítico são hidrolases que clivam ligações Oglicosídicas, essas enzimas são classificadas de acordo com seu local de atuação no
substrato celulósico (Figura 2) e são dividas em três grandes grupos: endoglucanases
(EnG), que clivam ligações internas da fibra celulósica; exoglucanases (ExG), que
2
atuam na região externa da celulose; e β-glicosidases (BG), que hidrolisam
oligossacarídeos solúveis em glicose (CASTRO; PEREIRA Jr, 2010).
Figura 2 – Representação esquemática da ação catalítica do complexo celulolítico sobre celulose
(OGEDA; PETRI, 2010).
As β-glicosidases são um grupo de enzimas bem heterogêneo que podem ser
classificadas em três categorias com base na especificidade do substrato: (1) arilo-βglucosidases, que atuam sobre substratos do grupo aril-glucósidos; (2) celobiases
verdadeiras, que hidrolisam a celobiose para liberar glicose; (3) enzimas com baixa
especificidade ao substrato, que são ativas sobre uma grande variedade de substratos.
Estas enzimas possuem dois modos de ação que determinam sua aplicação: (1)
atividade hidrolítica, onde catalisam a hidrólise da ligação β 1,4-glicosídica em
oligossacáridos de cadeia curta;
(2) atividade de transglicosilação ou glicosil
transferase, que consiste na capacidade de síntese de ligações glicosídicas (BHATIA et
al., 2002).
A alta atividade de hidrólise associada à tolerância a glicose, calor, álcool e ácidos
são características importantes para enzimas potencialmente aplicáveis em processos
industriais e a bioprospecção de linhagens fúngicas com boa produção de β-glicosidase
tem-se concentrado nesses parâmetros (KRISCH et al., 2012).
As β-glicosidases tem papel crucial na degradação da celulose, devido à
propriedade de hidrolisar a celobiose, dissacarídeo de glicose formado pela ação de
enzimas despolimerizantes sobre a cadeia de celulose. O acúmulo de celobiose no meio
reacional inibe a atividade de enzimas celulolíticas, desta forma, a β-glicosidase
possibilita a continuidade do processo catalítico porque degrada o principal inibidor das
3
celulases, liberando monossacarídeos fermentescíveis para a produção de etanol
(PARRY et al., 2001).
A função desempenhada pelas β-glicosidases no processo de degradação
enzimática da celulose faz com que esta enzima apresente grande potencial para a
indústria de etanol, contribuindo para viabilizar a obtenção de combustíveis a partir de
resíduos agroindustriais ricos em celulose (LEITE et al., 2007).
As β-glicosidases também apresentam aplicabilidade na indústria de sucos e
bebidas, por atuarem em sinergia com outras enzimas celulolíticas para desestruturar a
matriz da parede celular dos vegetais, o que facilita a ruptura da célula vegetal
aumentando a extração do suco. Durante o processo de vinificação a adição de celulases
auxilia a extração de antocianinas e terpenos, que estão presentes na casca da uva e são
os compostos responsáveis pela coloração e aroma do vinho (LEITE et al., 2007). As
celulases são utilizadas no processamento de frutas, hortaliças e grãos tornando-se
indispensáveis para a hidrólise de parede celular das plantas, no aumento do rendimento
e na redução da viscosidade de derivados de frutas (COURI et al, 2000).
A
hidrólise
de
isoflavonas
glicosiladas
de
soja
é
uma
importante
aplicação de β-glicosidase na indústria de alimentos, por aumentar a biodisponibilidade
das isoflavonas ao intestino humano (SINGHANIA et al., 2009).
Com crescimento da indústria de alimentos e biocombustíveis houve também um
aumento da geração de resíduos agroindustriais, que geralmente não recebem a devida
atenção, no sentido de serem usados ou reciclados, evitando o desperdício e
consequentes problemas ambientais devido ao acúmulo de matéria orgânica no meio
ambiente (SINGHANIA et al., 2009). Esses resíduos são ricos em material
lignocelulósicos constituídos por lignina, hemicelulose e celulose, unidas entre si por
ligações covalentes e não covalentes, formando uma rede complexa resistente a ataques
microbianos (CASTRO; PEREIRA Jr., 2010).
As características dos resíduos agroindustriais permitem sua utilização como
substratos para o crescimento microbiano, pois se assemelham com o habitat natural
desses microrganismos sendo ideais para obtenção de produtos com alto valor agregado,
como as enzimas, antibióticos, alcalóides, fatores de crescimento de plantas, ácidos
orgânicos, biopesticidas, incluindo micopesticidas e herbicidas, biossurfactantes,
biocombustíveis, compostos de aroma, etc (PANDEY et al., 2000; SINGHANIA et al.,
2009; BARRIOS-GONZÁLEZ, 2012).
4
O Cultivo em Estado Sólido (CES) é um bioprocesso onde o crescimento
microbiano e as formações de produtos ocorrem na superfície do substrato sólido e na
ausência de água livre, devido a seus aspectos físico-químicos é um processo que
apresenta diversas vantagens para obtenção de produtos de origem microbiana. Os
substratos tradicionalmente utilizados são produtos agrícolas, resíduos agroindustriais e
florestais. Dentre os produtos agrícolas e seus resíduos os mais utilizados são: arroz,
trigo, painço, cevada, milho e soja, farelo de trigo, bagaço de cana, sabugo e palha de
milho, farelo de soja entre outros (PANDEY et al., 2000; PANDEY, 2003).
Os fungos filamentosos são os que melhor se adaptam ao CES, devido a sua
morfologia, visto que o crescimento em hifas permite melhor colonização do substrato e
melhor adaptabilidade aos aspectos físico-químicos do processo (BARRIOSGONZÁLEZ, 2012).
O substrato ideal deve não só servir como suporte para as células, mas também,
fornecer nutrientes para que a cultura microbiana se desenvolva nele. Com essas
características, o farelo de trigo tem sido o principal subproduto utilizado em pesquisas
com CES, principalmente para produção de enzimas de interesse industrial (COURI et
al, 2000; PANDEY et al., 2000).
A aplicação do CES para produção de enzimas microbianas tem recebido grande
atenção, visto que, as quantidades de enzimas secretadas por fungos filamentosos neste
sistema frequentemente superam as secretadas em Cultivo Submerso (CS). Além disso,
apresentam características diferentes (peso molecular, parâmetros cinéticos e condições
ótima) em relação às obtidos em CS. O CES é favorecido pelo reduzido teor de água, o
que gera um processo industrial limpo, com baixos níveis de água residual e com
economia energética no processo de recuperação (downstream) (VINIEGRAGONZALEZ, 1997; BARRIOS-GONZÁLEZ, 2012).
A utilização de fungos filamentosos termófilos em CES é uma alternativa para
superar alguns entraves da aplicação industrial da β-glicosidase, considerando a redução
do custo de produção e a estabilidade estrutural das enzimas produzidas por linhagens
termófilas. Além disso, diminuem problemas com contaminação devido a baixa
atividade de água, desfavorecendo o crescimento de leveduras e bactérias. Nesse
sentido, objetivou-se com esse trabalho prospectar fungos filamentosos na região de
Dourados-MS, visando isolar linhagens termófilas com potencial para produção de βglicosidase por CES e caracterizar as enzimas produzidas pelas linhagens selecionadas.
5
2. METODOLOGIA
2.1) Isolamento dos fungos
Para o isolamento das linhagens de fungos filamentosos foram coletadas
amostras de pilhas de compostagem, pilhas de bagaço de cana-de-açúcar (Usina São
Fernando Açúcar e Álcool Ltda.) e serapilheira de fragmento de floresta estacional
semidecidual atlântica (Mata do Azulão), todas localizadas na região de Dourados-MS.
As amostras foram diluídas seriadamente e 100 µL foi inoculado em placas de Petri
contendo 20 mL de meio de cultura Sabouraud Dextrose acrescido de 0,25 g/L de
tetraciclina. As placas foram incubadas a 28 e 45 oC a fim de isolar linhagens mesófilas
e termófilas, e as colônias foram replaqueadas para obter colônias puras. Para manter a
viabilidade os microrganismos foram mantidos a 4oC em tubos de ensaio com meio
Sabouraud Dextrose inclinado, que foram repicados mensalmente. Cada isolado
também foi mantido com óleo mineral sobre o micélio, estes foram repicados a cada
ano.
2.2) Seleção das linhagens com potencial para produção de β-glicosidase
2.2.1) Preparo do inóculo
Os microrganismos foram cultivados em frascos Erlenmeyer de 250 mL
contendo 40 mL do meio ágar Sabouraud Dextrose inclinado, mantido por 48 horas nas
respectivas temperaturas de crescimento dos isolados. A suspensão do microrganismo
foi obtida pela raspagem suave da superfície do meio de cultura empregando 30 mL de
solução nutriente composta de sulfato de amônia 0,1%, sulfato de magnésio heptahidratado 0,1% e nitrato de amônia 0,1% (m/v), previamente autoclavada. A inoculação
do fungo no substrato se deu pela transferência de 5 mL desta suspensão para os frascos
Erlenmeyer contendo farelo de trigo.
2.2.2) Cultivo em Estado Sólido
Para seleção das linhagens promissoras os isolados foram cultivados em Estado
Sólido (CES) por 96 horas em frascos Erlenmeyer de 250 mL, contendo 5 g de farelo de
trigo umedecidos com solução nutriente (descrita no item anterior) até obter 70% de
6
umidade. Todo o material utilizado foi previamente autoclavado a 121°C durante 20
minutos.
2.2.3) Extração da enzima
A enzima foi extraída pela adição de 50 mL de água destilada nos frascos
Erlenmeyer contendo o substrato com o fungo cultivado. Os frascos foram mantidos em
agitação por 1 hora a 150 rpm, em seguida foram filtrados e posteriormente
centrifugados a 1500 xg. O sobrenadante foi utilizado para os ensaios enzimáticos.
2.2.4) Determinação da atividade de β-glicosidase nos extratos enzimáticos
A atividade de β-glicosidase foi determinada com 50 µL do extrato enzimático,
250 µL de tampão acetato de sódio 100 mM, pH 4,5 e 250 µL de p-nitrofenil β-Dglicopiranosídeo 4 mM (pNPβG, Sigma), a reação enzimática ocorreu por 10 minutos a
temperatura de 50°C e foi paralisada com 2 mL de carbonato de sódio 2000 mM. O pnitrofenol liberado foi quantificado por espectrofotometria a 410 nm. Uma unidade de
atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1
µmol de p-nitrofenol por minuto de reação.
2.3) Determinação da temperatura ótima dos fungos termófilos
Para determinar a temperatura ótima de crescimento das linhagens selecionadas,
os isolados foram cultivados em temperaturas que variaram de 25 a 60 oC, por repique
de ponto central em placa de Petri contendo 20 mL de meio de cultura Sabouraud
Dextrose, e o diâmetro do alo formado pelo micélio foi medido a cada 24 horas durante
96 horas.
2.4) Avaliação dos parâmetros de cultivo
As
linhagens
selecionadas
foram
cultivadas
em
diferentes
resíduos
agroindustriais a fim de estabelecer o substrato ideal para produção de β-glicosidase por
CES, os resíduos avaliados foram sabugo de milho, bagaço de cana, palha de milho,
casca de arroz, farelo de soja e farelo de trigo. A umidade do substrato foi variada de 50
a 90%, utilizando a solução nutriente anteriormente descrita. A fim de estabelecer o pH
ideal para o processo foi utilizado solução nutriente com pH variando de 4,0 a 7,0 para
7
umedecer o substrato. O tempo de cultivo para a máxima produção de β-glicosidase foi
avaliado a cada 24 horas durante 168 horas. Cada parâmetro de cultivo foi avaliado
separadamente, os respectivos ótimos foram adotados nos ensaios posteriores, sendo
que no último ensaio todas as características ideais para produção da enzima foram
adotadas.
2.5) Caracterização bioquímica das β-glicosidases produzidas
2.5.1) Efeito do pH e temperatura sobre a atividade enzimática
O pH ótimo foi determinado mensurando a atividade da enzima a 50ºC em
diferentes valores de pH (3,0 - 8,0), nesta etapa foi utilizado tampão McIlvaine a 0,1M.
A temperatura ótima foi determinada pela dosagem da atividade enzimática em
diferentes temperaturas (35 a 70ºC), no respectivo pH ótimo da enzima. A estabilidade
da enzima ao pH foi avaliada incubando-a por 24 horas a 25°C em diferentes valores de
pH. Os tampões utilizados foram McIlvaine 0,1M (3,0 - 8,0), Tris-HCl 0,1M (8,0 – 8,5)
e Glicina-NaOH 0,1M (8,5 – 10,5). A termoestabilidade foi estudada incubando a
enzima por 1 hora em valores de temperatura que variaram de 30 a 70°C. As atividades
residuais foram determinadas nas condições ótimas de pH e temperatura da enzima.
2.5.2) Avaliação do potencial de hidrolise de celobiose pelas enzimas produzidas
O potencial das enzimas de hidrolisar celobiose foi avaliado através do Kit
enzimático colorimétrico (Glicose-PP Analisa), incubando 100 µL do extrato
enzimático em tampão acetato de sódio 50 mM com 0,5% de Celobiose (Fluka), a
reação ocorreu a 50oC por 10 minutos e foi paralisada em banho de gelo. Para
quantificar a glicose liberada foi adicionado 1 mL da solução de cor do kit glicoseoxidase na reação anterior, que reagiu a 37oC por 10 minutos. A reação foi paralisada
em banho de gelo. A glicose liberada foi quantificada por espectrofotometria a 505 nm.
Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima
necessária para liberar 1 µmol de produto por minuto de reação.
8
2.5.3) Efeito da concentração de etanol e glicose sobre a atividade das βglicosidases
A atividade enzimática foi avaliada adicionando diferentes concentrações de
etanol (0 – 30%) e de glicose (0 – 100 mM) na mistura de reação para dosagem de
atividade de β-glicosidase. Os ensaios foram realizados em condições ótimas de
temperatura e pH de cada enzima.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1) ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE LINHAGENS COM POTENCIAL PARA
PRODUÇÃO DE Β-GLICOSIDADE
Posteriormente ao processamento das amostras foram isolados 17 fungos
morfologicamente distintos, sendo 13 mesófilos e 4 termófilos. Os microrganismos
isolados foram depositados no banco de cultura do Laboratório de Enzimologia e
Processos Fermentativos, seguindo a sequência numérica estabelecida em trabalhos
anteriores realizados pelo grupo de pesquisa. Para avaliar a produção de β-glicosidase
todos os fungos foram cultivados em estado sólido por 96 horas utilizando farelo de
trigo como substrato, com umidade inicial de 70%.
Dentre os fungos mesofílicos, obtidos a 28oC, os isolados 12 e 25 se destacaram
para produção de β-glicosidase, pois produziram cerca de 4,50 e 7,32 U/mL
respectivamente. Todos os isolados obtidos a 45oC apresentaram potencial para
produção de β-glicosidase com aproximadamente 4,81 U/mL, 4,92 U/mL, 1,80 U/ml,
4,22 U/mL e 2,08 U/ml, respectivamente (Tabela 1).
9
Tabela 1– Seleção de microrganismos para produção de β-glicosidase por cultivo em estado sólido
utilizando farelo de trigo com 70% de umidade e tempo de cultivo 96 horas.
Isolados
Local de coleta
Temperatura de
β-glicosidase (U/mL)
isolamento (oC)
Is.11
Bagaço de Cana
28
0,84
Is.12
Pilha de Compostagem
28
4,50
Is.13
Pilha de Compostagem
28
3,43
Is.14
Serapilheira
28
0,74
Is.15
Pilha de Compostagem
28
2,55
Is.16
Cama de Frango
28
0,37
Is.17
Cama de Frango
28
0,79
Is.18
Cama de Frango
28
0,28
Is.19
Cama de Frango
28
0,33
Is.20
Serapilheira
45
4,81
Is.21
Bagaço de Cana
45
4,92
Is.22
Bagaço de Cana
45
1,80
Is.23
Bagaço de Cana
45
4,22
Is.24
Cama de Frango
45
2,08
Is.25
Pilha de Compostagem
28
7,32
Is.26
Pilha de Compostagem
28
1,12
Is.27
Pilha de Compostagem
28
1,75
Com o objetivo de confirmar a termofilia dos microrganismos obtidos em
temperatura de 45oC, os isolados foram submetidos a temperaturas entre 25 e 60oC para
determinar a temperatura ótima de crescimento, para isso, o crescimento micelial foi
acompanhado pela medição do diâmetro em centímetros.
Os isolados 20 e 23 atingiram a borda da placa de Petri de 9 cm após 48 horas de
cultivo a 50 e 40oC, respectivamente. Para o isolado 21 a temperatura de 45oC foi ideal
para o crescimento em diâmetro. O isolado 22 apesar de crescer em 45oC não é
termófilo, visto que sua temperatura ótima de crescimento foi 35 oC (Figura 3).
10
Figura 3 – Temperatura ótima de crescimento micelial dos isolados obtidos a 45 oC, medida do
diâmetro do alo da colônia em centímetros.
Os resultados obtidos confirmam a temofilia dos isolados 20, 21, 23 e 24,
considerando o padrão de Madigan et al. (2004) que definem que microrganismos
termófilos são aqueles que apresentam crescimento entre 40 e 60oC. Devido ao
potencial para produção enzimática aliado a característica de termofilia, os isolados 20,
21 e 23 foram selecionados para a continuidade do trabalho.
3.2) AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS DE CULTIVO PARA PRODUÇÃO DE
β-GLICOSIDASE
O estabelecimento de relações entre o metabolismo dos microrganismos e os
fatores físico-químicos que afetam a produção de enzima ajuda a desenvolver modelos
11
apropriados de biorreatores assim como outros bioprocessos para aplicação de enzimas
na indústria (SINGHANIA et al., 2009). Os fatores avaliados foram o tipo de substrato
sólido utilizado no processo de cultivo, temperatura, pH inicial do processo, teor de
umidade e tempo de cultivo.
3.2.1) Seleção do Substrato
Nesta etapa do trabalho foi utilizado como substrato para o crescimento
microbiano: sabugo de milho, bagaço de cana, palha de milho, casca de arroz, farelo de
soja e farelo de trigo nas mesmas condições de cultivo para os 3 isolados, levando em
conta sua temperatura ótima de crescimento.
O farelo de trigo foi o melhor substrato para a produção de β-glicosidase. Os
isolados 20, 21 e 23, quando cultivados em farelo de trigo, produziram 4,48 U/mL, 4,92
U/mL, 9,95 U/mL, respectivamente. Os mesmos microrganismos, quando cultivados
nos outros substratos testados, apresentaram uma produção de β-glicosidase inferior a
40% da obtida no cultivo em farelo de trigo, exceto o isolado 20 que produziu 4,31
U/mL, quando cultivado em sabugo de milho. Os microrganismos utilizados neste
trabalho não produziram β-glicosidase nos cultivos realizados em bagaço de cana e
casca de arroz (Tabela 2).
Tabela 2: Seleção de resíduo agroindustrial como substrato para a produção de β-glicosidase, o cultivo
em estado sólido ocorreu por 96 horas nas respectivas temperaturas ótimas de crescimento de cada
isolado com umidade de 70%.
Substrato
Is.20 (U/mL)
Is.21 (U/mL)
Is.23(U/mL)
Sabugo de milho
Bagaço de cana
Palha de milho
Casca de arroz
Farelo de soja
Farelo de trigo
4,31
0,13
1,59
0
0,9
4,48
0,07
0
0,51
0
0,86
4,92
3,08
0,03
1,37
0,11
3,8
9,95
Esses resultados estão de acordo com trabalhos anteriores que relatam a
utilização de subprodutos agroindustriais para a produção de β-glicosidase por fungos
termófilos. O farelo de trigo, palha de trigo e farelo de soja foram os melhores
substratos para produção de β-glicosidase para o fungo Thermoascus aurantiacus a
produção da enzima nesses substratos foi de aproximadamente 5,0 U/mL, assim como
12
neste trabalho, a produção da enzima nos outros substratos testados foi inferior ao da
obtida com o farelo de trigo (KALOGERIS et al., 2003; LEITE et al., 2008). O farelo de
trigo tem sido o subproduto mais usado por induzir uma ampla variedade de enzimas
celulolíticas e apresentar custo relativamente baixo. Esse substrato complexo é rico em
proteínas (14%), hidratos de carbono (27%), minerais (5%), gordura (6%) e vitamina B
o que provavelmente favorece o crescimento e a produção de enzimas pelos
microrganismos (PANDEY et al., 2000; DELABONA et al., 2012).
3.2.2) Umidade ideal
O teor de umidade do meio de cultivo foi variado de 50 a 90%, sendo que teores
de umidades entre 60-75% foram os mais propícios para a produção de β-glicosidase.
Dentre os microrganismos selecionados o isolado 21 foi o que apresentou melhor
potencial para produção de β-glicosidase em baixa umidade; a maior produção da
enzima foi constatada em 60% de umidade onde se obteve 6,29 U/mL. O isolado 23 foi
o que apresentou melhor produção de β-glicosidase em 70% de umidade, pois obteve
9,25 U/mL da enzima. O isolado 20 teve produção ótima da enzima com 65% de
umidade obtendo 4,16 U/mL de β-glicosidase (Figura 4).
Figura 4: Produção de β-glicosidase em função da umidade em CES utilizando farelo de trigo como
substrato, o cultivo ocorreu por 96 horas nas respectivas temperaturas ótimas de cada isolado.
13
Na ausência de água livre entre as partículas do meio o microrganismo consegue
ter melhor aproveitamento do substrato por crescer de forma mais homogênea, em
concentrações superiores a 80% ocorre a compactação do substrato dificultando a
transferência de massas e consequentemente o crescimento do fungo (SINGHANIA et
al., 2009).
Leite et al. (2008) obtiveram 5,8 U/mL de β-glicosidase pelo fungo T.
aurantiacus cultivado em farelo de trigo com umidade de 60%; Kalogeris et al. (2003)
apresentaram resultados semelhantes ao de Leite et al. (2008), com outra linhagem do
mesmo microrganismo cultivado em palha de trigo como substrato com 80% de
umidade. Delabona et al. (2013) mostraram que para as diferentes linhagens mesofilicas
de Aspergillus 50% de umidade foi ideal para atingir a máxima produção de βglicosidase.
O teor de umidade adequado no cultivo em estado sólido é variável e dependente
da natureza do material, das necessidades do microrganismo e da expressão de
metabólitos desejados (PANDEY et al., 2000), geralmente fungos precisam de menor
umidade, sendo que 40-60% de umidade pode ser suficiente (SINGHANIA et al.,
2009). O teor de umidade em processos de CES pode variar entre 30-85%, mimetizando
as condições encontradas na natureza (CASTRO e PEREIRA Jr, 2010). O baixo grau de
umidade em CES é uma vantagem para aplicação industrial, pois diminui os problemas
com contaminação, e gera pequenas quantidades de água residual (BON et al., 2008).
3.2.3) Determinação do pH inicial para a produção das enzimas
A variação do pH do meio de cultivo se deu pelo ajuste do pH da solução
nutriente. O pH 5,0 foi ideal para os isolados 20 e 21 e para o isolado 23 foi o pH 4,0;
sendo que a produção enzimática de β-glicosidase foi de 4,61 U/mL, 4,85 U/mL e 9,77
U/mL respectivamente (Figura 5). Esses resultados estão de acordo com os citados na
literatura, principalmente quando comparados com estudos anteriores que utilizaram os
fungos T. aurantiacus e Aspergillus terreus. Para esses microrganismos o pH inicial
ideal para produção
de β-glicosidase
foi
de 4,0 e 5,5,
respectivamente
(SHAHRIARINOUR et al., 2011).
14
Figura 5: Efeito do pH na produção de β-glicosidase utilizando farelo de trigo para o CES por 96 horas
nas temperaturas e umidades ótimas de cada microrganismo.
Geralmente o pH ótimo para produção de celulases por linhagens fúngicas varia
entre 4,0 e 5,0 confirmando a preferência destes microrganismos por ambientes mais
ácidos. Em valores de pH acima de 5,0 os fungos filamentosos não conseguem se
desenvolver de forma adequada e consequentemente a produção de enzimas é reduzida.
Os valores de pH para CES normalmente se refere ao inicial do processo de cultivo,
visto que, o pH pode variar consideravelmente dependendo da fonte de nitrogênio e o
tempo de cultivo (KALOGERIS et al., 2003).
3.2.4) Tempo de Cultivo
A produção enzimática foi avaliada a cada 24 horas, por um período de 168
horas de cultivo. A maior produção de β-glicosidase pelas linhagens selecionadas foi
entre 72 a 120 horas, tempo este, considerado curto para produção enzimática (Figura
6).
15
Figura 6: Tempo de cultivo para produção de β-glicosidases em farelo de trigo, com temperatura,
umidade e pH ótimos para a produção da enzima.
Ao final da otimização do processo de cultivo foi obtido a maior produção de βglicosidases para todas as linhagens selecionadas. O isolado 20 apresentou produção de
máxima de 6,0 U/mL após 72 horas de cultivo. Dentre as linhagens selecionadas o
isolado 23 foi o microrganismo que apresentou a maior produção de β-glicosidase, cerca
de 11,7 U/mL após 96 horas de cultivo (Tabela 3).
Tabela 3: Parâmetros de cultivo em estado sólido para produção de β-glicosidase à partir dos
microrganismos selecionados.
Isolados
Substrato
Umidade
pH inicial
Tempo de
cultivo
U/mL
Is. 20
Farelo de trigo
65%
5,0
72
6,0
Is. 21
Farelo de trigo
60%
5,0
96
6,81
Is. 23
Farelo de trigo
70%
4,0
96
11,75
Os resultados obtidos são bastante promissores quando comparados com
trabalhos anteriores. No estudo realizado por Leite et al. (2008) os pesquisadores
obtiveram a máxima produção da enzima (7,0 U/mL) em 72 horas utilizando o T.
16
aurantiacus. Delabona et al. (2012) obtiveram 10,5 U/mL de β-glicosidase cultivando o
Aspergillus fumigatus por 96 horas, ambos utilizando o farelo de trigo como substrato.
Gao et al. (2012) cultivaram o fungo uma linhagem de Fusarium proliferatum
NBRC109045 em palha de milho associada a farelo de trigo por 240 horas e obtiveram
3,31 U/ml de β-glicosidase.
3.3) CARACTERIZAÇÃO DAS β-GLICOSIDASES PRODUZIDAS PELAS
LINHAGENS ISOLADAS.
3.3.1) Efeito de pH e temperatura sobre a atividade das enzimas
As β-glicosidases avaliadas apresentaram melhor atividade nos valores de pH
4,5 e 5,5 com ampla estabilidade estrutural ao pH, visto que a enzima do isolado 21
manteve-se estável após 24 horas de incubação em uma faixa de pH 3,5 a 10,0. Em
comparação, a enzima do isolado 20 apresentou estabilidade de pH 4,5 – 8,0, mantendo
83% de sua atividade original após 24 horas de incubação em pH 8,0. A β-glicosidase
do isolado 23 mostrou ser estável a faixa de pH 3,5 – 6,0 mantendo 89% de sua
atividade original após 24 horas de incubação em pH 6.5 (Tabela 4).
Valores de pH ótimos próximos a 4,0 e 5,0 são comumente observados para βglicosidases produzidas por fungos filamentosos. O pH ótimo da β-glicosidases
produzida pelo fungo T. aurantiacus foi 4,5 e sua estabilidade foi mantida do pH 4,5 ao
8,0 (LEITE et al., 2008). O pH ótimo para as enzimas produzidas pelos fungos
Rhizomucor miehei e A. fumigatus P40M2 foi 5,0 e 4,0, respectivamente, mantendo-se
estáveis em uma faixa de pH de 4,0-6,0 e de 3,0-6,0 respectivamente (KRISCH et al.,
2012; DELABONA et al., 2013). Os resultados demostram que enzimas produzidas
pelas linhagens selecionadas apresentam estabilidade estrutural igual ou superior às
descritas na literatura, o que confirma o potencial industrial das β-glicosidases
produzidas.
Tabela 4: Características bioquímicas das β-glicosidases produzidas em condições otimizadas de cultivo.
Microrganismos
pH ótimo
Is.20
Is.21
Is.23
4,5
5,5
4,5
Temperatura
ótima
75 oC
60 oC
70 oC
Estabilidade de
pH
4,0 – 8,0
4,0 – 10,5
3,0 – 6,0
Estabilidade de
temperatura
40 – 70 oC
40 – 55 oC
40 – 60 oC
17
Os valores de temperatura ótima das β-glicosidases produzidas pelos isolados
20 e 23 foram 75oC e 70oC, respectivamente. A β-glicosidase do isolado 20 se destaca
devido à alta temperatura para atividade enzimática e maior termoestabilidade, sendo
que, após 1 hora de incubação a 70 oC a enzima manteve 88% da sua atividade original.
A enzima do isolado 23 também apresentou elevada temperatura ótima, 70oC, no
entanto sua estabilidade térmica foi menor do que a da enzima do isolado 20, mantendose estável após 1 hora a 60oC, cerca de 90% de sua atividade original foi recuperada. A
β-glicosidase do isolado 21 apresenta atividade ótima a 60oC e a estabilidade foi de 40 a
55oC, a enzima mantive 77% de sua atividade original após 1 hora
a 55 oC,
respectivamente (Tabela 4).
O isolado 20 possui estabilidade térmica semelhante a do fungo termofílo T.
aurantiacus que tem atividade ótima a 75oC e mantém 85% de sua atividade original
após 1 hora a 70 oC (LEITE et al., 2008). Outros trabalhos realizados com βglicosidases microbianas, tanto mesófilas como com termófilas, relatam que essas
enzimas apresentam atividade ótima entre 50 e 75oC e estabilidade térmica entre 50 e
80oC (LEITE et al., 2007; LEITE et al., 2008; KRISCH et al., 2012; DELABONA et al.,
2013). A estabilidade térmica
da enzima refere-se à resistência a desnaturação em
função da temperatura. Enzimas termófilas apresentam atividade máxima em elevadas
temperaturas, podendo variar entre 50 e 65 oC. Elevadas temperaturas dos processos
industriais favorecem a formação de produto em menor tempo, justificando a incessante
busca por microrganismos termófilos e suas enzimas (DELABONA et al., 2012;
DELABONA et al., 2013; GOMES et al., 2007).
3.3.2) Hidrólise de Celobiose
As atividades enzimáticas obtidas com substrato sintético (pNPβG) foram
utilizadas como padrões para comparação com as obtidas utilizando celobiose como
substrato.
18
Tabela 5: Atividade relativa das β-glicosidases de fungos termofílicos em substrato sintético (pNPβG) e
substrato natural (Celobiose). As atividades relativas obtidas pela hidrólise da celobiose foram expressas
em porcentagem da atividade enzimática obtida utilizando pNPβG como substratos.
Substratos
Atividade Relativa (%)
Is. 20
Is. 21
Is. 23
pNPβG 4mM
100
100
100
Celobiose 0.5%
68,5
32,6
95,1
As atividades relativas obtidas com a hidrolise da celobiose para as enzimas dos
isolados 20 e 23 corresponderam a 68,5 e 95,1% das atividades utilizando pNPβG. A
enzima produzida pelo isolado 21 apresentou potencial reduzido para a hidrolise da
celobiose, por ter atividade inferior a 40% da obtida com pNPβG (Tabela 5). Esses
dados nos mostram que as enzimas apresentam considerável potencial para a hidrólise
da celobiose. As β-glicosidases de fungos termófilos são caracterizadas por uma baixa
especificidade de substrato. Estudos anteriores com a β-glicosidases purificada
mostraram que a enzima tem ampla especificidade em relação aos substratos, no entanto
pNPβG e celobiose são os preferidos (ZANOELO et al., 2004). Na maioria dos casos as
enzimas apresentam atividade catalítica muito maior com substrato artificial como o
pNPβG do que com celobiose (SINGHANIA et al., 2012)
Os resultados obtidos indicam que as enzimas produzidas apresentam potencial
para hidrolisar diferentes substratos glicosídeos, obviamente com diferentes afinidades.
No entanto, a confirmação desta hipótese só será possível com a purificação destas
proteínas. Segundo Bathia et al. (2002) a maioria das β-glicosidases microbianas
apresentam baixa especificidade, isto é, hidrolisam diferentes substratos com diferentes
afinidades.
3.3.3) Efeito de etanol
As β-glicosidases deste trabalho tiveram seu potencial catalítico avaliados na
presença de etanol em diferentes temperaturas. Todas as enzimas foram inibidas em
concentrações acima de 5% de etanol, quando incubadas em temperaturas superiores a
60oC. No entanto, em temperaturas inferiores foi possível observar considerável
estabilidade enzimática em misturas reacionais contendo até 30% de etanol (Figura 7).
19
Figura 7: Efeito de etanol sobre a atividade das β-glicosidases em diferentes temperaturas (40, 50, 55oC e
Temperatura ótima de atividade das enzimas).
A estabilidade enzimática a solventes orgânicos está intimamente relacionada
com a temperatura. Em temperaturas elevadas, as proteínas apresentam uma maior
flexibilidade, permitindo a interação do etanol com resíduos internos hidrofóbicos da
molécula. Essas interações causam alterações irreversíveis na estrutura protéica,
resultando na perda da atividade enzimática (LUCARINI et al., 2005).
Todas as β-glicosidase produzidas apresentaram aumento na sua velocidade
catalítica com adição de etanol na mistura de reação, principalmente quando incubadas
em temperaturas inferiores.
A ativação da β-glicosidase por etanol é comum e já foi citada por outros
autores. O aumento do potencial catalítico pelo etanol está associado com a atividade de
transglicosilação ou glicosil transferase, onde o etanol pode agir como aceptor para o
cátion glicosil intermediário, durante a hidrólise do substrato, isso explica o aumento
das atividades das β-glicosidases (Figura 7). Na presença de álcoois a β-glicosidase
pode catalisar a síntese de alquil-glicosídios, usando diferentes doadores de açúcar tais
como a celobiose e o pNPβG (PARRY et al., 2001; BHATIA et al., 2002;
BARBAGALLO et al., 2004; LEITE et al., 2008; HARNPICHARNCHAI et al., 2009;
KRISCH et al., 2012).
20
A estabilidade ao etanol é uma característica enzimática bastante apreciável em
processos de sacarificação e fermentação simultâneas, onde se associa ao processo de
hidrólise enzimática microrganismos fermentadores, que converterão os açúcares
fermentescíveis em etanol, reduzindo o efeito inibidor dos produtos de hidrólise sobre
as enzimas. No entanto, para a viabilidade deste processo é imprescindível que as
enzimas envolvidas apresentem tolerância à presença de etanol no meio reacional
(LEITE et al., 2008; CARDONA; SÁNCHEZ, 2007).
Considerando que em processos fermentativos tradicionais de produção
alcoólica, onde a Saccharomyces cerevisiae é utilizada como agente fermentador,
concentrações superiores a 10% de etanol são extremamente nocivas para o próprio
microrganismo fermentador (GU et al., 2001), é possível afirmar que as β-glicosidases
produzidas pelos microrganismos selecionados apresentam estabilidade suficiente para
serem aplicadas em processos de sacarificação e fermentação simultânea.
3.3.4) Efeito de glicose
A glicose é um forte inibidor da β-glicosidase, seu efeito sobre a ação das
enzimas foi estudado a partir da cinética da atividade residual em função da
concentração da glicose de 0 a 100 mM. As enzimas avaliadas apresentaram um perfil
de inibição muito semelhante, sendo que todas tiveram sua atividade reduzida em
aproximadamente 50% com 30 mM de glicose no meio reacional (Figura 8).
Figura 8: Efeito de glicose sobre a atividade das β-glicosidases.
21
Em concentrações de 100 mM de glicose restaram cerca de 20% da atividade
original das enzimas dos isolados 20, 21 e 23 (Figura 8). Quando a concentração do
substrato foi igualada a concentração da glicose, a inibição das β-glicosidase foi
completamente revertida, exceto a do isolado 20 (Tabela 6).
A inibição das β-glicosidases por glicose pode ser competitiva ou não
competitiva. A inibição competitiva é revertida pelo aumento da concentração do
substrato, o mesmo não acontece na inibição não competitiva. Isso ocorre porque na
inibição competitiva o inibidor e o substrato competem pelo sítio ativo da enzima, e na
inibição não competitiva o inibidor se liga em outra parte na enzima diminuindo a taxa
de formação do produto (LEITE et al., 2008). Portanto, os resultados indicam que a
inibição provocada por glicose nas β-glicosidases dos isolados 21 e 23 é competitiva, e
a inibição do isolado 20 é não competitiva (Tabela 6).
Tabela 6: Tipo de inibição da glicose sobre a atividade enzimática das linhagens selecionadas.
Enzimas
At. Residual (%)
At. Residual (%)
At. Residual (%)
pNPβG 4 mM
pNPβG 4 mM
pNPβG 30 mM
Glicose 30 mM
Glicose 30 mM
Tipo de Inibição
Is. 20
100
46.5
55.3
Não-Competitiva
Is. 21
100
51.1
96.3
Competitiva
Is. 23
100
46.3
97.1
Competitiva
Um dos principais obstáculos na utilização das β-glicosidases em processos
industriais é a forte inibição da enzima por glicose. A elevada concentração de glicose
pode bloquear o a entrada do substrato no sítio ativo da enzima, ou impedir o substrato
hidrolisado de sair (SINGHANIA et al., 2012). Neste sentido, muitos trabalhos
prospectam β-glicosidases que não sejam inibidas pelo produto da reação, pois
poderiam auxiliar no processo de sacarificação enzimática do material celulósico
(ZANOELO et al., 2004).
Por outro lado, a reversibilidade da inibição por glicose apresentada pelas
enzimas dos isolados 21 e 23 associada a elevada estabilidade ao etanol, confirmam que
estas β-glicosidases são promissoras para a aplicação em processos de sacarificação e
fermentação simultâneos (LEITE et al., 2008). No entanto, novos ensaios são
necessários para confirmação desta hipótese.
22
4) CONCLUSÕES
As linhagens selecionadas apresentaram-se viáveis para a produção de βglicosidase por cultivo em estado sólido. As condições de cultivo ideais para a produção
de β-glicosidase foram: farelo de trigo como substrato, umidade entre 60 e 75% e pH
entre 4,0 e 5,0. Estas condições confirmam que fungos filamentosos preferem ambientes
mais ácidos e são adaptados a crescerem na ausência de água livre, utilizando substratos
sólidos para a fixação e nutrição de sua estrutura micelial.
As análises do efeito do pH e da temperatura sobre a atividade das β-glicosidases,
mostraram características diferentes para as enzimas avaliadas, no entanto, todas
apresentaram estabilidade estrutural, o que é esperado para enzimas produzidas por
linhagens termófílas.
Dentre os microrganismos avaliados no presente trabalho destaca-se o isolado 23,
devido sua elevada produção enzimática em reduzido período de tempo. A β-glicosidase
produzida por esta linhagem apresentou expressivo potencial para hidrolisar celobiose,
elevada estabilidade a presença de etanol na mistura de reação e sua inibição por glicose
foi completamente revertida com o aumento da concentração de substrato,
características bastante apreciáveis para a aplicação em processos de sacarificação da
celulose.
23
5) REFERÊNCIAS
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uma introdução à biologia, bioquímica e biotecnologia. 2 ed. Caxias do Sul: Educs,
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58-66, 2004.
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