Concurso BD Biosciences Pesquisador SBI Projeto Finalista 2013 Papel Dos Receptores do Tipo Toll na Resistência à Quimioterapia e Evolução da Leukemia Mielóide Aguda Welbert de Oliveira Pereira ABSTRACT Acute myeloid leukemia (AML) is a myeloproliferative diseasecharacterized by expansion of CD34-positive hematopoietic clones into bone marrow, with subsequent release to peripheral blood and invasion of other tissues, damaging hematopoiesis and immune system function. Consequentially, AML patients present recurrent infections during the treatment and after immunosuppressive therapy postbone marrow transplantation. The chemotherapy reduces the bulk of blasts to undetectable levels, but episodes of relapses are consistently frequent. The triggers responsible for AML evolution remain unclear. Toll like receptors (TLR) are able to recognize pathogen-associated molecules. Because leukemia patients present increased susceptibility to infections, and preliminary results of our group confirmed the TLR expression in AML blasts, our hypothesis is that stimulation of TLR could be involved in AML progression and resistance to chemotherapy. Thus, the objective of this project is to investigate the role of TLR in the AML progression and chemotherapy resistance of the blast cells. Sorted CD34-positive blasts from bone marrow of AML patients will be cultured in the presence of TLR agonists. Differential gene expression, cytokines/chemokines production, immunophenotype and proliferation rate will be assessed after TLR stimulation. Additionally, we will investigate if TLR stimulation interferes with the resistance of chemotherapy in leukemia cells. This project aims to provide pioneers evidences regarding the role of TLR stimulation for AML, linking the episodes of infection with the progression of the disease. INTRODUÇÃO A leucemia mielóide aguda (LMA) é uma neoplasia hematológica caracterizada pela expansão de células precursoras transformadas (blastos) na medula óssea. Estaexpansão é gradativa, levando ao comprometimento da hematopoese, consequentemente do sistema imunológico. Posteriormente, ocorre a liberação dos blastos para o sangue periférico e a invasão de outros tecidos, formando lesões nodulares. Embora se tenha descrito inúmeras alterações genéticas e imunofenotípicas, que são consideradas marcadores de diagnóstico e prognóstico, a causa molecular da LMA é desconhecida. A quimioterapia com citarabina é o tratamento padrão, e reduz a população de blastos para níveis indetectáveis. Mas episódios de recaída são frequentes, com clones leucêmicos mais resistentes às drogas, levando o paciente ao óbito. O paciente LMA é tipicamente imunossuprimido devido à deficiente hematopoese, à mieloablação induzida pela quimioterapia e aos imunossupressores pós-transplante. Assim, pacientes LMA são frequentemente acometidos por infecções. Os receptores do tipo toll (Toll-like receptors – TLR) são responsáveis por reconhecer padrões moleculares associados a patógenos. Dados preliminares de nosso grupo demonstraram que R. Alexandre Dumas, 1976 - São Paulo, SP 04717-004 Brazil | 0800 771 71 57 | [email protected] | bdbiosciences.com/br Concurso BD Biosciences Pesquisador SBI Projeto Finalista 2013 blastos derivados de pacientes LMA expressam níveis normais ou aumentados de TLR, sugerindo que estas células seriam capazes de responder à sua estimulação. Diante dos dados da literatura e de nossos achados, levantamos a hipótese de que as infecções frequentes em pacientes LMA seriam fontes de agonistas de TLR, e que esta estimulação poderia ser capaz de modular fenômenos envolvidos com a progressão da leucemia e com a resistência à quimioterapia, deflagrando com a recaída da LMA. OBJETIVO O objetivo geral do projeto é investigar o efeito da estimulação dos TLR para a progressão da LMA, através da modulação da proliferação e resistência a apoptose induzida por quimioterapia. Figura 1: Ilustração da estratégia experimental do projeto de pesquisa: Medulas ósseas de indivíduos controle e pacientes LMA serão processadas e marcadas para posterior separação de blastos CD34+ por cell sorting, utilizando o citômetro FACS Aria. Os blastos serão cultivados na presença ou ausência de agonistas de TLR. Sobrenadantes das culturas dos blastos serão armazenados para posterior dosagem de citocinas e quimiocinas produzidas frente à estimulação dos receptores. Com auxílio do software de análise Infinicyt, serão comparadas as imunofenotipagens antes e depois do estímulo para estudo de marcadores de prognóstico. Para os experimentos de avaliação da proliferação celular, os blastos serão marcados com CFSE no tempo zero do tratamento com agonistas de TLR, e a proliferação será acompanhada por 4 dias através da detecção do decaimento da fluorescência. Análise do ciclo celular será baseada no conteúdo de DNA, visualizando as fases G1, S, G2 e sub-G0. R. Alexandre Dumas, 1976 - São Paulo, SP 04717-004 Brazil | 0800 771 71 57 | [email protected] | bdbiosciences.com/br Concurso BD Biosciences Pesquisador SBI Projeto Finalista 2013 Para ensaios de quimio-resistência, as células serão estimuladas com os agonistas de TLR e concomitantemente tratadas com citarabina. A taxa de apoptose será quantificada por citometria de fluxo através de marcação com anexina/iodeto de propídeo e por detecção de caspase-3 ativada (por citometria e alternativamente por western blot). RELEVÂNCIA E EXEQUIBILIDADE DO PROJETO Os resultados gerados serão absolutamente pioneiros neste campo da ciência, e abrirão uma frente de estudos quanto à relação clínica entre infecções adquiridas pelo paciente e a progressão da LMA. A viabilidade deste projeto é garantida por um conjunto de fatores, tais como: i) o parque tecnológico do Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa do Hospital Albert Einstein conta com os equipamentos necessários para sua execução, incluindo os citômetros FACS Aria e Fortessa; ii) nosso grupo possui experiência não apenas nos ensaios de biologia celular e molecular, mas também em citometria de fluxo aplicada ao diagnóstico de neoplasias hematológicas; iii) facilitado recrutamento de pacientes no Hospital Albert Einstein. O concurso BD Biosciences Pesquisador SBI visa o reconhecimento e apoio aos pesquisadores que promovem o constante avanço científico através do incentivo à técnica de Citometria de Fluxo com Múltipla Marcação no Brasil. Saiba mais em bdbiosciences.com/br/pesquisador R. Alexandre Dumas, 1976 - São Paulo, SP 04717-004 Brazil | 0800 771 71 57 | [email protected] | bdbiosciences.com/br