Título do Trabalho: Verificação da Atividade Lipolítica de
Pseudomonas Isoladas das Lagoas de Tratamento de Dejetos
de Suínos e de Efluentes de Abatedouros de Frangos.
Área de conhecimento: Engenharias.
Autores: Elisa Helena Siegel Moecke (orientadora), Aline Ferreira Ali de Ávila (bolsista - Art. 170).
Curso de Engenharia Ambiental-Campus Grande Florianópolis-Unidade Ponte do Imaruí
Resultados
Introdução
A biotecnologia é uma das ferramentas tecnológicas da atualidade, tem contribuído nas mais diversas
áreas, como agrícola, alimentícia, monitoramento de produtos de excreção e qualidade ambiental, além da
produção de novos produtos para a indústria química e farmacêutica. Tecnicamente, o termo biotecnologia
é o uso de sistemas biológicos, organismos vivos ou seus derivados para a produção ou modificação de
produtos e processos para um uso específico.
Muitos fungos e bactérias sintetizam e secretam enzimas, industrialmente úteis no processamento de uma
variedade de materiais. Uma das enzimas produzidas por microrganismos é a lípase. Atua sobre a ligação
éster de vários compostos, sendo os acilgliceróis seu melhor substrato. O uso de enzimas em processos
tecnológicos, muitas vez, não é viável economicamente. Uma das formas de deixar o processo mais
barato, é usá-las na forma imobilizada.
Diversas espécies de Pseudomonas, entre as quais P. aeruginosa e P. putida isoladas do meio ambiente
(em geral águas de esgoto), comprovaram em laboratório a bioprodução de enzimas lipolíticas (lipases).
Objetivos
• Verificar a capacidade lipolítica das Pseudomonas isoladas de sistemas de tratamento de dejetos de
suínos e de efluentes abatedouros de frangos, em sistemas de transesterificação visando a produção de
biodiesel.
Metodologia
Os microrganismos utilizados neste projeto foram isolados por alunos de projetos de Iniciação Científica
realizado em anos anteriores e que estão disponíveis no laboratório de Engenharia Ambiental – LEA da
UNISUL. Estes microrganismos foram isolados a partir de amostras provenientes de sistemas de
tratamento de dejetos de suínos – lagoa anaeróbica (Figura 1) e de sistemas de tratamento do tipo lagoa
de decantação de efluentes de abatedouro de frangos. Os microrganismos isolados foram reativados
utilizando o meio de Agar Cetrimide (AC) (figura 2) usando a técnica de estriamento em placa e incubadas
a 37ºC durante 48h. Após o crescimento as colônias foram identificadas morfologicamente, pela técnica de
coloração de Gram e também através de provas bioquímicas.
A Tabela 1 a seguir apresenta as características morfológicas dos microorganismos isolados
das lagoas de dejetos de suínos e de efluente de abatedouro de frango.
Tabela 1. Características morfológicas dos isolados.
Isolados
Meio
Forma
Bordos
Elevação
Tamanho
Pigmentação
Aspecto
Superfície
IPS-1
Cetrimide
circular
lisos
plana
2-3mm
branca
opaca
lisa
IPS-2
Cetrimide
circular
inteiros
convexa
3-4mm
creme
opaca
lisa
IPS-3
Cetrimide
irregular
lobados
plana
6mm
amarela
translúcida
lisa
IPS-4
Cetrimide
circular
lisos
convexa
3-4mm
branca
brilhosa
lisa
IPS-5
Cetrimide
circular
lisos
plana
2-3mm
amarela
opaca
lisa
Na tabela 2 são apresentados os resultados dos testes de coloração de Gram e das provas
bioquímicas: Catalase, Coagulase, Oxidase e Prova do Vermelho de Metila (VM) para os
isolados selecionados.
Tabela 2. Resultados dos testes de coloração de Gram e provas bioquímicas.
Isolados
Gram
Forma
Catalase
Coagulase
Oxidase
VM
IPS-1
-
bacilos
+
-
-
+
IPS-2
-
bacilos
+
-
+
+
IPS-3
-
bacilos
+
-
-
+
IPS-4
-
bacilos
+
-
-
+
IPS-5
-
bacilos
+
-
-
+
Legenda: (+) resultado positivo para o teste realizado, (-) resultado negativo para o teste realizado.
Na tabela 3 são apresentados os resultados da atividade lipolítica dos isolados.
Tabela 3. Atividade lipolítica das bactérias isoladas utilizando o método da titulação dos ácidos
Graxos liberados.
Isolados
Tempo de Reação / Volume de Inóculo
Atividade lipolítca
24h/1mL
U/mL
48h/1mL
U/mL
48h/5mL
U/mL
IPS-1
0,131
0,018
0,023
IPS-2
0,026
ND
0,028
IPS-3
0,92
0,030
0,001
IPS-4
0,34
ND
ND
IPS-5
0,89
ND
ND
As enzimas extracelulares produzidas pelas Pseudomonas, quando usadas como
catalisadores nas reações de transesterificação, não foram eficientes para produção de
biodiesel. Os valores de Rf obtidos durante a análise cromatográfica de camada delgada
(CCD) ficaram abaixo de 0,45. Para que haja a formação de biodiesel o Rf deve estar na faixa
de 0,6 e 0,7.
Figura 1-Suinocultura localizada em Antonio Carlos-SC
FONTE: AVILA,2010.
Figura 2-Meio Agar Cetrimide
FONTE: AVILA,2010
Fermentação Submersa
Foram retiradas três alçadas da colônia caracterizada e transferidas para um Erlenmeyer de 250mL
contendo 100mL do meio de crescimento (Figura 3) , a 30ºC ±1ºC e sob agitação de 100rpm por 48h. Após
este tempo foram retirados volumes de 1mL e 5mL da cultura (inóculo) para frascos Erlenmeyers de 125mL
contendo 50mL do Caldo Adaptador, mantidos sob agitação de 100rpm por 24h e 48 h a 30ºC ±1ºC e após
atuação da enzima extracelular (Figura 4) foi medido a atividade lipolítica das enzimas extracelulares por
titulação dos ácidos graxos liberados com KOH 0,05N usando fenolftaleína como indicador (AOCS, 2002).
Conclusões
As 5 cepas caracterizadas quanto à morfologia, técnica de coloração de Gram e pelos testes
bioquímicos de catalase, coagulase, oxidase e vermelho de metila tiveram resultados de
acordo com a literatura no que se refere às características das bactérias pertencentes à família
Pseudomonadaceae, e apenas a cepa IPS2 é do gênero Pseudomonas. A atividade lipolítica
extracelular dos isolados variou de 0,001 a 0,92 U/mL. Os isolados que tiveram os maiores
valores de atividade lipolítica foram as cepas IPS-3 e IPS-5. As cepas IPS-1 e IPS-2
apresentaram valores de atividade lipolítica menores que os encontrados por outros
pesquisadores.
As reações de transesterificação catalisadas pelas enzimas extraceluares produzidas pelo
inóculo bacteriano não apresentaram valores de Rf que indicasse a formação de ésteres
etílicos (biodiesel).
Bibliografia
Figura 3-Meio para crescimento s/ inóculo
FONTE: LOFFI,2010.
Figura 4-Meio de Crescimento após a atuação da enzima
FONTE: LOFFI,2010
Foram realizados ensaios para avaliar a atividade catalítica de transesterificação das lípases extracelulares
produzidas durante a fermentação submersa visando a produção de biodiesel.
AOCS. American Oil Chemists' Society. Official Methods and Recommended Practices of the American
Oil Chemists' Society, 5º edition, Champaign, 2002.
KAMINI, N. R.; FUJII, T.; KUROSU, T.; IEFUJI, H. Production, purification and characterization of an
extracellular lipase from the yeast, Cryptococcus sp. S-2. Process Biochemistry, v. 36, n. 4, p.317-324,
2000.
Apoio Financeiro: Unisul