X Reunião Sul-Brasileira
de Ciência do Solo
Fatos e Mitos em Ciência do Solo
Pelotas, RS - 15 a 17 de outubro de 2014
Núcleo Regional Sul
Isolamento e caracterização de rizobactérias indutoras de crescimento vegetal
no alho (Allium sativum)
Mariane da Rosa Leoncio(1); Glória Regina Botelho(2) ; Bruna Orsi(3); Cláudio Roberto F. S.
Soares(4); Rafael Dutra de Armas(5); Paulo Emílio Lovato(6)
(1)
Discente do curso de Agronomia; UFSC campus Curitibanos; Rod. Ulysses Gaboardi Km 3. Curitibanos-SC, CEP 89520-000;
[email protected]; (2)Professora adjunta; UFSC campus Curitibanos; (3)Discente do curso de Agronomia; UFSC
campus Curitibanos; (4) (5) (6) Professores adjuntos; UFSC campus Florianópolis;
RESUMO- O alho possui grande importância econômica
e social em Santa Catarina. O uso de fertilizantes
químicos incrementam o custo de produção e podem
causar danos ambientais. As Rizobactérias Promotoras de
Crescimento de Plantas (RPCP’s) podem ser alternativas
ao uso de insumos. Dentre as RPCP’s, os gêneros
Pseudomonas e Azospirillum possuem diversos estudos.
Neste contexto, objetivou-se caracterizar fenotípica e
genotipicamente, isolados de Pseudomonas do grupo
fluorescente e Azospirillum, obtidos da rizosfera de alho,
cultivado em casa-de-vegetação. Foram obtidos 23
isolados de Pseudomonas fluorescente e 27 de
Azospirillum. Os testes bioquímicos utilizados foram
Vermelho de Metila (VM), fermentação de glicose e
sacarose, presença de catalase, hidrólise de ureia. Os
testes de capacidade de produção de AIA (Ácido IndolAcético) e de solubilização de fosfatos in vitro avaliaram
o potencial de indução de crescimento vegetal. Os
isolados de Pseudomonas fluorescente foram avaliados
genotipicamente por BOX-PCR. Os resultados obtidos
por provas bioquímicas indicaram que a maior parte dos
isolados de Pseudomonas fluorescente e Azospirillum
apresentaram características semelhantes às dos gêneros.
As características de morfologia de colônia observadas
para Pseudomonas fluorescente mostraram similaridade
aos padrões. Porém, as avaliações genotípicas destes
mostraram pouca semelhança com P. fluorescens. As
análises de solubilização de fosfato indicaram reação
positiva para a maioria dos isolados de ambos os gêneros.
A avaliação de produção de AIA para Pseudomonas
fluorescente mostrou que mais de 80% dos isolados
apresentaram-se positivos.
Palavras-chave: Azospirillum, Pseudomonas, Liliaceae.
INTRODUÇÃO- O alho é uma das culturas de
grande importância econômica. Atualmente, o país é o
segundo maior consumidor e o maior importador de alho
do mundo Por vários anos, a região do Planalto
Catarinense foi considerada a capital do alho (LUCINI,
2009). Entretanto, fatores econômicos e fitossanitários
levaram à diminuição da produção. Atualmente, busca-se
incrementá-la, através de alternativas que promovam a
diminuição de seus custos, como a redução de insumos,
especialmente de adubos nitrogenados.
As bactérias denominadas Rizobactérias
Promotoras de Crescimento de Plantas (RPCPs)
beneficiam o crescimento de espécies vegetais e vivem na
rizosfera. Estas podem atuar na promoção do crescimento
de forma direta ou indireta. Dentre as RPCPs mais
estudadas estão Pseudomonas do grupo fluorescente e o
gênero Azospirillum (NOVAKOWISKI, 2011). Estes
gêneros têm recebido atenção, pois além de induzir o
crescimento de plantas por diversos mecanismos,
possuem a capacidade de suprimir a atividade de
fitopatógenos do solo (LOPER, 1991).
Na cultura do alho existem poucos estudos sobre
associação com bactérias benéficas. Por este motivo,
objetivou-se verificar, isolar e caracterizar, os gêneros
Azospirillum e Pseudomonas do grupo das fluorescentes,
para avaliar o seu potencial de eficiência na promoção de
crescimento in vitro.
MATERIAL E MÉTODOS- Foi coletado solo da
fazenda Dias, localizada no município de Curitibanos-SC,
seguindo os procedimentos-padrão. Este foi utilizado para
o plantio de bulbilhos de alho, em dois vasos de 5L, em
casa-de-vegetação, sendo semeados quatro bulbilhos por
vaso.
1.
Isolamento de Pseudomonas fluorescente e
Azospirillum
Para o isolamento dos gêneros foram separadas
amostras de solo e raízes. Para iniciar o procedimento
com solo, este foi homogeneizado e pesada uma amostra
de 10g. Essa foi transferida para 90 ml de solução salina
0,9%, agitado por 30 min a150 rpm.
Para isolamento de Pseudomonas fluorescentes,
realizou-se o procedimentos da diluição seriada, com a
retirada de 0,1 ml das diluições de 10 3, 104 e 105 para
placas contendo King B (KING et al., 1954), incubadas a
28°C por 48 horas. Em seguida, os isolados que
apresentaram fluorescência sob luz UV de 340m, foram
purificados.
Para isolamento de Azospirillum, após a diluição
seriada, retirou-se 0,1 ml das diluições de 10³, 104 e 105
que foram transferidos para frascos de penicilina
contendo 5ml de meio NFB semi-sólido (DOBEREINER
et al., 1995). Para cada diluição foram utilizados três
frascos que foram incubados a 28ºC, por sete dias. Após
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este período, foi observado o desenvolvimento de película
na região superficial do meio. Em seguida as colônias
foram purificadas.
Para isolamento de Azospirillum da raiz foi coletado
10g que foram desinfetas com água sanitária 10% por 10
minutos, depois lavada três vezes com água destilada
estéril. As amostras foram maceradas e transferidas,
posteriormente para frasco contendo 90 ml de solução
salina 0,9%, seguindo o mesmo tempo e rotação descritos
acima. Em seguida, processou-se a diluição seriada e de
cada tubo, retirou-se 0,1 ml da suspensão, segundo
DOBEREINER et al. (1995). Para cada diluição,foram
utilizados três frascos, incubados a 28º C, por sete dias.
Em seguida, as colônias que desenvolveram película
foram purificadas.
As culturas puras de Azospirillum e de Pseudomonas
fluorescente foram estocadas a -20°C.
2.
Determinação de características fenotípicas e
de potencial de indução de crescimento de plantas.
2.1. Caracterização de isolados de Pseudomonas
fluorescente.
A caracterização morfológica das colônias foi realizada
através da análise de coloração, intensidade de coloração,
espessura, borda, elevação e forma.
Os testes bioquímicos realizados foram fermentação de
glicose e de sacarose, presença de catalase, de urease e
crescimento a 41°C. As bactérias foram crescidas em
meio King B liquido durante 24 horas a 30°C. Transferiuse uma alíquota para os tubos contendo meios específicos
(RIBEIRO; SOARES, 2002) para cada teste, em três
repetições e foram incubados a 30°C, durante 48 horas.
Para o crescimento a 41°C foi utilizado o meio King B
líquido.
Para a análise de solubilização de fosfatos, utilizou-se
meio contendo fosfato de cálcio tribásico, (10g/L glicose;
5g/L deNH4Cl; 1 g/L de MgSO4.7H2O; 4 g/L de
CaHPO4; 15 g/L de Agar; pH6,5). Os isolados foram
previamente crescidos em meio King B líquido a 28°C,
por 24 horas. Em seguida, foi transferido 0,1 ml da
suspensão para placas contendo o meio, estabelecendo-se
quatro isolados, dispostos em pontos equidistantes. Foram
utilizadas cinco placas, como repetições. Após incubação
a 28°C, por sete dias, realizou-se avaliação qualitativa,
observando a presença de halo incolor em torno das
colônias solubilizadoras.
Avaliou-se a produção de AIA pelos isolados, através
da metodologia colorimétrica adaptada de Catellan
(1999), sendo essa, maior número de isolados por placa.
Os isolados foram avaliados qualitativamente, observando
a presença de halo avermelhado em torno das colônias
produtoras de AIA.
A caracterização genotípica dos isolados foi realizada
por BOX PCR, utilizando como padrões P. fluorescens e
Azospirillum sp. A extração de DNA baseou-se na técnica
de lise térmica (HAGEN et al., 2002). Para a amplificação
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do gene 16S rDNA utilizou-se a reação de BOX PCR com
um volume final de 25 µL, contendo 1 µL de DNA
molde, 5 µL de solução tampão, 2,5 µL de dNTPs , 2,5
µL de DMSO, 4 µL de BSA, 1 µL do primer BOX A1R
(10 pmol) e 0,5 µL de Taq DNA polimerase. A
amplificação foi programada em um ciclo inicial (95°C; 2
minutos) seguido de 30 ciclos (94°C; 3 segundos, 92°C;
30 segundos, 50°C;1 minuto, 65ºC; 8 minutos) e um ciclo
final (65°C; 8 minutos). Os produtos da reação foram
submetidos à eletroforese (V; 1 h) em gel de agarose 1%,
e visualizados sob luz ultravioleta.
2.2. Caracterização de isolados Azospirillum.
Os testes bioquímicos realizados para os isolados de
Azospirillum foram fermentação de glicose e de sacarose
e vermelho de metila. As bactérias foram crescidas em
meio LB liquido durante 24 horas a 30°C. Transferiu-se
uma alíquota para os tubos contendo meios específicos
para cada teste, em três repetições. Estes foram incubados
a 30°C, durante 48 horas.
Para a análise de solubilização de fosfato foi utilizado o
meio contendo fosfato de cálcio tribásico descrito
anteriormente. Os isolados foram previamente crescidos
em meio LB líquido a 30°C, por 24 horas. Em seguida,
foi transferido 0,1 ml da suspensão bacteriana para placas
contendo o meio, estabelecendo-se quatro isolados por
placa, dispostos em pontos equidistantes. Foram
utilizados cinco placas, como repetição. Após incubação a
30°C durante sete dias, realizou-se avaliação qualitativa,
observando a presença de halo incolor em torno das
colônias solubilizadoras de fosfato.
RESULTADOS E DISCUSSÃOOs resultados da caracterização morfológica dos
isolados de Pseudomonas seguem o padrão descrito
(COELHO, 2006). Todos os isolados eram Gramnegativos. A maioria apresentou fluorescência esverdeada
(60,87%) e intensidade brilhante (73,71%). A maioria das
colônias apresentou coloração branca (52,17%), tamanho
de 1,0-2,0cm (69,56%), borda lisa (52,17%), forma
circular (78,26%) e elevação convexa (78,26%),
semelhante ao obtido por Fonseca et al. (2000). Nos testes
bioquímicos, a maioria apresentou reação positiva para o
teste de catalase (82,6%) e hidrólise de ureia (82,6%).
Nos testes fermentação de glicose, todos os isolados
mostraram reação negativa.
Para análise do potencial de indução de crescimento
vegetal por solubilização de fosfatos e produção de AIA
in vitro observou-se que 52,17% e 82,60% dos isolados
foram positivos para os testes, respectivamente, sugerindo
potencial para estimular o crescimento plantas. Outros
mecanismos também são propostos, como a redução de
urease e o potencial de fixação de nitrogênio descrito para
bactérias
do
gênero
Pseudomonas
(FERNANDES;FERNANDES; RODRIGUES, 2001).
A caracterização genotípica dos isolados de
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Pseudomonas fluorescente indicou que grande parte dos
isolados possuía alta similaridade entre si. Porém,
apresentaram similaridade inferior a 30% , comparandose, Pseudomonas fluorescens. Nenhum dos isolados
apresentou similaridade à Azospirillum sp.
Todos os isolados de Azospirillum eram Gramnegativos. Para o teste de fermentação de glicose e da
sacarose obteve-se 77,77% e 96,29% dos isolados
positivos, respectivamente. Azospirillum são descritos
como capazes de metabolizar fontes diversas de C
(SILVA, 2010), indicando que o perfil de utilização de C
dos isolados testados, é semelhante ao do gênero.
Segundo Eckert et al. (2001), Azospirillum são positivos
para teste de urease, comprovando a semelhança entre os
isolados e o gênero. Para o teste de vermelho de metila,
todos os isolados obtiveram reação positiva, indicando a
produção de diacetil, Não foram encontradas referências
na literatura sobre esse teste para Azospirillum.
As análises de potencial de indução de crescimento
vegetal indicaram que 66,66% dos isolados foram capazes
de solubilizar o fosfato Este resultado sugere como um
mecanismo de indução ao desenvolvimento de plantas.
CONCLUSÕES–
Os
isolados
apresentaram
características fenotípicas semelhantes às dos gêneros de
interesse. A caracterização genotípica dos isolados de
Pseudomonas fluorescente indicou pouca similaridade
com a espécie padrão utilizada (Pseudomonas
fluorescens), sendo necessária comparação com outras
espécies do gênero. Os isolados de ambos os gêneros
apresentaram potencial de indução de crescimento de
planta in vitro, pela capacidade de solubilização de
fosfatos, onde se observou que 52,17% de Pseudomonas
fluorescente e 66,66% de Azospirillum foram positivos e
para produção de AIA em que 86,60% dos isolados de
Pseudomonas apresentaram-se positivos.
AGRADECIMENTOS- À pesquisadora Verônica
Massenas Reis da Embrapa Agrobiologia pelo
treinamento da autora. À CooperAlho, Cultivar
Distribuidora de Insumos Agricolas Ltda e Coocam pela
cessão de sementes, insumos e solo.
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