ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (EIE) PARA DIAGNÓSTICO DA
LEPTOSPIROSE HUMANA
(material fornecido para 96 reações)
Tel.: (21) 3882.9393
FAX: (21) 2561.0277
SAC: 0800.210.310
www.bio.fiocruz.br
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FAX: (21) 2561.0277
SAC: 0800.210.310
www.bio.fiocruz.br
EIE - IgM LEPTOSPIROSE
Bio-Manguinhos
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (EIE) PARA DIAGNÓSTICO DA
LEPTOSPIROSE HUMANA
(material fornecido para 96 reações)
EIE - IgM LEPTOSPIROSE
Bio-Manguinhos
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
EIE - IgM - LEPTOSPIROSE - Bio-Manguinhos
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO PARA DIAGNÓSTICO
DA LEPTOSPIROSE HUMANA
(material fornecido para 96 reações)
PRINCÍPIO DO TESTE:
Este ensaio consiste na reação de soros humanos com antígenos
solúveis e purificados de leptospira (L.interrogans) obtidos a
partir de cultura “in vitro”, que são previamente adsorvidos
nas cavidades de microplacas/strips (fase sólida). A seguir
adicionam-se, devidamente diluídos, os soros controle do teste e
as amostras a serem analisadas, que, caso contenham anticorpos
específicos, estes se ligarão ao antígeno da fase sólida. Na etapa
seguinte, ao se adicionar uma anti-imunoglobulina IgM humana
marcada com a enzima peroxidase, esta se ligará aos anticorpos
IgM caso estejam presentes.
Para evidenciação da reação, utiliza-se uma substância cromógena
(tetrametilbenzidina-TMB) que pela ação da peroxidase com o
peróxido de hidrogênio forma um composto de coloração azul
turquesa que ao adicionar-se o ácido sulfúrico que interrompe
a reação, passa a apresentar uma coloração amarela, em caso
positivo (reagente). Nas cavidades que não houver anticorpos
específicos, não haverá desenvolvimento de cor o que caracteriza
uma reação negativa (não reagente). Os resultados podem ser
avaliados por meio de um espectrofotômetro para microplaca
em comprimento de onda de 450 nm.
ESQUEMA DO TESTE:
Reação Positiva
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
Ensaio
Imunoenzimático
(EIE) para Leptospirose
MODELO DE PROTOCOLO
Lote: _____________________
EIE N0: ___________________
Validade: _________________
Data: _____________________
disposição das amostras
densidade ótica das amostras
Cálculo do Cut-Off:
Co= XCN x 2,3
co=
Cálcula da faixa Cinza:
FC= CO x 1,2
CO= ________
Faixa Cinza de _____(CO) a _____ (CO x 1,2).
fase
sólida
substrato+ = reação colorida
Cromógeno
Técnico Responsável: ________________________________
Observações:
substrato+ = reação colorida
Cromógeno
Antígeno + amostra + conjugado +
positiva
Antígeno + amostra + conjugado +
positiva
Técnico Responsável: ________________________________
Observações:
fase
sólida
co=
Reação Positiva
Cálculo do Cut-Off:
Co= XCN x 2,3
ESQUEMA DO TESTE:
PRINCÍPIO DO TESTE:
Este ensaio consiste na reação de soros humanos com antígenos
solúveis e purificados de leptospira (L.interrogans) obtidos a
partir de cultura “in vitro”, que são previamente adsorvidos
nas cavidades de microplacas/strips (fase sólida). A seguir
adicionam-se, devidamente diluídos, os soros controle do teste e
as amostras a serem analisadas, que, caso contenham anticorpos
específicos, estes se ligarão ao antígeno da fase sólida. Na etapa
seguinte, ao se adicionar uma anti-imunoglobulina IgM humana
marcada com a enzima peroxidase, esta se ligará aos anticorpos
IgM caso estejam presentes.
Para evidenciação da reação, utiliza-se uma substância cromógena
(tetrametilbenzidina-TMB) que pela ação da peroxidase com o
peróxido de hidrogênio forma um composto de coloração azul
turquesa que ao adicionar-se o ácido sulfúrico que interrompe
a reação, passa a apresentar uma coloração amarela, em caso
positivo (reagente). Nas cavidades que não houver anticorpos
específicos, não haverá desenvolvimento de cor o que caracteriza
uma reação negativa (não reagente). Os resultados podem ser
avaliados por meio de um espectrofotômetro para microplaca
em comprimento de onda de 450 nm.
Cálcula da faixa Cinza:
FC= CO x 1,2
CO= ________
Faixa Cinza de _____(CO) a _____ (CO x 1,2).
densidade ótica das amostras
disposição das amostras
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO PARA DIAGNÓSTICO
DA LEPTOSPIROSE HUMANA
(material fornecido para 96 reações)
Lote: _____________________
EIE N0: ___________________
EIE - IgM - LEPTOSPIROSE - Bio-Manguinhos
Validade: _________________
Data: _____________________
MODELO DE PROTOCOLO
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
EIE - Ensaio
IgM - Leptospirose
- Bio-Manguinhos
Imunoenzimático
(EIE) para Leptospirose
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
3
Reação Negativa
fase
sólida
Antígeno + amostra + conjugado + substrato+ = ausência de coloração
negativa
Cromógeno
MATERIAL FORNECIDO:
Identificação Componentes
R-01
Diluente de Amostras/
Conjugado [5X]
R-02
Lecitina de leite
R-03
Tampão de Lavagem [20X]
R-04
Diluente do Substrato
R-05
Cromógeno (TMB)
R-06
Substrato (H2O2)
R-07
Ácido Sulfúrico 2M
R-08
Controle Positivo
R-09
Controle Negativo
R-10
Conjugado
R-11
Molduras c/ 6 strips
duplas sensibilizadas
Folhas Adesivas
Manual de Instruções de Uso
Apresentação
1 Fr. 27 mL
1 saco 7 g
1 Fr. 40 mL
1 Fr. 22 mL
1 Fr. 0,250 mL
1 Fr. 0,1 mL
1 Fr. 10 mL
1 Fr. 0,1 mL
1 Fr. 0,1 mL
1 Fr. 0,250 mL
1 moldura
3 folhas
MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO:
- Água destilada.
- Vidraria básica em geral (tubos, pipetas, provetas, etc).
- Pipetadores multicanal e monocanal ajustáveis e ponteiras.
- Luvas descartáveis.
- Barquetes ou reservatórios.
- Estufa a 37oC.
- Água destilada.
- Vidraria básica em geral (tubos, pipetas, provetas, etc).
- Pipetadores multicanal e monocanal ajustáveis e ponteiras.
- Luvas descartáveis.
- Barquetes ou reservatórios.
- Estufa a 37oC.
MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO:
Identificação Componentes
R-01
Diluente de Amostras/
Conjugado [5X]
R-02
Lecitina de leite
R-03
Tampão de Lavagem [20X]
R-04
Diluente do Substrato
R-05
Cromógeno (TMB)
R-06
Substrato (H2O2)
R-07
Ácido Sulfúrico 2M
R-08
Controle Positivo
R-09
Controle Negativo
R-10
Conjugado
R-11
Molduras c/ 6 strips
duplas sensibilizadas
Folhas Adesivas
Manual de Instruções de Uso
1 moldura
3 folhas
1 Fr. 27 mL
1 saco 7 g
1 Fr. 40 mL
1 Fr. 22 mL
1 Fr. 0,250 mL
1 Fr. 0,1 mL
1 Fr. 10 mL
1 Fr. 0,1 mL
1 Fr. 0,1 mL
1 Fr. 0,250 mL
Apresentação
MATERIAL FORNECIDO:
Antígeno + amostra + conjugado + substrato+
negativa
Cromógeno
= ausência de coloração
fase
sólida
Reação Negativa
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
3
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
4
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
- Sistema de vácuo com pente de lavagem, pipeta Pasteur
adaptada ou lavador automático de microplacas.
- Hipoclorito de sódio a 2,5% ou água sanitária.
- Espectrofotômetro para leitura de microplacas, equipado com
filtro de 450 nm.
- Balança semi-analítica
CONSERVAÇÃO E ESTOCAGEM DO MATERIAL:
Manter a -20oC: R-08, R-09, R-10, R-11.
Manter entre 2o e 8oC: R-01, R-02, R-03, R-04, R-05, R-06 e R-07.
Todos os componentes do teste devem ser guardados nas
temperaturas indicadas desde o ato do recebimento do conjunto,
permanecendo estáveis pela validade definida na caixa principal
do kit.
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
13
ASSISTÊNCIA AOS USUÁRIOS:
Orientações técnicas adicionais a respeito deste produto poderão
ser obtidas junto a:
Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos
Bio-Manguinhos | Fiocruz
CNPJ: 33.781.055/0001-35
Av. Brasil, 4365 - Manguinhos -CEP: 21040-900 - Rio de Janeiro - RJ
SAC: 0800.210.310 | [email protected]
Fax: (21) 3882.7176
www.bio.fiocruz.br
edição: outubro de 2008
BM_017_06bk
Obs.: a temperatura de transporte, com bobinas de gelo
reciclável permite que o conjunto se mantenha em condições
adequadas durante 24 a 36 horas.
CUIDADOS E PRECAUÇÕES:
Somente para uso Diagnóstico “IN VITRO”.
Este conjunto diagnóstico contém produtos biológicos e
químicos, podendo representar uma fonte de infecção. Portanto,
ao manusear qualquer um dos reagentes desse conjunto,
observe as precauções de biossegurança necessárias.
A qualidade dos resultados obtidos com este conjunto
diagnóstico depende do cumprimento às boas práticas de
laboratório, tais como:
- as amostras, assim como os controles, podem conter agentes
infecciosos e devem ser manipulados com cuidado;
- homogeneizar as amostras e controles antes de usar;
- utilizar equipamento de proteção individual (EPI), tais como luvas
descartáveis, jaleco e protetor facial em todas as etapas do teste;
Somente para uso Diagnóstico “IN VITRO”.
Este conjunto diagnóstico contém produtos biológicos e
químicos, podendo representar uma fonte de infecção. Portanto,
ao manusear qualquer um dos reagentes desse conjunto,
observe as precauções de biossegurança necessárias.
A qualidade dos resultados obtidos com este conjunto
diagnóstico depende do cumprimento às boas práticas de
laboratório, tais como:
- as amostras, assim como os controles, podem conter agentes
infecciosos e devem ser manipulados com cuidado;
- homogeneizar as amostras e controles antes de usar;
- utilizar equipamento de proteção individual (EPI), tais como luvas
descartáveis, jaleco e protetor facial em todas as etapas do teste;
CUIDADOS E PRECAUÇÕES:
Obs.: a temperatura de transporte, com bobinas de gelo
reciclável permite que o conjunto se mantenha em condições
adequadas durante 24 a 36 horas.
Todos os componentes do teste devem ser guardados nas
temperaturas indicadas desde o ato do recebimento do conjunto,
permanecendo estáveis pela validade definida na caixa principal
do kit.
Manter a -20oC: R-08, R-09, R-10, R-11.
Manter entre 2o e 8oC: R-01, R-02, R-03, R-04, R-05, R-06 e R-07.
CONSERVAÇÃO E ESTOCAGEM DO MATERIAL:
- Sistema de vácuo com pente de lavagem, pipeta Pasteur
adaptada ou lavador automático de microplacas.
- Hipoclorito de sódio a 2,5% ou água sanitária.
- Espectrofotômetro para leitura de microplacas, equipado com
filtro de 450 nm.
- Balança semi-analítica
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EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
edição: outubro de 2008
BM_017_06bk
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Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos
Bio-Manguinhos | Fiocruz
CNPJ: 33.781.055/0001-35
Av. Brasil, 4365 - Manguinhos -CEP: 21040-900 - Rio de Janeiro - RJ
SAC: 0800.210.310 | [email protected]
Fax: (21) 3882.7176
ASSISTÊNCIA AOS USUÁRIOS:
Orientações técnicas adicionais a respeito deste produto poderão
ser obtidas junto a:
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13
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
12
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
- Adler, B., A. M. Murphy, S.A. Locarnini, and S. Faine. 1980.
Detection of specific antileptospiral immunoglobulins M and G
in human serum by solid-phase enzyme-linked immunosorbent
assay. J. Clin. Microbiol. 11: 452-457.
- Chapman, A. J., B. Adler, and S. Faine. 1988. Antigens recognised by the human immune response to infection with Leptospira
interrogans serovar hardjo. J. Med. Microbiol. 25: 269-278.
- Cumberland, P., C. O. Everard, S. Faine, and B. Adler. 1999.
Assessment of the efficacy of an IgM-elisa and microscopic agglutination test (MAT) in the diagnosis of acute leptospirosis. Am.
J. Trop. Med. Hyg. 61: 731-734.
– Faine, S., B. Adler, P. Perolat, and C. A. Bolin. 1999. Leptospira
and leptospirosis, 2nd ed. MediSci, Melbourne, Austrália.
– Farr, R. W. 1995. Leptospirosis. Clin.Infect. Dis. 21: 1-6.
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
5
- desprezar ponteiras, luvas, pipetas de vidro, frascos, placas usadas
etc. em solução de hipoclorito de sódio a 2,5% ou água sanitária;
- nunca misturar componentes de lotes diferentes;
- para evitar interferências, nunca tocar com os dedos a parte
de cima dos strips;
- cada strip só pode ser utilizada uma única vez;
- soluções contendo TMB e/ou peroxidase são irritantes para pele
e mucosas e não devem entrar em contato com metais;
- não usar os reativos após sua data de validade;
- utilizar frascos e vidrarias rigorosamente limpos, pois resíduos
de detergentes e/ou substâncias oxidantes poderão interferir na
reação.
PROCEDIMENTO DO TESTE:
1 - Preparo do diluente de amostras/conjugado:
nº strips
duplas
1
2
3
4
5
6
nº reações
16
32
48
64
80
96
R-01
4 mL
6 mL
8 mL
10 mL
12 mL
14 mL
R-02
(pesar)
1g
1,5 g
2g
2,5 g
3g
3,5 g
H20 destilada
16 mL
24 mL
32 mL
40 mL
48 mL
56 mL
2 - Diluir em tubos 5 µL dos soros controle e das amostras de
soros a serem analisadas, previamente homogeneizadas, em
500 µL do diluente de amostra /conjugado (1:100).
3 - Distribuir 100 µL dos soros controle já diluídos da seguinte
forma: na coluna 1 fileira “A” o soro controle positivo, na
“B” e “C” o controle negativo, na “D” somente o diluente de
amostra/conjugado (sem soro) que servirá de controle do
conjugado. Nos outros orifícios, distribuir 100 µL das amostras
3 - Distribuir 100 µL dos soros controle já diluídos da seguinte
forma: na coluna 1 fileira “A” o soro controle positivo, na
“B” e “C” o controle negativo, na “D” somente o diluente de
amostra/conjugado (sem soro) que servirá de controle do
conjugado. Nos outros orifícios, distribuir 100 µL das amostras
2 - Diluir em tubos 5 µL dos soros controle e das amostras de
soros a serem analisadas, previamente homogeneizadas, em
500 µL do diluente de amostra /conjugado (1:100).
nº strips
duplas
1
2
3
4
5
6
- Adler, B., A. M. Murphy, S.A. Locarnini, and S. Faine. 1980.
Detection of specific antileptospiral immunoglobulins M and G
in human serum by solid-phase enzyme-linked immunosorbent
assay. J. Clin. Microbiol. 11: 452-457.
- Chapman, A. J., B. Adler, and S. Faine. 1988. Antigens recognised by the human immune response to infection with Leptospira
interrogans serovar hardjo. J. Med. Microbiol. 25: 269-278.
- Cumberland, P., C. O. Everard, S. Faine, and B. Adler. 1999.
Assessment of the efficacy of an IgM-elisa and microscopic agglutination test (MAT) in the diagnosis of acute leptospirosis. Am.
J. Trop. Med. Hyg. 61: 731-734.
– Faine, S., B. Adler, P. Perolat, and C. A. Bolin. 1999. Leptospira
and leptospirosis, 2nd ed. MediSci, Melbourne, Austrália.
– Farr, R. W. 1995. Leptospirosis. Clin.Infect. Dis. 21: 1-6.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
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80
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nº reações
4 mL
6 mL
8 mL
10 mL
12 mL
14 mL
R-01
R-02
(pesar)
1g
1,5 g
2g
2,5 g
3g
3,5 g
16 mL
24 mL
32 mL
40 mL
48 mL
56 mL
H20 destilada
1 - Preparo do diluente de amostras/conjugado:
PROCEDIMENTO DO TESTE:
- desprezar ponteiras, luvas, pipetas de vidro, frascos, placas usadas
etc. em solução de hipoclorito de sódio a 2,5% ou água sanitária;
- nunca misturar componentes de lotes diferentes;
- para evitar interferências, nunca tocar com os dedos a parte
de cima dos strips;
- cada strip só pode ser utilizada uma única vez;
- soluções contendo TMB e/ou peroxidase são irritantes para pele
e mucosas e não devem entrar em contato com metais;
- não usar os reativos após sua data de validade;
- utilizar frascos e vidrarias rigorosamente limpos, pois resíduos
de detergentes e/ou substâncias oxidantes poderão interferir na
reação.
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
5
6
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
teste já diluídas nos respectivos orifícios correspondentes
(seguir protocolo).
CP= Controle Positivo
CN=Controle Negativo
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
11
REPRODUTIBILIDADE, REPETITIVIDADE E ESTABILIDADE.
Diversos estudos foram realizados em nossos laboratórios,
avaliando-se amostras conhecidas e caracterizadas como padrão, sob os aspectos de reprodutibilidade e repetitividade. As
conclusões nos permitiram determinar um período mínimo de 6
meses de validade para o produto, se acondicionado conforme as
recomendações do Manual de Instruções de Uso, mantendo-se
as mesmas características e padrões de qualidade.
SS=Sem Soro
4 - Selar os “strips” com a folha adesiva e incubar a 37ºC por
60 minutos.
5 - Preparo do tampão de lavagem:
Obs.: este tampão é sujeito a cristalização, neste caso, coloque
em banho-maria a 37ºC até a dissolução dos cristais.
a) volumes necessários quando se utiliza sistema de vácuo com
pente de lavagem ou pipeta Pasteur:
nº strips duplas
1
2
3
4
5
6
no reações
16
32
48
64
80
96
R-03(20X)
5 mL
10 mL
13 mL
15 mL
20 mL
25 mL
H2O dest.
95 mL
190 mL
247 mL
285 mL
380 mL
475 mL
No caso de se utilizar equipamentos automáticos ou semi
automáticos de lavagem, torna-se necessário o preparo adicional
de 200mL de tampão de lavagem, devido a um maior consumo
No caso de se utilizar equipamentos automáticos ou semi
automáticos de lavagem, torna-se necessário o preparo adicional
de 200mL de tampão de lavagem, devido a um maior consumo
nº strips duplas
1
2
3
4
5
6
no reações
16
32
48
64
80
96
R-03(20X)
5 mL
10 mL
13 mL
15 mL
20 mL
25 mL
H2O dest.
95 mL
190 mL
247 mL
285 mL
380 mL
475 mL
a) volumes necessários quando se utiliza sistema de vácuo com
pente de lavagem ou pipeta Pasteur:
Obs.: este tampão é sujeito a cristalização, neste caso, coloque
em banho-maria a 37ºC até a dissolução dos cristais.
4 - Selar os “strips” com a folha adesiva e incubar a 37ºC por
60 minutos.
5 - Preparo do tampão de lavagem:
CP= Controle Positivo
CN=Controle Negativo
SS=Sem Soro
teste já diluídas nos respectivos orifícios correspondentes
(seguir protocolo).
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EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
Diversos estudos foram realizados em nossos laboratórios,
avaliando-se amostras conhecidas e caracterizadas como padrão, sob os aspectos de reprodutibilidade e repetitividade. As
conclusões nos permitiram determinar um período mínimo de 6
meses de validade para o produto, se acondicionado conforme as
recomendações do Manual de Instruções de Uso, mantendo-se
as mesmas características e padrões de qualidade.
REPRODUTIBILIDADE, REPETITIVIDADE E ESTABILIDADE.
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
11
10
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
ÍNDICES DE SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE
Este produto foi submetido à avaliação de 152 amostras de soros
humanos, sendo 37 positivas e 115 negativas para Leptospirose,
em nossos laboratórios. Os resultados obtidos foram de 100%
de sensibilidade e 100% de especificidade, considerando a
concordância com outros ensaios laboratoriais, tais como
microaglutinação (MAT), macroaglutinação (SAT) e aspectos
clínico-epidemiológicos.
Ainda em nossos laboratórios, submetemos nosso Kit a
uma avaliação onde constatamos o cruzamento frente a
outras patologias.
Partindo para avaliações externas, nosso Kit EIE-IgM-Leptospirose
foi submetido a avaliação no Centro de Referência Nacional em
Leptospirose que utilizou 104 amostras da sua rotina normal.
Como resultado, obtivemos os índices de 92,9% de concordância
com os resultados da Micro-aglutinação (Teste de referência
para OMS e aceito mundialmente pela comunidade científica).
Esta boa performance aumenta ainda mais para 95,1%, se
considerarmos como negativas, as amostras com resultados
na Faixa Cinza (FC).
Outros dois estudos foram realizados junto ao Centro de Pesquisa
Gonçalo Muniz – CPqGM-BA. Inicialmente, onde foram analisadas
102 amostras de pacientes com sintomas clínicos compatíveis
com o quadro de leptospirose (fase aguda), sendo divididos em
grupos relacionados a quantidade de dias do aparecimento dos
sintomas. Foi possível verificar uma excelente performance, superior a performance da MAT, nos grupos com mais de 5-7 dias
do aparecimento dos sintomas, confirmando a indicação descrita
no manual de instruções do Kit para aplicação do teste.
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
7
pelo uso desses equipamentos (10 mL de Tampão de Lavagem
(20X) + 190 mL de H2O destilada).
6 - Descolar cuidadosamente a folha adesiva, aspirar o conteúdo
e lavar 5 vezes com tampão de lavagem (200 µL/orifício). Bater
levemente a placa após a última lavagem.
7 - Diluir o conjugado no diluente de amostra/conjugado,
preparado anteriormente. Preparo do conjugado:
nº strips duplas
1
2
3
4
5
6
nº reações
16
32
48
64
80
96
R-01 diluído
2,5 mL
5 mL
6 mL
8 mL
9 mL
12 mL
R-10
25 µL
50 µL
60 µL
80 µL
90 µL
120 µL
8 - Homogeneizar bem e distribuir 100 µL da diluição do
conjugado em cada orifício dos strips.
9 - Selar e incubar os strips em estufa a 37ºC por 30 minutos.
Lavar conforme descrito no item 6.
10 - Preparar o substrato alguns minutos antes do uso,
preferencialmente em frasco escuro.
11 - Preparo do substrato:
nº strips duplas
1
2
3
4
5
6
nº reações
16
32
48
64
80
96
R-04
2,5 mL
5 mL
6 mL
8 mL
10 mL
12 mL
R-05
25 µL
50 µL
60 µL
80 µL
100 µL
120 µL
R-06
5 µL
10 µL
12 µL
16 µL
20 µL
24 µL
12 - Distribuir 100 µL do substrato rapidamente em todos os
orifícios.
12 - Distribuir 100 µL do substrato rapidamente em todos os
orifícios.
Este produto foi submetido à avaliação de 152 amostras de soros
humanos, sendo 37 positivas e 115 negativas para Leptospirose,
em nossos laboratórios. Os resultados obtidos foram de 100%
de sensibilidade e 100% de especificidade, considerando a
concordância com outros ensaios laboratoriais, tais como
microaglutinação (MAT), macroaglutinação (SAT) e aspectos
clínico-epidemiológicos.
Ainda em nossos laboratórios, submetemos nosso Kit a
uma avaliação onde constatamos o cruzamento frente a
outras patologias
Partindo para avaliações externas, nosso Kit EIE-IgM-Leptospirose
foi submetido a avaliação no Centro de Referência Nacional em
Leptospirose que utilizou 104 amostras da sua rotina normal.
Como resultado, obtivemos os índices de 92,9% de concordância
com os resultados da Micro-aglutinação (Teste de referência
para OMS e aceito mundialmente pela comunidade científica).
Esta boa performance aumenta ainda mais para 95,1%, se
considerarmos como negativas, as amostras com resultados
na Faixa Cinza (FC).
Outros dois estudos foram realizados junto ao Centro de Pesquisa
Gonçalo Muniz – CPqGM-BA. Inicialmente, onde foram analisadas
102 amostras de pacientes com sintomas clínicos compatíveis
com o quadro de leptospirose (fase aguda), sendo divididos em
grupos relacionados a quantidade de dias do aparecimento dos
sintomas. Foi possível verificar uma excelente performance, superior a performance da MAT, nos grupos com mais de 5-7 dias
do aparecimento dos sintomas, confirmando a indicação descrita
no manual de instruções do Kit para aplicação do teste.
ÍNDICES DE SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE
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EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
nº strips duplas
1
2
3
4
5
6
nº reações
16
32
48
64
80
96
R-04
2,5 mL
5 mL
6 mL
8 mL
10 mL
12 mL
R-05
25 µL
50 µL
60 µL
80 µL
100 µL
120 µL
R-06
5 µL
10 µL
12 µL
16 µL
20 µL
24 µL
8 - Homogeneizar bem e distribuir 100 µL da diluição do
conjugado em cada orifício dos strips.
9 - Selar e incubar os strips em estufa a 37ºC por 30 minutos.
Lavar conforme descrito no item 6.
10 - Preparar o substrato alguns minutos antes do uso,
preferencialmente em frasco escuro.
11 - Preparo do substrato:
nº strips duplas
1
2
3
4
5
6
nº reações
16
32
48
64
80
96
R-01 diluído
2,5 mL
5 mL
6 mL
8 mL
9 mL
12 mL
R-10
25 µL
50 µL
60 µL
80 µL
90 µL
120 µL
6 - Descolar cuidadosamente a folha adesiva, aspirar o conteúdo
e lavar 5 vezes com tampão de lavagem (200 µL/orifício). Bater
levemente a placa após a última lavagem.
7 - Diluir o conjugado no diluente de amostra/conjugado,
preparado anteriormente. Preparo do conjugado:
pelo uso desses equipamentos (10 mL de Tampão de Lavagem
(20X) + 190 mL de H2O destilada).
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
7
8
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
13 - Incubar à temperatura ambiente, ao abrigo da luz, durante
20 minutos
14 - Bloquear a reação adicionando 50 µL de ácido sulfúrico 2M
em todos os orifícios. Em seguida, proceder a leitura.
Amostras não reagentes = As que apresentarem densidade
ótica inferior ao Cut-Off.
CO
AMOSTRAS NÃO REATIVAS
LEITURA:
Ligar o Espectrofotômetro para microplacas, equipado com filtro
de 450nm para leitura e sem a utilização de filtro de referência
(620-630nm). Após alguns minutos para estabilização do feixe
de luz, zerar o aparelho no ar e, em seguida, iniciar a leitura da
microplaca de teste.
Obs.: caso a leitura seja feita com filtro de 450nm tendo como
referência outro de 620-630nm, todas as densidades óticas (DO)
ficarão abaixo do esperado, prejudicando o cálculo do cut-off e
causando a ocorrência de resultados falso-positivos no ensaio.
_
- Cálculo do Cut-Off: CO = X CN x 2,3
CO = Cut-Off
_
X CN = Média da densidade ótica dos orifícios do
Controle Negativo
_
Exemplo: X CN= 0,095 + 0,085 = 0,090
2
CO = 0,090 x 2,3 = 0,207
Obs.: o operador deverá observar os controles do teste, considerando
que a DO obtida para o controle do conjugado (SS) não poderá ser
superior a 1,5 x DO obtida para o soro controle negativo.
RESULTADOS
Amostras reagentes = As que apresentarem densidade ótica
igual ou superior ao Cut-Off.
9
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
FAIXA AMOSTRAS REATIVAS
CINZA
- Cálculo da Faixa Cinza (FC)
FC= CO x 1,2
Exemplo: em um ensaio que o valor calculado para o CO é 0,200:
FC = 0,200 x 1,2
FC = 0,240
Neste exemplo a FC compreende o intervalo entre 0,200 e 0,240.
Obs. 1: recomendamos a repetição das amostras que
apresentarem densidade ótica na “faixa cinza”, considerada
neste teste, entre o valor obtido para o Cut-Off e o valor obtido
com a multiplicação deste por 1,2.
Obs. 2: mantendo-se as amostras na “faixa cinza”, após a
repetição, recomendamos a coleta de uma nova amostra após
10-15 dias da coleta da primeira amostra, ou então, pode-se
utilizar outras metodologias para confirmação deste resultado,
que deverá ser designado como indeterminado.
VALIDAÇÃO DO TESTE:
Considerar o teste válido quando os valores da densidade ótica
estiverem na faixa descrita a seguir:
- Controle Positivo: > 0,500
- Controle Negativo: <0,200
Repetir o ensaio se os valores citados estiverem fora do limite.
Amostras reagentes = As que apresentarem densidade ótica
igual ou superior ao Cut-Off.
Repetir o ensaio se os valores citados estiverem fora do limite.
RESULTADOS
Obs.: o operador deverá observar os controles do teste, considerando
que a DO obtida para o controle do conjugado (SS) não poderá ser
superior a 1,5 x DO obtida para o soro controle negativo.
CO = 0,090 x 2,3 = 0,207
Ligar o Espectrofotômetro para microplacas, equipado com filtro
de 450nm para leitura e sem a utilização de filtro de referência
(620-630nm). Após alguns minutos para estabilização do feixe
de luz, zerar o aparelho no ar e, em seguida, iniciar a leitura da
microplaca de teste.
Obs.: caso a leitura seja feita com filtro de 450nm tendo como
referência outro de 620-630nm, todas as densidades óticas (DO)
ficarão abaixo do esperado, prejudicando o cálculo do cut-off e
causando a ocorrência de resultados falso-positivos no ensaio.
_
- Cálculo do Cut-Off: CO = X CN x 2,3
CO = Cut-Off
_
X CN = Média da densidade ótica dos orifícios do
Controle Negativo
_
Exemplo: X CN= 0,095 + 0,085 = 0,090
2
- Controle Positivo: > 0,500
- Controle Negativo: <0,200
Considerar o teste válido quando os valores da densidade ótica
estiverem na faixa descrita a seguir:
VALIDAÇÃO DO TESTE:
Exemplo: em um ensaio que o valor calculado para o CO é 0,200:
FC = 0,200 x 1,2
FC = 0,240
Neste exemplo a FC compreende o intervalo entre 0,200 e 0,240.
Obs. 1: recomendamos a repetição das amostras que
apresentarem densidade ótica na “faixa cinza”, considerada
neste teste, entre o valor obtido para o Cut-Off e o valor obtido
com a multiplicação deste por 1,2.
Obs. 2: mantendo-se as amostras na “faixa cinza”, após a
repetição, recomendamos a coleta de uma nova amostra após
10-15 dias da coleta da primeira amostra, ou então, pode-se
utilizar outras metodologias para confirmação deste resultado,
que deverá ser designado como indeterminado.
- Cálculo da Faixa Cinza (FC)
FC= CO x 1,2
LEITURA:
13 - Incubar à temperatura ambiente, ao abrigo da luz, durante
20 minutos
14 - Bloquear a reação adicionando 50 µL de ácido sulfúrico 2M
em todos os orifícios. Em seguida, proceder a leitura.
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EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
AMOSTRAS NÃO REATIVAS
FAIXA AMOSTRAS REATIVAS
CINZA
Amostras não reagentes = As que apresentarem densidade
ótica inferior ao Cut-Off.
CO
EIE - IgM - Leptospirose - Bio-Manguinhos
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