1
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTU SENSU
MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS-IMUNOPATOLOGIA DAS DOENÇAS
INFECCIOSAS E PARASITÁRIAS
Chaiana Fróes Magalhães
Efeito de extratos e frações de Piper aduncum sobre o crescimento e metabolismo dos
Streptococcus mutans e Streptococcus sanguis
Governador Valadares
Março 2010
2
CHAIANA FRÓES MAGALHÃES
Efeito de extratos e frações de Piper aduncum sobre o crescimento e metabolismo dos
Streptococcus mutans e Streptococcus sanguis
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado em Ciências Biológicas da
Universidade Vale do Rio Doce, para obtenção
do título de Mestre em Ciências Biológicas na
área de Imunopatologia das Doenças
Infecciosas e Parasitárias.
Orientador: Dr. Anderson Assunção Andrade
Co-orientadora: Dra. Kênia Valéria dos Santos
Governador Valadares
Março 2010
3
CHAIANA FRÓES MAGALHÃES
Efeito de extratos e frações de Piper aduncum sobre o crescimento e metabolismo dos
Streptococcus mutans e Streptococcus sanguis
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado em Ciências Biológicas da
Universidade Vale do Rio Doce, para obtenção
do título de Mestre em Ciências Biológicas na
área de Imunopatologia das Doenças
Infecciosas e Parasitárias.
Governador Valadares, ___ de ________________ de ______.
Banca Examinadora:
_____________________________________________
Examinador(a)
____________________________________________
Examinador(a)
Governador Valadares
Março 2010
4
Dedico este trabalho aos meus alicerces : Deus,
pelo seu incondicional amor,
aos meus pais,irmãos e Bebelzinha,
à minha tia Penha e o meu orientador.
5
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Dr. Anderson Assunção Andrade, que nunca mediu esforços para me
ajudar nesta longa caminhada, que vem me acompanhando desde a graduação e assim
podendo participar de perto da minha evolução. Você é pra mim um exemplo de Ser Humano,
um profissional brilhante e se tornou um grande amigo. Foi o meu chão em todos os
momentos, durante esses dois anos de muita luta e de muita superação. Você não ter me
abandonado naquele momento em que foi embora, aumentou ainda mais a minha força de
vencer.
Á minha co-orientadora Dra. Kênia Valéria dos Santos, que me acolheu e aceitou contribuir
com essa difícil tarefa que foi lhe dada, fazendo-a com uma dedicação sem igual. Agradeço
por me ensinar como fazer uma apresentação mais didática e assim me tornar mais confiante.
Obrigada por ter sentado ao meu lado em um dia que eu estava disposta a desistir e com a
mais calma das palavras me fez acreditar mais em mim.
Aos meus grandes amigos do Laboratório de Pesquisa em Microbiologia da UNIVALE,
Adiléia, que se tornou uma grande amiga, com seus conselhos que me fortaleciam, a
Lourimar, uma amiga que esteve ao meu lado com suas palavras sábias quando mais precisei
de ajuda, ao Luiz Roberto, sorrindo toda manhã com o mais lindo dos sorrisos, quando meu
humor não estava dos melhores (rsrsrs) e orações que me fortaleciam sem eu mesma saber e a
Lenice, que com toda sua sabedoria me ensinou que para gostarmos de alguém, não necessita
de tempo, e sim de Amor no coração. Aos alunos de iniciação científica (IC) do laboratório
que me ajudaram com muita boa vontade. Enfim, obrigada por tamanho carinho, pelas
conversas e inúmeras risadas que me distraíram e pela força nos momentos mais difíceis que
antecederam a defesa. Em especial agradeço a Elaine, que em vários momentos se tornou
minha “mãe adotiva” e me passou coragem quando queria desistir e agüentou muitos choros,
durante estes anos de amizade, mas também inúmeras risadas, que nos faziam até chorar, mas
dessa vez o choro tinha um gostinho agradável. Minha “Amiga-mãe”, anos se passaram e
nossa amizade foi ficando acima do profissional, fomos criando laços de amor, portanto hoje
não te digo um adeus, isso seria muito injusto, te digo apenas um até logo.
À coordenadora do laboratório de Microbiologia, Carmem Helena Barbosa do Vale, muito
obrigada por estes anos de convívio.
6
Aos professores do curso de Mestrado em Ciências Biológicas da UNIVALE pelos
ensinamentos que contribuíram para meu crescimento e formação profissional.
Á coordenadora do curso de mestrado Dra. Alda Maria Soares Vieira, que me atendeu em
todos os momentos quando a procurava com os vários problemas existentes nesta caminhada.
Agradeço também a secretária do mestrado, Kelli, com toda a sua calma foi resolvendo os
problemas da melhor forma possível.
Aos meus irmãos, por nunca deixarem que a distância interferisse no grande amor que
sentimos um pelo outro. Pela palavra amiga mesmo a distância, pela grande confiança de
saberem que eu venceria. Lutaram, lutaram muito, para que eu chegasse aqui hoje. Obrigada
meus “Irmãos-filhos”.
Á minha princesinha Bebelzinha, que em toda manhã quando estava chorando, enxugava
minhas lágrimas e dizia assim: “Fica assim não meu amor, estou orando por você, Jesus vai te
ajudar”. Como não resgatar as forças depois das palavras tão meigas de uma criança de
apenas cinco anos?
Aos meus pais pelo amor incondicional, por sempre acreditarem que sou capaz. Eu não seria a
metade do que sou, se vocês não existissem na minha vida. Á você mãe, agradeço por engolir
várias vezes o choro, só para me passar a força necessária naquele momento. Ao meu pai,
agradeço por fazer o possível e impossível para jamais me deixar sentir sozinha. Vocês são, o
meu orgulho, a minha rocha, a minha vontade de vencer a cada dia.
Às minhas grandes amigas Fernanda e Danyelle, elas que me faziam esquecer todos os
problemas quando saia do laboratório depois do estressante dia. Obrigada, porque nos dias de
hoje, não é fácil manter uma amizade de mais de 15 anos.
À minha tia Penha, pioneira dessa história toda, aquela que um dia me ligou e disse: “Largue
seu emprego e vai estudar e vencer, eu estarei te ajudando”, e assim se fez até o último dia.
Tia, eu vou te provar que valeu a pena todo o seu esforço.
7
Aos meus familiares, avós, tios e primos, obrigada por estarem presentes na minha vida,
torcendo por mais essa vitória, sendo através de um abraço, um sorriso ou em orações.
E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse trabalho.
Ao meu Deus, agradeço pelo grande amor, por me presentear com todas estas maravilhosas
pessoas. Obrigada por a cada instante mostrar que esteve e sempre estará ao meu lado, mesmo
nos mais simples gestos. Eu realmente posso tudo naquele que me fortalece, e assim sendo, a
vitória sempre vem no final.
Hoje posso dizer que no começo houve muitas provas amargas, aquelas que necessitaram de
muita força pra seguir em frente. Inúmeras vezes pensei em desistir de tudo. Não é fácil, Deus
nunca disse que seria, mas sempre disse que estaria conosco e graças a Ele e a todas essas
pessoas acima, hoje com todo o meu esforço e dedicação posso dizer que “MINHA
VITÓRIA TEVE UM SABOR DE MEL”.
8
EXECUÇÃO DO TRABALHO
Laboratório de Pesquisa em Microbiologia da Universidade Vale do Rio Doce (UNIVALE),
Governador Valadares - MG.
Laboratório de Química da Universidade Vale do Rio Doce (UNIVALE), Governador
Valadares – MG.
Centro de Pesquisa René Rachou (CPqRR) – Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte - MG.
COLABORADORES:
Dr. Ezequias Pessoa de Siqueira Filho
Centro de Pesquisas René Rachou – FIOCRUZ- MG
Dra. Ivana Cristina Ferreira dos Santos
Laboratório de Botânica da Universidade Vale do Rio Doce (UNIVALE) – MG
Dr. Rodrigo Loreto Peres
Laboratório de Química da Universidade do Rio Doce (UNIVALE) – MG
Daniele Fortunato de Oliveira
Estagiária do Laboratório de Botânica da Universidade Vale do Rio Doce (UNIVALE)
ÓRGÃOS FINANCIADORES:
Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais – FAPEMIG
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES
Universidade Vale do Rio Doce – UNIVALE
9
RESUMO
A aplicação tópica de substâncias bactericidas para controlar o crescimento da placa
dental é uma estratégia amplamente utilizada. No entanto, em geral, esses compostos não são
seletivos em sua ação, de modo que eles eliminam também as bactérias da placa que
desempenha papel benéfico ao hospedeiro. Desse modo, a descoberta de agentes
antimicrobianos capazes de preservar as espécies benéficas, tendo, portanto, ação mais
específica sobre os microrganismos patogênicos, seria altamente desejável. Diante disso,
nosso objetivo é avaliar a atividade de extratos e frações de Piper aduncum sobre o
crescimento e metabolismo dos Streptococcus mutans e Streptococcus sanguis, dois membros
antagônicos da placa bacteriana, sendo o primeiro considerado como o principal agente da
cárie dental, enquanto o último é visto como uma bactéria benéfica em relação à doença. O
efeito antibacteriano de extratos hexânicos e etanólicos, obtidos por quatro diferentes métodos
de extração (decocção, maceração, turbólise e soxhlet), foi avaliado pela determinação dos
valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima
(CBM), pelo estabelecimento da curva de morte das bactérias e pela capacidade de inibir a
aderência, mediada por sacarose, e acidogênese do S. mutans. Os extratos também foram
avaliados quanto à sua citotoxicidade em linhagens de células de mamíferos. De forma geral,
o S. mutans foi mais susceptível aos extratos de P. aduncum do que o S. sanguis (CIM
variando de 0,16-0,62 mg/ml e 0,31-2,5 mg/ml, respectivamente). O extrato bruto mais ativo
foi o etanólico obtido por maceração (EMP), o qual apresentou os menores valores de CIM,
tanto para S. mutans (0,16 mg/ml) quanto para S. sanguis (0,31 mg/ml). Na concentração
correspondente à CIM, o EMP reduziu a acidogênese do S. mutans e inibiu sua aderência
mediada por sacarose. Por ser o extrato mais ativo, o EMP foi fracionado por cromatografia
de exclusão em gel, sendo obtidas 16 frações, das quais sete tiveram sua atividade
antibacteriana testada (G, I, J, L, M, N e Q). A fração J foi a mais ativa contra o S. mutans,
apresentando valores de CIM < 0,08 mg/ml e efeito inibitório sobre a aderência dessa bactéria
a partir da concentração de 0,08 mg/ml.
Os dados indicam uma atividade bacteriostática do extrato EMP e suas frações (na
concentração equivalente à CIM) sobre o S. sanguis, pois no ensaio de cinética do tempo de
morte observou-se redução na contagem de UFC/ml menor que 3 log em relação ao controle.
Em síntese, nossos dados indicam que o extrato EMP é mais ativo sobre o S. mutans do que
sobre S. sanguis, é capaz de inibir a aderência e reduzir a acidogênese do S. mutans in vitro, e
10
não é citotóxico para células de mamíferos, o que sugere que ele pode ser uma fonte
promissora de novos compostos antimicrobianos direcionados para prevenção da cárie dental.
Palavras-chave:
Placa
bacteriana.
Antibacterianos. Plantas medicinais.
Streptococcus
mutans.
Streptococcus
sanguis.
11
ABSTRACT
Topical application of antibacterial substances to control the growth of dental plaque is
a strategy widely used. However, in general, these compounds are not selective in its action,
so that they also eliminate the bacteria in plaque that plays a beneficial role to the host. Thus,
the discovery of antimicrobial agents capable of preserving the beneficial species, being,
therefore, more specific on the pathogens, it would be highly desirable. Given this, the aim of
this study was to investigate the activity of extracts and fractions from Piper aduncum on
growth and metabolism of two members of the dental biofilm, Streptococcus mutans and
Streptococcus sanguis: the first is considered a major pathogen causing human dental caries,
while the latter is considered a benign, or even a beneficial, bacterium with regard to dental
caries. Ethanol and hexane extracts obtained by four different extraction techniques
(decoction, maceration, soxhlet and turbo-extraction) were tested for their antibacterial
activity by (1) determining the values of minimal inhibitory concentration (MIC) and Minimal
Bactericidal Concentration (MBC), (2) establishment of time-kill kinetics of the bacteria, (3)
investigating their inhibitory effect on sucrose-dependent adherence and (4) acid production
from glucose by S. mutans. The cytotoxic potencial of extracts was assessed against
mammalian cell lines.
In general terms, S. mutans was more susceptible to extracts of P. aduncum than S.
sanguis (MIC ranging from 0.16-0.62 mg/ml and 0.31-2.5 mg/ml, respectively). The most
active crude extract was the ethanol extract obtained by maceration (EMP), which had the
lowest MIC values for both S. mutans (0.16 mg/ml) and for S. sanguis (0.31 mg/ml). At the
concentration corresponding to the CIM, the EMP reduced acid production from glucose by S.
mutans and inhibited their sucrose-dependent adherence. The most active antimicrobial
extract, the EMP, was fractionated by gel exclusion chromatography. Were obtained 16
fractions, of which 7 had their antibacterial activity assessed (G, I, J, L, M, N and Q). Among
these, the fraction (J) exhibited the most antimicrobial activity against S. mutans, with MIC
values <0.08 mg/ml and inhibitory effect on the adhesion of this bacterium from the
concentration of 0.08 mg/ml.
The data indicate a bacteriostatic activity of EMP extract and its fractions (at the
concentration equivalent to MIC) on the S. sanguis, because the time-kill kinetics showed
decreasing in the number of CFU/ml lower than 3 log compared to control. In summary, our
data indicate that the extract EMP is more active on S. mutans than for S. sanguis, can inhibit
the adherence and reduce the acid production by S. mutans in vitro, and it is no cytotoxic to
12
mammalian cells, suggesting that it may be a promising source of new antimicrobial
compounds directed to prevention of dental caries.
Words-Key: Bacterial plaque. Streptococcus mutans. Streptococcus sanguis. Antibacterial.
Medical plants.
13
SUMÁRIO
1 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................ 13
1.1 PLACA BACTERIANA: IMPLICAÇÕES NA SAÚDE E NA DOENÇA...................... 14
1.2 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE PLANTAS MEDICINAIS:.............................. 18
2 JUSTIFICATIVA................................................................................................................. 22
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 24
3.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................................ 24
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................................... 24
4 METODOLOGIA ................................................................................................................ 25
4.1 OBTENÇÃO DA ESPÉCIE VEGETAL ESTUDADA: ................................................... 25
4.2 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO – PREPARO DOS EXTRATOS VEGETAIS: ................. 25
4.2.1 Decocção ..................................................................................................................... 25
4.2.2 Maceração ................................................................................................................... 25
4.2.3 Soxhlet ......................................................................................................................... 26
4.2.4 Turbólise ..................................................................................................................... 26
4.3 FRACIONAMENTO ........................................................................................................ 27
4.4 TESTES MICROBIOLÓGICOS: .................................................................................... 27
4.4.1 AMOSTRAS BACTERIANAS: ....................................................................................... 27
4.4.2 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA: ..................................... 27
4.4.3 ENSAIO DA ADERÊNCIA BACTERIANA À SUPERFÍCIE DE VIDRO SOBRE O
S. MUTANS:.......................................................................................................................... 28
4.4.4 EFEITO DO EXTRATO DE PIPER ADUNCUM SOBRE A PRODUÇÃO DE
ÁCIDO POR S. MUTANS: .................................................................................................... 29
4.4.5 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE: .............................................................................. 29
4.4.6 DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA DE CRESCIMENTO DE S. MUTANS E S.
SANGUIS:............................................................................................................................. 30
4.4.7 DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA DE AÇÃO DOS EXTRATOS E FRAÇÕES
MAIS ATIVOS DE P. ADUNCUM SOBRE O CRESCIMENTO DE S. MUTANS E S.
SANGUIS:............................................................................................................................. 30
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 32
6 CONCLUSÕES ........................................................................ Erro! Indicador não definido.
6.1 CONCLUSÃO FINAL .................................................................................................... 45
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 46
14
1. REVISÃO DA LITERATURA
1.1 PLACA BACTERIANA: IMPLICAÇÕES NA SAÚDE E NA DOENÇA
A placa bacteriana, também conhecida como placa dental ou biofilme dental, pode ser
definida como uma película não calcificada, fortemente aderida às superfícies dentais, e que
resisti à remoção pelo fluxo salivar (MARSH, 1992). A placa dental residente, em estágio de
homeostasia, é natural e benéfica ao hospedeiro, pois age como uma barreira, protegendo a
superfície dental contra a invasão por espécies patogênicas (MARSH, 1994; KRETH et al.,
2005). Por outro lado, quando ocorre algum distúrbio, essa estrutura é considerada a principal
causa de doenças que ocorrem na cavidade oral (KRETH et al., 2005). Em qualquer situação,
a placa apresenta uma grande diversidade de gêneros e espécies microbianas. Portanto,
conclui-se que tal diversidade pode estar relacionada tanto com a saúde quanto com a doença
(MARSH, 2004).
Estruturalmente, a placa é um biofilme, cuja constituição pode variar em dependência
de fatores intrínsecos e extrínsecos (MARSH, 1992). O termo biofilme é usado para denotar
ecossistemas microbiológicos complexos embebidos em uma matriz de polímeros orgânicos,
aderidos a uma superfície (WILSON, 2001). Apresenta, portanto, uma organização estrutural
e funcional. A placa dental, especificamente, é formada por uma seqüência de eventos,
incluindo estágios distintos como: a formação da película adquirida, interações físicoquímicas entre a superfície da célula bacteriana e moléculas do hospedeiro, multiplicação
microbiana, produção de polímeros (incluindo a síntese de polissacarídeos extracelulares) e
recrutamento de novas espécies para o biofilme através de interações interbacterianas, e
formação do biofilme maduro (MARSH, 2006).
O biofilme dental apresenta um crescimento contínuo, por isso seu crescimento deve
ser controlado por meio de métodos mecânicos e/ou químicos, pois essa estrutura é
considerada a principal causa de doenças que ocorrem na cavidade oral como estomatites,
infecções periimplantares, doença periodontal e cárie dentária (ROSAN e LAMONT, 2000).
A cárie dentária é a doença infecciosa crônica de maior incidência na espécie humana
(DE LORENZO, 2004) e tende a permanecer não tratada em muitas áreas subdesenvolvidas,
principalmente se considerarmos que, não raro, o paciente só consegue aliviar a sua dor com a
extração dentária (AJDIC et al., 2002).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), a prevalência da cárie em crianças
em idade escolar é de 60-90%, entre os adultos é virtualmente universal na maioria dos países
15
(PETERSEN et al., 2005). Em 1981, a OMS adotou indicadores como forma de monitorar a
saúde oral da população. Estes indicadores baseiam-se no número de dentes permanentes
cariados, perdidos e obturados (CPO) por crianças, com 12 anos de idade e em adultos com
idade entre 35 a 44 anos. Para cada item (dente cariado, perdido ou obturado) é computado
um valor de escore (PETERSEN, 2003).
Uma vez que poucos países são isentos de altos níveis dessa doença, os mapas da
distribuição de cárie tipicamente mostram a severidade da doença ao invés da prevalência
(PETERSEN, 2003).
A cárie ainda se constitui na principal causa de perdas dos dentes, notadamente em
pessoas com idade inferior a 40 anos, após a qual as doenças periodontais passam a
representar causa significativa, cujo impacto aumenta conforme o aumento da idade (DE
LORENZO, 2004).
A cárie dentária é caracterizada pela destruição dos tecidos dentais duros, por ácidos
produzidos pelos microrganismos da placa bacteriana (microrganismos acidogênicos),
resultando finalmente na formação de uma cavidade (WHO, 1982). Contudo, para que a
doença se desenvolva, múltiplos fatores são requeridos, incluindo desde fatores inerentes ao
hospedeiro, como produção de saliva (quantidade e qualidade) e susceptibilidade do dente, até
fatores comportamentais do hospedeiro, como qualidade da higiene bucal e composição /
freqüência da dieta, principalmente da dieta rica em sacarose (DE LORENZO, 2004).
Os carboidratos fermentados na dieta são um dos principais fatores responsáveis pelas
mudanças bioquímicas e fisiológicas no biofilme dental. Após a fermentação dos açúcares
(glicose, sacarose e frutose), o pH é diminuído rapidamente (LEME et al., 2008), ocorrendo
uma mudança no ambiente oral, que resulta em um desequilíbrio no balanço da microbiota
residente da placa. Esse desequilíbrio é representado pela seleção de bactérias cariogênicas, as
quais são capazes de sobreviver em condições de baixo pH (bactérias acidúricas) (MARSH,
1994). A sacarose é considerada o principal carboidrato cariogênico (LEME et al., 2008),
pois, além de ser fermentado pelas bactérias, também serve como substrato para a síntese de
polissacarídeos extracelulares através da enzima glicosiltransferase presente na placa dental
(BROWEN, 2002). Dessa forma, a sacarose influência diretamente na constituição do
biofilme dental, promovendo a sucessão de uma placa não-associada à doença para uma placa
cariogênica (DE LORENZO, 2004).
Os polissacarídeos extracelulares (na maioria glicanas insolúveis) promovem a
aderência bacteriana na superfície dos dentes, contribuindo com a integridade estrutural do
biofilme dental. A exposição à sacarose e os polissacarídeos insolúveis podem estar
16
associados com a patogenicidade da placa dental (LEME et al., 2008), aumentando os
microrganismos acidogênicos e acidúricos (HOLBROOK, 1993).
Os microrganismos que melhor preenchem todos os requisitos de cariogenicidade, e,
portanto, são considerados os principais agentes etiológicos da cárie dentária são os
estreptococos do grupo mutans (LOESCHE, 1986).
Os estreptococos do grupo mutans constituem um conjunto de microrganismos
associados à patogenicidade da placa dental humana (YATSUDA, 2005). Esse grupo é
composto atualmente por sete espécies, sendo a espécie Streptococcus mutans a mais
prevalente na espécie humana e o principal microrganismo associado à cárie dental. Os S.
mutans são cocos gram positivos, anaeróbios facultativos, cujas células apresentam-se
dispostas isoladamente ou em cadeias, apresentando acidogênese intensa (DE LORENZO,
2004). A intensa fermentação da sacarose por essas bactérias resulta na produção de grandes
quantidades de ácido láctico e, conseqüentemente, na intensa acidificação da placa. A queda
do pH é responsável pelo desequilíbrio ecológico mantendo metabolicamente inativa a grande
maioria das espécies contidas na placa e possibilitando a seleção das raras espécies acidófilas
ou acidúricas, que continuam a metabolizar e a produzir ácido mesmo em pH ácido. O
somatório destas novas condições ecológicas justifica o considerável aumento numérico das
poucas espécies intensamente acidogênicas e acidúricas como S. mutans e uma severa redução
do número de outras espécies consideradas como indicativas do estado de saúde (DE
LORENZO, 2004).
Outra característica importante do S. mutans para o desenvolvimento da cárie é sua
habilidade de aderir firmemente à superfície dos dentes na presença de sacarose,
principalmente na superfície lisa onde a fixação bacteriana é mais dificultosa (ALALUUSUA
et al., 1997). Essa aderência é mediada principalmente pela ação de enzimas
Glicosiltransferases (GTF), as quais sintetizam polímeros extracelulares de carboidratos,
conhecidos como glicanas. As glicanas, sobretudo as insolúveis em água, têm sido
consideradas como os principais fatores de aderência e acúmulo de estreptococos cariogênicos
sobre a superfície dental (YATSUDA, 2005), sendo, portanto, consideradas fundamentais
para a virulência do S. mutans na patogênese da cárie dental (YAMASHITA et al., 1993).
A aderência do S. mutans na superfície do dente e subseqüente formação da placa
cariogênica ocorrem em dois estágios. O primeiro estágio é a aderência reversível da célula
bacteriana à película adquirida presente na superfície do esmalte e o segundo estágio é a
acúmulo do microrganismo através do seu crescimento e produção de glicanas extracelulares.
17
A interferência em alguns desses mecanismos pode prevenir a formação da cárie dentária
(LANDUCCI, 2003).
Além dos estreptococos do grupo mutans, várias outras espécies do gênero
estreptococos participam da constituição da placa dental, sendo que muitas delas estão
associadas ao bom estado de saúde do hospedeiro, como o Streptococcus sanguis. Essa
espécie tem sido isolada em todas as placas humanas examinadas e é uma das primeiras
bactérias a aderir seletivamente e colonizar a superfície dental (CAUFIELD et al., 2000). É
considerado, portanto, um colonizador pioneiro da placa dental. As placas dentais constituídas
basicamente por colonizadores pioneiros são consideradas benéficas ao hospedeiro, pois
reduzem o risco de infecções agindo como uma barreira contra a colonização por agentes
exógenos, freqüentemente patogênicos. Contribuem para essa resistência à colonização,
fatores como uma competição mais efetiva por nutrientes e sítios aos quais as bactérias
possam aderir, e a criação de condições desfavoráveis para o crescimento de espécies
invasoras, como a produção de substâncias com ação antimicrobiana (MARSH, 2003).
Caufield e colaboradores (1993) observaram que a proporção entre S. mutans e S.
sanguis pode servir como indicador de risco de cárie dental. Crianças com níveis nãodetectáveis de estreptococos do grupo mutans apresentaram maiores níveis de S. sanguis na
saliva do que as crianças colonizadas por estreptococos do grupo mutans. Este dado indica
que pode haver uma competição entre essas espécies na colonização das superfícies dentais e
que um pode afetar a colonização do outro. De fato, estudos feitos com animais isentos de
germes (“germe free”) também demonstram o que é chamado de “exclusão competitiva” entre
o S. mutans e o S. sanguis dependendo da seqüência de inoculação, ou seja, a colonização
precoce por S. sanguis e a presença de níveis elevados dessa bactéria na cavidade oral
estariam relacionadas a um significativo atraso na colonização por estreptococos do grupo
mutans. Similarmente, altos níveis de S. mutans na cavidade oral correlacionam-se com
baixos níveis de S. sanguis (KRETH et al., 2005). Por ser antecessor, o S. sanguis poderia
competir com estreptococos do grupo mutans pela colonização de sítios na superfície dental
(CAUFIELD et al., 1993).
As condições ambientais também modulam a competição e a coexistência entre as
espécies, como por exemplo, um ambiente onde as condições são de pH ácido, ocorre a
inibição do crescimento de S. sanguis e o favorecimento do S. mutans (KREHT et al.,2005).
Segundo Kreht e colaboradores (2005), ambas as espécies produzem substâncias que
inibem o crescimento de outras espécies, sendo que o S. mutans produz mutacinas que servem
para inibir tanto o S. sanguis quanto outras espécies orais. Por sua vez, o S. sanguis produz o
18
peróxido de hidrogênio, que consegue reduzir o crescimento de S. mutans. A produção de
substâncias inibitórias é um fator majoritário para a determinação da composição da
microbiota da placa (MARSH, 1994).
Dessa forma, ao utilizar agentes antimicrobianos para combater as bactérias da placa, é
importante que os benefícios da microbiota residente sejam considerados (MARSH, 2003).
Por isso, a descoberta de agentes antimicrobianos capazes de preservar as espécies benéficas,
tendo, portanto, ação mais específica sobre os microrganismos patogênicos, seria altamente
desejável (RUKAYADI e HWANG, 2006).
1.2 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE PLANTAS MEDICINAIS
Planta medicinal é aquela que contém um ou mais tipos de princípios ativos,
conferindo-lhe atividade terapêutica (MARTINS et al., 1994). Esses podem ser empregados
tanto na forma de preparações caseiras, como chás, tinturas e pós, ou na forma de composto
puro isolado da planta e transformado em cápsulas, comprimidos e pomadas, pela indústria
farmacêutica (LORENZI e MATOS, 2002).
O uso das espécies vegetais, para o tratamento e cura de doenças e sintomas, remonta
ao início da civilização, desde o momento em que o homem iniciou o percurso de manuseio,
adaptação e modificação dos recursos naturais para seu próprio benefício. Esta prática milenar
ultrapassou todas as barreiras e obstáculos durante o processo evolutivo e chegou até os dias
atuais, sendo amplamente utilizada por grande parte da população mundial como fonte de
recurso terapêutico eficaz (DI STASI, 1996).
Dentre as aplicações terapêuticas das plantas medicinais, uma das mais estudadas é
seu potencial como fonte de compostos com atividade antimicrobiana. A escassez de doenças
infecciosas em plantas silvestres é por si só uma indicação do sucesso dos mecanismos de
defesa desenvolvida por elas. As plantas são conhecidas por produzir uma enorme variedade
de pequenas moléculas antibióticas, geralmente classificadas como fitoalexinas. Sua natureza
estrutural
é
diversa,
tendo
terpenóides,
glicosídeos,
flavonóides
e
polifenóis.
Interessantemente, a maioria destas pequenas moléculas tem atividade antibiótica fraca –
várias ordens de grandeza menor que aquelas de antibióticos comuns produzidos por bactérias
ou fungos. Apesar desse fato que antibacterianos derivados de plantas são menos potentes, as
plantas combatem as infecções com sucesso. Portanto, torna-se claro que as plantas adotaram
um paradigma diferente – sinergismo- para combater as infecções (HEMAISWARYA et al.,
2008). Esse efeito sinérgico explica a superioridade terapêutica de muitos extratos de plantas
19
derivados da medicina tradicional quando comparados com seus respectivos constituintes
isolados (WAGNER e ULRICH-MERZENICH, 2009).
Entre as principais ferramentas para a seleção de espécies vegetais com potencial para
ser empregada para prevenir ou tratar determinada enfermidade, estão as informações de
como as plantas são utilizadas por diferentes grupos étnicos e os estudos farmacológicos das
preparações utilizadas, abordadas, respectivamente, no âmbito da Etnobotânica e da
Etnofarmacologia. Esse conhecimento transmitido ao longo de sucessivas gerações tem-se
mostrado eficiente como ponto de partida para o delineamento experimental visando a
descoberta de novos fármacos (de SOUZA et al., 2004). De fato, as plantas são, há séculos,
utilizadas pelo homem para fins terapêuticos (NOSTRO et al., 2000), e, segundo dados da
Organização Mundial de Saúde (OMS), 65-80% da população dos países em desenvolvimento
dependem de plantas medicinais como única forma de acesso aos cuidados básicos de saúde
(ELISABETSKY, 1987).
Nas últimas décadas, tem sido observado mundialmente um crescente interesse global
no aproveitamento da biodiversidade, particularmente no que se refere às plantas medicinais,
que têm sido utilizadas em várias áreas da saúde como uma expressiva forma alternativa de
tratamento e prevenção (LEWIS e ELVIN- LEWIS, 1997).
No Brasil há crescente interesse e busca pela medicina tradicional e pela fitoterapia,
que ocorre devido a vigente carência de recursos dos órgãos públicos de saúde e incessantes
aumentos de preços nos medicamentos alopáticos (MEDEIROS et al., 2004), bem como dos
efeitos colaterais apresentados por alguns destes medicamentos. Nosso país está entre os que
possuem maior diversidade genética vegetal, contando com mais de 55.000 espécies
catalogadas (AZEVEDO e SILVA, 2006), e detentor de mais de 30% dos remanescentes de
florestas tropicais existentes sobre a superfície terrestre, abrigando não somente a maior
diversidade biológica do planeta, como também alta variabilidade genética (MEDEIROS et
al., 2004). Além disso, o número de informações sobre plantas medicinais tem crescido
lentamente, evidenciando que em um país biologicamente tão rico, mas com ecossistemas tão
ameaçados, as pesquisas com plantas medicinais deveriam ser mais incentivadas (NETO e
MORAIS, 2003).
Estudos têm demonstrado a ação antimicrobiana de algumas plantas medicinais sobre
bactérias da cavidade oral. Por exemplo, Ceanothus americanus apresentou efeito bactericida
sobre S. mutans, Actinomyces viscosus e Porphyromonas gingivalis (LI et al., 1997). Além
disso, o bacuquiol, um composto isolado da semente e folhas de Psoralea corylifolia, uma
planta nativa da China, apresentou atividade bactericida sobre vários microrganismos orais,
20
incluindo S. mutans, S. sanguis, Streptococcus salivarius, Streptococcus sobrinus,
Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei,
Lactobacillus plantarum, Actinomyces viscosus, and Porphyromonas gingivalis (KATSURA
et al., 2001). Além desses, vários outros produtos de origem vegetal têm sido avaliados
quanto à sua atividade sobre bactérias cariogênicas e periodontopatogênicas (SOTE et al.,
1995; TAKARADA, et al., 2004).
Um exemplo é o trabalho de Iauak e colaboradores
(2003), no qual foi avaliada a atividade antimicrobiana de extratos de diversas plantas
medicinais (Althaea officinalis L., Arnica montana L., Calendula officinalis L., Hamamelis
virginiana L., Illicium verum Hook., e Melissa officinalis L.) sobre várias espécies de
bactérias,(Porphyromonas
gingivalis,
Prevotella
spp.,
Fusobacterium
nucleatum,
Capnocytophaga gingivalis, Veilonella parvula, Eikenella corrodens, Peptostreptococcus
micros e Actinomyces odontolyticus), sendo relatados muitos extratos ativos. Esses estudos
demonstram que extratos ou compostos isolados de plantas medicinais possuem propriedades
de inibir a formação de placa dental, o que sugere que os mesmos podem ser utilizados na
odontologia preventiva, sobretudo em países em desenvolvimento, onde grande parte da
população não dispõe de recursos financeiros para tratamentos odontológicos. Entretanto, a
biodisponibilidade dos princípios ativos dessas plantas bem como os efeitos produzidos após
um longo período de uso in vivo precisam ser melhor estudados (SOTE et al., 1995, de
SOUZA et al., 2004).
Considerando que duas das principais estratégias para prevenir a cárie dental são inibir
o crescimento dos estreptococos mutans e/ou inibir a aderência dessas bactérias à superfície
dos dentes (KOO et al., 2002) e, além disso, que compostos com ação antimicrobiana,
idealmente, devem agir mais especificamente sobre as bactérias patogênicas, preservando as
espécies benéficas (RUKAYADI e HWANG, 2006), nosso objetivo é testar a atividade de
extratos e frações de Piper aduncum sobre o crescimento e metabolismo de duas espécies
antagônicas de Streptococcus que compõem a placa dental: Streptococcus mutans e
Streptococcus sanguis.
A escolha da espécie vegetal a ser estudada foi realizada a partir de informações
etnobotânicas (LORENZI e MATOS, 2002). O Piper aduncum é uma planta pertencente à
família Piperaceae, cujas características incluem: arbusto ereto, ramificado, perenifólio, de
hastes articuladas e nodosas, de 2-4 m de altura, nativo do sudeste do Brasil. Folhas simples,
inteiras, opacas em ambas as faces, com a inferior finamente pubescente, de 10-17 cm de
comprimento. Flores pequenas e discretas, reunidas em espigas alongadas, densas e curvas, de
7-14 cm de comprimento. Multiplica-se por sementes. Possui nomes populares como aperta-
21
ruão, aperta-joão, matico-falso, jaborandi-falso, falso-jaborandi, jaborandi-do-mato, pimentado-fruto-ganchoso, caá-peba, nhandi, cheirosa (LORENZI e MATOS, 2008).
É uma planta de ocorrência espontânea em pastagens e beira de matas do Sudeste,
onde é considerada “planta daninha”. Ocasionalmente é cultivada com fins ornamentais.
Contudo, é na medicina natural que sua popularidade é maior, embora muitas das indicações
terapêuticas ainda não tenham amparo científico. Assim, o chá ou a infusão alcoólica de suas
folhas, raízes e frutos são empregados como tônico, carminativo, antiespasmódico, contra
blenorragia e para afecções no fígado, vesícula e do baço. Às folhas são atribuídas
propriedades tônicas, estomáquica e antiespasmódica e, às raízes ação eficaz contra picada de
cobra; externamente é usada contra a erisipela. Seu óleo essencial contém cerca de 40% de
anethole e mostrou-se ativo contra cercárias, forma intermediária do agente causador da
esquistossomose (LORENZI e MATOS, 2002).
Várias espécies do gênero Piper têm sido descritas na literatura com atividade
antimicrobiana, incluindo a própria Piper aduncum. Em uma investigação de plantas
medicinais colombianas com atividade antimicrobiana, o extrato metanólico das folhas de
Piper lanceaefolium foi testado contra Candida. albicans, Klebsiella pneumoniae,
Enterococus faecalis, Mycobacterium phlei, Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus, tendo
sido encontradas atividades significantes (LOPEZ et al., 2001). Locher e colaboradores
(1995) estudaram extratos obtidos de plantas medicinais havaianas e não verificaram
atividade antibacteriana nos extratos de P. methysticum, porém, tal extrato foi ativo contra
várias espécies de fungos. Lentz et al., (1998), estudando plantas medicinais hondurenhas,
mostraram que o extrato do P. aduncum é ativo contra S. aureus, B. subtilis e Mycobacterium
intracellulare. Além disso, o extrato das partes aéreas do P. aduncum testado contra nove
diferentes linhagens bacterianas foi significativamente mais ativo contra bactérias Grampositivas do que contra as Gram-negativas (KLOUCEK et al., 2005).
A atividade antimicrobiana do extrato do P. aduncum não se limita à bactérias e
fungos. Sua atividade já foi também demonstrada para o poliovírus (LOHEZIC-LE
DEVEHAT et al., 2002) e Leishmania amazonensis (TORRES-SANTOS et al., 1999). O
amplo espectro de atividade do extrato de Piper aduncum ajuda a explicar o uso difundido
dessa planta entre populações de diferentes países.
22
2- JUSTIFICATIVA
Os estreptococos do grupo mutans são conhecidos como os principais microrganismos
da placa dental relacionados ao desenvolvimento da cárie. Portanto, uma eficiente forma de
prevenir o surgimento da cárie dentária é impedir a aderência ou crescimento das bactérias
pertencentes a esse grupo, principalmente o S. mutans, na placa dental. Para isso, uma
abordagem amplamente adotada consiste na aplicação tópica de bactericidas, tais como
triclosan e clorexidina. Contudo, em geral, esses compostos não são seletivos em sua ação e
seu uso freqüente pode, potencialmente, resultar em mudanças da microbiota oral e ocorrência
de linhagens resistentes (RUKAYADI e HWANG, 2006). Por isso, há um interesse crescente
no efeito de compostos naturais sobre a microbiota oral residente, em relação tanto à sua
habilidade de promover o crescimento de microrganismos benéficos, quanto à sua
propriedade de inibir o crescimento e metabolismo das espécies associadas a doenças
(PERCIVAL et al., 2006). De fato, nos últimos anos, muitos produtos de plantas têm sido
incorporados com sucesso em dentifrícios e enxaguantes bucais, com a finalidade de auxiliar
no controle do crescimento das bactérias da cavidade oral (VAN DER WEIJDEN et al., 1998)
e, conseqüentemente, prevenir as doenças, especialmente as doenças relacionadas à placa
dental, como a cárie (KOO et al., 2002; HWANG et al., 2003).
Vários compostos derivados de plantas já tiveram sua atividade antibacteriana
demonstrada para as bactérias da cavidade oral. Por exemplo, polifenóis extraídos do cacau
mostraram-se capazes de inibir a formação do biofilme e a produção de ácido pelo S. mutans
(PERCIVAL et al., 2006). Sanguinarina, um alcalóide extraído do rizoma da Sanguinaria
canadensis, possui um amplo espectro de atividade contra uma variedade de bactérias orais
(DZINK e SOCRANSKY, 1985). O extrato de chá verde, habitualmente consumido no Japão
após cada refeição, é conhecido por conter vários polifenóis que inibem o crescimento do S.
mutans (SAKANAKA et al. 1996). Xantorrizol, isolado de Curcuma xanthorrhiza Roxb
possui atividade antibacteriana contra vários patógenos orais, tendo, particularmente, uma
atividade bactericida muito rápida contra o S. mutans (RUKAYADI e HWANG, 2006).
Assim, baseado no conhecimento de que as plantas produzem uma enorme
variedade de pequenas moléculas antibióticas, acreditamos que o projeto se justifica pela
razão de que a descoberta de novos produtos naturais com atividade antibacteriana
direcionada para a prevenção de doenças bucais, talvez com menores efeitos adversos quando
comparados aos produtos industrializados e com ação mais seletiva, é muito importante para
obtenção de um controle efetivo da formação de um biofilme patogênico. Além disso, o
23
trabalho pode fornecer amparo científico para as indicações populares de Piper aduncum
como antibacteriano.
24
3- OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito de extratos e frações de Piper aduncum sobre o crescimento e
metabolismo dos Streptococcus mutans e Streptococcus sanguis.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Preparar extratos brutos, utilizando diferentes solventes e métodos de extração, das folhas
do Piper aduncum.
 Determinar o solvente e método de extração que produz o extrato com a melhor atividade
antibacteriana contra S. mutans e S. sanguis.
 Determinar, frente às linhagens de S. mutans e S. sanguis, a Concentração Inibitória
Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) dos extratos.
 Realizar o fracionamento do extrato bruto mais ativo.
 Determinar a CIM e CBM das frações obtidas.
 Verificar o efeito dos extratos e frações mais ativos de P. aduncum sobre o metabolismo
do S. mutans (produção de ácido, aderência à superfície de vidro).
 Determinar a cinética de ação dos extratos e frações mais ativos de P. aduncum sobre o
crescimento de S. mutans e S. sanguis.
 Verificar a citotoxicidade dos extratos e frações mais ativos de P. aduncum em linhagens
de células humanas transformadas (HeLa e A431) e não transformadas (Fibroblastos
Embrionários Murinos MEFs).
25
4- METODOLOGIA
4.1 OBTENÇÃO DA ESPÉCIE VEGETAL ESTUDADA:
O material vegetal foi coletado no horto de plantas medicinais localizado no Campus
II da UNIVALE entre os meses de junho e julho de 2009. As folhas do Piper aduncum foram
secadas em uma estufa a 40º C. Após a secagem completa, o material foi triturado e
posteriormente submetido a diferentes extrações (decocção, maceração, soxhlet e turbólise)
com a utilização de solvente polar (etanol) e apolar (hexano).
4.2 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO – PREPARO DOS EXTRATOS VEGETAIS:
4.2.1 Decocção
Inicialmente o material vegetal foi triturado e pesado 10 gramas do mesmo, em
seguida foi acondicionado em um balão de fundo redondo com capacidade para 500 ml onde
adicionou-se 200 ml dos respectivos solventes (etanol e hexano). O balão foi colocado em
uma manta de aquecimento NALGON® à temperatura de 100 °C, onde permaneceu por 6
horas.
A solução obtida foi então filtrada em filtro de papel, e então levada ao rotavapor
FISATOM® com pressão reduzida, à temperatura de 40ºC e 120 rpm. Em seguida, essa
solução foi depositada em um Becker (250 ml), na qual foi selado com um papel filme
perfurado, e conduzido a uma estufa de fluxo de ar a 40°C, onde permaneceu até a completa
secagem do extrato. Após a secagem, o extrato foi armazenado no freezer à -18°C até a
requisição dos bioensaios de susceptibilidade, quando este foi pesado (0,200g) e solubilizado
em 800µl de DMSO, obtendo uma concentração final de 200 mg/ml.
4.2.2 Maceração
O material vegetal foi triturado e pesado 75 gramas do mesmo, em seguida foi
acondicionado em um balão de fundo redondo com capacidade para 1000 ml, onde adicionouse 750 ml do solvente etanol.Após esse processo, o balão foi selado com papel filme e a
solução foi armazenada por 10 dias em condições ambientais.
Após este período, a solução foi filtrada em papel filtro, e colocada em um balão de
fundo redondo, e levada ao rotavapor FISATOM ® com pressão reduzida, à temperatura de
40ºC e 120 rpm. Essa solução foi, em seguida, depositada em Becker (250 ml), o qual foi
selado com um papel filme perfurado, e conduzido a uma estufa de fluxo de ar a 40°C, onde
26
permaneceu até a completa secagem do extrato. Após a secagem, o extrato foi armazenado no
freezer à -18°C até a requisição dos bioensaios de susceptibilidade, quando este foi pesado
(0,200g) e solubilizado em 800µl de DMSO, obtendo uma concentração final de 200mg/ml.
4.2.3 Soxhlet
Os extratos foram preparados em um extrator de Soxhlet com os solventes etanol e
hexano. Foram adicionados 10gramas do material vegetal triturado envolvido em papel filtro
WHATMAN®, e então acondicionado no interior da parte extratora do aparelho de Soxhlet,
que foi acoplado a um balão de fundo redondo (500 ml) contendo 150 ml do respectivo
solvente. O sistema foi deixado em uma manta de aquecimento NALGON ® a 100ºC, por 4
horas.
A solução obtida foi então filtrada em papel filtro, e colocada em um balão de fundo
redondo, e levada ao rotavapor FISATOM®com pressão reduzida, à temperatura de 40ºC e
120 rpm. Essa solução foi, em seguida, depositada em um Becker (250 ml), o qual foi selado
com um papel filme perfurado, e conduzido a uma estufa de fluxo de ar a 40°C, onde
permaneceu até a completa secagem do extrato. Após a secagem, o extrato foi armazenado no
freezer à -18°C até a requisição dos bioensaios de susceptibilidade, quando este foi pesado
(0,200g) e solubilizado em 800µl de DMSO, obtendo uma concentração final de 200mg/ml.
4.2.4 Turbólise
Foi adicionado 15 gramas do material vegetal triturado em um copo de liquidificador
(1000 ml) juntamente com 150 ml de solvente etanol. O aparelho de liquidificador foi
submetido a realizar 1000 rpm durante 5 minutos, repetindo o processo por 6 vezes.
A solução obtida foi então filtrada em papel filtro, e colocada em um balão de fundo
redondo, e levada ao rotavapor FISATOM® com pressão reduzida, à temperatura de 40ºC
e120 rpm. Em seguida, essa solução foi depositada em um Becker (250 ml), o qual foi selado
com um papel filme perfurado, e conduzido a uma estufa de fluxo de ar a 40°C, onde
permaneceu até a completa secagem do extrato. Após a secagem, o extrato foi armazenado no
freezer à -18°C até a requisição dos bioensaios de susceptibilidade, quando este foi pesado
(0,200g) e solubilizado em 800µl de DMSO, obtendo uma concentração final de 200mg/ml.
27
4.3 FRACIONAMENTO
O fracionamento do extrato bruto etanólico, obtido por maceração de Piper aduncum,
foi realizado por meio de cromatografia de exclusão em gel no Centro de pesquisas René
Rachou (CPpRR) em colaboração com o professor Dr. Ezequias Pessoa de Siqueira Filho.
Cerca de 10 gramas do extrato bruto foram dissolvidos em 50 ml de etanol. Este
volume foi aplicado em um sistema de cromatografia de permeação em gel e bombeado a uma
vazão de 120 ml por hora. O sistema de cromatografia é constituído por uma série de 3
colunas de gel de sephadex LH-20 com as dimensões: 2 colunas com diâmetro de 56
milíimetros por 480 milíimetros de comprimento e uma coluna de 56 milíimetros de diâmetro
por 250 de comprimento ligadas em série. Foram coletados 120 tubos, sendo cada um
preenchido com 20 ml da amostra. A composição de cada tudo foi analisada por
cromatografia em camada delgada para agrupamento de acordo com o perfil químico, na qual
foi usadas placas de sílica gel Merck HF com fluorescência a 254 nm e eluídas em metanoldiclorometano (5:95) e reveladas com vanilina: ácido sulfúrico.O tempo total da corrida foi de
20 horas.
4.4 TESTES MICROBIOLÓGICOS:
4.4.1 AMOSTRAS BACTERIANAS:
Neste estudo foram utilizadas duas espécies de Streptococcus: S. sanguis (ATCC
10557) e S. mutans. (IM/UFRJ). As amostras se encontravam congeladas em caldo infuso de
cérebro-coração (BHI), contendo 10% de glicerina, em freezer a -80ºC no Laboratório de
Imunologia da UNIVALE. Ambas as linhagens são pertencentes à coleção de cultura do
Laboratório de Microbiologia Oral e Anaeróbios – UFMG.
4.4.2 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA:
A atividade antimicrobiana foi determinada pela Concentração Inibitória Mínima
(CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM), obtidas pelo ensaio de microdiluição em
caldo, de acordo com o protocolo da CLSI (Clinical and Laboratory Standarts
Institute),(1992) e KOO et al., (2000).
28
Inicialmente o inóculo para cada linhagem testada foi ajustado para a turvação de 0,5
na escala de McFarland (~1,5x108 UFC/ml) e posteriormente diluído 1:100. Para cada espécie
bacteriana testada foram feitas diluições seriadas dos extratos em microplaca de 96 poços
estéril. Resumidamente, foram adicionados 100 µl de caldo BHI em cada um dos 96 poços da
placa. Em seguida, os extratos ou frações na concentração inicial de 200 mg/ml foram
diluídos cinco vezes para obterem a concentração de 40 mg/ml e posteriormente foram
adicionados 100 µl em triplicata nos primeiros poços de cada linha, a partir dos quais foram
realizadas diluições seriadas na razão de dois, por meio da transferência de 100 µl da solução
para o poço seguinte. Esse procedimento foi feito até o último poço, quando 100 µl da solução
foram descartados. Por fim, foram adicionados 100 µl da suspensão do inoculo padronizado
(~1,5x106 UFC/ml) aos poços contendo os extratos. Dessa forma, foram obtidas soluções de
extratos e frações nas concentrações finais variando de 10,0 a 0,08 mg/ml. Para cada placa
teste, foram incluídos ainda três controles: um apenas com 200 µl de meio (controle de
esterilidade); outro com 100 µl de meio e 100 µl da suspensão do inóculo (controle de
crescimento); e o último com 100 µl de meio acrescido de DMSO nas mesmas concentrações
daquelas presentes nos extratos e frações, variando de 4 a 0,03% (v/v), mais 100 µl da
suspensão do inóculo (controle do solvente). A microplaca foi incubada anaerobicamente a
37ºC (câmara de anaerobiose, Forma Scientific Anaerobic System, Inc Model 1025),
contendo atmosfera de 80% N2, 10% H2 e 10% CO2, por 24 h. Todos os testes foram
repetidos pelo menos duas vezes, em experimentos independentes. Como controle da
validação do método foi utilizado um antibiótico padrão (Cloranfenicol) e a linhagem de
referência Staphylococcus aureus ATCC 29213 de acordo com a CLSI (2006).
A CIM foi definida como a menor diluição do extrato capaz de produzir inibição
completa do crescimento bacteriano visível. Para a determinação da CBM, uma alíquota de
50µl de todos os poços com concentrações maiores que a CIM foram sub-cultivadas em ágar
BHI com 5% de sangue desfibrinado de carneiro. Essas placas foram incubadas por 24h em
ambiente anaeróbio. A CBM foi definida como a menor concentração capaz de inibir
qualquer crescimento bacteriano (100% de taxa de morte).
4.4.3 ENSAIO DA ADERÊNCIA BACTERIANA À SUPERFÍCIE DE VIDRO SOBRE O S.
MUTANS:
O ensaio para avaliar a inibição da aderência das células bacterianas à superfície de
vidro foi realizado como descrito por LIMSONG e colaboradores (2004). A cultura bacteriana
29
foi crescida por 6 horas em uma estufa a 37°C com 5% de CO 2 em um tubo de ensaio,
inclinado em um ângulo de 30°, contendo 1 ml de caldo BHI com 1% de sacarose, mais
diferentes concentrações do extrato ou frações (variando de 2,5mg/ml a 0,04 mg/ml) . Após
incubação, os tubos foram lavados com salina para a remoção das células não aderidas. Em
seguida as células aderidas foram coradas com cristal violeta e analisada por leitura visual.
4.4.4 EFEITO DO EXTRATO DE PIPER ADUNCUM SOBRE A PRODUÇÃO DE ÁCIDO
POR S. MUTANS:
O efeito do extrato oriundo de Piper aduncum sobre a glicólise foi medido por meio
da queda do pH do meio na presença de uma suspensão celular densa, como descrito por
DUARTE et al., 2006 e PERCIVAL et al., 2006.
Inicialmente uma cultura de S. mutans foi cultivada anaerobicamente em 100 ml de
caldo BHI por 24 horas e após esse período, foi lavada três vezes com solução salina (KCL
50mM e MgCl2 1mM) e centrifugado a 4000 rpm, por 10 minutos (BecKman® GS 6R) para a
obtenção do “pellet”, o qual foi depois suspendido em 5 ml de salina. O pH foi ajustado para
7,2 com solução de KOH a 0,1M. Em seguida, foi adicionado 1 ml desta suspensão bacteriana
em tubos contendo 4 ml de solução salina, mais diferentes concentrações do extrato ou
frações (CIM, 1/2CIM e 1/4CIM), mais 100µl de glicose (5M) em uma concentração final de
100 mM.
O pH foi monitorado durante uma hora, com intervalos de tempo de 15 minutos em
um potenciômetro digital (pH Sensoglass®Sp910T).
4.4.5 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE:
A citotoxicidade dos extratos brutos de Piper aduncum, foi avaliada em linhagens de
células humanas transformadas [HeLa (derivadas de carcinoma de colo de útero) e A431
(derivadas de carcinoma epidermóide)] e em células normais murinas (Fibroblastos
Embrionários Murinos – MEFs), por meio do ensaio de MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2,
5-diphenyltetrazolium
bromide),
segundo
MOSMANN
(1983),
com
modificações.
Brevemente, 100 µl de uma suspensão de células na concentração de 3x104 células/ml, foram
adicionados em cada um dos poços de uma microplaca de 96 poços, sendo a placa incubada
por 12 horas a 37°C em atmosfera de 5% CO2. Após este período, 100 µl do extrato (40
mg/ml) foram adicionados em triplicata nos primeiros poços de cada linha, a partir dos quais
30
foram realizadas diluições seriadas na razão de dois, por meio da transferência de 100 µl da
solução para o poço seguinte.
A microplaca foi novamente incubada por 48 h. Em seguida, adicionou-se 10µl de MTT
por poço (5mg/ml), resultando na concentração final de 0,5 mg/ml. Após 4 horas de
incubação a 37°C em atmosfera de 5% CO2, 100 µl de dimethyl sulfoxide (DMSO) foram
adicionados em cada poço. Foi feita a leitura da absorbância a 540 nm em leitora de
microplaca (Thermoplate Reader®) e a porcentagem de células viáveis foi determinada da
seguinte forma: a absorbância das células tratadas foi dividida pela absorbância das células
não tratadas, e o resultado multiplicado por 100.
4.4.6 DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA DE CRESCIMENTO DE S. MUTANS E S.
SANGUIS:
O experimento foi realizado de acordo com SANTOS et al,2007. Inicialmente um préinóculo em caldo BHI de S. mutans ou S. sanguis, cultivados por 24h, foram diluídos em 200
ml do mesmo meio até a densidade óptica de 0,07 e 0,05 à 550nm (inóculo inicial),
respectivamente. Este foi o ponto zero do experimento. As culturas ajustadas foram, então,
incubadas em câmara anaeróbica, a 37°C e intervalos de 30 minutos, uma alíquota de 1 ml foi
retirada de cada cultura para a leitura da absorbância em espectrofotômetro (FENTO.
4.4.7 DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA DE AÇÃO DOS EXTRATOS E FRAÇÕES MAIS
ATIVOS DE P. ADUNCUM SOBRE O CRESCIMENTO DE S. MUTANS E S. SANGUIS:
O experimento foi realizado de acordo com SANTOS et al., 2007. Inicialmente um
pré-inóculo em caldo BHI de S. sanguis ou S. mutans cultivados por 24h foram diluídos em
200 ml do mesmo meio até a densidade óptica de 0,07 e 0,05 à 550nm (inóculo inicial),
respectivamente. Quando a população bacteriana atingiu o meio da fase logarítmica
(aproximadamente 2h e 30 minutos para S. sanguis e 6h para S. mutans), foram adicionados à
cada cultura, separadamente, o extrato bruto etanólico de Piper aduncum (concentrações
finais de 0,31 mg/ml ou 0,16 mg/ml para S. sanguis e S .mutans, respectivamente) ou as
frações J e L (concentrações finais de 0,62 mg/ml e 0,31 mg/ml, respectivamente). Este foi o
ponto zero do experimento. Um frasco controle sem o extrato e as frações foi mantido ao
longo de todo o experimento. As culturas foram, então, incubadas em câmara anaeróbica, a
37°C e em intervalos de 30 minutos, uma alíquota de 1 ml foi retirada de cada cultura e
31
submetida a diluições decimais seriadas em solução salina. Para a contagem das unidades
formadoras de colônias (UFC), um volume de 50µl de cada diluição, foi inoculado em ágar
BHI com 5% de sangue desfibrinado de carneiro. Após um período de 24 horas de incubação
das placas, em câmara anaeróbica, a 37°C, realizou-se a contagem das colônias.
32
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os dados da tabela 1 mostram a atividade dos extratos etanólicos e hexânicos de Piper
aduncum, obtidos por quatro diferentes métodos de extração (decocção, maceração, turbólise
e soxhlet), contra o Streptococcus mutans e o Streptococcus sanguis. As CIMs dos extratos
etanólicos para S. mutans variaram de 0,16 a 0,62 mg/ml, enquanto as CIMs dos extratos
hexânicos variaram de 0,16 a 0,31 mg/ml. Com relação ao S. sanguis, os extratos etanólicos
apresentaram CIMs entre 0,31 e 2,5 mg/ml, enquanto as CIMs dos extratos hexânicos
variaram de 0,31 a 0,62 mg/ml.
De modo geral, o S. sanguis apresentou-se menos sensível aos extratos de P. aduncum
que o S. mutans e os extratos hexânicos foram mais ativos que os correspondentes etanólicos
obtidos pelos métodos de Decocção e Soxhlet. Considerando todos os extratos avaliados, os
mais ativos foram o etanólico (maceração) e o hexânico (Soxhlet) que apresentaram os
menores valores de CIM tanto para S. mutans (0,16 mg/ml) quanto para S. sanguis (0,31
mg/ml). Por outro lado, o extrato etanólico (decocção) foi o menos ativo em ambas as
espécies (CIM 0,62 mg/ml para S. mutans e 2,5 mg/ml para S. sanguis).
33
Tabela 1: Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) dos
extratos de Piper aduncum contra o crescimento de Streptococcus mutans e Streptococcus sanguis.
S. mutans
Método de Extração
S. sanguis
Solvente
CIM*
CBM*
CIM*
CBM*
etanol
0,62
>2,5
2,5
>5,0
hexano
0,31
>10
0,62
5
etanol
0,16
>10,0
0,31
0,62
hexano
NR
NR
NR
NR
etanol
0,31
>1,25
1,25
>5,0
hexano
NR
NR
NR
NR
etanol
0,31
>0,31
0,62
>0,62
hexano
0,16
>0,31
0,31
>0,62
Decocção
Maceração
Turbólise
Soxhlet
*Valores expressos em mg ml-1
NR: Não realizado.
Da mesma forma que o solvente utilizado na preparação dos extratos influenciou na
atividade dos mesmos (os extratos hexânicos foram invariavelmente mais ativos que os
correspondentes etanólicos), as técnicas empregadas para prepará-los claramente tiveram
também um papel sobre a eficiência dos extratos. Para ilustrar isso, podemos comparar a
atividade dos extratos etanólicos decocção e maceração: o extrato obtido por maceração foi
quatro vezes mais ativo que o decocção sobre o S. mutans (CIM de 0,16 e 0,62 mg/ml,
respectivamente), e oito vezes mais ativo sobre o S. sanguis (CIM de 0,31 e 2,5 mg/ml,
respectivamente). De fato, segundo Victório e colaboradores (2009) parâmetros como tempo,
solvente, temperatura e técnica de extração influenciam a extração de metabólitos
secundários. Por essa razão, diferentes procedimentos têm sido utilizados para a aquisição de
compostos biologicamente ativos a partir de extratos vegetais brutos. O tipo de solvente e o
método de extração são fatores fundamentais a serem considerados para otimizar o
rendimento da extração. Em linha com essa idéia, Paiva e colaboradores (2004) afirmam que
34
diferentes técnicas de extração podem interferir quantitativamente e qualitativamente na
composição do extrato. Esses pesquisadores compararam a eficiência de diferentes técnicas
(maceração, ultrassom e soxhlet) para a extração de plumbagina, uma naftoquinona que
demonstra várias atividades biológicas e que pode ser obtida de raízes de Plumbago scandens
L. Concluíram que a extração por Soxhlet foi à técnica mais eficiente, sendo que sua
eficiência foi atribuída ao emprego de pequeno volume de solvente, o qual é continuamente
renovado em contato com o material da planta, promovendo mais interações entre eles. No
nosso caso, a extração por Soxhlet foi também um das mais eficientes.
A susceptibilidade de uma determinada espécie de microrganismo a produtos vegetais
oriundos de uma mesma espécie de planta podem apresentar resultados muito diferentes
quando avaliada em estudos independentes. Por exemplo, em um estudo que avaliou a
atividade antimicrobiana de 92 plantas medicinais Hondurenhas, o extrato etanólico de P.
aduncum
preparado por percolação mostrou a mais ampla efetividade contra fungos e
bactérias; no entanto, quando avaliado sobre bactérias orais, não foi capaz de inibir o
crescimento do S. mutans, mas inibiu o crescimento do S. sanguis e de outras bactérias (como
F. Nucleatum, P. intermedia e A. Actinomycetemcomitans) (Lentz et al., 1998). Esses dados
são amplamente divergentes dos nossos, pois, independentemente do método de extração
empregado, os extratos etanólicos preparados por nós foram sempre mais ativos sobre o S.
mutans em relação ao S. sanguis. Desse modo, fica claro que análise de atividade de materiais
de origem vegetal está sujeita a discrepâncias, as quais podem ser atribuídas a vários fatores,
incluindo diferenças na parte da planta utilizada, os solventes e métodos de extração, o
período em que as amostras vegetais foram coletadas, a localização geográfica das plantas e o
método utilizado para realizar o bioensaio (RUNYORO et al., 2006). Esse último fator é
particularmente interessante de ser considerado, pois a avaliação da atividade antimicrobiana
do extrato de Piper aduncum feita por Lentz e colaboradores (1998) foi conduzida pelo
método de disco-difusão. Segundo Cos e colaboradores (2006), há vários métodos disponíveis
para detectar atividade antimicrobiana, mas, visto que eles não são igualmente sensíveis ou
baseados no mesmo princípio, os resultados serão profundamente influenciados pelo método
escolhido. Sobre o método de disco-difusão, esses autores acrescentam que o método não é
apropriado para testar amostras não-polares ou amostras que não se difundem facilmente no
ágar. Em geral, a potência antimicrobiana relativa de diferentes amostras não pode sempre ser
comparada, principalmente por causa de diferenças nas propriedades físicas, tais como
solubilidade, volatilidade e características de difusão no ágar.
35
Vale a pena ressaltar que nos testes para determinar a sensibilidade das bactérias aos
extratos vegetais incluímos, como controle de qualidade do método, o teste do antimicrobiano
cloranfenicol e a linhagem de referência, Staphylococcus aureus (ATCC 29213). A CIM
encontrada (8 µg/ml) está dentro dos limites aceitáveis para esta combinação de
antimicrobiano.
Não há entendimento sobre o nível de inibição antimicrobiana aceitável para
considerar um material vegetal promissor. No entanto, critérios rigorosos para estabelecer o
ponto de corte devem ser adotados a fim de minimizar os resultados falso-positivos. De
acordo com Cos e colaboradores (2006), em modelos in vitro de avaliação de atividade antiinfectiva, a atividade de extratos ou compostos é geralmente expressa por valores numéricos
(IC50, IC90, CIM, etc), mas a interpretação correta destas variáveis de eficácia não é nada
fácil porque é necessário um profundo conhecimento do modelo e do protocolo utilizado. De
qualquer maneira, certamente uma atividade relevante e seletiva relaciona-se a valores de
IC50 inferiores a 100 µg/ml para extratos brutos e abaixo de 25 µM para compostos puros.
Para resultados baseados em valores de CIM, o critério proposto por Aligiannis et al. (2001)
para classificar potência de extratos vegetais tem sido adotado por outros pesquisadores
(Duarte et al., 2005; Essop et al., 2008) e consiste nos seguintes parâmetros: inibidor forte CIM até 0,5 mg/ml; inibidor moderado - CIM entre 0,6 e 1,5 mg/ml; inibidor fraco - CIM
acima de 1,6 mg/ml. Nesse trabalho, adotaremos também esse critério para análise dos dados.
Considerando esses critérios, todos os extratos de Piper aduncum testados, com exceção do
etanólico (decocção), apresentam forte atividade antibacteriana contra o S. mutans.
Nesse ponto do trabalho, precisávamos selecionar o extrato com melhor atividade
antibacteriana a fim de fracioná-lo e determinar seu efeito sobre o metabolismo do S. mutans.
O extrato escolhido foi o etanólico obtido por maceração (4,5 gramas de rendimento) por ter
apresentado os menores valores de CIM, tanto para S. mutans quanto para S. sanguis, e
melhor rendimento que o extrato hexânico preparado em aparelho Soxhlet (2,5 gramas de
rendimento). O extrato escolhido será mencionado ao longo deste texto como extrato EMP.
A partir do extrato bruto de EMP, foram obtidas 17 frações, sete destas em quantidade
suficiente para realização dos testes microbiológicos (G, I, J, L, M, N e Q) (Figura 1).
36
Figura 1: Perfil químico das frações do extrato EMP.
Apenas as frações J e L preservaram a forte atividade antibacteriana contra o S. mutans
detectada no extrato EMP, sendo que a atividade da fração J foi, inclusive, superior àquela
apresentada pelo extrato EMP. Outra característica muito interessante dessa fração foi que ela
apresentou certa seletividade para o S. mutans em relação ao S. sanguis: ela foi fortemente
ativa sobre o primeiro e moderadamente ativa sobre o segundo.
37
Tabela 2: Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida
mínima (CBM) das frações do extrato EMP de Piper aduncum contra
Streptococcus mutans e Streptococcus sanguis.
Frações
S. mutans
CIM
*
CBM
S. sanguis
*
CIM*
CBM*
G
>10,0
NR
>10,0
NR
I
1,25
>10,0
1,25
>10,0
J
<0,08
>10,0
0,62
>10,0
L
0,31
>2,5
0,31
0,62
M
5,0
>10,0
1,25
>10,0
N
>10,0
NR
>10,0
NR
Q
>10,0
NR
>10,0
NR
*Valores expressos em mg ml-1
NR: Não realizado.
É amplamente conhecido que a acidogenicidade do S. mutans, juntamente com sua
habilidade de sintetizar glicanas extracelulares são os principais fatores para o
desenvolvimento e estabelecimento de um biofilme cariogênico. Dessa forma, analisamos
também a interferência do extrato EMP e de suas frações sobre a produção de ácido e
aderência do S. mutans.
A menor concentração do extrato bruto EMP que inibiu a aderência do S. mutans
sobre a superfície do tubo de vidro foi aquela correspondente à CIM, ou seja, a concentração
de 0,16 mg/ml (figura 2a). Essa foi também a menor concentração da fração L com atividade
antiaderente (figura 2b). Mais uma vez, a atividade da fração J foi superior à do extrato EMP,
pois sua menor concentração que inibiu a aderência do S. mutans foi 0,08 mg/ml (figura 2c).
Interessantemente, a fração I que apresentou fraca atividade antibacteriana foi capaz de inibir
a aderência do S. mutans a partir da concentração de 0,04 mg/ml.
38
(a)
-
+
1
(b)
2
3
4
5
+
1
(c)
-
+
1
2
3
4
5
-
2
3
4
5
Figura 2: Ensaio de aderência celular ao tubo de vidro. Streptococcus mutans foi incubado por 6 horas em meio
com 1% de sacarose mais, extrato EMP (a) ou suas frações: fração L (b) e fração J (c), em diferentes
concentrações (0,62 – 0,04 mg/ml), As células aderidas ao tubo ao final do processo foram visualizadas por meio
de coloração com solução de cristal violeta a 1%. (-) Controle negativo: bactérias mantidas sem sacarose; (+)
Controle positivo: bactérias mantidas com 1% de sacarose; (1-5) bactérias mantidas com sacarose mais o extrato
EMP ou suas frações a (1) 0,62 mg/ml, (2) 0,31 mg/ml, (3) 0,16 mg/ml, (4) 0,08 mg/ml e (5) 0,04 mg/ml.
Segundo KIM e colaboradores (2008), o metabolismo anticárie de agentes
antimicrobianos naturais pode ser classificado em dois mecanismos: Primeiro, quando destrói
a integridade da parede celular, e segundo quando inibe a aderência bacteriana, ao invés de
matar a bactéria. Portanto nossos resultados nos parecem promissores, visto que o extrato
EMP é capaz de inibir a aderência in vitro do S. mutans em concentrações a partir de 0,16
mg/ml. Além disso, suas frações mantiveram a atividade do extrato EMP (fração L) ou
apresentaram atividade superior (frações I e J). Apesar da aderência bacteriana à superfície do
vidro ser uma metodologia simples e antiga, ela ainda é muito utiliza em estudos recentes,
pois essa aderência é mediada por glicanas e dependente da sacarose, à semelhança da
situação que ocorre in vivo (LIMSONG, 2004). Esse é um ponto interessante a se considerar,
pois o estabelecimento do S. mutans na superfície do dente torna-se irreversível após a
39
síntese, a partir da sacarose, de glicanas insolúveis em água pela ação enzimática da
glicosiltransferase (GTase) e subseqüente agregação célula à célula (NOSTRO et al., 2004).
A atividade antiaderente que observamos no extrato EMP e em suas frações foi
superior àquela verificada em outros produtos naturais. Por exemplo, uma investigação
demonstrou que quatro espécies de plantas (Andrographis paniculata, Cassia alata, Chinese
black tea e Harrisonia perforata) foram capazes de inibir a aderência do S. mutans à parede
do tubo de vidro, porém tal atividade foi constatada apenas em concentrações dos extratos a
partir de 5,0 mg/ml (LIMSONG, 2004).
Em trabalhos anteriores, a capacidade de extratos vegetais de impedir a adesão de S.
mutans tem sido relacionada à presença de flavonóides (NOSTRO et al., 2004). De fato, os
flavonóides são conhecidos por terem atividade antiGTase (IiO et al.,1984) e, posteriormente,
foi mostrado que flavonóis e flavonas são capazes de inibir a atividade GTase tanto em
solução quanto na superfície de grânulos de hidroxiapatita (KOO et al., 2002).
Com relação à interferência do extrato sobre o processo de acidogênese desencadeado
pelo S. mutans, os dados encontrados sugerem uma menor produção de ácido por este
microrganismo quando na presença do extrato bruto de EMP na concentração equivalente à
CIM. O S. mutans rapidamente foi capaz de transformar a glicose em ácido, de modo que o
pH do meio reduziu de 7.2 para 4.87±0,09 após 5 minutos. Com o decorrer do tempo
observou-se um decréscimo gradativo do pH, o qual alcançou o menor valor após 60 minutos
(4.17±0,15). Contudo, a adição do EMP correspondente à CIM (0,16 mg/ml) foi capaz de
reduzir parcialmente a queda do pH terminal. No tempo de 5 minutos, na presença do EMP, o
valor de pH foi 5.25±0, já em 60 minutos o pH final foi 4.62±0,05 (Figura 3a). Na fração J
observa-se que após 60 minutos o S.mutans reduziu o pH do meio de 7,2 para 3,96±0,14,
enquanto que no controle a queda do pH neste mesmo intervalo de tempo foi de 3,67 ±0,25
(Figura 3b). Os resultados da fração L nos mostram um perfil semelhante ao da fração J, onde
após 60 minutos o pH final foi de 3,91±0,01 e no controle o pH final alcançou 3,76± 0.06
(Figura 3c). Portanto, as frações J e L do extrato EMP apresentam uma atividade que permite
a diminuição da produção de ácido pelo S.mutans , assim como no extrato bruto. No entanto,
nesse caso o efeito das frações foi menos acentuado que o efeito do extrato EMP. Entre as
frações, a fração J foi mais ativa que a L.
O efeito do extrato bruto e de sua fração J em relação à inibição da atividade
glicolítica do S. mutans foi superior ao observado por PERCIVAL e colaboradores (2006)
uma preparação de polifenóis naturais extraídos do cacau, que foram capazes de inibir a queda
do pH de 4,5 ± 0,08 (pH do controle) para 4,67±0,09) no tempo de 20 minutos.
40
(a)
(b)
(c)
Figura 3: Influência de diferentes concentrações do extrato bruto e frações de EMP sobre a atividade glicolítica
do S. mutans medida pela queda do pH em função do tempo.(a) extrato bruto; (b) fração J; (c) fração L.
A cárie é o resultado da desmineralização do esmalte através da produção de ácido por
produtos fermentados pelas bactérias da placa (PERCIVAL et al.,2006), então agentes
anticáries que tenham efeitos reduzindo a produção de ácido pelas bactérias cariogênicas,
seriam favoráveis para diminuir a ação destas bactérias sobre o biofilme dental, o que nos
parece acontecer na CIM do extrato EMP e suas frações sobre o S. mutans.
Muitos estudos têm demonstrado a efetividade de extratos naturais ou compostos
derivados dos mesmos na prevenção da cárie. O chá verde, por exemplo, é conhecido por suas
propriedades anticariogênicas e seu componente principal é a catequina. Foi relatado que uma
solução de enxágüe bucal contendo 2 mg/ml de epigalocatequina galato pode inibir a
acidogênese de placa dental (MAEYAMA et al., 2005).
Para analisarmos a cinética de ação do extrato EMP sobre as duas espécies de
Streptococcus, inicialmente foram feitas as curvas de crescimento dos respectivos
microrganismos, como ilustrado na figura 4. Com este ensaio definiu-se o tempo de início do
41
experimento de curva de morte: final da fase logarítmica de crescimento, que para S. sanguis
foi 150 minutos e para S. mutans 360 minutos.
2,0
1,8
1,6
Abs (550nm)
1,4
1,2
1,0
S. mutans
S. sanguis
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
240
300
360
420
480
Tempo (minutos)
Figura 4: Curvas de crescimento de S. sanguis e S. mutans em caldo BHI, à 37oC, em anaerobiose.
A cinética de ação do extrato EMP (na concentração equivalente à CIM) sobre S.
sanguis mostrou que ao final de 150 minutos houve diferença de menos de 1 log na contagem
de UFC/mL em relação ao controle (figura 5a). As frações J e L, obtidas à partir do extrato
EMP, apresentaram perfis de atividade similares àquele observado para o extrato bruto (figura
5b e 5c, respectivamente). Boswell e colaboradores (1997) definiram a atividade bactericida
na cinética de tempo de morte como um decréscimo de 3 log 10 na contagem de UFC/ml, e a
atividade bacteriostática como um decréscimo inferior a 2 log 10 na contagem de UFC/ml.
Credito e colaboradores (1999) e Spangler e colaboradores (1997) definiram a atividade
bacteriostática como uma mudança na concentração bacteriana, avaliada pela contagem de
UFC/ml, correspondente a uma queda de zero a < 3 log 10 e a atividade bactericida como uma
mudança correspondente a uma queda de mais de 3 log 10 na contagem de UFC/ml, em
comparação à contagem de células viáveis no tempo zero. Assim, com base nos dados
obtidos, supõe-se que o extrato EMP, assim como suas frações J e L, apresentem atividade
bacteriostática contra S. sanguis na concentração equivalente à CIM, o que corrobora os dados
apresentados na tabela 1.
42
(a)
(b)
10
Log10 UFC mL
-1
8
6
4
Controle
CIM
2
0
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Tempo (minutos)
(c)
10
9
8
Log10 UFC ml
-1
7
6
5
Controle
CIM
4
3
2
1
0
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Tempo (minutos)
Figura 5: Atividade do extrato EMP e suas frações sobre o crescimento de S. sanguis. (a) extrato bruto; (b)
fração J; (c) fração L.
Os dados da cinética de ação do extrato EMP (figura 6a) e de sua fração L (figura 6b),
na concentração equivalente à CIM, sobre S. mutans mostram que, ao final de 150 minutos de
exposição da bactéria ao extrato e sua fração, detectou-se uma queda de, aproximadamente, 2
log10 na contagem de UFC/mL em relação ao controle, o que indica atividade bacteriostática
(Boswell et al.,1997; Credito et al., 1999; Spangler et al.,1997). No ensaio de determinação
da atividade antimicrobiana por microdiluição em placa (tabela 1) o valor da CBM do extrato
EMP foi maior do que o valor da CIM, o que contradiz os dados da curva de morte que foi
realizada na concentração de 0,16 mg/ml (CIM). Uma explicação para este achado poderia
estar relacionada à estabilidade do extrato bruto, que não foi avaliada neste estudo. O tempo é
fator sabidamente importante para a atividade de alguns compostos antimicrobianos
(LEVISON, 2000; MATTOES et al., 2004; RYBAK, 2006). Como o experimento de curva de
43
morte foi realizado em 2 horas e 30 minutos e a leitura da placa de microdiluição foi feita com
24h, supõe-se que neste último o tempo tenha sido suficiente para a diminuição da atividade
do extrato.
(b)
10
9
9
Controle
CIM
8
7
6
-1
10
Log10 UFC ml
Log10 UFC mL
-1
(a)
8
Controle
CIM
7
6
5
5
-20
0
20
40
60
80
100
Tempo (minutos)
120
140
160
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Tempo (minutos)
Figura 6: Atividade do extrato EMP (a) e sua fração L (b) sobre o crescimento de S. mutans.
Segundo Cos e colaboradores (2006), em relação às análises de atividade anti-infectiva
de produtos naturais, um dos principais problemas é a falta de discriminação da toxicidade
celular específica, o que contribui para aumentar a incidência de resultados falso-positivos, ou
seja, extratos equivocadamente classificados como promissores. Ainda de acordo com esses
autores, tal problema pode ser facilmente resolvido pela inclusão de uma avaliação paralela da
atividade do material vegetal sobre linhagens de células hospedeiras (avaliação da
citotoxicidade). Portanto, eles concluem que a citotoxicidade sobre células hospedeiras é um
critério muito importante para determinar a seletividade da atividade farmacológica observada
e deve sempre ser incluída em paralelo. Considerando essa questão, avaliamos a
citotoxicidade de extratos hexânicos e etanólicos de Piper aduncum, obtidos por diferentes
métodos de extração (maceração, turbólise, decocção e soxhlet), em células tumorais humanas
HeLa (adenocarcinoma epitelial cervical) e A431 (carcinoma epidermóide de pele), e também
em células normais murinas (Fibroblastos Embrionários Murinos– MEFs) (Tabela 2). A
avaliação foi feita por meio do ensaio de redução do metil-tiazolil-tetrazólio (MTT). Os
compostos antitumorais doxorrubicina e elipticina foram utilizados como controle positivo.
De maneira geral, as células A431 apresentaram os maiores valores de IC50 e o extrato
hexânico obtido por Soxhlet foi o mais citotóxico para todas as linhagens celulares testadas.
44
Na maioria das vezes, os extratos hexânicos foram mais citotóxicos que os correspondentes
extratos etanólicos.
Parâmetros de referência para citotoxicidade de extratos vegetais têm sido propostos
por vários autores. O critério estabelecido pelo American National Cancer Institute tem sido
adotado por alguns autores (DE MESQUITA et al., 2009), e considera um extrato bruto
citotóxico quando seu valor de IC50 é menor que 30 µg/ml. Já Dua e colaboradores (2004),
referindo-se aos critérios da WHO (World Health Organization), classificaram extratos
vegetais como não citotóxicos quando seus valores de IC50 são maiores ou iguais a 16 µg/ml.
Dessa forma, considerando quaisquer desses critérios, os diferentes extratos de Piper
aduncum podem ser classificados como não citotóxicos, independentemente da linhagem
celular empregada nos ensaios.
Tabela 3: Citotoxicidade in vitro de extratos de Piper aduncum em células tumorais humanas (HeLa e A431)
e em células normais murinas (MEFs)
Célula
Extrato etanólico
Decocção
HeLa
A431
MEFs
Soxhlet
IC50 (ug/ml) ±D.P.*
Extrato hexânico
Soxhlet
Elipa
Doxob
Turbolize
Maceração
Maceração
Decocção
90,5±1,2
78,8±0,7
79,5±2,4
84,6±1,6
33,9±7,2
45,7±1,2
46,9±8,1
0,39±0,04
0,33±0,02
133,4±7,3
251,2±15,2
256,3±20,6
181,7±12,3
116,7±6,5
166,0±5,2
159,7±8,7
0,55±0,07
NR
0,49±0,1
0,21±0,08
43,9±3,2
57,8±8,2
47,0±2,7
53,2±10,2
42,9±3,5
52,7±0,3
52,0±5,5
*Os resultados representam a média e o desvio padrão (DP) de três experimentos independentes.
NR: Não realizado
Elipticina e Doxorubicina são compostos de referência utilizados como controle positivo
45
6. CONCLUSÕES
 O extrato etanólico produzido pela técnica de maceração foi a melhor combinação
solvente/método de extração para obtenção de extratos de folhas de Piper aduncum
com forte atividade antibacteriana contra S. mutans e S. sanguis.
 O S. mutans apresentou-se mais sensível aos extratos brutos de P. aduncum do que o
S. sanguis.
 As frações J e L do extrato bruto de P. aduncum apresentaram maiores atividades
contra e S. mutans.
 Tanto o extrato bruto de P. aduncum quanto suas frações J e L foram capazes de
diminuir a produção de ácido e a aderência de S. mutans à superfície de vidro.
 O extrato bruto de P. aduncum e a fração J mostraram atividade bacteriostática contra
S. sanguis na cinética de ação dos compostos.
 A fração L do extrato bruto de P. aduncum mostrou atividade bactericida contra S.
sanguis na cinética de ação dos compostos.
 O extrato bruto de P. aduncum mostrou atividade bacteriostática contra S. mutans na
cinética de ação do composto.
 Os extratos de P. aduncum não são citotóxicos para linhagens de células de
mamíferos.
6.1. Conclusão Final
Os resultados obtidos no presente estudo claramente mostram que extratos de
folhas de Piper aduncum inibem o Streptococcus mutans e afetam duas de suas mais
importantes propriedades cariogênicas: a aderência dependente de sacarose e a
acidogênese. Além disso, essa atividade é seletiva, pois os extratos
não
foram
citotóxicos para linhagens de células de mamíferos e foram menos ativos sobre o
Streptococcus sanguis. Em conjunto, os resultados levantam a possibilidade de
utilização de extratos de Piper aduncum na prevenção da cárie dental. Entretanto, são
necessários testes adicionais, incluindo modelos experimentais in vivo e aplicabilidade
farmacológica, antes de se considerar o extrato de Piper aduncum realmente promissor.
46
REFERÊNCIAS
AJDIC, D; MCSHAN, W.M; MCLAUGHLIN, R.E; SAVIC, G; CHANG, J; CARSON, M.B;
PRIMEAUX, C; TIAN, R; KENTON, S; JIA, H; LIN, S; JDICQIAN, Y; LI, S; ZHU, H;
NAJAR, F; LAI, H;
WHITE, J; ROE, B.A;
FERRETTI, J.J. Genome sequence of
Streptococcus mutans UA159, a cariogenic dental pathogen. PNAS, v.99, n.22, p.14439.
2002.
ALALUUSUA, S; GRONROOS, L; ZHU, X; SAARELA, M; MATTO , J; ASIKAINEM, S;
FUKUSHIMA, K. Production of glucosyltransferases by clinical mutans streptococcal
isolates as determined by semiquantitative cross-dot assay. Archives of Oral Biology, v.42,
p.417–422. 1997.
ALIGIANNIS, N; KALPOTZAKIS, E; MITAKU, S; CHINOU, I.B. Composition and
antimicrobial activity of the essential oils of two Origanum species. Journal of Agricultural
and Food Chemistry, v.40, p. 4168–4170. 2001.
AZEVEDO, S. K. S; SILVA, I. M. Plantas medicinais e de uso religioso comercializadas em
mercados e feiras livres no Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Acta bot. bras, v.20 n.1, p.185-194.
2006.
BOWEN, W.H. Do we need to be concerned about dental caries in the coming millennium?
Crit Rev Oral Biol Med, v.13, n.2, p.126-131. 2002.
BOSWELL, F. J; ANDREWS, J. M; WISE, R. Pharmacodynamic properties of BAY 12-8039 on
gram-positive and gram-negative organisms as demonstrated by studies of time-kill kinetics
and postantibiotic effect. Antimicrob. Agents Chemother, v. 41, p.1377-1379. 1997.
CAUFIELD, P.W; CUTTER, G.R; DASANAYAKE, A.P. Initial acquisition of mutans
streptococci by infants: evidence for a discrete window of infectivity. Journal of Dental
Research, v.72, n.1, p.37-45. 1993.
CAUFIELD, P.W; DASANAYAKE, A.P; LI, Y; PAN, Y; HSU, J; HARDIN, JM. Natural history
of Streptococcus sanguinis in the oral cavity of infants: evidence for a discrete window of
infectivity. Infect Immun, v.68, n.7, p. 4018-4023. 2000.
CREDITO, K. L; EDNIE, L. M; JACOBS, M. R; APPELBAUM, P. C. Activity of telithromycin
(HMR 3647) against anaerobic bacteria compared to those of eight other agents by time-kill
methodology. Antimicrob. Agents Chemother, v.43, p. 2027-2031. 1999.
47
CLINICAL AND LABORATORY STANDARTS INSTITUTE, 1992. Methods for determining
bactericidal activity of antimicrobial agents. Tentative standard M26-T. Clinical and
Labotarory Standards Institute, Wayne, PA.
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE. 2006. Performance standards
for antimicrobial susceptibility testing; 16th informational supplement. M100-S16.
Clinical and Laboratory Standarts Institute, Wayne, PA.
COS, P.; VLIETINCK, A.J.; BERGHE, D.V.; MAES, L. Anti-infective potential of natural
products:
how
to
develop
a
stronger
in
vitro
'proof-of-concept'.
Journal
of
Ethnopharmacology, v. 106, n.3, p. 290-302. 2006.
DE LORENZO, J. L. Microbiologia para o Estudante de Odontologia. São Paulo. Ed Atheneu,
2004.
DE MESQUITA, M; DE PAULA, J.E; PESSOA, C; DE MORAES,O.M; VERAS COSTALOTUFO, L; GROUGNET, R; MICHEL, S; TILLEQUIN, F; SALMEN ESPINDOLA, L.
Cytotoxic activity of Brazilian Cerrado plants used in traditional medicine against cancer cell
lines. Journal of Ethnopharmacology, v. 123, n.3, p. 439-445. 2009.
DE SOUZA, G.C; HAAS, A.S; VON POSER, G.L; SCHAPOVAL, E.S; ELISABETSKY, E.
Ethnopharmacological studies of antimicrobial remedies in the south of Brazil. Journal of
Ethnopharmacology, v. 90, n. 1, p. 135-143. 2004.
DI STASI, L. C. Plantas Medicinais: arte e ciência – Um guia de estudo interdisciplinar. São
Paulo: Unesp. p.230, 1996.
DUARTE, M.C.; FIGUEIRA, G.M.; SARTORATTO, A.; REHDER, V.L.; DELARMELINA, C.
Anti-Candida activity of Brazilian medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology, v.97, p.
305–311. 2005.
DUARTE, S; GREGOIRE, S; SINGH, A.P; VORSA, N; SCHAICH, K; BOWEN, W.H; KOO, H.
Inhibitory effects of cranberry polyphenols on formation and acidogenicity of Streptococcus
mutans biofilms. FEMS Microbiol Lett, v. 257, p. 50–56. 2006.
DZINK, J.L ; SOCRANSKY, S.S. Comparative In Vitro Activity of Sanguinarine Against Oral
Microbial Isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.27, n.4, p. 663-665. 1985.
ELISABETSKY, E. Pesquisa em plantas medicinais. Ciência e Cultura. 39(8):697 – 702, 1987.
ESSOP, A.B.; VAN ZYL, R.L; VAN VUUREN, S.F.; MULHOLLAND, D.; VILJOEN, A.M.
The in vitro pharmacological activities of 12 South African Hermannia species. Journal of
Ethnopharmacology, v. 119, p. 615–619. 2008.
48
HEMAISWARYA, S; KRUTHIVENTI, A. K; DOBLE, M. Synergism between natural products
and antibiotics against infectious diseases. Phytomedicine, v.15, n.8, p. 639–652. 2008.
HOLBROOK W.P. Dental caries and cariogenic factors in pre-school urban Icelandic children.
Caries Research, v.27, n.5, p. 431-437.1993.
HWANG, B.Y; ROBERTS, S.K; CHADWICK, L.R; WU, C.D; KINGHORN, A.D.
Antimicrobial constituents from goldenseal (the Rhizomes of Hydrastis canadensis) against
selected oral pathogens. Planta Med, v. 69, n. 7, p. 623–627. 2003.
IAUAK, L; LO BUE, A.M; MILAZZO, I; RAPISARDA, A; BLANDINO, G. Antibacterial
activity of medicinal plant extracts against periodontopathic bacteria. Phytother Res, v. 17, n.
6, p. 599-604. 2003.
Iio, M.; UYEDA, M.; IWANANI, T.; NAKAGAWA, Y. Flavonoids as a possible preventive of
dental caries. Agricultural and Biological Chemistry, v. 48, p. 2143–2145. 1984.
KATSURA, H; ICHITSUKIYAMA, R; SUZUKI, A; KOBAYASHI, M. In Vitro Antimicrobial
Activicties of Bakuchiol against oral microorganisms. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, v. 45, n. 11, p. 3009-3013. 2001.
KIM, J-E; KIM, H-E, HWANG, J-K; LEE, H-J; KWON, H-K; KIM, B-II. Antibacterial
characteristics of Curcuma xanthorrhiza extract on Streptococcus mutans biofilm. Journal of
Microbiology, v. 46, n. 2, p. 228-232. 2008.
KLOUCEK, P; POLESNY, Z; SVOBODOVA, B; VLKOVA, E; KOKOSKA, L. Antibacterial
screening of some Peruvian medicinal plants used in Calleria District. Journal
Ethnopharmacol, v. 99, n. 2, p. 309-312. 2005.
KOO. H; GOMES. B.P.F.A; ROSALEN. P.L; AMBROSANO, G.M.B; PARK, Y.K; CURY, J.A.
In vitro antimicrobial activity of propolis and Arnica montana against oral pathogens.
Archives of Oral Biology, v. 45, p. 141–148. 2000.
KOO, H; PEARSON, S.K; SCOTT-ANNE, K; ABRANCHES, J; CURY, J.A; ROSALEN, P.L;
PARK, Y.K; MARQUIS, R.E; BOWEN, W.H. Effects of apigenin and tt-farnesol on
glucosyltransferase activity, biofilm viability and caries development in rats. Oral
Microbiology and Immunology, v. 17, p. 337–343. 2002.
KRETH, J; MERRITT, J; SHI, W; QI, F. Competition and coexistence between Streptococcus
mutans and Streptococcus sanguinis in the Dental Biofilm. Journal of Bacteriology, v. 187,
n. 21, p. 7193-7203. 2005.
LANDUCCI, L. F; OLIVEIRA, L. D; BRANDÃO, E. H. S; KOGA-ITO, C. Y; JARDIM
JÚNIOR, E.G; JORGE, A. O. C. Efeitos de Coffea arabica sobre a aderência de Streptococcus
mutans à superfície de vidro. Cienc Odontol Bras, v. 6, n. 3, p. 58-64. 2003.
49
LEME, A.F.P; KOO, H; BELLATO, C.M; BEDI, G; CURY, JA. The role of sucrose in cariogenic
dental biofilm formation-nem insight. Nih Public Access, v. 85, n. 10, p. 878-887. 2008.
LENTZ, D.L; CLARK, A.M; HUFFORD, C.D; MEURER-GRIMES, B; PASSREITER, C.M;
CORDERO, J; IBRAHIMI, O; OKUNADE, A.L. Antimicrobial properties of Honduran
medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology, v. 63, p. 253-263. 1998.
LEWIS, H; ELVIN-LEWIS, M. P. F. In: Medical Botany-Plants Affecting Man´s Health. Nova
York: Wiley e Sons, 1997.
LEVISON, M.E. Pharmacodynamics of antibacterial drugs. Infect Dis Clin North Am, v.14, n. 2,
p. 281-91. Jun. 2000.
LI,
XC;
CAI,
L;
WU,
C.D.
Antimicrobial
compounds
from
Ceanothus americanus against oral pathogens. Phytochemistry, v.46, n. 1, p. 97-102.
1997.
LIMSONG, J; BENJAVONGKULCHAI, E; KUVATANASUCHATI, J. Inhibitory effect of some
herbal extracts on adherence of Streptococcus mutans. Journal of Ethnopharmacology, v. 92,
p. 281–89. 2004.
LOCHER, C.P; BURCH, M.T; MOWER, H.F; BERESTECKY, J; DAVIS, H; VAN POEL, B;
LASURE, A; VANDEN BERGHE, D.A; VLIETINCK, A.J. Anti-microbial activity and anticomplement activity of extracts obtained from selected Hawaiian medicinal plants. Journal of
Ethnopharmacol, v. 49, n. 1, p. 23-32. 1995.
LOESCHE, W. J. Role of Streptococcus mutans in human dental decay. Microbiol Rev, v.50, n. 4,
p. 353-80. 1986.
LOHEZIC-LE, DEVEHAT. F; BAKHTIAR, A; BEZIVIN, C; AMOROS, M; BOUSTIE, J.
Antiviral and cytotoxic activities of some Indonesian plants. Fitoterapia, v. 73, n. 5, p. 400405. 2002.
LOPEZ, A; HUDSON, JB; TOWERS, GH. Antiviral and antimicrobial activities of Colombian
medicinal plants. Journal of Ethnopharmacol, v. 77, n. 2-3, p. 189-96. 2001.
LORENZI, H; MATOS, F. J. A. Plantas Medicinais no Brasil: nativas e exóticas. Nova Odessa,
SP: Instituto Plantarum, p. 378, 2002.
LORENZI, H; MATOS, F.J.A. Plantas Medicinais no Brasil: nativas e exóticas. Nova
Odessa,SP: Instituto Plantarum.p.419, 2008.
MARSH, P.D. Microbiological aspects of the chemical control of plaque and gingivitis. Journal
of Dental Research, v. 71, n. 7, p. 1431-1438. 1992.
MARSH,. PD. Microbial ecology of dental plaque and its significance in health and disease. Adv
Dent Res, v. 8, n. 2, p. 263-271. 1994.
50
MARSH, P.D. Are dental diseases examples of ecological catastrophes?. Microbiology, v. 149, n.
2, p. 279-294. 2003.
MARSH, P.D. Dental Plaque as a Microbial biofilm.Caries Research, v. 38, p. 204-11. 2004.
MARSH, P.D. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-implications for health and
disease. BMC Oral Health, v. 6, n. 1, p. 14. 2006.
MARTINS, E.R; CASTRO D.M; CASTELLANI, D.C; DIAS, J.E. Plantas Medicinais. Viçosa,
MG: UFV, 220p, 1994.
MATTOES, H.M; KUTI, J.L; DRUSANO, G.L; NICOLAU, D.P. Optimizing antimicrobial
pharmacodynamics: dosage strategies for meropenem. Clin Ther. Aug, v.26, n. 8, p. 1187-98.
2004.
MEDEIROS, M.F.T; FONSECA, V. S; ANDREATA, R. H. P. Plantas medicinais e seus usos
pelos sitiantes da Reserva Rio das Pedras, Mangaratiba, RJ, Brasil. Acta bot. bras, v. 18, n. 2,
p. 391-399. 2004.
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to
proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunol Methods, v. 65, n. 1-2, p. 55-63.
1983.
NETO, G. G; MORAIS, R. G. Recursos medicinais de espécies do cerrado de Mato Grosso: Um
estudo bibliográfico. Acta bot. Bras, v.17, n. 4, p. 561-584. 2003.
NOSTRO, A; GERMANO, M.P; D'ANGELO, V; MARINO, A; CANNATELLI, M.A. Extraction
methods and bioautography for evaluation of medicinal plant antimicrobial activity. Letters in
Applied Microbiology, v. 30, n. 5, p. 379-384. 2000.
NOSTRO, A.; CANNATELLI, M.A.; CRISAFI, G.; MUSOLINO, A.D.; PROCOPIO, F.;
ALONZO, V. Modifications of hydrophobicity, in vitro adherence and cellular aggregation of
Streptococcus mutans by Helichrysum italicum extract. Letters in Applied Microbiology, v.
38, p. 423–427. 2004.
PAIVA, S.R.; LIMA, L.A.; FIGUEIREDO, M.R.; KAPLAN, M. Plumbagin quantification in
roots of Plumbago scandens L. obtained by different extraction techniques. Anais da
Academia Brasileira de Ciências, v. 76, n. 3, p. 499-504. 2004.
PAUL, COS; ARNOLD, J. VLIETINCK, DIRK VANDEN BERGHE; LOUIS MAES. Antiinfective potential of natural products: How to develop a stronger in vitro „proof-of-concept‟.
Journal of Ethnopharmacology , v.106, p. 290–302. 2006.
PERCIVAL, R.S; DEVINE, D.A; DUGGAL, M.S; CHARTRON, S; MARSH, P.D. The The
effect of cocoa polyphenols on the growth, metabolism, and biofilm formation by
51
Streptococcus mutans and Streptococcus sanguinis. European Journal of Oral Sciences, v.
114, p. 343–348. 2006.
PETERSEN, P.E; BOURGEOIS, D; OGAWA, H; ESTUPINAN-DAY, S; NDIAYE, C. The
global burden of oral disease and risks to oral health. Bulletin of the World Health
Organization, v. 83, n. 9, p. 661-669. 2005.
PETERSEN, P.E. The World Oral Health Report. Geneva, Switzerland: World Health
Organization; 2003.
PHONGPAICHIT, S; NIKOM, J; RUNGJINDAMAI, N; SAKAYAROJ, J; HUTADILOKTOWATANA, N; RUKACHAISIRILUL, V; KIRTIKARA, K. Biological activities of
extracts from endophytic fungi isolated from Garcinia plants. FEMS Immunol Med
Microbiol, v. 51, p. 517–525. 2007.
RYBAK, M.J. Pharmacodynamics: relation to antimicrobial resistance. Am J Infect Control, v.
34, n. 5, p. 38-45. 2006.
ROSAN, B; LAMONT, R.J. Dental plaque formation. Microbes and Infection, v. 2, n. 13, p.
1599-1607. 2000.
RUKAYADI, Y; HWANG, J. K. In vitro activity of xanthorrhizol against Streptococcus mutans
biofilms. Lett Appl Microbiol, v. 42, n. 4, p. 400-404. 2006.
SAKANARA, S; AIZAWA, M; KIM, M; YAMAMOTO, T. Inhibitory effects of green tea
polyphenols on growth and cellular adherence of an oral bacterium, Porphyromonas
gingivalis. Biosci Biotechnol Biochem, v. 60, n. 5, p. 745-749. 1996.
SANTOS, K.V.; DINIZ, C.G; COUTINHO, S.C; APOLÔNIO, A.C.M; SOUSA-GAIA, L.G;
NICOLI,
J.R;
FARIAS,
L.M;
CARVALHO,
M.A.R.
In
vitro
activity
of
piperacillin/tazobactam and ertapenem against Bacteroides fragilis and Escherichia coli in
pure and mixed cultures. J. Med. Microbiol, v. 56, p. 798-802. 2007.
SOTE, E.O; WILSON, M. In-vitro antibacterial effects of extracts of Nigerian tooth-cleaning
sticks on periodontopathic bacteria. Afr Dent J, v. 9, p. 15-19. 1995.
SPANGLER, S. K; JACOBS, M. R; APPELBAUM, P. C. Bactericidal activity of DU-6859a
compared to activities of three quinolones, three beta-lactams, clindamycin, and
metronidazole against anaerobes as determined by time-kill methodology. Antimicrob.
Agents Chemother, v. 41, p. 847-849. 1997.
52
TAKARADA, K; KIMIZUKA, ; TAKAHASHI, N., HONMA, K; OKUDA, K; KATO, T.A.
Comparison of the antibacterial efficacies of essential oils against oral pathogens. Oral
Microbiol Immunol, v. 19, n. 1, p. 61-64. 2004.
TORRES-SANTOS, E.C; MOREIRA, D.L; KAPLAN, M .A; MEIRELLES, M.N; ROSSIBERGMANN, B. Selective Effect of 29,69-Dihydroxy-49-Methoxychalcone Isolated from
Piper aduncum on Leishmania amazonensis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.43,
n. 2, p. 1234–1241. 1999.
VAN DER WEIJDEN, G. A; TIMMEE, C. J; TIMMERMAN, M. F; REIJERSE, E; MANTEL,
M. S; VAN DER VELDEN, U. The effect of herbal extracts in an experimental mouthrinse
on established plaque and gingivitis. Journal of Clinical Periodontology, v. 25, p. 399-403.
1998.
VICTÓRIO, C.P.; LAGE, C.L.; KUSTER, R.M. Flavonoid extraction from Alpinia zerumbet
(Pers.) Burtt et Smith leaves using different techniques and solvents. Eclética Química, v. 34,
n. 1, p. 19-24. 2009.
V.K. DUA, V.P. OJHA, R. ROY, B.C. JOSHI, N. VALECHA, C. USHA DEVI, M.C.
BHATNAGAR, V.P. SHARMA, S.K. SUBBARAO. Anti-malarial activity of some
xanthones
isolated
from
the
roots
of
Andrographis
paniculata.
Journal
of
Ethnopharmacology, v. 95, p. 247–251. 2004.
WAGNER, H; ULRICH-MERZENICH, G. Synergy research: Approaching a new generation of
phytopharmaceuticals. Phytomedicine, v. 16, n. 2-3, p. 97–110. 2009.
WILSON, M. Bacterial biofilms and human disease. Science Progress, v. 84, n. 3, p. 235-54.
2001.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Global goals for oral health in the year 2000. Int. Dent.
J. 32(1): 74-77, 1982.
YAMASHITA, Y; BOWEN, W. H; BURNE, R. A; KURAMITSU, H. K. Role of the
Streptococcus mutans gtf genes in caries induction in the specific-pathogen-free rat model.
Infect Immun, v. 61, n. 9, p. 3811–3817. 1993.
YATSUDA, R; ROSALEN, P. L; CURY, J. A; MURATA, R. M; REHDER, V. L. G; MELO, L.
V; KOO, H. Effects of Mikania genus plants on growth and cell adherence of mutans
streptococci. Jounal of Etnopharmacology, v. 97, n. 2, p. 183-289. 2005.
53