Streptococcus
mutans
Objetivo do Trabalho
• Consiste na análise de bactérias
Streptococcus mutans e em como conseguem
sobreviver e produzir ácidos em pHs baixos.
Pesquisas foram realizadas afim de
estabelecer o desempenho desta em pHs
baixos (normalmente a S. mutans encontra-se
em pH por volta de 7.0 - em meio salivar - e
no experimento foi testado um pH 5.0).
Esta bactéria é vulgar na boca do homem e é o
principal fator do desenvolvimento
de cáries devido a sua capacidade acidogênica e
acidúrica.
Através de pesquisas,
foi possível estreitar as
adaptações
bioquímicas e
fisiológicas que
permitem o S. mutans
produzir ácidos e
sobreviverem em pHs
baixos.
Essa bactéria gasta energia pra expulsar o excesso
de H+ a partir da célula, minimizando os efeitos
negativos ( efeitos esses que serão discutidos ao
longo do estudo).
A análise final demonstrou a capacidade de
adaptação fenotípica durante a tolerância a ácidos
e as mudanças no nível das proteínas, que
parecem estar limitadas as principais vias
metabólicas : a glicólise, a produção de ácidos
graxos e a síntese de cadeias ramificadas de
aminoácidos.
Metodologia Empregada
• PREPARAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
-Meio de cultura com saliva artificial,
modificada,incluindo adenina,guanina e uracila a
20microgramas/mol,15 mM de KH2PO4 e 15 mM de
K2HPO4.
• a S.mutans é dependente de glicose a uma certa taxa
de diluição,em pH 7.0 e pH 5.0,onde quase toda a
glicose foi utilizada,e aminoácidos adicionados
permaneceram em excesso.
PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS
CELULARES
• Mutanolisina(enzima de extração).
• -Proteínas são separadas em um meio onde
há faixas ácidas de pH’s fixos (pH 4-6.7).Há a
adição de substâncias que favorecem a
difusão de mais alvos protéicos no
gel.(Amidosulfatobetaína-14,e DTT)
• Proteínas em faixas mais básicas de pH fixo(611):-Extração(mutanolisina)
•
-Centrifugação
-Precipitação
-Degradação do DNA(Exonuclease III)
•
-Eletroforese
IDENTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS
• São identificadas por mapeamento de massa
ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS
-Derivados de aminoácidos são separados e
quantificados
-Triptofano (raios UV)
-Todos os outros(Técnica de fluorescência)
ANÁLISE DE METABÓLITOS
• Mede-se as concentrações de
acetato,glicose,etanol,lactato presente no
meio em estado de equilíbrio.
• A quantidade de polissacarídeo intracelular
acumulada é determinada por iodeto de
potássio.(Método de DiPersio)
Glicólise
O principal sistema de transporte ativo de açúcar
em importantes bactérias orais acidogênicas,tais
como streptococus: fosfoenolpiruvato(PEP)
Sistema de Fosfotransferase do açúcar.
VIA GLICOLÍTICA
Muitas bactérias orais, dentre elas os
streptococos,degradarão a glicose 6-P formada
após o transporte através da via glicolítica de
Embden-Meyerhof,com o intuito de gerar
energia e precursores para a síntese do material
celular
GLICOSE 6-FOSFATO
( S. mutans cultivada em cultura de pH 5)
Metabólitos intermediários como a
diidroxiacetona-fosfato e o gliceraldeído
3-fosfato mantém os seus níveis estáveis.
Muitos microorganismos também
possuem a via pentose-fosfato com o
objetivo de produzir precursores
celulares(ribose 5-P), bem como o
poder redutor para as reações
biossintéticas(NADPH).
NADP – dependente gliceraldeído 3fosfato desidrogenase
(em pH 5)
Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase
e
Fosfoglicerato quinase
Importantes na determinação do sentido
do fluxo de carbono
Conversão final do 3-fosfoglicerato em piruvato
ENZIMAS DA VIA GLICOLÍTICA
•
1a, 1b Mannose-specific phosphotransferase system
component IIAB
•
11aPhosphoglyceromutase
11b Phosphoglycerate mutase-like protein
•
•
2a ATP synthase alpha chain
2b ATP synthase epsilon chain
•
12a, 12b, 12c, 12d, 12e, 12f, 12g, 12h, 12i
Enolase
•
3 Glucose kinase
•
13a, 13b, 13c, 13d Piruvate kinase
•
4 Glucose-6-phosphate isomerase
•
5a, 5b Phosphofructokinase
•
6a, 6b,6c Fructose-1,6-bisphosphate aldolase
•
7a, 7b, 7c Triosephosphate isomerase
•
8a, 8b, 8c, 8d, 8e, 8f, 8g, 8h Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase
•
9a, 9b NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase
•
10a, 10b, 10c, 10d, 10e, 10f, 10g, 10h, Phosphoglycerate
kinase
pH 5,0 X pH 7,0
Início da glicólise em Streptococcus mutans
Ação da Hexoquinase na transformação de Glicose em
Glicose 6 – fosfato (que é essencial para a ativação da
Piruvato quinase mais tarde).
‘
A piruvato quinase é a principal limitante na
regulação da glicólise em Streptococcus
mutans, uma vez que é ativada pela glicose – 6
fosfato mas inibida por fosfato inorgânico.
ATIVAÇÃO E INIBIÇÃO DA
PIRUVATO QUINASE
A ativação da piruvato quinase se faz pela
presença de glicose 6 – fosfato. Quanto maior
a concentração de glicose 6 - fosfato
(consequente maior concentração de
fosfoenolpiruvato) maior será a atividade da
piruvato quinase.
A inibição da mesma se faz pela concentração
de fosfato inorgânico formado pelas reações
de ATP ou ADP. Em altas concentrações de
fosfato inorgânico a piruvato quinase é
inibida.
Gráfico de comparação da ação da Piruvato quinase
em função da concentração de Fosfoenolpiruvato
AÇÃO DA ENOLASE
A enolase catalisa a eliminação de água do 2-fosfoglicerato
para que ocorra a formação de fosfoenolpiruvato(PEP) – composto
dotado de potencial energético elevado – que
permitirá a formação de ATP na reação seguinte.
INIBIÇÃO DA ENOLASE
Fluoreto – Inibidor competitivo da enolase
Bloqueia a glicólise
Não há produção de lactato
Nível de glicose inicial permanece igual
Descobertas científicas e
Sucesso do estudo se devem à
Mudança na forma como o
experimento é realizado
Utilização da técnica de cultura contínua
Como resultado desses
experimentos, concluímos que:
Os Streptococcus mutans toleram pH
baixos através de ....
Aumento de sua capacidade de extrusão de H+
Redução do nível de produção de H+
Redução da forma de NAD (P) H
Produção de NH3 para neutralização do citoplasma
UFRJ – Universidade Federal do Rio de Janeiro
Odontologia – 1º período
Bioquímica – Prof. Fabio Schneider
GRUPO:
JULIANA NOITE
KARINA ANDRADE
LORRANE MELLO
MARIANA PEREIRA
MILENA IUNG
RAYAN FORTUNATO
STEPHANIE MOURA
TATHYANE CALDAS
URSULA PUETTER