UPC II – Microbiologia
Aula prática laboratorial 1 2012/2013
1-10-2012
Maria José Correia
[email protected]
Sumário P1:

Apresentação sucinta do programa das aulas
laboratoriais;

Segurança no Laboratório

Noções de desinfeção, assepsia e esterilização

Introdução à microscopia
01/10/2013
UPC II - Microbiologia 2012/2013
2
Programa:
Semana
Data
Tema
1
01/10
O laboratório de Microbiologia (Equipamentos Materiais e Cuidados)
2
8/10
Meios de cultura e cultivo de microrganismos (Preparação dos meios
para a aula seguinte)
3
15/10
Recolha e processamento de amostras (Recolha pelos alunos de uma
amostra do biofilme oral e sua inoculação nos meios apropriados).
22/10 e
29/10
Observação direta de microrganismos (Coloração de Gram das
amostras do biofilme oral.
6
5/11
Observação de preparações definitivas e investigação on line da
estrutura e fatores de virulência de microrganismos patogénicos e
comensais.
7
12/11
Ficha de avaliação
8-9
19 e
26/11
Identificação de microrganismos por cultura e testes bioquímicos
miniaturizados para identificação de streptococci. Inclui realização de
um antibiograma com o microrganismo identificado.
10-11
3e
10/12
Identificação molecular de streptococci orais nas amostras de biofilme.
12-14
7,14 e
21/01
Genética molecular microbiana - Clonagem.
23/01
Ficha de avaliação. Arrumação dos laboratórios.
4-5
15
01/10/2013
UPC II - Microbiologia 2012/2013
3
Segurança no laboratório:

Atitudes:



01/10/2013
Usar o senso comum (a maioria dos acidentes
de laboratório começa com algo simples);
Estar consciente – conhecer os reagentes antes
de os usar (ler os rótulos tomar as medidas
necessárias);
Estar protegido – conhecer as práticas e
equipamentos que podem aumentar a
proteção (máscaras, luvas, etc.).
UPC II - Microbiologia 2012/2013
4
Segurança no laboratório:

01/10/2013
Regras gerais:

Nunca COMER, BEBER, FUMAR, aplicar lentes de
contacto ou cosméticos!

Nunca cheirar soluções ou reagentes

Nunca pipetar com a boca

Lavar imediatamente a pele após contacto com
culturas/químicos
UPC II - Microbiologia 2012/2013
5
Segurança no laboratório:
É especialmente perigoso
correr ou brincar em ambientes
laboratoriais
01/10/2013
UPC II - Microbiologia 2012/2013
6
Segurança no laboratório:

Bancada:






01/10/2013
As bancadas de trabalho devem ser mantidas
organizadas e limpas
Identificar todo o material utilizando para isso
marcadores de vidro apropriados
Manter os bicos de Bunsen e as lamparinas acesas
apenas enquanto são necessários
Os lixos devem ser perfeitamente identificados
(contaminado e limpo)
O material de vidro estalado ou partido deve ser
imediatamente rejeitado
Colocar as pipetas de vidro sujas em contentores de
plástico devidamente identificados para esse fim
UPC II - Microbiologia 2012/2013
7
Segurança no laboratório:

Proteção pessoal:




01/10/2013
Usar bata e manter os cabelos compridos
apanhados;
Não usar sapatos abertos, chinelos, sandálias;
Usar a hotte e a CSB sempre que necessário;
Quando abandonar o laboratório retirar a bata e
lavar todas as zonas de pele que possam ter estado
expostas a substâncias tóxicas/patogénicas.
UPC II - Microbiologia 2012/2013
8
Instruções gerais:

Ler os protocolos antes de cada aula prática

Desinfetar as mãos e a bancada

No início da aula examinar/registar os resultados das
experiências realizadas na aula anterior

Seguir atentamente as instruções fornecidas pelo docente
antes de executar o trabalho proposto


01/10/2013
Depois de terminar o trabalho de cada aula arrumar a
bancada onde trabalhou. Colocar o lixo e o material
inoculado nos locais apropriados
Desinfetar a bancada (álcool) e lavar as mãos com
sabonete antes de deixar o laboratório
UPC II - Microbiologia 2012/2013
9
Assepsia
ausência de microrganismos

Manutenção das condições de assepsia:





01/10/2013
limpar e desinfetar a bancada de trabalho
lavar e desinfetar as mãos no início e fim da aula
usar bata limpa (sempre)
esterilizar o material a utilizar
trabalhar à chama ou na câmara de fluxo laminar
UPC II - Microbiologia 2012/2013
10
Técnicas de esterilização

Principais agentes anti-microbianos


01/10/2013
Métodos físicos
 Calor
 Radiações
 Filtros
Métodos químicos
 desinfetante
 antisséticos
UPC II - Microbiologia 2012/2013
11
Esterilização pelo calor

Calor seco

Oxidação e desnaturação das proteínas

Combustão da matéria orgânica

Aplicações:


01/10/2013
Materiais resistentes a altas temperaturas (ansas, vidros não
calibrados, etc.)
Equipamento

Estufas a 160-180ºC (2 horas)

Equipamento de incineração ou queima direta
UPC II - Microbiologia 2012/2013
12
Esterilização pelo calor

Calor húmido



Coagulação das proteínas; destruição de células
vegetativas e esporos
Aplicações:

Meios de cultura e soluções aquosas

Materiais pouco resistentes ao calor (plásticos resistentes, etc.)
Equipamento/técnicas:



01/10/2013
Autoclave (atmosfera de vapor de água sob pressão)
Pasteurização (aquecimento do produto por um período de tempo
que varia com produto a pasteurizar e a temperatura utilizada)
Tindalização (aquecimento a 65-100ºC durante 30-60 min, intercalado
com incubação a 35ºC – ciclos que podem repetir-se até 3 dias)
UPC II - Microbiologia 2012/2013
13
Esterilização por filtração
Prescott, Microbiology, 5th edition



01/10/2013
Remoção de microrganismos em membranas
filtrantes com poro nominal inferior às dimensões
bacterianas (0,2 µm)
Aplicações:
 Produtos termo lábeis, voláteis ou sensíveis a altas
pressões (ex: antibióticos e vitaminas)
Equipamento/técnicas:
 Filtração com funil (grandes volumes)
 Filtração com seringa (pequenos volumes)
 Filtração de ar em câmaras de fluxo laminar
UPC II - Microbiologia 2012/2013
14
Esterilização por radiações

Raios X e :


Raios UV:


Destruição mecânica de células
Raios catódicos (feixes de electrões de intensidade e
velocidade elevadas):

01/10/2013
Menor energia, radiação pouco penetrante usada para
esterilização de superfícies
Ultra-sons (radiação de alta frequência)


Poder ionizante e elevado poder de penetração - para
objectos volumosos
Esterilização de material cirúrgico
UPC II - Microbiologia 2012/2013
15
Esterilização por agentes químicos
Agentes bactericidas ou bacteriostáticos (só eliminam
as formas vegetativas e não as formas esporuladas)




Sabões, sais biliares e fenóis (alteração da tensão
superficial)
Cloro (oxidação de compostos celulares)
Álcoois (desnaturação de proteínas e solubilização de
lípidos)
Detergentes germicidas:
misturas comerciais de vários agentes
bactericidas e bacteriostáticos
01/10/2013
UPC II - Microbiologia 2012/2013
16
Introdução à microscopia
Prescott, Microbiology, 5th edition

Microscópio ótico
Ocular


instrumento usado
para ampliar
constituído por uma
parte mecânica e
uma parte ótica
Tubo Revólver
Objetiva
Coluna
Platina
Diafragma
Condensador
Fonte de luz
Pé
Parafuso
Micrométrico
01/10/2013
UPC II - Microbiologia 2012/2013
Parafuso
Macrométrico
17
Microscópio ótico - Parte mecânica

Pé ou Base – suporta/estabiliza o microscópio

Braço ou Coluna – peça fixa à base, serve de suporte a outros constituintes
do microscópio.

Tubo ou Canhão –suporta os sistemas de lentes da extremidade superior

Platina – peça paralela à base, onde é colocada a preparação a observar,
possuindo no centro um orifício que permite a passagem dos raios luminosos
concentrados pelo condensador.

Parafuso Macrométrico – engrenagem indispensável para fazer a focagem.

Parafuso Micrométrico – elemento que permite movimentos de amplitude
reduzida para completar a focagem.

Revólver – peça giratória adaptada à zona inferior do tubo que suporta as
objetivas de diferentes ampliações (ex: 10x, 40x, 100x)
01/10/2013
UPC II - Microbiologia 2012/2013
18
Microscópio ótico - Parte ótica

Sistema de Oculares e Sistema de Objetivas – o conjunto de lentes
que permitem a ampliação do objecto (a ampliação dada ao
microscópio é igual ao produto da ampliação da objetiva pela
ampliação da ocular)

Fonte Luminosa



lâmpada (iluminação artificial),
espelho que reflita a luz solar (iluminação natural).
Condensador – conjunto de lentes convergentes que distribui
regularmente, sobre o campo visual do microscópio, a luz emitida pela
fonte luminosa.

Diafragma – regula a intensidade luminosa no campo visual do
microscópio
01/10/2013
UPC II - Microbiologia 2012/2013
19
Utilização do microscópio







Ligar a lâmpada
Ajustar distância interpupilar (oculares)
Colocar a lâmina na platina e focar em objetiva 10x
Ampliar a imagem, retificar focagem e observar
Utilizar óleo de imersão (1 gota) apenas para a objetiva 100x
Limpar a objetiva com solução apropriada
Quando terminar observação:



01/10/2013
Regular a luz para o mínimo e desligar a lâmpada
Voltar sempre para a objetiva de menor ampliação
Cobrir o microscópio
UPC II - Microbiologia 2012/2013
20
Objetivos P1:

O aluno deve ser capaz de:






01/10/2013
seguir todas as regras de segurança referidas;
definir desinfeção, assepsia e esterilização;
enumerar os principais processos de esterilização
de material e meios de cultura;
descrever as situações específicas em que deve
ser utilizado um determinado método de
esterilização;
descrever o modo de atuação dos métodos de
esterilização;
utilizar o microscópio da forma mais correta.
UPC II - Microbiologia 2012/2013
21