Desenho de primer e
otimizações de PCR
Éderson Kido
Com base em
http://www.mcb.uct.ac.za/pcroptim.htm
Molecular Biology Techniques
Manual
Fatores que afetam a PCR
Temperatura de denaturação


Se o ácido nuclêico é aquecido em tampão
de força iônica < 150 mM de NaCl, a
temperatura de denaturação fica < 100oC.
Logo, a PCR trabalha entre 91-97oC.
A meia-vida da Taq Pol a 95oC é ~30min.
Logo, o número de ciclos não supera muito
em 30.
Temperatura de denaturação
Diminui após ~10 ciclos, pois o tamanho
médio do DNA alvo também decresce.

moldes menores de 300bp (50% de CG) tem
temperatura de denaturação de 88oC.
Tempo de permanência: denaturação da
Taq. Em geral: 94oC – 1min.

Se reduzir o tempo, maior número de ciclos é
possível. Se aumentar a temperatura,
diminua o tempo.
Temperatura de anelamento (Ta)
Depende do tamanho e composição dos
primers.



~5oC abaixo do menor Tm do par de primers.
Tm = 4(G + C) + 2(A + T)oC
Se Ta for muito baixo, primers podem anelar
em alvos similares e amplificar produtos não
específicos. Se Ta for alto demais, a
probabilidade do anelamento diminui e a
quantidade de produto também.
Temperatura de anelamento
Maioria dos primers
anelam em menos de
30 s, a não ser que
Ta seja muito próximo
do Tm ou primers
muito longo.
Tamanho do primer
Geralmente de 18 – 22 bases


Seqüência de 16 bases: estatisticamente ->
uma vez em cada 416 bases (~4 bilhões
bases; ~ tamanho do genoma humano ou do
milho).
Assim, seqüências maiores que 17 são
específicas!
Primers degenerados
Primers com opções em diferentes locais
Amplificação de seqüências
relacionadas em diferentes organismos
.
TCGAATTCNCCYAAYTGNCCNT
where Y = T + C, and N = A + G + C + T,
Degeneração diminui a especificidade dos
primers, aumenta ocorrência de mismatches
e background.
Base deoxiinosina pareia com qualquer base.
Primers derivados de alinhamentos
múltiplos
Temperatura de elongação
Elongação ocorre a partir da temperatura
de anelamento.
Em ~70oC, a extensão ocorre com ~100
bases/s (1 min é suficiente para produto
de 2 kb; para 3 kb, até 3 min).
Normalmente 70-72oC, por 30s a 3 min.
Reação de PCR
Tampão de PCR:
10-50 mM Tris-HCl pH 8.3,
até 50 mM KCl, >1.5mM MgCl2,
primers 0.2 – 1 uM (cada),
50 – 200 uM (dNTP, cada)
BSA até 100 ug/ml,
Detergente não-iônico: Tween-20 ou Triton X100 (0.05 - 0.10% v/v; previne agregação da
enzima)
Modernos são proprietários
Considerações
PCR trabalha bem com tampão da transcriptase
reversa: logo, síntese de cDNA com posterior PCR.
> 50 mM de KCl ou NaCl inibe a Taq, mas presença
auxilia no anelamento.
[Mg2+] afeta anelamento, especificidade do produto,
atividade enzimática... Primers, dNTPs e moldes quelam
e seqüestram o íon. De 0,5 a 2,5 mM > [dNTP].
Primers: <1 uM (a menos que sejam degenerados);
geralmente 0,2 uM.
Nucleotídeos: ~50 mM (longos produtos exigem mais).
Número de ciclos
Depende da concentração do DNA alvo.
40-45 ciclos amplificam 50 moléculas alvos até
[ ] igual a 25-30 ciclos, com 3x105 moléculas.
Se o produto não for feito em 30 ciclos,
reamplificar (20-30 ciclos) 1 uL, com novo mix.
Efeito plateau
Atenua o acúmulo do
produto, qdo este atinge
de 0,3 a 1nM.
Devido: degradação de
enzima; depleção de
dNTPs, primers; inibição
pelo produto; competição
por produtos não
específicos; reanelamento, etc
Nested PCR
PCR1 detecta a partir de 1000 moléculas; PCR2 detecta a partir de 1.
Primer design
Tamanho: 17-28 bases;
Composição: 50% (C+G);
Deveria terminar (3´) em G ou C;
Tm entre 50-80oC;
Três ou mais Gs ou Cs (3´) podem causar
mispriming em regiões ricas em G ou C (evitar);
Evitar primers com complementaridade de
bases (dímeros de primers);
Evitar complementaridade de bases em mesmo
primer (haipin, estruturas secundárias)
Problemas