“Primers” para PCR:
• “Primers”: oligonucleotídeos com 18 a 28 bases (fita
única) escritos sempre na direção 5´  3´
• São necessários dois “primers”:
• Um complementar a um trecho da fita anti-sense
» Primer sense (forward)
• Um complementar a um trecho da fita sense
» Primer anti-sense (reverse)
Desenho de “primers”
Escolha dos primers para PCR:
1
1
Asp Pro Val Ala Val Leu Ala Val Phe Glu Glu Ile
G GAT CCA GTG GCG GTG TTG GCC GTG TTC GAG GAG ATA
12
37
13 Gln Val Glu Glu Val Leu Tyr Ile Leu Val Phe Gly Glu
38 CAG GTG GAG GAG GTG CTG TAT ATC CTG GTC TTC GGC GAG
25
76
26 Ser Leu Leu Asn Asp Gly Val Thr Val Val Arg Tyr His
77 TCC CTC CTC AAC GAT GGT GTG ACG GTG GTC CGT TAC CAT
38
115
oligonucleotídeo 1 para PCR (sense):
39 Leu Phe Glu Gly Phe Ser Glu Leu Gly Glu Asp Asn Ile
51
116 CTG TTC GAG GGC TTC AGC GAG CTC GGT GAG GAC AAC ATC 154
52 Lys Ala Val Asp Ile Ala Ser Xxx Val Ala Ser Phe Leu
155 AAG GCC GTT GAC ATC GCC AGC NGG GTC GCC TCC TTC CTT
64
193
65 Leu Val Ala Leu Gly Gly Thr Ala Ile
Gly Ile Ile Trp
77
194 CTC GTG GCC CTC GGC GGC ACG GCC ATC GGC ATC ATC TGG 232
78 Gly Phe Leu Thr Ala Phe Ile Thr Arg Leu Thr Ser Gln
233 GGC TTC CTC ACC GCC TTC ATC ACC AGG TTA ACG AGT CAG
90
271
91 Val Pro Arg Asp Arg Ala Ile Phe Val Phe Val Met Ala
272 GTN CCG CGT GAT CGA GCC ATC TTC GTG TTC GTG ATG GCC
103
310
104 Tyr Leu Asn Ala Glu Met Leu Ala Ser Ser Ser Glu Thr
116
311 TAC CTC AAT GCG GAG ATG CTG GCC TCG TCC TCG GAG ACC 349
117 Ile Ile
350 ATC ATC T
118
356
5' GTG GAG GAG GTG CTG TAT ATC 3'
- oligonucleotídeo 2 para PCR (anti-sense):
5' GTA GGC CAT CAC GAA CAC GAA 3'
- oligonucleotídeo para hibridização
(anti-sense):
5' CTG ACT CGT TAA CCT GGT GAT G 3'
Critérios para desenho de “primers”:
- Composição de bases:
O conteúdo de G+C deve estar entre 40% e 60%, com distribuição mais ou menos
homogênea de todas as bases ao longo do comprimento do “primer”.
- Comprimento:
A região do “primer” complementar à “template” deve ser de 18 a 28 nts. Os dois
“primers” a serem utilizados numa reação não devem ter diferença de comprimento
que exceda 3 nts.
- Seqüências repetidas ou auto-complementares:
Não deve haver repetições invertidas no “primer” ou seqüências auto-complementares
com mais de 3 nts seguidos.
• Complementaridade entre membros de um par de “primers”:
A extremidade 3’ de um “primer” não pode ser capaz de se ligar a qualquer
ponto do outro primer. Como os “primers” estão presentes em alta concentração,
mesmo baixa complementaridade entre eles pode levar à formação de híbridos
e a conseqüente síntese e amplificação de dímeros de “primers”.
Dímeros dos “primers” é o produto da
extensão do primer por pareamento consigo
mesmo ou com o outro “primer” do par.
Como são produtos mais curtos, são copiados
mais eficientemente, podendo dominar a
reação e sequestrar “primers” que iriam se
parear com a “template” real.
Outro fato que pode ocorrer, quando começa
a se acumular produto de PCR, é o
pareamento das extremidades dos produtos
amplificados, formando concatâmeros. Isso
aparecerá na eletroforese como “smears” de
elevado peso molecular.
- Temperatura de fusão: temperatura na qual 50% das moléculas alvo já estão pareadas
com os “primers”
O Tm calculado dos dois membros do par de “primers” não deve diferir em mais que 5oC
(Tm depende da concentração de “primers” e de sais)
Extremidade 3’:
A natureza da extremidade 3’ dos “primers” é crucial. Se possível, a base da extremidade
3’ de cada “primer” deve G ou C. Mas não é recomendável que seja ...NGGG ou ...NCCC,
pois pode gerar dímeros de primers.
-Localização do sítio de pareamento dos “primers” na seqüência alvo:
Algumas vezes há restrições impostas pelo tipo de informação que se quer obter ao fazer a
PCR. Ao desenhar “primers” para cDNA, o ideal é que estejam em exons diferentes.
-Adição de sítios de restrição, promotores de bacteriogafos, clamp GC, e outras seqüências
na extremidade 5’: Usualmente estas seqüências não alteram o pareamento do “primers”
nas seqüências alvo.
A extremidade 5’ não precisa ser complementar à seqüência alvo. Isso nos
permite adicionar seqüências com propósitos específicos na extremidade 5’
• sítio para enzima de restrição, mais 3 a 4 bases adicionais
• promotores para transcrição in vitro
• promotores de seqüências consenso para inicío de tradução
• para transcrição e tradução in vitro
etc
Para o cálculo do Tm considera-se apenas a região complementar à seqüência alvo.
“primers” com sítios para enzimas de restrição:
Cáculo do Tm dos inciadores
Tm é a temperatura na qual metade das fitas moldes presentes na reação estão hibridizadas
com os primers, que usualmente estão presentes em considerável excesso em relação às
templates.
Tm depende da concentração de primers (e templates) e da concentração de sal.
Métodos para cálculo do Tm:
Para “primers” com cerca de 20 nucleotídeos (regra de Wallace):
Tm = (número de G + C) x 4 + (número de A+T) x 2
Uma fórmula mais acurada que pode ser usada para oligonucleotídeos entre 15 e 70
nucleotídeos (Bolton e McCarthy):
Tm = 81,5 + 16,6[log10(I) + 0,41 (%G+C)-(675/N)
onde
I: concentração de cátions monovalentes
N: comprimento em no. de nucleotídeos
Pode ser ainda usado cálculo da temperatura de annealing otimizada (Wu et al., 1991) para
oligonucloetídeos com 20-35 nts.
Tp = 22 + 1,46 [(2 x número de G+C) + (número de A+T)
 Nearest neighbor method:
Proc Natl Acad Sci U S A 1986 Jun;83(11):3746-50
Breslauer KJ, Frank R, Blocker H, Marky LA
Nucleic Acids Research Rychlik, Spencer and Rhoads, vol 18, num 12, pp 6409-6412
H
- 273,15 + 16,6 log [Na+]
Tm =
S + R ln[primers]
5’
3’
G ~ 10K cal/mol
G global do primer < 10 Kcal/mol
G ~ 0,6K cal/mol
G não depende da concentração de sal.
5’
3’
3’
5’
5’
Favorece produtos inespecíficos
3’
3’
3’ irá parear por último.
Aumento da especificidade
5’
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Primer3 – Free Online Primer Design Tool | PCR Primer Analysis ...
Existe uma grande variedade entre os valores calculados usando as
diferentes fórmulas.
Estas fórmulas constituem apenas um guia para a temperatura de
annealing a ser usada na PCR. Na prática, é necessário determinar a
temperatura ótima empiricamente.
Pode usar:
- Touch down
- PCR em termociclador com gradiente
• A distância entre os “primers” :
Fragmentos longos são mais difíceis de ser amplificados
• Fragmentos de 120-300 nt são adequados quando o objetivo é apenas
detectar a presença do gene
• Quando o propósito é clonar uma região específica de um gene ou um
cDNA inteiro, o fragmento poderá ser maior, mas devemos usar
enzimas com antividade corretiva ou mix de enzimas.
Primers degenerados:
verificar as tabelas
de uso do código
pela espécie
(codon usage)
Desenho de iniciadores degenerados: uma mistura de primers
- Met Ile His Trp Cys Pro Leu
ATG ATT CAT TGG TGT CCT TTT
ATC CAC
ATA
TGC CCC TTG
CCA CTT
CCG CTC
CTA
CTG
1 . 3 . 2 . 1 . 2 . 4 . 6 = 288
- mas não é possível usar as 6 degenerações acima
- uso de inosina (por A/T/G) reduz diluição
- quantidade de primer deve ser aumentada
- alinhamento prévio usando Clustal ou Clustalw
Codon usage:
disponível para grande número de espécies em
http://www.kazusa.or.jp/codon
http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html
Para preparar o estoque de primer é necessário que o fabricante forneça a
quantidade sintetizada. Dilua o primer liofilizado de modo que a solução estoque
fique na concentração de 1 mM, por exemplo.
Se não sabe a quantidade, meça a concentração por espectrofotometria (A260 nm)
c = A260/el
e: coeficiente de extinsão (M-1 cm-1)
l: banda de passagem do espectrofotômetro
Cálculo de e:
A - 15.200
C - 7.050
G - 12.010
T - 15.200
Exemplo: 5’GTGAGTCCCTGAATGTAGTG 3’
e = (15.200 x 4) + (7.050 x 3) + (12.010 x 7) + (8.400 x 6) = 216.420
Dilua o estoque de modo que a leitura de A260 esteja entre 0.1-0.8
Suponhamos que a diluição tenha sido de 100, a A260 = 0.15
C = [0.15 X 100]/ 216.420 X 1 = 0,000069 M = 69 mM = 69 pmol/mL
Fatores de conversão úteis:
pmol para ng = (no. de pmol x N x 325)/1000 - N é o número de nucleotídeos
ng para pmol = (ng x 1000)/ (N x 325)
325 é a massa molecular média dos nucleotídeo.
PCR quantitativo em tempo real
Sistema para quantificação do produto amplificado por PCR em tempo real
ou sistema de detecção de seqüência (SDS):
Isso consiste em utilizar um sistema que detecta o aumento da quantidade
de fitas de DNA no tubo de reação, através da medida do aumento da
emissão fluorescente, à medida que a reação está ocorrendo.
Os níveis de fluorescência emitida pela amostra excitada por um laser ou
por uma lâmpada de halogênio associada a um filtro específico, é detectada
a cada ciclo e enviada para uma unidade processadora.
O ciclador térmico utilizado para
quantificação em tempo real está equipado
com cabos de fibra óptica que direciona a
luz do laser para cada uma das poças do
bloco onde são colocadas as amostras
O sistema coleta a emissão fluorescente entre 500 e 600 nm em cada uma
das 96 poças com amostras, a cada 3 a 10 s. Os cabos levam a emissão
fluorescente de volta à câmara CCD
Para detecção do produto de PCR em cada ciclo é preciso marcar o DNA
amplificado com algum tipo de molécula fluorescente.
Existem vários tipos de moléculas fluorescentes utilizadas para esse fim.
Dois sistemas têm sido mais comumente utilizados:
- SYBR Green
- TaqMan
Sistema SYBR Green:
O corante se liga a duplas fitas de DNA.
Se há aumento do número de fitas duplas,
há aumento proporcional da intensidade de
fluorescência.
Fluorescence Ressonance Energy Transfer - FRET
Sistema TaqMan
• Sistema TaqMan emprega uma sonda, que é um oligonucleotídeo específico
que é complementar a uma parte interna do segmento a ser amplificado.
• Este oligonucleotídeo é marcado com uma molécula fluorescente em sua
extremidade 5’, esta molécula é denominada “reporter”;
na extremidade 3’, é adicionada outra molécula que pode ou não ser fluorescente
(de comprimento de onda diferente), cuja função é denominada “quencher”.
• Enquanto a sonda está livre em solução o “quencher” absorve a fluorescência do
“reporter”, não sendo detectada fluorescência.
Reporter
Quencher
5’ATCACC..............CATCG 3’
Substâncias fluorescentes usadas:
reporter
quencher
A atividade de exonuclease 5’  3’ da Taq DNA polimerase é utilizada para separar
“reporter” e “quencher” durante a síntese de cada nova molécula de DNA.
Holland et al. 1991: descreveu pela primeira vez a atividade síntese de DNA associada
a atividade exonucleásica 5’-> 3’da Taq DNA pol.; atividade essa que se seguia ao
aparecimento de uma estrutura em forquilha, criada pela fita template e pela fita a ser
removida pela atividade exonucleolítica da enzima.
Lee - 1993: explorou a essa característica da enzima para criar
sistema TaqMan
reporter
FAM
quencher
TET
reporter quando liberado pela
enzima, fluoresce livremente
Taq DNA Pol
Cada vez que é sintetisada uma nova fita há aumento
da intensidade da emissão fluorescente
4
3
2
1
Representação de um plot da amplificação em tempo real
O plot da amplificação mostra 4 fases distintas:
linha basal: não houve acúmulo de fitas duplas o suficiente para que a fluorescência
emitida possa ser detectada.
fase log: a quantidade de amplicon dobra a cada ciclo
fase linear: há pequeno aumento, amplificação linear, da quantidade de amplicon
fase platô: não há mais aumento no número de amplicons
sensibilidade (dynamic range): < 101 a > 1010
Esta maneira de quantificar o produto
de PCR criou um novo paradigma para
quantificação por PCR:
É avaliado o momento de aparecimento
do sinal e não quanto sinal é gerado
após um dado número de ciclos
Ciclo threshold – Ct:
A fluorescência ultrapassa um nível avaliado como “background” – valor correspondente a
cerca de 10 vezes o desvio padrão do “background”.
Pode-se estabelecer um nível (Crossing Point – CP) em qualquer ponto da fase 2.
A diluição serial (diluição em série de 10 x) de uma amostra seguida de
amplificação das moléculas originais por PCR deve resultar numa curva com
gradiente próximo de –3,3, isso indica que a amplificação é de duas vezes a
cada ciclo (Y = 1).
Caso o slope seja maior em módulo que 3,3 significa que a eficiência de
amplificação é menor que 1.
Nesta curva padrão (diluições
seriadas), as 3 últimas diluições
parecem ter a mesma quantidade.
Exemplo típico de contaminação
com DNA genômico.
Sistema SYBR Green:
O corante detecta todo tipo de dupla fita presente na amostra.
Caso haja amplificação de produtos inespecíficos ou amplificação de dímeros de
primers, a fluorescência emitida por estas moléculas será indistinguível da
fluorescência emitida pelo produto amplificado específico que se desejava amplificar.
Cada curva é o
registro do que
ocorreu em um tubo
ao longo dos diversos
ciclos de PCR
Após o término dos ciclos de amplificação, se utilizamos SYBR Green, podemos
avaliar quantos tipos de diferentes fragmentos foram amplificados, porque
diferentes fragmentos têm “melting points” diferentes:
Quando as fitas se separam, o SYBR
Green não mais se liga àquelas
moléculas, e deixa de emitir
fluorescência.
A fluorecência cai abruptamente.
SYBR Green
É possível derivar a quantidade de fluorescência em função da
temperatura e expressar o resultado como na curva abaixo.
Neste caso, um único produto amplificado.
SYBR Green
Exemplo de dois diferentes produtos amplificados em tubos distintos.
SYBR Green
Identificação de tipos de HPV por avaliação do Tm dos produtos
amplificados com o mesmo par de primers.
Para otimização, procure obter a condição com:
. maior variação de fluorescência por ciclo (R ou Rn)
. menor Ct
Sintetize vários pares de primers e teste-os com SYBR Green.
Analise R, Ct e curvas “melting”.
Primers:
Tm 10oC abaixo do Tm da sonda (60 a 65 oC)
Sonda:
Não pode ter G na extremidade 5’ junto ao fluoróforo repórter
Tm 70oC a 75oC
Localize a sonda a 2 ou 3 bases de um dos primers
Como calcular o número de moléculas-template presentes no início da
reação (No) a partir do Ct?
Nf = No (1+Y)n
Ct = n = número de ciclos
Ct é um termo exponencial! Não é linear.
A conversão para uma forma linear é através do termo:
2-Ct
Nf = No (1+Y)Ct
Nf = número de moléculas quando a fluorescência atinge o nível limiar definido
pelo pesquisador.
Tem que ser um ponto escolhido dentro da fase de amplificação exponencial e é o
mesmo para todas as amostras analisadas num mesmo experimento.
Y = 1 (se a eficiência de amplificação for 100%)
Nf/No = 2Ct 
No/Nf = 2-Ct 
No  2-Ct
PCR em tempo real será quase sempre comparativo.
Duas moléculas alvo são amplificadas, simultaneamente em um mesmo tubo, ou
em duas reações distintas:
Gene de interesse (x)
Controle interno – Referência (r)
(outro gene, ou o mesmo gene clonado e mutado para servir de controle)
Analisemos esta questão formalmente:
Para o Gene de interesse - x
Nf,x = No,x (1 + Yx)Ct,x
Para o controle interno - r
Nf,r = No,r (1 + Yr)Ct,r
Se Yx = Yr = 1 , podemos escrever:
No,x = Nf,x . 2-Ct,x
(1)
No,r = Nf,r . 2-Ct,r
Dividindo (1) por (2) 
(2)
No,x = Nf,x . 2-Ct,x
No,r = Nf,r . 2-Ct,r
Definindo:
No,x/No,r = XN
quantidade normalizada de moléculas
do gene de interesse em relação ao número
de moléculas controle no tempo zero
Nf,x/Nf,r = K
relação constante e próxima de 1, visto
que o número de moléculas amplificadas
quando ambos atingem o limiar deve ser o
mesmo.
Temos que
XN = K . 2-Ct
Em nossos experimentos o valor de XN (número normalizado de nossas
moléculas alvo no início da reação de PCR) será medido em diferentes
condições experimentais:
por exemplo condição A e condição B:
Assim teremos:
XN,A
XN,B
=
K . 2-Ct,A
K . 2-Ct,B
= 2-   Ct
Exemplo de comparação da quantidade de moléculas de mRNA/c-myc
normalizada pela quantidade de molécula de mRNA/GAPDH em cérebro e rins.
A comparação foi: cérebro/cérebro
rim/cérebro
Livak KJ AND Schmittgen TD 2001 Methods 25:402-048
Quantificação relativa de mRNA por PCR convencional
Quantificação relativa mRNA
Comparação de amostras A e B
A quantidade de um mRNA específico em cada uma das amostras A e B é normalizada por meio da
comparação com a quantidade de uma molécula tomada como controle interno, esta com
expressão constante nas condições A e B.
Controles internos mais utilizados: b-actina; b2-microglobulina, GAPDH; fosfogliceratocinase 1;
hipoxantina ribosiltransferase (HPRT1); RNA ribossomal
Estes mesmos controles internos são utilizados para PCR em tempo real
Para quantificação, o que mais comumente é feito quando não se dispõe de PCR em
tempo real:
• Transcrição reversa com oligo-dT ou randon primers, a partir de 5 mg de RNA total de
cada uma das amostras correspondentes às situações A e B
• Diluição do cDNA (1:10 a 1:100) - 1 mL para PCR
• PCR com primers específicos para o gene alvo e para um gene utilizado como
controle interno.
• Faz-se PCR com números variáveis de ciclos, de modo a determinar o menor número
de ciclos necessários para visualização da banda amplificada sem alcançar o platô.
• A amplificação de ambos os genes deve estar na fase exponencial de amplificação,
para que possamos fazer a comparação entre eles.
A quantidade final de produto só tem relação conhecida com a quantidade inicial
de moléculas alvo se o platô ainda não foi atingido
Cinética da PCR
Nf = No (1 + Y)n
Considerações sobre controles internos
para PCR semiquantitativo
O RNA nativo a ser usado como controle interno:
•Não deve ter sua expressão modificada pela manobra experimental e condição
especial que está sendo analisada.
•Os níveis de expressão do controle interno e do gene analisado devem ser similares.
•A amplificação de uma molécula muito abundante pode prejudicar, por competição,
a amplificação da molécula pouco abundante (isso, para multiplex PCR)
Para genes muito expressos: GAPDH e b-actina (ambos muito abundantes)
Para genes de média e baixa expressão: hipoxantina ribosiltransferase (HPRT1) que é um gene
housekeeping com poucas cópias de mRNA
Para estudos com estimulação com soro: b2-microglobulina ou 18S
Neste caso, b-actina e GAPDH não são recomendáveis
Exemplo de análise
temporal do nível de
expressão gênica após
um dado tratamento
No caso da avaliação do efeito de um dado tratamento, o
controle interno não deve sofrer variação com o tratamento.
No exemplo acima, b-2 microgobulina poderia ser usada como
controle interno, mas não o GAPDH.
Gene de interesse:
Interleucina Ib
Controle interno:
18S
Para análise quantitativa a integridade do RNA é fundamental.
Com a degradação parcial do RNA há alteração da relação entre
a quantidade de um RNA específico e a quantidade de RNA total.
As moléculas de RNA não se degradam de forma homogênea.
A reprodutibilidade dos experimentos de quantificação relativa cai
muito quando o número de cópias da molécula alvo é muito baixo.
Efeito de amostragem estocástica
(“stochastic sample effect”)