Real Time PCR [email protected] O Que é? • Reação de PCR cuja detecção dos amplicons é simultânea a amplificação, não necessitando de etapas posteriores como gel de eletroforese ou detecção radioativa , “like” ELISA ou Blots. [email protected] Tipos • • • • • • SYBR Green TaqMan/FRET Molecular Becons LUX Scorpions outros [email protected] Vantagens • • • • • • • • Rápida ciclagem Alto Throughput Baixo risco de contaminação Muito sensível Larga faixa dinâmica Reprodutibilidade Quantificável Não é mais caro que PCR convencional [email protected] PCR [email protected] Química da fluorescência TaqMan SYBR Green [email protected] TaqMan Atividade 5’-Nuclease [email protected] Atividade da Taq Nucleotídeo 5’ nuclease Síntese 5’ 3’ Taq Direção da síntese [email protected] A Atividade 5’-Nuclease não altera a PCR [email protected] TaqMan utiliza FRET Fluorescent Resonant Energy Transfer [email protected] TaqMan usa uma Probe Fluorescente Reporter Quencher [email protected] Taq Extende do Primer Upstream [email protected] A atividade 5’-Nuclease digere a Probe [email protected] Aumento do sinal do Reporter durante a Amplificação Número de ciclos [email protected] SYBR Green I Corante Minor Groove Binding. Sem probe; Custo mais baixo que TaqMan Menos que 0.5g de DNA na amostra. Não aceita multiplex. [email protected] Especificidade TaqMan Alta especificidade, inerente a química. SYBR Green Baixa especificidade. Espec. observada apenas no “Melt Curve” [email protected] PCR quantitativo Expressão gênica transgênicos Quant. Câncer Qt patógenos [email protected] Fases da PCR Linear Plateau Gel EtBr Log [DNA] Geométrica # ciclos [email protected] AMOUNT OF DNA 1600000000 AMOUNT OF DNA 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1,024 2,048 4,096 8,192 16,384 32,768 65,536 131,072 262,144 524,288 1,048,576 2,097,152 4,194,304 8,388,608 16,777,216 33,554,432 67,108,864 134,217,728 268,435,456 536,870,912 1,073,741,824 1,400,000,000 1,500,000,000 1,550,000,000 1,580,000,000 1400000000 1200000000 1000000000 800000000 600000000 400000000 200000000 0 0 5 10 15 20 25 30 35 30 35 PCR CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA CYCLE NUMBER 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 10000000000 1000000000 100000000 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1 0 5 10 15 20 25 PCR CYCLE NUMBER [email protected] Fase geométrica y= X 2 [email protected] Problemas nas fases linear e plateau Fase linear Efeito Plateau [email protected] PCR Qt tradicionais Uso de competidores Compartilha mesmos primers. Competidor = tamanhos diferentes. Compartilhar mesmas condições. Métodos radio / ELISA. Gráfico conc. Limite de número de ciclos. . . . . . [email protected] O Que faz o Real Time? A tecnologia Real Time tem acesso a fase Geométrica maior qualidade. São evitadas as fases linear e plateau. [email protected] Calibração externa DNA/RNA são amplificados como uma curva separada para compensar a eficiência e fornecer unidades de quantificação Detection threshold target A target B Log [DNA] # ciclos [email protected] Fluorescência Normalizadada ”reporter” (Rn) Real-Time PCR Características do gráfico Real Time 0.90 0.80 Y=X(1+e) 0.70 n Amostra 0.60 baixa CV Plateau Alta CV Log [DNA] Rn 0.50 0.40 Threshold 0.30 0.20 Geometric Baseline Y=X2 nControle sem Template 0.10 Cycle # 0.00 0 5 10 Número de ciclos PCR 15 20 CT 25 30 35 40 Fase geométrica CT é inversamente proporcinal a conc. de DNA [email protected] Plot da Amplificação [email protected] Curva Padrão y= -3.6x + 39 7 pg DNA R2= 0.999 700 ng DNA [email protected] OBRIGADO [email protected]
Download
![Real-Time PCR [M.Tevfik DORAK]](http://s1.livrozilla.com/store/data/000038827_1-221f1ff2af16fbd29a3ac38973d80e73-260x520.png)
