Primer Design
A reação de polimerização em cadeia é um método
para amplificar seletivamente o DNA.
•O molde é um DNA dupla fita.
•Um par de primers é adicionado, cada um com a
sequencia coincidente com o final de uma das
extremidades a serem amplificadas.
•A Taq termoestavel e os dNTPs são adicionados a
reação.
•No primeiro ciclo, o aquecimento a 95°C abre a dupla
fita de DNA e o subsequencte resfriamento a 60°C
permite que os primers hibridizem com a sequencia
complementar no DNA alvo.
•A polimerase extende cada primer a partir da porção
3’ pela polimeração dos dNTPs, gerando novas fitas
sintetizadas.
A reação de PCR produz uma quantidade de DNA que dobra a cada ciclo de
sintese.
Modified from: Molecular Biology of the Cell, 3rd edn. 1994 by Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff,
Keith Roberts, and James D. Watson.
Regras gerais para o desenho dos primers
Parametros
1. Sequencia de
nucleotídeos única
Otimização
A sequencia 3’ é crítica
para o anelamento
2. G/C na porção 3'
1-2 G/C (S) nucleotideos
3. Não autocomplementaridade
4. Não dimerização
(complementaridade
com outro primer)
5. Distribuição de bases
randômicas e composição
6. Tamanho do primer
< 3 bases contínuas
< 3 bases contínuas
45-55% G+C
18-25 bases
7. Equivalencia de Tm
8. Tamanho e
composição do
amplificado
100-600 bases
This table is modified from that of A. Sharrocks (1994) in “PCR Technology. Current Innovations” (eds. H.G. Griffin and A. M.
Griffin) CRC Press, Boca Raton.
Sequencia única de nucleotídeos do
molde de DNA
• Importante para especificidade de amplificação
GG
AT
C CAATTTTGTCGATCCCGATC
…GTATCGTTAAAACAGCTAGGGCTAGGAC…
Grampo de G/C na porção 3'
•A porção 3‘ do primer deve ser G ou C para aumentar o
correto anelamento do primer
•G-C possui pontes de hidrogenio mais fortes que A-T
Lembre-se que a porção 3’ frequentemente determina o
anelamento. Se voce tem um primer em que pelo menos
5-10 nt complementam exatamente com a porção 3’, o
anelamento provavelmente funcionará.
Sem auto-complementaridade
O auto-pareamento diminui a habilidade do primer se
anelar com o molde.
Como regra geral, não use primers com mais de 3
bases no inicio que se complementam com as bases da
porção 3’.
Não dimerização
Os pares de primers podem alinhar entre si. Se este
alinhamento inclui pelo menos uma das porções 3’ a
polimeras irá extender apenas a porção entre os dois
resultando na formação de um dímero:
5’ GTTCAAATGGCATCGTAGGGATGCAT 3‘
| | | || | |
3’ ACCGTAGTACTGCCG 5’
Distribuição randomica de bases e
composição
•Se o conteúdo de G+C% dos dois primers for muito
diferente
eles terão diferentes Tms e não anelarão a mesma
temperatura.
•Se todos os nucleotídeos da porção 5’ do primer forem
G ou C e
todos os da porção 3’ forem A ou T, mesmo que a
proporção
esteja correta, a porção 3’ não se anelará na temperatura
predita.
Tamanho do primer
•O tamanho do primer deve ser longo o bastante para
garantir que uma única sequencia seja amplificada e
não tão longo para afetar a Tm e o anelamento.
•Os melhores tamanhos variam de 14 a 30
nucleotídeos.
Equivalencia de Tm
• A Tm aproximada pode ser calculada pela fórmula:
Tm = 4(G + C) + 2(A + T)oC.
A temperatura de alinhamento depende diretamente do
tamanho e da composição dos primers. Um primeira
tentativa pode ser feita com a reação a 5°C abaixo da Tm
estimada para os primers
•A principal consequencia de se utilizar uma Tm muito baixa
é a possibilidade do primer anela com qualquer sequencia
do DNA , perdendo a especificidade
Tamanho do amplificado
•O máximo rendimento é obtido em uma reaçao de
PCR quando o tamanho do produto é entre 100-600
nt.
•Diferentes polimerases possuem diferentes graus
de processividade e diferentes tamanhos ótimos.
Ferramentas para desenho:
• Primer 3
• GeneRunner
• NCBI
Primer3
• http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm
• Escolhe normalmente os 3 melhores pares de primers para a
seqüência proposta
• É bastante exigente.
GeneRunner
• Excelente para conferir os oligos obtidos com o Primer3
• Pouco exigente quanto aos seus próprios critérios
NCBI
• Importante para conferir se a seqüência escolhida não
amplifica nenhum outro gene do organismo escolhido ou o
mesmo gene em possíveis contaminantes.