Polymerase Chain Reaction
(PCR)
Tópicos
1. DNA
2. PCR
–
–
–
–
Alvos
Denaturação
Primers
Anelamento
– Ciclos
– Requerimentos
DNA
DNA é um ácido nucléico
composto de duas
cadeias antiparalelas
complementares.
Os nucleotídeos são
compostos de um grupo
fosfato, uma pentose e
uma base nitrogenada
DNA
• Acúcar do DNA
– Ácido Desoxirribonucleico
• Açúcar do RNA
– Ácido Ribonucleico
DNA
O DNA tem quatro bases nitrogenadas.
• Duas são chamadas purinas
– Adenina ( A ), Guanina ( G )
• Duas são pirimidinas
– Citosina ( C ), Timina ( T )
DNA
Essas quatro bases são ligadas em um
padrão repetitivo por pontes de hidrogênio
entre as bases nitrogenadas
A ligação de duas cadeias complementares é
chamada de HIBRIDIZAÇÃO.
DNA
Uma purina sempre se liga a uma pirimidina
para manter a estrutura do DNA.
Adenina ( A ) se liga a timina ( T ), através de
duas pontes de hidrogênio.
Guanina ( G ) se liga a citosina ( C ), através
de três pontes de hidrogênio.
DNA
Examplo de padrão de ligação.
• Padrão primário
CCGAATGGGATGC
GGCTTACCCTACG
• Padrão complementar
DNA Molecule
Adenina
Timina
Guanina
Citosina
PCR
PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é
uma técnica que amplifica uma sequência
específica de DNA, como objetivo de tornála abundante e disponível para diversas
técnicas de biologia molecular.
OS Alvos do PCR
Os alvos a serem considerados no PCR são as
regiões que flanqueiam a sequência
específica de DNA a ser amplificada, a qual
pode ser um gene inteiro ou somente uma
região pequena.
PCR Targets
O número de bases nos alvos pode variar.
TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA
O . . . . Representa o meio da sequência de
DNA, e não há problemas em não conhecêla para poder amplificá-la.
PCR - Desnaturação
A desnaturação é o primeiro passo do PCR, no
qual as fitas de DNA são separadas através
de aquecimento a 95°C.
PCR Primers
Os primers são sequências de 15 a 30
nucleotídeos, fita única, que são usadas
para flanquearem as extremidades da
região a ser amplificada. Marcam o início e
o fim da seuqência-alvo.
PCR Primers
Um primer para cada extremidade da sua
sequência alvo deve ser desenhado, para
que as fitas sejam copiadas
simultaneamente em ambas as direções.
PCR Primers
TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT
AATTGCCGGAATT . . . . . . . . . .>
e
<. . . . . . . . . . AAATTTGGCCAA
TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT
PCR Primers
OS primers são colocados em excesso na
reação de PCR, para que eles se liguem ao
DNA alvo, ao invés das duas fitas se ligarem
de novo uma a outra.
PCR - Anelamento
O anelamento é o processo através do qual
duas sequencias de nucleotídeos são
ligadas através da formação de pontes de
hidrogênio. Na reação de PCR, o
anelamento se dá através da ligação dos
primers com o DNA Alvo, a temperatura de
55°C.
PCR Taq DNA Polimerase
O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a
qual é uma bactéria encontrada
sobrevivendo a altas temperaturas em
geisers no Yellow Stone National Park.
PCR Taq DNA Polimerase
Essa bactéria produz uma enzima DNA
polimerase, a qual amplifica o DNA a partir do
anelamento com os primers, na presença de
MG, a altas temperaturas.
PCR Ciclos
PCR Ciclos
PCR Ciclos
PCR Ciclos
PCR Cycles
PCR Ciclos
• Desnaturação: 94°- 95°C
• Anelamento: 55°- 65°C
• Extensão: 72°
• Número de ciclos: 25-40
PCR Ciclos
PCR Ciclos
PCR Ciclos
Número de cópias da
Região alvo de DNA
A = 2n
n = número de ciclos
PCR Requerimentos
• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM
• Tampão: pH 8.3-8.8
• dNTPs: 20-200µM
• Primers: 0.1-0.5µM
• DNA Polimerase: 1-2.5 units
• DNA Alvo:  1 µg
Extração de DNA de células sanguíneas
Centrifugar, extrair e descartar o plasma, com o cuidado de
Não remover a faixa de células brancas.
Extração de DNA de células sanguíneas
Extrair cuidadosamente 200ul da região de células brancas
E separar em tubos identificados
Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar
Protease a
Cada tubo
Adicionar
Tampão de
Lise em cada
tubo
Extração de DNA de células sanguíneas
Realizar
Homogeneização
Criteriosa do
material
Extração de DNA de células sanguíneas
Incubar os tubos
A 56C por pelo
Menos 10min.
Extração de DNA de células sanguíneas
Centrifugar os tubos
para retirar quaisquer
grumos
Adicionar etanol para lavagem
e centrifugar de novo.
Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar as maostras em colunas de afinidade e
centrifugar .
Extração de DNA de células sanguíneas
Tubo com coluna
A coluna vai ser retirada
e adaptada em outro tubo
no qual será feita a eluição
Coluna.
Esse eluato (flow
through) será
Descartado.
Extração de DNA de células sanguíneas
A coluna será colocada em um novo tubo, aonde será
Lavada mais duas vezes com tampão, para retirar quaisquer
Moléculas que não estejam ligadas fortemente a coluna.
Extração de DNA de células sanguíneas
A coluna com o tubo é então centrifugada
Mais uma vez, para remover excesso de
Tampão de Lavagem.
O próximo passo é adicionar Tampão de
Eluição
• Incuba-se por 30 minutos a 25C
• O eluato da coluna é então guardado, pois
agora esse contém o DNA Alvo.
Extração de DNA de células sanguíneas
Então pode-se preparar o mix de PCR.
Mix de PCR
•10x Buffer - 10 µl
•MgCl - 6 µl
•dNTPs- 0.8 µl
•Primer forward - 2 µl
•Primer reverse - 2 µl
•Taq polimerase - 0.5 µl
•H2O estéril - 73.7 µl
Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar ao mix de PCR a amostra de DNA em tubos
Específicos e colocar em termociclador.
Extração de DNA de células sanguíneas
Análise do produto de PCR.
Bibliografia
• Alberts, Brown,Johnson, Lewis, Raff, Roberts,
Walter. Use of PCR in Forensic Science. 1998.
Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/
forensci_PCR.htm.l
• Brown, John C. What The Heck Is PCR? 1995.
Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available
http://falcon.cc.ukans.edu/~jbrown/pcr.html
• Photographs: Courtesy of UMC clinical lab and
Tom Wiggers.
Bibliografia
• Ronald H. Holton, Ph.D.:
– Molecular Diagnostics in the Clinical
Laboratory
– Molecular Biology in the Clinical Laboratory
– Molecular Pathology: Basic Methodologies
and Clinical Applications
– Expanding applications of PCR, by Peter
Gwynne and Guy Page